JP2600850B2 - テトラヒドロカンナビノール誘導体 - Google Patents
テトラヒドロカンナビノール誘導体Info
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- JP2600850B2 JP2600850B2 JP25021088A JP25021088A JP2600850B2 JP 2600850 B2 JP2600850 B2 JP 2600850B2 JP 25021088 A JP25021088 A JP 25021088A JP 25021088 A JP25021088 A JP 25021088A JP 2600850 B2 JP2600850 B2 JP 2600850B2
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- Japan
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- thc
- solution
- cgg
- spdp
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はテトラヒドロカンナビノール（以下THCと記
す）誘導体に関する。THCは大麻の主要麻薬成分であ
る。本発明を用いて作製した抗THC抗体は、生体内や大
気中のTHCの極微量検出に有効である。
す）誘導体に関する。THCは大麻の主要麻薬成分であ
る。本発明を用いて作製した抗THC抗体は、生体内や大
気中のTHCの極微量検出に有効である。
従来の技術 大麻の主要麻薬成分であるTHCを微量検出するには抗T
HC抗体を用いた免疫反応を用いる方法が有効である。抗
THC抗体を作製するためには免疫原としてTHCを生体に注
射する必要がある。ところがTHCは低分子（Mw＝314）で
あるため単独では免疫応答を引き起こせない。このよう
な物質はハプテンと呼ばれる。ハプテンはタンパク質等
の高分子と結合させ複合体（ハプテン−タンパク質コン
ジュゲート）にすることで免疫原となる。THCをタンパ
ク質と結合させTHC−タンパク質コンジュゲートにする
ためには、タンパク質と結合が可能な官能基をTHCに導
入したTHC誘導体を作製する必要がある。抗THC抗体を作
成するためのTHC誘導体は、P.T.ツイらによって報告さ
れている。（例えばP.T.Tsui,K.A.Kelly and A.H.Seho
n,Can.J.Biocem.,52（1974））。
HC抗体を用いた免疫反応を用いる方法が有効である。抗
THC抗体を作製するためには免疫原としてTHCを生体に注
射する必要がある。ところがTHCは低分子（Mw＝314）で
あるため単独では免疫応答を引き起こせない。このよう
な物質はハプテンと呼ばれる。ハプテンはタンパク質等
の高分子と結合させ複合体（ハプテン−タンパク質コン
ジュゲート）にすることで免疫原となる。THCをタンパ
ク質と結合させTHC−タンパク質コンジュゲートにする
ためには、タンパク質と結合が可能な官能基をTHCに導
入したTHC誘導体を作製する必要がある。抗THC抗体を作
成するためのTHC誘導体は、P.T.ツイらによって報告さ
れている。（例えばP.T.Tsui,K.A.Kelly and A.H.Seho
n,Can.J.Biocem.,52（1974））。
発明が解決しようとする課題 従来作製されていたTHC誘導体は、THCにエステル結合
を用いて官能基を導入していた。しかしエステル結合は
容易に加水分解をするため、動物体内で十分な期間免疫
反応を誘期する点で信頼性に欠けている。タンパク質１
分子に結合したTHCの分子数の定量測定を行うにはTHC誘
導体を放射性同位体でラベルした物質を用いて測定して
いた。しかし、この方法はTHCの放射性同位が入手困難
であり、さらに放射性物質を扱うので簡便でなかった。
を用いて官能基を導入していた。しかしエステル結合は
容易に加水分解をするため、動物体内で十分な期間免疫
反応を誘期する点で信頼性に欠けている。タンパク質１
分子に結合したTHCの分子数の定量測定を行うにはTHC誘
導体を放射性同位体でラベルした物質を用いて測定して
いた。しかし、この方法はTHCの放射性同位が入手困難
であり、さらに放射性物質を扱うので簡便でなかった。
課題を解決するための手段 下記の構造を有するTHC誘導体。
作用 上記構成をとることにより、THCはエーテル結合で官
能基を導入したため、加水分解が阻止され安定性が向上
する。さらに官能基としてアミノ基を導入することで、
