JPH0260269B2 - - Google Patents
Info
- Publication number
- JPH0260269B2 JPH0260269B2 JP59139182A JP13918284A JPH0260269B2 JP H0260269 B2 JPH0260269 B2 JP H0260269B2 JP 59139182 A JP59139182 A JP 59139182A JP 13918284 A JP13918284 A JP 13918284A JP H0260269 B2 JPH0260269 B2 JP H0260269B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- particle
- inner core
- particle reagent
- biological interest
- compound
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired
Links
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 141
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 65
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 45
- 239000000178 monomer Substances 0.000 claims description 31
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 26
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 21
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 claims description 14
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 claims description 14
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 claims description 10
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 9
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 claims description 7
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims description 5
- 239000004593 Epoxy Substances 0.000 claims description 4
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 claims description 4
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 3
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 2
- GOOHAUXETOMSMM-UHFFFAOYSA-N Propylene oxide Chemical compound CC1CO1 GOOHAUXETOMSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 125000002485 formyl group Chemical class [H]C(*)=O 0.000 claims 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 37
- 229920000768 polyamine Polymers 0.000 description 36
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 35
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 31
- 239000004721 Polyphenylene oxide Substances 0.000 description 30
- 229920000570 polyether Polymers 0.000 description 30
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 29
- 239000011162 core material Substances 0.000 description 27
- ZFXYFBGIUFBOJW-UHFFFAOYSA-N theophylline Chemical compound O=C1N(C)C(=O)N(C)C2=C1NC=N2 ZFXYFBGIUFBOJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 26
- 239000011257 shell material Substances 0.000 description 25
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 22
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- -1 aminophenyl groups Chemical group 0.000 description 21
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 239000000047 product Substances 0.000 description 18
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 16
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 16
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 16
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 15
- 229960000278 theophylline Drugs 0.000 description 15
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 14
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 13
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 13
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 13
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 13
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 13
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 13
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 13
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 11
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 10
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 10
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 10
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 10
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 10
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 10
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 9
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 9
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- YYROPELSRYBVMQ-UHFFFAOYSA-N 4-toluenesulfonyl chloride Chemical compound CC1=CC=C(S(Cl)(=O)=O)C=C1 YYROPELSRYBVMQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 8
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 7
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 7
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 6
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 5
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 5
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- VHJLVAABSRFDPM-ZXZARUISSA-N dithioerythritol Chemical compound SC[C@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-ZXZARUISSA-N 0.000 description 5
- 125000003700 epoxy group Chemical group 0.000 description 5
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 5
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 5
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000000370 acceptor Substances 0.000 description 4
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 4
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 4
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 4
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 4
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 4
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 101000609762 Gallus gallus Ovalbumin Proteins 0.000 description 3