すでに生化学分野の情報として確立されている我々の定
量法が使用可能となり、放射性同位体を用いることなく
定量することができる。
能基を導入したため、加水分解が阻止され安定性が向上
する。さらに官能基としてアミノ基を導入することで、
すでに生化学分野の情報として確立されている我々の定
量法が使用可能となり、放射性同位体を用いることなく
定量することができる。
メチレン基の数ｎは、20以上ではコンジュゲートの溶
解性が劣るため本発明の用途には不適である。また、良
好な免疫反応を起こすためには、ハプテンとタンパク質
がある程度離れている方が望ましいという観点から、２
≦ｎ≦20が理想的である。
解性が劣るため本発明の用途には不適である。また、良
好な免疫反応を起こすためには、ハプテンとタンパク質
がある程度離れている方が望ましいという観点から、２
≦ｎ≦20が理想的である。
実施例 以下にメチレン基の数ｎを４とした場合の本発明の実
施例について説明する。
施例について説明する。
THC誘導体の作製 （Ａ）THC−BPIの作製 THC 816mg（2600μmol）を乾燥ベンゼン2mlに溶解
し、水素化ナトリウム 104mg（5200μmol）を加えた。
この溶液に、ブロモブチルフタルイミド（BBPI）733mg
（2600μmol）を乾燥ベンゼン2mlに溶解したものを徐々
に加えた。溶液の温度を80℃に保ち10時間還流し、目的
物であるテトラヒドロカンナビノール−０−ブチルフタ
ルイミド（THC−BPI）を得た。反応の確認はTLCでおこ
なった。THC−BPIは分取（吸着剤シリカゲル、展開液
ｎ−ヘキサン／ジエチルエーテル＝4/1）で採し、140mg
を得た。
し、水素化ナトリウム 104mg（5200μmol）を加えた。
この溶液に、ブロモブチルフタルイミド（BBPI）733mg
（2600μmol）を乾燥ベンゼン2mlに溶解したものを徐々
に加えた。溶液の温度を80℃に保ち10時間還流し、目的
物であるテトラヒドロカンナビノール−０−ブチルフタ
ルイミド（THC−BPI）を得た。反応の確認はTLCでおこ
なった。THC−BPIは分取（吸着剤シリカゲル、展開液
ｎ−ヘキサン／ジエチルエーテル＝4/1）で採し、140mg
を得た。
（Ｂ）THC−NH2の作成 THC−BPI 140mg（270μmol）を95％エタノール2mlに
溶解したものに、ヒドラジン 270mg（5400μmol）を95
％エタノール2mlに溶解した溶液を徐々に加えた。
溶解したものに、ヒドラジン 270mg（5400μmol）を95
％エタノール2mlに溶解した溶液を徐々に加えた。
２時間還流し後、分取TLC（吸着剤シリカゲル、展開
液 クロロホルム／メタノール＝95/5、アンモニア飽
和）で目的物であるTHC−NH2を採取した。反応の確認は
TLCでおこなった。
液 クロロホルム／メタノール＝95/5、アンモニア飽
和）で目的物であるTHC−NH2を採取した。反応の確認は
TLCでおこなった。
THC−CGGコンジュゲートの作製 （Ａ）THC−SPDPの作成 THC−NH2 20mg（52μmol）をエタノール 2.0mlに溶解
したものに、Ｎ−サクシンイミジル３−（２−ピリジル
ジチオ）プロピオネート（以下SPDP、ファルマシア製、
FW＝312.4）11mg（34μmol）をエタノール 2.0mlに溶解
した溶液を徐々に加え、室温で30分間撹拌した。TLCで
反応前後の溶液のチェックを行い、SPDPの消失を確認し
た。分取TLC（吸着剤シリカゲル、展開液 クロロホル
ム／メタノール＝95/5、アンモニア飽和）で目的物であ
るTHC−SPDPを採取した。
したものに、Ｎ−サクシンイミジル３−（２−ピリジル
ジチオ）プロピオネート（以下SPDP、ファルマシア製、
FW＝312.4）11mg（34μmol）をエタノール 2.0mlに溶解
した溶液を徐々に加え、室温で30分間撹拌した。TLCで
反応前後の溶液のチェックを行い、SPDPの消失を確認し
た。分取TLC（吸着剤シリカゲル、展開液 クロロホル
ム／メタノール＝95/5、アンモニア飽和）で目的物であ
るTHC−SPDPを採取した。
（Ｂ）CGG溶液の作製 チキンγグロブリン（CGG）100mgを、0.1molのNaClを
含むph7.0のリン酸バッファー（以下PBS）50mlに分散し
撹拌した。
含むph7.0のリン酸バッファー（以下PBS）50mlに分散し
撹拌した。
（Ｃ）CGG−SPDPの作製 SPDP 20mg（0.64mmol）を、エタノール15mLに緩やか
に加熱をしつつ溶解した。CGG溶液50mlを撹拌しながら
このSPDP溶液を10分間にわたって滴下後、さらに一晩４
℃で撹拌した。余分のSPDPを除くためSephadex G−25
（ファルマシア製）のゲルクロマトグラフィー（16mm径
×70cm）にこの溶液を流し、CGGとSPDPの結合物（CGG−
SPDP）を得た。なお、以降の本実験におけるゲルクロマ
トグラフィーは全て同一条件で行った。
に加熱をしつつ溶解した。CGG溶液50mlを撹拌しながら
このSPDP溶液を10分間にわたって滴下後、さらに一晩４
℃で撹拌した。余分のSPDPを除くためSephadex G−25
（ファルマシア製）のゲルクロマトグラフィー（16mm径
×70cm）にこの溶液を流し、CGGとSPDPの結合物（CGG−
SPDP）を得た。なお、以降の本実験におけるゲルクロマ
トグラフィーは全て同一条件で行った。
（Ｄ）CGG−SPDPの還元 8.6μＭのCGG−SPDPのPBS溶液50mlに、100mMジチオス
レイトール（DTT）を含むPBS溶液1mlをゆっくり滴下
し，最終濃度2mMにし、２−ピリジルスルフィド基を還
元した。30分後この溶液をゲルクロマトグラフィーにか
け低分子を除去し、7.7μＭのCGG−SH溶液50mlを得た。
レイトール（DTT）を含むPBS溶液1mlをゆっくり滴下
し，最終濃度2mMにし、２−ピリジルスルフィド基を還
元した。30分後この溶液をゲルクロマトグラフィーにか
け低分子を除去し、7.7μＭのCGG−SH溶液50mlを得た。
（Ｅ）CGG−THCの作製 7.7μＭのCGG−SH溶液50mLに、7.7μＭのTHC−SPDPの
エタノール溶液1.5mLをゆっくり滴下し、室温で20分間
撹拌ののち冷蔵室で一晩撹拌した。カラムクロマトグラ
フィーで精製し11.3μＭのCGG−THCのPBS溶液30mlを得
た。
エタノール溶液1.5mLをゆっくり滴下し、室温で20分間
撹拌ののち冷蔵室で一晩撹拌した。カラムクロマトグラ
フィーで精製し11.3μＭのCGG−THCのPBS溶液30mlを得
た。
（Ｆ）CGG1分子当りのTHC量の測定 CGG1分子当りに結合したTHCの分子数を知るために、C
GG、CGG−SPDP、CGG−THCそれぞれのSH残基を４−ピリ
ジルヂサルファイド（4PDS）を用いた324nmの吸光度測
定で定量した。その結果CGGD21分子当りTHCが９分子結
合していることがわかった。また酵素免疫測定法により
CGGにTHCが導入されていることを確認した。
GG、CGG−SPDP、CGG−THCそれぞれのSH残基を４−ピリ
ジルヂサルファイド（4PDS）を用いた324nmの吸光度測
定で定量した。その結果CGGD21分子当りTHCが９分子結
合していることがわかった。また酵素免疫測定法により
CGGにTHCが導入されていることを確認した。
THC−BSAコンジュゲートの作製 （Ａ）BSA溶液の作製 牛血清アルブミン（BSA）100mgを0.1molのNaCl含むpH
7.0のリン酸バッファー（以下PBS）30mlに分散し撹拌し
た。
7.0のリン酸バッファー（以下PBS）30mlに分散し撹拌し
た。
（Ｂ）BSA−THCの作製 BSA溶液30mLに、27mMのTHC−SPDPのエタノール溶液0.
15mLをゆっくり滴下し、室温で20分間撹拌ののち４℃で
一晩撹拌後、カラムクロマトグラフィーで精製し、35μ
ＭのBSA−THCのPBS溶液36mlを得た。
15mLをゆっくり滴下し、室温で20分間撹拌ののち４℃で
一晩撹拌後、カラムクロマトグラフィーで精製し、35μ
ＭのBSA−THCのPBS溶液36mlを得た。
（Ｃ）BSA一分子当りのTHC量の測定 BSA1分子当りに結合したTHCの分子数を知るために、B
SA、BSA−SPDP、BSA−THCそれぞれのSH基量を４−ピリ
ジルジサルファイド（4PDS）を用いた324nmの吸光度測
定で調べた。その結果BSA一モル当りTHCが0.4モル結合
できていることがわかった。また酵素免疫測定法により
BSAにTHCが導入されていることを確認した。
SA、BSA−SPDP、BSA−THCそれぞれのSH基量を４−ピリ
ジルジサルファイド（4PDS）を用いた324nmの吸光度測
定で調べた。その結果BSA一モル当りTHCが0.4モル結合
できていることがわかった。また酵素免疫測定法により
BSAにTHCが導入されていることを確認した。
THC誘導体の安定性の評価実験 本発明によるTHC誘導体（Ｉ）と、ツイらの作製したT
HC誘導体（II）の安定性を比べる評価実験をした。PH7.