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920002594 Polyethylene Glycol 8000 Polymers 0.000 description 3
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 3
- 238000007720 emulsion polymerization reaction Methods 0.000 description 3
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 229940033663 thimerosal Drugs 0.000 description 3
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 3
- ABIFUJNCKIMWRZ-JGVFFNPUSA-N (2r,4s)-4-(3-phosphonopropyl)piperidine-2-carboxylic acid Chemical compound OC(=O)[C@H]1C[C@@H](CCCP(O)(O)=O)CCN1 ABIFUJNCKIMWRZ-JGVFFNPUSA-N 0.000 description 2
- FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 3-(dimethylamino)propyliminomethylidene-ethylazanium;chloride Chemical compound Cl.CCN=C=NCCCN(C)C FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HGINCPLSRVDWNT-UHFFFAOYSA-N Acrolein Chemical compound C=CC=O HGINCPLSRVDWNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000003945 anionic surfactant Substances 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- GDCXBZMWKSBSJG-UHFFFAOYSA-N azane;4-methylbenzenesulfonic acid Chemical compound [NH4+].CC1=CC=C(S([O-])(=O)=O)C=C1 GDCXBZMWKSBSJG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 150000002118 epoxides Chemical group 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 150000004820 halides Chemical group 0.000 description 2
- 150000002440 hydroxy compounds Chemical class 0.000 description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 238000012643 polycondensation polymerization Methods 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002787 reinforcement Effects 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 125000005490 tosylate group Chemical group 0.000 description 2
- ILWRPSCZWQJDMK-UHFFFAOYSA-N triethylazanium;chloride Chemical compound Cl.CCN(CC)CC ILWRPSCZWQJDMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 2
- JJRUAPNVLBABCN-UHFFFAOYSA-N 2-(ethenoxymethyl)oxirane Chemical compound C=COCC1CO1 JJRUAPNVLBABCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003903 2-propenyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])=C([H])[H] 0.000 description 1
- NGBYKZGOXFIONW-UHFFFAOYSA-N 4-(1,3-dimethyl-2,6-dioxo-7h-purin-8-yl)butanoic acid Chemical compound O=C1N(C)C(=O)N(C)C2=C1NC(CCCC(O)=O)=N2 NGBYKZGOXFIONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- 101710130081 Aspergillopepsin-1 Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- FTGYIVKKFUDOSB-UHFFFAOYSA-N C=C.C=C.C=C.C=C.CC1=CC=C(S(O)(=O)=O)C=C1.CC1=CC=C(S(O)(=O)=O)C=C1 Chemical compound C=C.C=C.C=C.C=C.CC1=CC=C(S(O)(=O)=O)C=C1.CC1=CC=C(S(O)(=O)=O)C=C1 FTGYIVKKFUDOSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100031007 Cytosolic non-specific dipeptidase Human genes 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 239000005909 Kieselgur Substances 0.000 description 1
- CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-N Methacrylic acid Chemical compound CC(=C)C(O)=O CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000014171 Milk Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010011756 Milk Proteins Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 150000008065 acid anhydrides Chemical class 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 125000002837 carbocyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 1
- 150000001721 carbon Chemical group 0.000 description 1
- 125000002843 carboxylic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002274 desiccant Substances 0.000 description 1
- GYZLOYUZLJXAJU-UHFFFAOYSA-N diglycidyl ether Chemical compound C1OC1COCC1CO1 GYZLOYUZLJXAJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 238000002296 dynamic light scattering Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- VOZRXNHHFUQHIL-UHFFFAOYSA-N glycidyl methacrylate Chemical compound CC(=C)C(=O)OCC1CO1 VOZRXNHHFUQHIL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010559 graft polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 229920002100 high-refractive-index polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 229920001477 hydrophilic polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 239000003701 inert diluent Substances 0.000 description 1
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 235000021239 milk protein Nutrition 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 238000004848 nephelometry Methods 0.000 description 1
- 239000012299 nitrogen atmosphere Substances 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- RPQRDASANLAFCM-UHFFFAOYSA-N oxiran-2-ylmethyl prop-2-enoate Chemical compound C=CC(=O)OCC1CO1 RPQRDASANLAFCM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013610 patient sample Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 229920001281 polyalkylene Polymers 0.000 description 1
- 239000002491 polymer binding agent Substances 0.000 description 1
- 230000000379 polymerizing effect Effects 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 150000003141 primary amines Chemical class 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000007065 protein hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000012207 quantitative assay Methods 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000007086 side reaction Methods 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 239000012258 stirred mixture Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 150000003461 sulfonyl halides Chemical class 0.000 description 1
- 150000003512 tertiary amines Chemical class 0.000 description 1
- LMYRWZFENFIFIT-UHFFFAOYSA-N toluene-4-sulfonamide Chemical compound CC1=CC=C(S(N)(=O)=O)C=C1 LMYRWZFENFIFIT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-N toluene-4-sulfonic acid Chemical compound CC1=CC=C(S(O)(=O)=O)C=C1 JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 125000000391 vinyl group Chemical group [H]C([*])=C([H])[H] 0.000 description 1
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229920003176 water-insoluble polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920003169 water-soluble polymer Polymers 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/805—Optical property
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/823—Immunogenic carrier or carrier per se
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Addition Polymer Or Copolymer, Post-Treatments, Or Chemical Modifications (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
〔発明の技術分野〕
本発明は比濁イムノアツセーに使用される粒子
試薬、そしてより特定的には生物学的に関心ある
化合物のラテツクス粒子への結合のための親水性
重合体結合基を有するそのような試薬に関する。 〔発明の技術的背景〕 凝集（アグルチネーシヨン）反応は長い間、広
汎な種々の細菌、細胞表面抗原、血清蛋白質およ
び臨床的関心のあるその他のアナライトの視覚的
（半定量的）および定量的アツセーに使用されて
きた。二価抗体と関心ある多価抗原との反応から
凝集が生じて凝集塊が生成する。これを種々の方
法で検出および／または測定することができる。
同様に、同一の反応は相当する抗原の添加により
生ぜしめられる凝集反応により特異抗体の検出に
対して使用することができる。 一般に大形の交叉結合集塊（アグレゲート）を
生成させるためには抗原上の反応部位の数は少く
とも２でなくてはならない。一価ハプテンの検出
が所望されている場合には、反応スキームは以下
のように修正されなくてはならない。すなわち多
価形態の抗原例えばハプテン−蛋白質コンジユゲ
ートを生成させそして試料中に存在する遊離ハプ
テンを抗体の利用可能結合部位に対してこの多価
形態のものと競争させ、それによつて凝集量を減
少せしめる。この技術は凝集阻害と呼ばれてい
る。 多価形態のハプテン製造は当技術分野では古い
ものである。往々にしてハプテンを免疫源の製造
において実施されるように担体蛋白質に結合させ
る。反応の化学量論性は蛋白質１分子当り３また
はそれ以上のハプテンを加えるように調整され
る。正確な数はその物質の利用される特定のアツ
セーの要求により決定される。 凝集またはその阻害の視覚的または機器的測定
のための感度増大は担体として可溶性蛋白質また
は蛋白質コンジユゲートではなく粒子試薬を使用
することにより達成させることができる。例えば
ニワトリ卵アルブミンに対する抗血清はニワトリ
卵アルブミン自体を沈降させる場合よりも、コロ
イド粒子上にコーテイングさせたニワトリ卵アル
ブミン沈降の場合において2000倍感度が高い
〔H.N.Eisen氏著「Immunology」第394頁（1974
年）参照〕。 抗体粒子試薬もまた知られている。そのような
試薬の製造に対する一般的方法は、適当な吸着剤
の表面に抗体を吸着させることである。ポリスチ
レンベースのラテツクス粒子がこの目的に対して
広く使用されている。しかしこれら試薬は保存ま
たは使用の間に脱着を生じて試薬の性質の変動を
招来しやすい。これは次いでアツセー感度および
再現性に悪影響を与えうる。 この脱着の問題を克服するために粒子表面に生
物学的関心のある化合物を共有結合的に結合させ
ることによつて粒子試薬を製造することができ
る。ポリスチレン重合体を変性して共有結合蛋白
結合を生成させうる官能基を包含せしめる。米国
特許第4064080号明細書は末端アミノフエニル基
を有し且つそれに蛋白質を結合せしめたスチレン
重合体を開示している。米国特許第4181636号明
細書は水溶性活性剤によつて免疫学的に活性な物
質にカツプリングせしめたカルボキシル化ラテツ
クス重合体およびそれらの凝集試験における診断
試薬としての使用を開示している。米国特許第
4210723号明細書は粒子表面に遊離エポキシ基を
有する直径0.15〜1.5μｍのシエル−コア（殻−
芯）ラテツクス重合体粒子およびこれらエポキシ
基を介しての蛋白質のカツプリングを記載してい
る。 以後の免疫学的活性物質の結合のためにその他
の重合体系も開発された。米国特許第4264766号
明細書は0.01〜0.9μｍの粒子サイズを有しそして
カルボキシルおよびアミノ基のような活性基を有
しそしてこれに水溶性多価ヒドロキシ化合物を共
有結合的に結合させることのできるラテツクス重
合体を開示している。活性化剤例えばカルボジイ
ミドの使用によつて、免疫学的活性な物質はラテ
ツクス粒子／多価ヒドロキシ化合物担体に結合さ
れて診断的に有用な試薬を生成する。 米国特許出願第315922号明細書は、内部コアが
光散乱測定に対して高い感度を与えるような高い
屈折率を有しており、そして外側シエルが生物学
的関心ある化合物を直接かまたは蛋白性物質を介
して結合させうる官能基を含有しているシエル−
コア重合体粒子を開示している。 通常、生物学的関心のある低分子量化合物（ア
ナライト）はラテツクス粒子に直接は結合されな
い。この理由はそのような粒子試薬は往往にして
適当な抗体と混合した場合良好には凝集せず、ま
たはそれらは粒子表面への共有結合的に適当な官
能基に次けているからである。これらの問題を克
服するためにアナライトを通常はブリツジまたは
スペーサー成分を介して粒子に結合される。 最も一般的に使用されるスペーサーは蛋白質ま
たは糖蛋白質例えばアルブミンである。人血清ア
ルブミン（HSA）はアナライトおよび粒子表面
両者上のアミノ反応性基とのカツプリングにおい
て使用できるアミノ基を多量に有する水溶性蛋白
質である。 アナライト−蛋白コンジユゲートから製造され
る粒子試薬は一般に大なる有用性を示すけれど
も、それらの使用に関してはいくらかの不利点が
なお存在している。蛋白質の溶解性および安定特
性はアナライト−蛋白質コンジユゲートの形成お
よびそれの粒子への結合に対して使用しうる化学
的手段を限定している。蛋白質は極端な温度およ
びPHにより変性され、そして往々にしてこれは有
機溶媒には不溶である。更に親水性蛋白質でさえ
も疎水性部分を有しており、この中に疎水性アナ
ライトが埋没されうる。粒子試薬の長期保存は蛋
白質の加水分解、酸化、コンホメーシヨン変化、
および微生物的分解を生ぜしめうる。最後に、蛋
白質スペーサーは抗アナライト抗体により認識さ
れる抗原決定基を含有しうるのであり、これはア
ツセーにおける非特異的凝集の結果となる。 臨床的診断での使用のための粒子試薬の製造に
利用しうる親水性で化学的に良好に定義された結
合基に対する要求が存在している。 〔発明の概要〕 本発明の粒子試薬は (A) ナトリウムＤ線の波長で測定して1.54以上の
屈折率を有する重合体である「内側コア」およ
び (1) エポキシ、カルボキシおよびアルデヒドよ
りなる群から選ばれた親水性重合体リンカー
と反応しうる官能基を有するエチレン性不飽
和単量体、 (2) 場合により重合体粒子を実質的に水不溶性
とするに充分な量のその他のエチレン性不飽
和単量体、および (3) 外側シエルの10重量部を越えない内側コア
の単量体 の重合体であつて前記内側コアの存在下の重合に
より形成された「外側シエル」 を有しそして大約0.03〜0.1μｍの直径範囲を有し
ている重合体粒子、および (B) 実験式 Ｈ〔NHC2H3R（OC2H3R）xOC2H3R〕yNH2 （式中ＲはＨおよび／またはCH3であり、ｘ
は０〜70でありそしてｙは１〜20である）の親
水性重合体リンカーを介して前記重合体粒子と
共有結合的に結合されている生物学的関心のあ
る化合物 から本質的に構成されている。 生物学的関心のある化合物を測定するための、
本発明の方法は (A) 下記(1)、(2)および(3)すなわち (1) (a) ナトリウムＤ線の波長で測定して1.54
以上の屈折率を有する重合体である内側コ
アおよび (i) エポキシ、カルボキシおよびアルデヒ
ドよりなる群から選ばれた親水性重合体
リンカーと反応しうる官能基を有するエ
チレン性不飽和単量体、 (ii) 場合によりその粒子を実質的に水不溶
性とするに充分な量のその他のエチレン
性不飽和単量体、および (iii) 外側シエルの10重量部を越えない内側
コアの単量体 の重合体であつてしかも前記内側コアの存在下の
重合により形成された外側シエルを有しそして大
約0.03〜0.1μｍの直径範囲を有している重合体粒
子、そして (b) 実験式 Ｈ〔NHC2H3R（OC2H3R）xOC2H3R〕y
NH2 （式中ＲはＨおよびまたはCH3であり、
ｘは０〜70でありそしてｙは１〜20であ
る）の前記親水性重合体リンカーによつて
前記重合体粒子と共有結合的に結合された
生物学的に関心ある化合物 から本質的になる高屈折率を有する粒子試薬、 (2) 生物学的関心ある化合物を含有すると考え
られる液体、および (3) 凝集剤 を培養し、そして (B) 光学的に凝集から生じた増大された粒子サイ
ズを測定する 各段階を包含している。 本発明のポリエーテル−ポリアミン親水性リン
カーは水および多くの有機溶媒に可溶であり、化
学的および熱的に安定であり、そして微生物分解
に対して抵抗性であり、抗蛋白質または抗（ハプ
テン−担体コンジユゲート）抗体と免疫学的に交
叉反応性でなく、そして疎水性部分を有していな
い。結合剤としての蛋白質に対するそれらの置き
換えはまた、粒子ベースアツセーの精度の改善、
所望のシグナル水準の達成に要求される抗体量の
低減およびポリエチレンエーテルグリコール
（PEG）のこのアツセーの依存性の減少のような
予期せざる利点を有している。 〔発明の詳細な開示〕 本発明は生物学的関心のある化合物（アナライ
ト）を高屈折率ラテツクス重合体粒子に親水性重
合体結合剤を介して結合せしめた比濁イムノアツ
セーに使用するための改善された粒子試薬の製造
に関する。 この粒子試薬は、 (1) 高い屈折率のコア物質から形成させることに
より、 (2) ポリエーテル・ポリアミン親水性リンカーに
共有結合的に結合しうるシエル物質を含有させ
ることにより、そして (3) イムノアツセーにおける至適感度のための小
粒子サイズのものであることによつてイムノア
ツセーの感度を最大とするようにデザインされ
ている。結合剤は水性および有機溶媒に可溶性
であり、化学的および熱的に安定であり、化学
的に良好に定義されておりすなわち再現性可能
であり、そしてアナライトおよび粒子表面両方
のアミン反応性基に共有結合的に結合しうるよ
うにデザインされている。 粒子懸濁液の光散乱性はいくつかの変数に依存
するが最も重要なものは粒子サイズ、コアおよび
懸濁媒体の屈折率、および測定に使用される光の
波長である。すなわちコア材料、粒子サイズおよ
び凝集反応の検出波長の選択はすべてアツセー感
度の至適化に対して重要なフアクターである。こ
れらのフアクターは使用される光散乱検出手段の
タイプにより決定されうる。 ある測定波長における粒子サイズ変化の濁度検
出に対しては、粒子サイズおよび屈折率を注意し
て選ぶことが必要である。その理由は濁度計シグ
ナルは最大値を経てピークにおいてほとんどまた
は全く感度のない二重値反応を示すからである。
それに加えて、勾配感度はピークの小粒子サイズ
側では大粒子サイズ側よりも大であり、そしてそ
れは粒子の媒体に対する屈折率比の増大と共に上
昇する。 これらの理由の故に、高い屈折率の小形粒子お
よび短い波長の検出系が最大感度に対しては好ま
しい。蛋白質およびその他の成分による光吸収の
故に、血清中の試料の測定に対しては紫外線領域
では実際的制限が存在している。すなわち便利な
波長は約320nm以上のものである。より長い波長
を使用しうるが感度はより低い。小形粒子すなわ
ち約0.1μｍ以下の直径を有するものが増大した勾
配感度およびより迅速な反応速度の両方の故に好
ましい。安定性および合成上の便利さの理由から
約0.03μｍ以上の粒子サイズが好ましい。一般に
0.03〜0.1μｍの粒子サイズ範囲を本発明の粒子試
薬中で使用することができる。 いくつかの異つた光散乱測定法例えば比濁法
（ネフロメトリー）、粒子計算、準弾性
（quasielastic）光散乱、自動相関分光分析および
粒子の非対称性または極性の測定を使用しうる。
本発明の粒子試薬を使用した免疫反応の測定の好
ましい方法は濁度によるものである。その理由は
臨床実験室では一般に使用可能な分光光度計以外
の特別の装置を必要としないからである。分光光
度計は凝集反応により形成された粒子集塊に由来
するみかけの吸収上昇を記録する。これら集塊は
光学ビームの外に光を散乱させ、すなわち検出装
置に達する光の量を減少させる。実際にはみかけ
の吸収はアナライトにより生ぜしめられた凝集阻
害の逆の尺度である。凝集の間に生ずる濁度変化
を至適化させるためには粒子サイズを注意して選
ぶことが重要である。 凝集反応の間に有効粒子サイズは上昇する。従
つて高感度測定のためには、ある与えられた粒子
サイズ変化に対するシグナル変化が至適となるよ
うな波長を選択することが重要である。 凝集反応の濁度検出に対する屈折率の重要性の
故に、コア物質は所望のアツセー感度に対して許
容しうるシグナル変化を生成するようなものに限
定される。すなわち高い芳香性および高い原子量
の置換基を有するコア重合体が脂肪族重合体より
も好ましく、そして一般に高い屈折率の重合体が
低い屈折率の重合体に比べて好ましい。 重合体粒子の内側コアは高い屈折率を有する大
なる物質群から選ぶことができる。好ましいのは
最終粒子サイズが制御可能でありそして実質的に
均一となるように乳化重合により製造することの
できる物質である。重合体粒子の内側コア中に使
用される典型的重合体は1.54以上（Na Ｄ線
569nmにおいて）の屈折率を有している。屈折率
は波長の函数なのであるから、散乱性は測定の波
長に依存する。一般に屈折率はより短い波長にお
いてより大である。コア重合体は濁度測定用に選
ばれた波長の光を吸収してはならないことが理解
されている。 内側コアの製造に対して関心ある単量体は高い
屈折性を付与する置換基例えばハライド、芳香族
基、複素環状基、不飽和基または炭素環状基に加
えてビニルまたはアリル基を含有するものであ
る。 本発明の粒子試薬の製造に有用な重合体粒子は
主として乳化重合により製造することができる。
段階的乳化重合はnD＝1.54以上の所望の屈折率
に近いコア／シエル重合体を導き得る。所望の屈
折率の重合体を得るためには、シエル重合体が重
合体粒子の約10重量部を越えないことが好まし
い。 重合体粒子の粒子サイズ制御のための便利な方
法は、最初に使用される表面活性剤の量によりそ
の粒子サイズが制御しうるような種子乳剤を製造
することである。種子乳剤の製造後、追加の単量
体および表面活性剤を制御された速度で加えて種
子乳剤中の粒子サイズを上昇させることができ
る。 重合体粒子の外側シエル重合体は結合させるべ
き親水性結合基と反応しうる官能基を有する広範
囲なエチレン性不飽和単量体から製造することが
できる。場合により、外側シエルはまた内側コア
の製造に使用された単量体を含むその他のエチレ
ン性不飽和単量体をも含有しうる。コアに対する
シエル重合体の結合は、コア重合体中の残存エチ
レン性不飽和基への官能性単量体のグラフト重合
によつて達成できるし、または官能性単量体をコ
アのまわりで重合させて隣接シエルを生成させる
ことができる。好ましい単量体としては、エポキ
シ基を含有するもの、例えばグリシジルメタアク
リレート、グリシジルアクリレート、ビニルグリ
シジルエーテルおよびメタアリルグリシジルエー
テルがあげられる。その他の官能基としてはカル
ボキシルおよびアルデヒドがあげられる。 コア単量体の変換を実質的完了まで実施して、
シエル重合体が未知の組成の共重合体でなく、ホ
モ重合体または既知の組成の共重合体となるよう
にすることが好ましい。98％以上の変換はコア乳
剤の温度を重合の終りに約95℃まで上昇させるこ
とによつて達成できる。その表面が未知の組成の
共重合体である粒子が生成する確率を更に低下さ
せるために、シエル単量体をバツチ的ではなく
徐々に加えることができる。そのような方法にお
いては、残存コア単量体はシエル重合体形成の初
期の間に消費されうる。使用される単量体がエポ
キシ基を含有するものである場合には、シエル重
合体がホモ重合体であることが好ましい。しかし
実際問題として外側シエルの10重量部までの内側
コアの単量体を存在させることができる。 シエル単量体がアルデヒドまたはカルボン酸基
を含有する場合には、水溶性重合体の形成を避け
るように注意が払われなくてはならない。すなわ
ち例えばアクロレインまたはメタクリル酸を単独
で使用してホモ重合体シエル構造を生成させるこ
とはできない。しかしながらそれらを水不溶性重
合体粒子を生成させるようなその他の単量体と共
重合させることはできる。 外側シエルは好ましくはホモ重合体であるがし
かしこれは外側シエルの10重量部以下、好ましく
は５重量部以下、そして更により好ましくは２重
量部以下の内側コア単量体を含有しうる。これら
単量体は内側コアの重合からの残存単量体であり
うるしまたはいずれかのその他の適当なエチレン
性不飽和単量体でありうる。 粒子試薬は数種の異つた官能性シエル物質を含
有しうる。好ましいのはエポキシ基を含有するも
のであり、これは親水性重合体結合剤による生物
学的関心ある化合物の共有結合的結合に便利には
使用されうる。このようにして形成された粒子試
薬が本発明の主題である。 親水性重合体リンカーによつて共有結合的に結
合された生物学的に関心ある化合物（アナライ
ト）を含有する粒子試薬の製造に対しては、２つ
の方法が存在しうる。リンカーを最初に重合体粒
子に結合させ、そして生物学的に関心ある化合物
またはアナライトの適当な誘導体を次いでリンカ
ーに結合させることができる。適当な誘導体は比
較的穏和な条件下に水性媒体中でアミンと反応し
うる官能基例えばエポキシド、アルデヒドおよび
カルボキシル基を含有するものである。アナライ
ト誘導体中の官能基はラテツクス重合体粒子シエ
ル中に存在するものと同じかまたは異つたもので
ありうる。すなわち誘導体および粒子シエルが共
にカルボキシル基を含有していることができる
し、または誘導体がカルボキシル基を含有しそし
て粒子シエルがエポキシド基を含有していること
もできる。結合剤として屡々使用される蛋白質に
対する本発明のポリエーテルポリアミンの置換は
通常の方法からの顕著な逸脱は要しない。この方
法の限界はすべての段階が必ず実質的に水性の環
境中で実施されるということである。 あるいはまた、生物学的関心ある化合物または
その適当な誘導体を最初に親水性リンカーに結合
させ、次いでこの生成物を粒子に結合させる。必
要な場合には、アナライト誘導体とポリエーテル
ポリアミンリンカーとの反応は厳しい条件下に任
意の適当な溶媒中で実施することができる。その
理由はポリエーテルアミンは多くの有機溶媒に可
溶性であり、酸化的および熱的に安定であり、そ
して酸または塩基触媒によつて容易には分解され
ないからである。すなわち水性媒体中での使用に
不適当なアナライト誘導体をここでは使用しう
る。例えば酸ハライド、酸無水物、アリルハライ
ド、α−ハロケトン、スルホニルハライドまたは
スルホネートエステル基を含有するアナライト誘
導体を使用してアナライト−リンカー生成物を生
成させることができる。これを次いで水性媒体中
で当技術分野で周知の方法によつてアミン反応性
基を有するラテツクス重合体粒子と反応させるこ
とができる。しかしながら時としてコンジユゲー
トとも呼ばれるこのアナライト−リンカー生成物
は従来技術のアナライト−蛋白質コンジユゲート
の場合よりも一層アルカリ性のPH値で重合体粒子
にカツプリングさせることができる。往々にして
この自由度は粒子表面とのコンジユゲートの反応
を改善する結果となる。 アナライトコンジユゲートによる重合体粒子の
表面被覆すなわち生物学的関心のある化合物に対
する重合体粒子の比は化学量論により、反応時間
によりそして不活性希釈剤による生物学的に関心
ある化合物の希釈により変動させることができ
る。完全な被覆は迅速な凝集速度を与えうるけれ
ども、アツセー感度上昇においては表面被覆のよ
り少ないことが重要でありうる。 本発明のポリエーテルポリアミンは次の実験式 Ｈ〔NHC2H3R（OC2H3R）xOC2H3R〕yNH2 〔式中ＲはＨ、CH3および出発グリコールの製
造法によつてＨとCH3との両方（例えば生成物が
プロピレンオキシド末端閉止されたポリエチレン
グリコールから導かれた場合）であることがで
き、そしてｘは０〜70でありそしてｙは１〜20で
ある〕を有している。好ましくはｘ＝１〜30、よ
り好ましくはｘ＝１〜15でありそしてある場合に
は最も好ましいものはｘ＝１〜２である。一方好
ましいのはｙ＝１〜10、最も好ましいのはｙ＝１
〜15である。Ｒ＝Ｈ（ポリエチレンエーテルポリ
アミン）の生成物はPEPAとして参照され、一方
Ｒ＝CH3（ポリプロピレンエーテルポリアミン）
の生成物はPPPAとして参照される。 前記式は便利さのために与えられているという
ことを理解すべきである。Ｒ＝CH3の場合には、
式中のＲ基の位置は一定されておらずこれは出発
原料たるグリコールまたは酸化物のタイプおよび
ポリエーテルポリアミンの製造に使用される反応
条件の性質に応じて、近隣の炭素原子のどちらか
に存在させることができる。 本発明に使用されるポリエーテルポリアミンは
アンモニアを例えばグリコールのヒドロキシル数
から計算して150〜3000（Ｒ＝Ｈ）の範囲の数平均
分子量（o）を有する適当なポリアルキレンエ
ーテルグリコールのジ（ｐ−トルエンスルホネー
ト）エステル（本明細書では以後「ジトシレート
エステル」と称する）と反応させることにより製
造される。化学量論、溶媒および反応条件は反応
の初期段階においてトシレート基をアンモニアで
置換することによつて形成される第１級アミンが
それ自体追加のトシレート基の置換に競争しうる
ものであつて縮合重合を与えて所望の生成物を与
えるように選ばれる。得られるポリエーテルポリ
アミンは純粋化合物として使用することができる
しまたは反応中に生成されるオリゴマー混合物と
して使用することができる。更にポリエーテルポ
リアミン中のポリエーテル鎖セグメントはｘが単
一の独立した値を有している単分散でありうるし
またはそれらはｘが全体的平均鎖長を意味してい
る多分散でもありうる。 アンモニア−ジトシレートエステル反応に対す
る好ましい溶媒は純粋の無水で阻害剤不含のテト
ラヒドロフラン（THF）である。反応は好まし
くは100℃で４時間、シールしたステンレススチ
ール反応器中で自己発生圧力下に実施される。副
生成物たるアンモニウムトシレートはTHFに不
溶でありそしてこれは冷反応混合物の過により
除去される。 ｙ値により与えられる、そして表の式中の
（Ｓ−NH）の後の下に書いた文字により示され
ている縮合重合度は、アンモニア対ジトシレート
エステルの比率によりそして反応成分の濃度によ
り制御される。オリゴマー生成物は酸滴定により
測定される総塩基性窒素含量により特性づけるこ
とができる。表Ａはポリエチレンエーテルグリ
コールのo（PEG、ヒドロキシル数値より計算）
のまたはoから計算されるｘの函数としての必
要なジトシレートエステルが導かれ特定のポリエ
ーテルアミンオリゴマーの理論的窒素含量を示
す。一方表Ｂは単分散PEGs（ｓは適当なポリ
エチレンエーテルセグメントを表わす）に基いた
同様のデータを示す。
試薬、そしてより特定的には生物学的に関心ある
化合物のラテツクス粒子への結合のための親水性
重合体結合基を有するそのような試薬に関する。 〔発明の技術的背景〕 凝集（アグルチネーシヨン）反応は長い間、広
汎な種々の細菌、細胞表面抗原、血清蛋白質およ
び臨床的関心のあるその他のアナライトの視覚的
（半定量的）および定量的アツセーに使用されて
きた。二価抗体と関心ある多価抗原との反応から
凝集が生じて凝集塊が生成する。これを種々の方
法で検出および／または測定することができる。
同様に、同一の反応は相当する抗原の添加により
生ぜしめられる凝集反応により特異抗体の検出に
対して使用することができる。 一般に大形の交叉結合集塊（アグレゲート）を
生成させるためには抗原上の反応部位の数は少く
とも２でなくてはならない。一価ハプテンの検出
が所望されている場合には、反応スキームは以下
のように修正されなくてはならない。すなわち多
価形態の抗原例えばハプテン−蛋白質コンジユゲ
ートを生成させそして試料中に存在する遊離ハプ
テンを抗体の利用可能結合部位に対してこの多価
形態のものと競争させ、それによつて凝集量を減
少せしめる。この技術は凝集阻害と呼ばれてい
る。 多価形態のハプテン製造は当技術分野では古い
ものである。往々にしてハプテンを免疫源の製造
において実施されるように担体蛋白質に結合させ
る。反応の化学量論性は蛋白質１分子当り３また
はそれ以上のハプテンを加えるように調整され
る。正確な数はその物質の利用される特定のアツ
セーの要求により決定される。 凝集またはその阻害の視覚的または機器的測定
のための感度増大は担体として可溶性蛋白質また
は蛋白質コンジユゲートではなく粒子試薬を使用
することにより達成させることができる。例えば
ニワトリ卵アルブミンに対する抗血清はニワトリ
卵アルブミン自体を沈降させる場合よりも、コロ
イド粒子上にコーテイングさせたニワトリ卵アル
ブミン沈降の場合において2000倍感度が高い
〔H.N.Eisen氏著「Immunology」第394頁（1974
年）参照〕。 抗体粒子試薬もまた知られている。そのような
試薬の製造に対する一般的方法は、適当な吸着剤
の表面に抗体を吸着させることである。ポリスチ
レンベースのラテツクス粒子がこの目的に対して
広く使用されている。しかしこれら試薬は保存ま
たは使用の間に脱着を生じて試薬の性質の変動を
招来しやすい。これは次いでアツセー感度および
再現性に悪影響を与えうる。 この脱着の問題を克服するために粒子表面に生
物学的関心のある化合物を共有結合的に結合させ
ることによつて粒子試薬を製造することができ
る。ポリスチレン重合体を変性して共有結合蛋白
結合を生成させうる官能基を包含せしめる。米国
特許第4064080号明細書は末端アミノフエニル基
を有し且つそれに蛋白質を結合せしめたスチレン
重合体を開示している。米国特許第4181636号明
細書は水溶性活性剤によつて免疫学的に活性な物
質にカツプリングせしめたカルボキシル化ラテツ
クス重合体およびそれらの凝集試験における診断
試薬としての使用を開示している。米国特許第
4210723号明細書は粒子表面に遊離エポキシ基を
有する直径0.15〜1.5μｍのシエル−コア（殻−
芯）ラテツクス重合体粒子およびこれらエポキシ
基を介しての蛋白質のカツプリングを記載してい
る。 以後の免疫学的活性物質の結合のためにその他
の重合体系も開発された。米国特許第4264766号
明細書は0.01〜0.9μｍの粒子サイズを有しそして
カルボキシルおよびアミノ基のような活性基を有
しそしてこれに水溶性多価ヒドロキシ化合物を共
有結合的に結合させることのできるラテツクス重
合体を開示している。活性化剤例えばカルボジイ
ミドの使用によつて、免疫学的活性な物質はラテ
ツクス粒子／多価ヒドロキシ化合物担体に結合さ
れて診断的に有用な試薬を生成する。 米国特許出願第315922号明細書は、内部コアが
光散乱測定に対して高い感度を与えるような高い
屈折率を有しており、そして外側シエルが生物学
的関心ある化合物を直接かまたは蛋白性物質を介
して結合させうる官能基を含有しているシエル−
コア重合体粒子を開示している。 通常、生物学的関心のある低分子量化合物（ア
ナライト）はラテツクス粒子に直接は結合されな
い。この理由はそのような粒子試薬は往往にして
適当な抗体と混合した場合良好には凝集せず、ま
たはそれらは粒子表面への共有結合的に適当な官
能基に次けているからである。これらの問題を克
服するためにアナライトを通常はブリツジまたは
スペーサー成分を介して粒子に結合される。 最も一般的に使用されるスペーサーは蛋白質ま
たは糖蛋白質例えばアルブミンである。人血清ア
ルブミン（HSA）はアナライトおよび粒子表面
両者上のアミノ反応性基とのカツプリングにおい
て使用できるアミノ基を多量に有する水溶性蛋白
質である。 アナライト−蛋白コンジユゲートから製造され
る粒子試薬は一般に大なる有用性を示すけれど
も、それらの使用に関してはいくらかの不利点が
なお存在している。蛋白質の溶解性および安定特
性はアナライト−蛋白質コンジユゲートの形成お
よびそれの粒子への結合に対して使用しうる化学
的手段を限定している。蛋白質は極端な温度およ
びPHにより変性され、そして往々にしてこれは有
機溶媒には不溶である。更に親水性蛋白質でさえ
も疎水性部分を有しており、この中に疎水性アナ
ライトが埋没されうる。粒子試薬の長期保存は蛋
白質の加水分解、酸化、コンホメーシヨン変化、
および微生物的分解を生ぜしめうる。最後に、蛋
白質スペーサーは抗アナライト抗体により認識さ
れる抗原決定基を含有しうるのであり、これはア
ツセーにおける非特異的凝集の結果となる。 臨床的診断での使用のための粒子試薬の製造に
利用しうる親水性で化学的に良好に定義された結
合基に対する要求が存在している。 〔発明の概要〕 本発明の粒子試薬は (A) ナトリウムＤ線の波長で測定して1.54以上の
屈折率を有する重合体である「内側コア」およ
び (1) エポキシ、カルボキシおよびアルデヒドよ
りなる群から選ばれた親水性重合体リンカー
と反応しうる官能基を有するエチレン性不飽
和単量体、 (2) 場合により重合体粒子を実質的に水不溶性
とするに充分な量のその他のエチレン性不飽
和単量体、および (3) 外側シエルの10重量部を越えない内側コア
の単量体 の重合体であつて前記内側コアの存在下の重合に
より形成された「外側シエル」 を有しそして大約0.03〜0.1μｍの直径範囲を有し
ている重合体粒子、および (B) 実験式 Ｈ〔NHC2H3R（OC2H3R）xOC2H3R〕yNH2 （式中ＲはＨおよび／またはCH3であり、ｘ
は０〜70でありそしてｙは１〜20である）の親
水性重合体リンカーを介して前記重合体粒子と
共有結合的に結合されている生物学的関心のあ
る化合物 から本質的に構成されている。 生物学的関心のある化合物を測定するための、
本発明の方法は (A) 下記(1)、(2)および(3)すなわち (1) (a) ナトリウムＤ線の波長で測定して1.54
以上の屈折率を有する重合体である内側コ
アおよび (i) エポキシ、カルボキシおよびアルデヒ
ドよりなる群から選ばれた親水性重合体
リンカーと反応しうる官能基を有するエ
チレン性不飽和単量体、 (ii) 場合によりその粒子を実質的に水不溶
性とするに充分な量のその他のエチレン
性不飽和単量体、および (iii) 外側シエルの10重量部を越えない内側
コアの単量体 の重合体であつてしかも前記内側コアの存在下の
重合により形成された外側シエルを有しそして大
約0.03〜0.1μｍの直径範囲を有している重合体粒
子、そして (b) 実験式 Ｈ〔NHC2H3R（OC2H3R）xOC2H3R〕y
NH2 （式中ＲはＨおよびまたはCH3であり、
ｘは０〜70でありそしてｙは１〜20であ
る）の前記親水性重合体リンカーによつて
前記重合体粒子と共有結合的に結合された
生物学的に関心ある化合物 から本質的になる高屈折率を有する粒子試薬、 (2) 生物学的関心ある化合物を含有すると考え
られる液体、および (3) 凝集剤 を培養し、そして (B) 光学的に凝集から生じた増大された粒子サイ
ズを測定する 各段階を包含している。 本発明のポリエーテル−ポリアミン親水性リン
カーは水および多くの有機溶媒に可溶であり、化
学的および熱的に安定であり、そして微生物分解
に対して抵抗性であり、抗蛋白質または抗（ハプ
テン−担体コンジユゲート）抗体と免疫学的に交
叉反応性でなく、そして疎水性部分を有していな
い。結合剤としての蛋白質に対するそれらの置き
換えはまた、粒子ベースアツセーの精度の改善、
所望のシグナル水準の達成に要求される抗体量の
低減およびポリエチレンエーテルグリコール
（PEG）のこのアツセーの依存性の減少のような
予期せざる利点を有している。 〔発明の詳細な開示〕 本発明は生物学的関心のある化合物（アナライ
ト）を高屈折率ラテツクス重合体粒子に親水性重
合体結合剤を介して結合せしめた比濁イムノアツ
セーに使用するための改善された粒子試薬の製造
に関する。 この粒子試薬は、 (1) 高い屈折率のコア物質から形成させることに
より、 (2) ポリエーテル・ポリアミン親水性リンカーに
共有結合的に結合しうるシエル物質を含有させ
ることにより、そして (3) イムノアツセーにおける至適感度のための小
粒子サイズのものであることによつてイムノア
ツセーの感度を最大とするようにデザインされ
ている。結合剤は水性および有機溶媒に可溶性
であり、化学的および熱的に安定であり、化学
的に良好に定義されておりすなわち再現性可能
であり、そしてアナライトおよび粒子表面両方
のアミン反応性基に共有結合的に結合しうるよ
うにデザインされている。 粒子懸濁液の光散乱性はいくつかの変数に依存
するが最も重要なものは粒子サイズ、コアおよび
懸濁媒体の屈折率、および測定に使用される光の
波長である。すなわちコア材料、粒子サイズおよ
び凝集反応の検出波長の選択はすべてアツセー感
度の至適化に対して重要なフアクターである。こ
れらのフアクターは使用される光散乱検出手段の
タイプにより決定されうる。 ある測定波長における粒子サイズ変化の濁度検
出に対しては、粒子サイズおよび屈折率を注意し
て選ぶことが必要である。その理由は濁度計シグ
ナルは最大値を経てピークにおいてほとんどまた
は全く感度のない二重値反応を示すからである。
それに加えて、勾配感度はピークの小粒子サイズ
側では大粒子サイズ側よりも大であり、そしてそ
れは粒子の媒体に対する屈折率比の増大と共に上
昇する。 これらの理由の故に、高い屈折率の小形粒子お
よび短い波長の検出系が最大感度に対しては好ま
しい。蛋白質およびその他の成分による光吸収の
故に、血清中の試料の測定に対しては紫外線領域
では実際的制限が存在している。すなわち便利な
波長は約320nm以上のものである。より長い波長
を使用しうるが感度はより低い。小形粒子すなわ
ち約0.1μｍ以下の直径を有するものが増大した勾
配感度およびより迅速な反応速度の両方の故に好
ましい。安定性および合成上の便利さの理由から
約0.03μｍ以上の粒子サイズが好ましい。一般に
0.03〜0.1μｍの粒子サイズ範囲を本発明の粒子試
薬中で使用することができる。 いくつかの異つた光散乱測定法例えば比濁法
（ネフロメトリー）、粒子計算、準弾性
（quasielastic）光散乱、自動相関分光分析および
粒子の非対称性または極性の測定を使用しうる。
本発明の粒子試薬を使用した免疫反応の測定の好
ましい方法は濁度によるものである。その理由は
臨床実験室では一般に使用可能な分光光度計以外
の特別の装置を必要としないからである。分光光
度計は凝集反応により形成された粒子集塊に由来
するみかけの吸収上昇を記録する。これら集塊は
光学ビームの外に光を散乱させ、すなわち検出装
置に達する光の量を減少させる。実際にはみかけ
の吸収はアナライトにより生ぜしめられた凝集阻
害の逆の尺度である。凝集の間に生ずる濁度変化
を至適化させるためには粒子サイズを注意して選
ぶことが重要である。 凝集反応の間に有効粒子サイズは上昇する。従
つて高感度測定のためには、ある与えられた粒子
サイズ変化に対するシグナル変化が至適となるよ
うな波長を選択することが重要である。 凝集反応の濁度検出に対する屈折率の重要性の
故に、コア物質は所望のアツセー感度に対して許
容しうるシグナル変化を生成するようなものに限
定される。すなわち高い芳香性および高い原子量
の置換基を有するコア重合体が脂肪族重合体より
も好ましく、そして一般に高い屈折率の重合体が
低い屈折率の重合体に比べて好ましい。 重合体粒子の内側コアは高い屈折率を有する大
なる物質群から選ぶことができる。好ましいのは
最終粒子サイズが制御可能でありそして実質的に
均一となるように乳化重合により製造することの
できる物質である。重合体粒子の内側コア中に使
用される典型的重合体は1.54以上（Na Ｄ線
569nmにおいて）の屈折率を有している。屈折率
は波長の函数なのであるから、散乱性は測定の波
長に依存する。一般に屈折率はより短い波長にお
いてより大である。コア重合体は濁度測定用に選
ばれた波長の光を吸収してはならないことが理解
されている。 内側コアの製造に対して関心ある単量体は高い
屈折性を付与する置換基例えばハライド、芳香族
基、複素環状基、不飽和基または炭素環状基に加
えてビニルまたはアリル基を含有するものであ
る。 本発明の粒子試薬の製造に有用な重合体粒子は
主として乳化重合により製造することができる。
段階的乳化重合はnD＝1.54以上の所望の屈折率
に近いコア／シエル重合体を導き得る。所望の屈
折率の重合体を得るためには、シエル重合体が重
合体粒子の約10重量部を越えないことが好まし
い。 重合体粒子の粒子サイズ制御のための便利な方
法は、最初に使用される表面活性剤の量によりそ
の粒子サイズが制御しうるような種子乳剤を製造
することである。種子乳剤の製造後、追加の単量
体および表面活性剤を制御された速度で加えて種
子乳剤中の粒子サイズを上昇させることができ
る。 重合体粒子の外側シエル重合体は結合させるべ
き親水性結合基と反応しうる官能基を有する広範
囲なエチレン性不飽和単量体から製造することが
できる。場合により、外側シエルはまた内側コア
の製造に使用された単量体を含むその他のエチレ
ン性不飽和単量体をも含有しうる。コアに対する
シエル重合体の結合は、コア重合体中の残存エチ
レン性不飽和基への官能性単量体のグラフト重合
によつて達成できるし、または官能性単量体をコ
アのまわりで重合させて隣接シエルを生成させる
ことができる。好ましい単量体としては、エポキ
シ基を含有するもの、例えばグリシジルメタアク
リレート、グリシジルアクリレート、ビニルグリ
シジルエーテルおよびメタアリルグリシジルエー
テルがあげられる。その他の官能基としてはカル
ボキシルおよびアルデヒドがあげられる。 コア単量体の変換を実質的完了まで実施して、
シエル重合体が未知の組成の共重合体でなく、ホ
モ重合体または既知の組成の共重合体となるよう
にすることが好ましい。98％以上の変換はコア乳
剤の温度を重合の終りに約95℃まで上昇させるこ
とによつて達成できる。その表面が未知の組成の
共重合体である粒子が生成する確率を更に低下さ
せるために、シエル単量体をバツチ的ではなく
徐々に加えることができる。そのような方法にお
いては、残存コア単量体はシエル重合体形成の初
期の間に消費されうる。使用される単量体がエポ
キシ基を含有するものである場合には、シエル重
合体がホモ重合体であることが好ましい。しかし
実際問題として外側シエルの10重量部までの内側
コアの単量体を存在させることができる。 シエル単量体がアルデヒドまたはカルボン酸基
を含有する場合には、水溶性重合体の形成を避け
るように注意が払われなくてはならない。すなわ
ち例えばアクロレインまたはメタクリル酸を単独
で使用してホモ重合体シエル構造を生成させるこ
とはできない。しかしながらそれらを水不溶性重
合体粒子を生成させるようなその他の単量体と共
重合させることはできる。 外側シエルは好ましくはホモ重合体であるがし
かしこれは外側シエルの10重量部以下、好ましく
は５重量部以下、そして更により好ましくは２重
量部以下の内側コア単量体を含有しうる。これら
単量体は内側コアの重合からの残存単量体であり
うるしまたはいずれかのその他の適当なエチレン
性不飽和単量体でありうる。 粒子試薬は数種の異つた官能性シエル物質を含
有しうる。好ましいのはエポキシ基を含有するも
のであり、これは親水性重合体結合剤による生物
学的関心ある化合物の共有結合的結合に便利には
使用されうる。このようにして形成された粒子試
薬が本発明の主題である。 親水性重合体リンカーによつて共有結合的に結
合された生物学的に関心ある化合物（アナライ
ト）を含有する粒子試薬の製造に対しては、２つ
の方法が存在しうる。リンカーを最初に重合体粒
子に結合させ、そして生物学的に関心ある化合物
またはアナライトの適当な誘導体を次いでリンカ
ーに結合させることができる。適当な誘導体は比
較的穏和な条件下に水性媒体中でアミンと反応し
うる官能基例えばエポキシド、アルデヒドおよび
カルボキシル基を含有するものである。アナライ
ト誘導体中の官能基はラテツクス重合体粒子シエ
ル中に存在するものと同じかまたは異つたもので
ありうる。すなわち誘導体および粒子シエルが共
にカルボキシル基を含有していることができる
し、または誘導体がカルボキシル基を含有しそし
て粒子シエルがエポキシド基を含有していること
もできる。結合剤として屡々使用される蛋白質に
対する本発明のポリエーテルポリアミンの置換は
通常の方法からの顕著な逸脱は要しない。この方
法の限界はすべての段階が必ず実質的に水性の環
境中で実施されるということである。 あるいはまた、生物学的関心ある化合物または
その適当な誘導体を最初に親水性リンカーに結合
させ、次いでこの生成物を粒子に結合させる。必
要な場合には、アナライト誘導体とポリエーテル
ポリアミンリンカーとの反応は厳しい条件下に任
意の適当な溶媒中で実施することができる。その
理由はポリエーテルアミンは多くの有機溶媒に可
溶性であり、酸化的および熱的に安定であり、そ
して酸または塩基触媒によつて容易には分解され
ないからである。すなわち水性媒体中での使用に
不適当なアナライト誘導体をここでは使用しう
る。例えば酸ハライド、酸無水物、アリルハライ
ド、α−ハロケトン、スルホニルハライドまたは
スルホネートエステル基を含有するアナライト誘
導体を使用してアナライト−リンカー生成物を生
成させることができる。これを次いで水性媒体中
で当技術分野で周知の方法によつてアミン反応性
基を有するラテツクス重合体粒子と反応させるこ
とができる。しかしながら時としてコンジユゲー
トとも呼ばれるこのアナライト−リンカー生成物
は従来技術のアナライト−蛋白質コンジユゲート
の場合よりも一層アルカリ性のPH値で重合体粒子
にカツプリングさせることができる。往々にして
この自由度は粒子表面とのコンジユゲートの反応
を改善する結果となる。 アナライトコンジユゲートによる重合体粒子の
表面被覆すなわち生物学的関心のある化合物に対
する重合体粒子の比は化学量論により、反応時間
によりそして不活性希釈剤による生物学的に関心
ある化合物の希釈により変動させることができ
る。完全な被覆は迅速な凝集速度を与えうるけれ
ども、アツセー感度上昇においては表面被覆のよ
り少ないことが重要でありうる。 本発明のポリエーテルポリアミンは次の実験式 Ｈ〔NHC2H3R（OC2H3R）xOC2H3R〕yNH2 〔式中ＲはＨ、CH3および出発グリコールの製
造法によつてＨとCH3との両方（例えば生成物が
プロピレンオキシド末端閉止されたポリエチレン
グリコールから導かれた場合）であることがで
き、そしてｘは０〜70でありそしてｙは１〜20で
ある〕を有している。好ましくはｘ＝１〜30、よ
り好ましくはｘ＝１〜15でありそしてある場合に
は最も好ましいものはｘ＝１〜２である。一方好
ましいのはｙ＝１〜10、最も好ましいのはｙ＝１
〜15である。Ｒ＝Ｈ（ポリエチレンエーテルポリ
アミン）の生成物はPEPAとして参照され、一方
Ｒ＝CH3（ポリプロピレンエーテルポリアミン）
の生成物はPPPAとして参照される。 前記式は便利さのために与えられているという
ことを理解すべきである。Ｒ＝CH3の場合には、
式中のＲ基の位置は一定されておらずこれは出発
原料たるグリコールまたは酸化物のタイプおよび
ポリエーテルポリアミンの製造に使用される反応
条件の性質に応じて、近隣の炭素原子のどちらか
に存在させることができる。 本発明に使用されるポリエーテルポリアミンは
アンモニアを例えばグリコールのヒドロキシル数
から計算して150〜3000（Ｒ＝Ｈ）の範囲の数平均
分子量（o）を有する適当なポリアルキレンエ
ーテルグリコールのジ（ｐ−トルエンスルホネー
ト）エステル（本明細書では以後「ジトシレート
エステル」と称する）と反応させることにより製
造される。化学量論、溶媒および反応条件は反応
の初期段階においてトシレート基をアンモニアで
置換することによつて形成される第１級アミンが
それ自体追加のトシレート基の置換に競争しうる
ものであつて縮合重合を与えて所望の生成物を与
えるように選ばれる。得られるポリエーテルポリ
アミンは純粋化合物として使用することができる
しまたは反応中に生成されるオリゴマー混合物と
して使用することができる。更にポリエーテルポ
リアミン中のポリエーテル鎖セグメントはｘが単
一の独立した値を有している単分散でありうるし
またはそれらはｘが全体的平均鎖長を意味してい
る多分散でもありうる。 アンモニア−ジトシレートエステル反応に対す
る好ましい溶媒は純粋の無水で阻害剤不含のテト
ラヒドロフラン（THF）である。反応は好まし
くは100℃で４時間、シールしたステンレススチ
ール反応器中で自己発生圧力下に実施される。副
生成物たるアンモニウムトシレートはTHFに不
溶でありそしてこれは冷反応混合物の過により
除去される。 ｙ値により与えられる、そして表の式中の
（Ｓ−NH）の後の下に書いた文字により示され
ている縮合重合度は、アンモニア対ジトシレート
エステルの比率によりそして反応成分の濃度によ
り制御される。オリゴマー生成物は酸滴定により
測定される総塩基性窒素含量により特性づけるこ
とができる。表Ａはポリエチレンエーテルグリ
コールのo（PEG、ヒドロキシル数値より計算）
のまたはoから計算されるｘの函数としての必
要なジトシレートエステルが導かれ特定のポリエ
ーテルアミンオリゴマーの理論的窒素含量を示
す。一方表Ｂは単分散PEGs（ｓは適当なポリ
エチレンエーテルセグメントを表わす）に基いた
同様のデータを示す。
【表】
【表】
表はそれぞれ200および595のoを有するポ
リエチレンエーテルグリコールから導かれたオリ
ゴマー混合物に対する窒素含量の実際に得られた
値を示す（すべての場合成分を100℃で自己発生
圧力下に４時間一緒に加熱させた）。表の値は
オリゴマーの複雑な混合物の平均窒素含量を表わ
しているけれども、アンモニア／ジトシレート比
の減少およびジトシレート濃度の上昇は縮合重合
過程に対して好ましいことが明白である。生成物
の物理的性質はこれを反映している。例えば生成
物の粘度はＤからＧにいくにつれて実質的に上昇
することが見出された。室温においてＤは粘稠な
液体でありそしてＧはワツクス様固体である。
リエチレンエーテルグリコールから導かれたオリ
ゴマー混合物に対する窒素含量の実際に得られた
値を示す（すべての場合成分を100℃で自己発生
圧力下に４時間一緒に加熱させた）。表の値は
オリゴマーの複雑な混合物の平均窒素含量を表わ
しているけれども、アンモニア／ジトシレート比
の減少およびジトシレート濃度の上昇は縮合重合
過程に対して好ましいことが明白である。生成物
の物理的性質はこれを反映している。例えば生成
物の粘度はＤからＧにいくにつれて実質的に上昇
することが見出された。室温においてＤは粘稠な
液体でありそしてＧはワツクス様固体である。
【表】
前記のポリエチレンエーテルポリアミンはポリ
エチレンエーテルジトシレートから合成されるが
これ自体は適当なポリエチレンエーテルグリコー
ルからｐ−トルエンスルホニルクロリド（トシル
クロリド）との酸受容体存在下での反応によつて
合成される。好ましい酸受容体は第３級アミンで
ある。 「J.Chem.Soc.（London）」第1322〜1325頁
（1958年）は「Org.Synth.」総集編第３巻第366〜
367頁（1955年）記載の方法の変形を使用してト
リエチレンエーテルジトシレートおよびテトラエ
チレンジトシレートを合成している。この方法は
酸受容体および溶媒の両方としてピリジンを使用
しており、そしてこれを非常に高い濃度で存在さ
せている。前記方法により合成されたジトシレー
トエステルから製造されたポリエーテルポリアミ
ンは、本発明の粒子試薬の製造に使用された場
合、種々の比濁イムノアツセーでは良好に機能し
ない粒子試薬を与えた。この理由は種々の副反応
を招来しそしてジトシレートエステル量を実質的
に減少させてしまう高濃度のピリジンの存在によ
ると信じられる。 本発明に使用されるポリエチレンエーテルジト
シレートの合成のための好ましい方法では溶媒と
してメチレンクロリドを使用し、そして酸受容体
としてトリエチルアミンを使用する。生成物から
過剰のトリエチルアミンを除去することに対して
は特別の注意が払われる。これらジトシレートか
ら生成されるポリエーテルポリアミンは比濁イム
ノアツセーにおいて良好に機能する粒子試薬を生
成する。 ある種のPPPA生成物はテキサコ・ケミカル社
からジエフアミン（Jeffamine）の商品名で市場
的に入手可能である。 ポリエーテルポリアミンを使用して製造される
粒子試薬を更にバツフイー、血清成分および表面
活性剤を含有しうる実質的に水性の媒体中に懸濁
させて光散乱イムノアツセーに使用するための単
分散粒子試薬を生成させることができる。 本発明は更に生物学的に関心ある成分の測定の
ための高感度光散乱イムノアツセーに使用するた
めの免疫学的に活性な安定な粒子試薬に関する。
アツセーのタイプとしては免疫学的対応反応成分
を生成させうる生物流体、細胞および組織抽出液
中の広汎な種々の物質があげられる。生物学的関
心のある化合物としては血清、血漿、唾液、尿ま
たは乳蛋白質、薬物、ビタミン、ホルモン、酵
素、抗体、多糖体、細菌、プロトゾア、真菌、ビ
ールス、細胞および組織抗原およびその他の血液
細胞または血液流体物質があげられる。 イムノアツセーはアナライトのタイプおよび要
求される感度によつて種々の方法でデザインする
ことができる。 比較的高温度のアナライト例えば血清蛋白に対
しては、適当な抗体粒子試薬を直接粒子強化比濁
免疫沈降アツセーに使用することができる。本発
明の方法は通常の免疫沈降技術に比べて上昇した
検出性を与え、試薬コストを低下させ、そしてよ
り少量の患者試料容量の使用を可能ならしめる。
逆に関心ある循環抗体の検出のためには、対応反
応性抗原または抗体粒子試薬を直接アツセーで使
用することができる。いずれの場合にも抗原また
は抗体はポリエーテルポリアミン結合剤によつて
粒子上に共有結合的に結合されている。 本発明の阻害イムノアツセー法はまた粒子試薬
の他に以後「凝集剤」と呼ばれる粒子試薬の凝集
を生ぜしめる二官能性または多官能性の薬剤を要
求する。生物学的関心ある化合物により阻害され
うるのはこの凝集である。この凝集剤は生物学的
に関心ある化合物に対する抗体でありうるし、ま
たは前述したようにポリエーテルポリアミンによ
つて生物学的に関心ある化合物に対する抗体に共
有結合的に結合された重合体粒子に基く粒子試薬
でありうる。 凝集剤はまた生物学的に関心ある化合物とポリ
エーテルポリアミンとの多価コンジユゲートであ
りうる。そのようなコンジユゲートは本発明の方
法で使用される粒子試薬が生物学的関心ある化合
物に対する共有結合的に結合した抗体を含有して
いる場合に使用することができる。 数種の異つたアツセー構造をアナライト測定に
使用することができる。一つのそのような構造に
おいては、抗原粒子試薬はアナライトまたは適当
なアナライトの誘導体、ポリエーテルポリアミン
および重合体粒子から製造され、そしてこれら粒
子の遊離アナライトによる抗体との反応の阻害は
測定される。反応は粒子試薬とアナライトとの間
の抗体に対する直接的競争により、またはアナラ
イトを最初に過剰の抗体と反応させ次いで抗原粒
子試薬を加えて過剰の抗体と反応させる一連反応
により実施しうる。 その他のアツセー構造においては同一または異
つたサイズの抗体と抗原粒子試薬との両者を存在
させることができ、そしてアナライトによる阻害
を競争的または連続様式で実施させることができ
る。抗体または抗原粒子試薬のどちらかまたは両
方がポリエーテルポリアミン結合剤を使用しう
る。 本発明の粒子強化比濁イムノアツセーは一般に
は水性のバツフアー化媒体中で実施されるがこれ
は更に表面活性剤、保存剤およびポリエチレング
リコールを含有しうる。ある場合には、それはま
た血清阻害を減少させるために還元剤例えばジチ
オエリスリトール（DTE）を含有させるのが望
ましいであろう。このアツセーは手作業で実施し
うるしまたはそれは種々の自動化または半自動化
装置に適応させることができる。 本発明のアツセーをその他の粒子強化比濁アツ
セー例えばアナライトと粒子との間の結合剤とし
てHSAを使用した米国特許出願第315922号明細
書記載のものと比較した場合、いくつかの予期せ
ざる利点がポリエーテルポリアミンリンカーの使
用から生ずる。 そのような利点の一つは、アツセーの抗体要求
が約10倍少なくなることである。往々にして抗体
は製造が困難でありかつ費用がかかるので、ある
与えられたシグナル水準の達成に要求される量の
この減少は有意のコスト節約を意味しうる。その
他の利点は同一シグナル水準の達成のためにアツ
セー中に要求されるPEG量が大約２のフアクタ
ーだけ減少することである。実際に要求される
PEG濃度はポリエーテルポリアミンリンカーの
鎖長によつて変動する。大約選ばれたポリエーテ
ルポリアミンはPEG量を減少させ、そして試薬
量が限定されている多くの自動化臨床分析装置へ
のアツセーの適応を単純化する。 アツセーに要求される抗体の量と要求される
PEG量との間には相関的関係が存在している。
抗体要求のそれ以上の減少は、アツセー中の
PEG量の上昇によつて達成させることができる。
ポリエーテルポリアミンリンカーの使用がPEG
要求の減少を招来するので若干のそのような上昇
はここでは受容されうる。 全く予期せざるそして驚くべきその他の利点は
ポリエーテルポリアミン（PEPA）リンカーが使
用された場合、HSAリンカーを有する粒子試薬
を使用するアツセーに比べて、アツセー精度にお
いて約４倍の改善が達成されることである。蛋白
質リンカーに比べた場合の合成リンカーの使用か
ら得られる精度のそのような改善は高度に重要で
ある。その理由は変動係数により測定した場合の
良好な精度はすべてのイムノアツセーの成功に対
して本質的である。 本発明を説明する以下の例においては、すべて
の部は特記されていない限りは重量基準である。 例 １ テオフイリンアツセー (A) ポリエチレンエーテルグリコールのジトシレ
ートエステルの合成 機械的撹拌機、温度計、添加斗および乾燥窒
素雰囲気を保持させる系を付した３容三頚フラ
スコを氷水浴中で冷却させそして乾燥窒素で置換
させた。この系は反応全体にわたつてわずかに窒
素陽圧に保持されていた。トシルクロリド
（343.2ｇ、1.8モル）をフラスコ中に入れ、次い
で1200mlのメチレンクロリドを加えた。わずかに
吸熱的な溶解の後、ポリエチレンエーテルグリコ
ール〔シグマ・ケミカル社製品、150.0ｇ、0.750
モル、o＝200（ヒドロキシル数による）〕を速や
かに加え、そして容器を150mlのメチレンクロリ
ドで洗つた。トリエチルアミン（191.2ｇ、1.89
モル）を次いでその温度を15〜18℃に保ちつつ１
時間かけて滴加した。トリエチルアミン容器およ
び添加斗を150mlのメチレンクロリドで洗つた。
反応混合物をその日の残りの間15〜20℃で撹拌し
そして同一温度に一晩放置した。トリエチルアミ
ン塩酸塩はこの反応の過程全体にわたつて沈殿し
た。 反応の開始後約24時間でこの混合物を氷浴中で
冷却させ、１時間撹拌してすべての追加のトリエ
チルアミン塩酸塩を分離させ、そして冷却された
フイルターフラスコ中に過した。液を第一に
塩酸の冷却溶液（500ml水中32ml濃HCl）次いで
500ml区分量の冷水で２回抽出した。メチレンク
ロリド溶液を無水硫酸ナトリウム（250ｇ）上で
乾燥させ、溶液を乾燥剤から傾瀉させそしてメチ
レンクロリドをフラツシユエバポレーター（生成
物の温度は決して35℃以上にはさせない）中で蒸
発させた。すべての痕跡量のメチレンクロリドの
除去を確実ならしめるために、残渣を無水の阻害
剤不含テトラヒドロフラン200mlに溶解させ、そ
して次いで溶媒を同一条件下にフラツシユエバポ
レーター中で除去させた。 (B) ポリエーテルポリアミン（PEPA）の製造 前記(A)からのポリエチレンエーテルジトシレー
ト228ｇを1500mlの純無水阻害剤不含テトラヒド
ロフランに溶解させ、そしてこの溶液をステンレ
ススチールのオートクレーブ中に入れた。このオ
ートクレーブをシールし、そして無水アンモニア
（600ｇ）をポンプで汲み入れた。この撹拌混合物
を100℃に加熱し、そしてこの温度に自己発生圧
力下に４時間保持した。オートクレーブを室温ま
で冷却させ、そして圧力を徐々に解放した。この
ポリエーテルポリアミン−THF溶液は残存トシ
ルクロリド〔(A)から〕とアンモニアとからの生成
物である結晶性アンモニウムトシレートおよび塩
化アンモニウムを含有していた。固体を過によ
り除去し、そしてTHFをフラツシユエバポレー
ター中で蒸発させた。残渣をその重量の４倍の冷
水に加えそしてこの混合物を約１時間水中で冷却
させた。パラトルエンスルホンアミドが多量の沈
殿として分離した。この混合物を過しそして最
初の残渣の重量の1/4に等しい量の活性炭（ダル
コＧ−60）を加えた。この水性混合物を時々撹拌
しつつ加熱沸騰させ、室温まで冷却させ、そして
次いでカーボンを除去するために珪藻土を通して
過させた。60〜70℃の浴温でフラツシユエバポ
レーター中で水を除去した。酸滴定により測定し
た残渣のアミン含量は6.8meq／ｇであり、これ
はｘ＝2.1およびｙ＝約４に相当する（表Ａ参
照）。 (C) テオフイリン−ポリエーテルポリアミンコン
ジユゲートの製造 Ｎ−エチル−N′−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）カルボジイミド塩酸塩（260ｇ）をジメチル
スルホキサイド（30ml）中の８−（３−カルボキ
シプロピル）−１，３−ジメチルキサンチン（ペ
ニンスラ・ラボラトリース社製品、340mg）の溶
液に加えた。そしてこの溶液を23℃で３時間撹拌
した。20mlのジメチルスルホキサイド中前記(B)か
らのポリエーテルポリアミン（1.13ｇ、7.7meqの
アミン）を加え、そして撹拌を23℃で更に18時間
つづけた。このようにして得られたコンジユゲー
ト溶液を４℃で保存した。 (D) テオフイリン−ポリエーテルポリアミン粒子
試薬の製造 前記(C)からのテオフイリン−PEPAコンジユゲ
ート溶液（27ml）を5mM燐酸ナトリウム（450
ml、PH8.0）および10％GAFAC RE−610（GAF
社より入手可能な陰イオン性表面活性剤を含有す
る0.15M燐酸バツフアー5.4mlと共に混合した。
0.2Mおよび0.02M水酸化ナトリウムの添加によ
つてPHを10.0〜10.1に調整した。米国特許出願第
315922号明細書の例４に記載のようにして製造さ
れたエポキシ官能性粒子含有重合体粒子ラテツク
ス（17％固体分、64.8ml）を次いで加えそしてこ
の混合物を２時間撹拌しつつ70℃に加熱した。 この反応混合物を冷却し、0.1％GAFAC RE−
610を含有する15mM燐酸バツフアー（PH7.0）
600mlを加え、そして６区分量で、16時間
8000rpmで遠心させた。上澄液を傾瀉させ、そし
て各ペレツトを0.1％GAFACを含有する15mM燐
酸バツフアー（200ml、PH7.0）中で超音波処理す
ることによつて再懸濁させ、再び13000rpmで6.5
時間遠心させ、上澄液を傾瀉させ、そして各ペレ
ツトを50mlの最終バツフアー（0.35％GAFACお
よび0.01％チメロサールを含有する15mMホスフ
エート）に再懸濁させた。各試料を３分間超音波
処理して単分散粒子懸濁液を生成させた。６個の
試料を一緒に混合して450mlの最終容量とし、そ
して0.8μフイルターに通した。 (E) アツセー アツセーは分析テストパツク（米国再交付特許
第29725号参照）中でaca〓クリニカルアナライ
ザー（デユポン社製品）上で実施された。０〜
40μｇ／mlの既知のテオフイリン濃度を含有する
プールされた人血清40μを自動的に機械の充填
ステーシヨンで試験パツクに注入させ、次いで
4.96mlの0.15M燐酸バツフアー（PH7.8）、1.3％最
終濃度を与えるPEG8000（65.0mg）、5.8mgのDTE、
0.05mlのGAFAC RE−610溶液（10％ｗ／ｖ、蒸
留水中）および0.06mlの前記(D)からの粒子試薬を
ブレーカー／ミキサーでパツクに加えた。３1/
２分後、2μの抗テオフイリン抗体（10mg／μ
HSA、1M NaCl、0.05MK2HPO4、0.1％
（ｗ／ｖ）NaN3および0.002％（ｗ／ｖ）チメロ
サールを含有する溶液（PH7.8）で１：24に希釈
を加えることによつてブレーカー／ミキサーで
反応を開始させた。この抗体は30／15と称される
テオフイリンに対するマウスモノクローン抗体
（ハイブリドーマセルラインから得られる、
ATCCの受理番号HB8152）であり、そしてこれ
は減菌過腹水として使用された。その製造はこ
こに参照として包含されている米国特許出願第
406554号明細書に記載されている。 粒子凝集の凾数としての濁りの変化速度を抗体
添加の29秒および46秒後の340nmにおける吸収の
差として記録した。データは以下の表に示され
ている。 表 テオフイリンによる濁りの阻害テオフイリン（μｇ／ml）
速度（340nmにおけるmA／分） ０ 220 2.5 186 5.0 148 10.0 87 20.0 43 40.0 18 例 ２ テオフイリン−HSA粒子試薬およびテオフイ
リン−PEPA粒子試薬を使用したアツセー性能
の比較 テオフイリン−HSA粒子試薬を使用した粒子
強化濁り阻害イムノアツセーを前記１(E)に記載の
ようにして実施したがただしこの場合試料サイズ
は20μであり、PEGの最終濃度は３％であり、
そして28μの未希釈抗体がブレーカー／ミキサ
ーで加えられた。 表ＡはHSAリンカーに対して本発明のポリ
エーテルポリアミンリンカーを使用して得られた
精度（μｇ／mlでの％C.V.、20パツクの平均）
を比較している。精度は本発明のリンカーの使用
によつてテオフイリン水準10μｇ／mlおよび20μ
／mlの両方で約４倍改善された。 表Ｂは異つた結合剤を使用したテオフイリン
アツセーにおける340nmの濁度の変化速度を比較
している。必要な抗体量の14倍の減少に加えて、
全シグナルおよび分離の両者はHSA粒子を使用
した場合よりも本発明の粒子試薬の使用の場合よ
り良好であつた。
エチレンエーテルジトシレートから合成されるが
これ自体は適当なポリエチレンエーテルグリコー
ルからｐ−トルエンスルホニルクロリド（トシル
クロリド）との酸受容体存在下での反応によつて
合成される。好ましい酸受容体は第３級アミンで
ある。 「J.Chem.Soc.（London）」第1322〜1325頁
（1958年）は「Org.Synth.」総集編第３巻第366〜
367頁（1955年）記載の方法の変形を使用してト
リエチレンエーテルジトシレートおよびテトラエ
チレンジトシレートを合成している。この方法は
酸受容体および溶媒の両方としてピリジンを使用
しており、そしてこれを非常に高い濃度で存在さ
せている。前記方法により合成されたジトシレー
トエステルから製造されたポリエーテルポリアミ
ンは、本発明の粒子試薬の製造に使用された場
合、種々の比濁イムノアツセーでは良好に機能し
ない粒子試薬を与えた。この理由は種々の副反応
を招来しそしてジトシレートエステル量を実質的
に減少させてしまう高濃度のピリジンの存在によ
ると信じられる。 本発明に使用されるポリエチレンエーテルジト
シレートの合成のための好ましい方法では溶媒と
してメチレンクロリドを使用し、そして酸受容体
としてトリエチルアミンを使用する。生成物から
過剰のトリエチルアミンを除去することに対して
は特別の注意が払われる。これらジトシレートか
ら生成されるポリエーテルポリアミンは比濁イム
ノアツセーにおいて良好に機能する粒子試薬を生
成する。 ある種のPPPA生成物はテキサコ・ケミカル社
からジエフアミン（Jeffamine）の商品名で市場
的に入手可能である。 ポリエーテルポリアミンを使用して製造される
粒子試薬を更にバツフイー、血清成分および表面
活性剤を含有しうる実質的に水性の媒体中に懸濁
させて光散乱イムノアツセーに使用するための単
分散粒子試薬を生成させることができる。 本発明は更に生物学的に関心ある成分の測定の
ための高感度光散乱イムノアツセーに使用するた
めの免疫学的に活性な安定な粒子試薬に関する。
アツセーのタイプとしては免疫学的対応反応成分
を生成させうる生物流体、細胞および組織抽出液
中の広汎な種々の物質があげられる。生物学的関
心のある化合物としては血清、血漿、唾液、尿ま
たは乳蛋白質、薬物、ビタミン、ホルモン、酵
素、抗体、多糖体、細菌、プロトゾア、真菌、ビ
ールス、細胞および組織抗原およびその他の血液
細胞または血液流体物質があげられる。 イムノアツセーはアナライトのタイプおよび要
求される感度によつて種々の方法でデザインする
ことができる。 比較的高温度のアナライト例えば血清蛋白に対
しては、適当な抗体粒子試薬を直接粒子強化比濁
免疫沈降アツセーに使用することができる。本発
明の方法は通常の免疫沈降技術に比べて上昇した
検出性を与え、試薬コストを低下させ、そしてよ
り少量の患者試料容量の使用を可能ならしめる。
逆に関心ある循環抗体の検出のためには、対応反
応性抗原または抗体粒子試薬を直接アツセーで使
用することができる。いずれの場合にも抗原また
は抗体はポリエーテルポリアミン結合剤によつて
粒子上に共有結合的に結合されている。 本発明の阻害イムノアツセー法はまた粒子試薬
の他に以後「凝集剤」と呼ばれる粒子試薬の凝集
を生ぜしめる二官能性または多官能性の薬剤を要
求する。生物学的関心ある化合物により阻害され
うるのはこの凝集である。この凝集剤は生物学的
に関心ある化合物に対する抗体でありうるし、ま
たは前述したようにポリエーテルポリアミンによ
つて生物学的に関心ある化合物に対する抗体に共
有結合的に結合された重合体粒子に基く粒子試薬
でありうる。 凝集剤はまた生物学的に関心ある化合物とポリ
エーテルポリアミンとの多価コンジユゲートであ
りうる。そのようなコンジユゲートは本発明の方
法で使用される粒子試薬が生物学的関心ある化合
物に対する共有結合的に結合した抗体を含有して
いる場合に使用することができる。 数種の異つたアツセー構造をアナライト測定に
使用することができる。一つのそのような構造に
おいては、抗原粒子試薬はアナライトまたは適当
なアナライトの誘導体、ポリエーテルポリアミン
および重合体粒子から製造され、そしてこれら粒
子の遊離アナライトによる抗体との反応の阻害は
測定される。反応は粒子試薬とアナライトとの間
の抗体に対する直接的競争により、またはアナラ
イトを最初に過剰の抗体と反応させ次いで抗原粒
子試薬を加えて過剰の抗体と反応させる一連反応
により実施しうる。 その他のアツセー構造においては同一または異
つたサイズの抗体と抗原粒子試薬との両者を存在
させることができ、そしてアナライトによる阻害
を競争的または連続様式で実施させることができ
る。抗体または抗原粒子試薬のどちらかまたは両
方がポリエーテルポリアミン結合剤を使用しう
る。 本発明の粒子強化比濁イムノアツセーは一般に
は水性のバツフアー化媒体中で実施されるがこれ
は更に表面活性剤、保存剤およびポリエチレング
リコールを含有しうる。ある場合には、それはま
た血清阻害を減少させるために還元剤例えばジチ
オエリスリトール（DTE）を含有させるのが望
ましいであろう。このアツセーは手作業で実施し
うるしまたはそれは種々の自動化または半自動化
装置に適応させることができる。 本発明のアツセーをその他の粒子強化比濁アツ
セー例えばアナライトと粒子との間の結合剤とし
てHSAを使用した米国特許出願第315922号明細
書記載のものと比較した場合、いくつかの予期せ
ざる利点がポリエーテルポリアミンリンカーの使
用から生ずる。 そのような利点の一つは、アツセーの抗体要求
が約10倍少なくなることである。往々にして抗体
は製造が困難でありかつ費用がかかるので、ある
与えられたシグナル水準の達成に要求される量の
この減少は有意のコスト節約を意味しうる。その
他の利点は同一シグナル水準の達成のためにアツ
セー中に要求されるPEG量が大約２のフアクタ
ーだけ減少することである。実際に要求される
PEG濃度はポリエーテルポリアミンリンカーの
鎖長によつて変動する。大約選ばれたポリエーテ
ルポリアミンはPEG量を減少させ、そして試薬
量が限定されている多くの自動化臨床分析装置へ
のアツセーの適応を単純化する。 アツセーに要求される抗体の量と要求される
PEG量との間には相関的関係が存在している。
抗体要求のそれ以上の減少は、アツセー中の
PEG量の上昇によつて達成させることができる。
ポリエーテルポリアミンリンカーの使用がPEG
要求の減少を招来するので若干のそのような上昇
はここでは受容されうる。 全く予期せざるそして驚くべきその他の利点は
ポリエーテルポリアミン（PEPA）リンカーが使
用された場合、HSAリンカーを有する粒子試薬
を使用するアツセーに比べて、アツセー精度にお
いて約４倍の改善が達成されることである。蛋白
質リンカーに比べた場合の合成リンカーの使用か
ら得られる精度のそのような改善は高度に重要で
ある。その理由は変動係数により測定した場合の
良好な精度はすべてのイムノアツセーの成功に対
して本質的である。 本発明を説明する以下の例においては、すべて
の部は特記されていない限りは重量基準である。 例 １ テオフイリンアツセー (A) ポリエチレンエーテルグリコールのジトシレ
ートエステルの合成 機械的撹拌機、温度計、添加斗および乾燥窒
素雰囲気を保持させる系を付した３容三頚フラ
スコを氷水浴中で冷却させそして乾燥窒素で置換
させた。この系は反応全体にわたつてわずかに窒
素陽圧に保持されていた。トシルクロリド
（343.2ｇ、1.8モル）をフラスコ中に入れ、次い
で1200mlのメチレンクロリドを加えた。わずかに
吸熱的な溶解の後、ポリエチレンエーテルグリコ
ール〔シグマ・ケミカル社製品、150.0ｇ、0.750
モル、o＝200（ヒドロキシル数による）〕を速や
かに加え、そして容器を150mlのメチレンクロリ
ドで洗つた。トリエチルアミン（191.2ｇ、1.89
モル）を次いでその温度を15〜18℃に保ちつつ１
時間かけて滴加した。トリエチルアミン容器およ
び添加斗を150mlのメチレンクロリドで洗つた。
反応混合物をその日の残りの間15〜20℃で撹拌し
そして同一温度に一晩放置した。トリエチルアミ
ン塩酸塩はこの反応の過程全体にわたつて沈殿し
た。 反応の開始後約24時間でこの混合物を氷浴中で
冷却させ、１時間撹拌してすべての追加のトリエ
チルアミン塩酸塩を分離させ、そして冷却された
フイルターフラスコ中に過した。液を第一に
塩酸の冷却溶液（500ml水中32ml濃HCl）次いで
500ml区分量の冷水で２回抽出