0に調整したPBS50mlにＩ、IIを溶解し、この溶液それぞ
れを室温（20℃）でゆるく撹拌し５日間放置した。その
後溶液中のTHC誘導体量を定量した結果、IIに比べＩが
はるかに安定であることが確認できた。
HC誘導体（II）の安定性を比べる評価実験をした。PH7.
0に調整したPBS50mlにＩ、IIを溶解し、この溶液それぞ
れを室温（20℃）でゆるく撹拌し５日間放置した。その
後溶液中のTHC誘導体量を定量した結果、IIに比べＩが
はるかに安定であることが確認できた。
タンパク質１分子当りのTHCの定量測定 THC誘導体が結合するときのタンパク質１分子当りのS
H基量の変化を測定することにより、THC量を測定した。
SH基の変化量は４−ピリジルヂサルファイド（4PDS）試
薬を用いた吸光度より求めた。
H基量の変化を測定することにより、THC量を測定した。
SH基の変化量は４−ピリジルヂサルファイド（4PDS）試
薬を用いた吸光度より求めた。
4PDSはピリジン二分子がジスルフィド結合しており、
SH基と一方のピリジンは結合し、もう一方は４−チオピ
リヂン（４−TP）となる。この4TPの324nmの吸光度変化
を測定してTHCの結合数を測定した。その結果CGG1分子
当りTHCが９分子結合できていることがわかった。
SH基と一方のピリジンは結合し、もう一方は４−チオピ
リヂン（４−TP）となる。この4TPの324nmの吸光度変化
を測定してTHCの結合数を測定した。その結果CGG1分子
当りTHCが９分子結合できていることがわかった。
発明の効果 本発明によれば、加水分解の影響なく安定で、タンパ
ク質と結合して、容易に定量が行えるTHC誘導体が得ら
れ、さらにこれをタンパク質と結合することにより、抗
THC抗体の作製が可能なTHC−タンパク質コンジュゲート
が提供される。
ク質と結合して、容易に定量が行えるTHC誘導体が得ら
れ、さらにこれをタンパク質と結合することにより、抗
THC抗体の作製が可能なTHC−タンパク質コンジュゲート
が提供される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 光亦 忠泰 大阪府門真市大字門真1006番地 松下電 器産業株式会社内 (56)参考文献 特開 昭63−192770（ＪＰ，Ａ) 米国特許3649650（ＵＳ，Ａ)
Claims (2)
- 【請求項１】下記の構造を有するテトラヒドロカンナビ
ノール誘導体。 - 【請求項２】請求項１に記載のテトラヒドロカンナビノ
ール誘導体とタンパク質とを結合しており、免疫機構を
有する実験動物の体内に導入した際、免疫原性を発揮す
る性能を有したテトラヒドロカンナビノール−タンパク
質コンジュゲート。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25021088A JP2600850B2 (ja) | 1988-10-04 | 1988-10-04 | テトラヒドロカンナビノール誘導体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25021088A JP2600850B2 (ja) | 1988-10-04 | 1988-10-04 | テトラヒドロカンナビノール誘導体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02101072A JPH02101072A (ja) | 1990-04-12 |
| JP2600850B2 true JP2600850B2 (ja) | 1997-04-16 |
Family
ID=17204459
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP25021088A Expired - Fee Related JP2600850B2 (ja) | 1988-10-04 | 1988-10-04 | テトラヒドロカンナビノール誘導体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2600850B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5817766A (en) * | 1995-04-05 | 1998-10-06 | Roche Diagnostic Systems, Inc. | Reagents for a cannabinoid immunoassay |
| US20060051824A1 (en) * | 2004-09-03 | 2006-03-09 | Haoyun An | Tetrahydrocannabinoid antigens and method of use |
-
1988
- 1988-10-04 JP JP25021088A patent/JP2600850B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH02101072A (ja) | 1990-04-12 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |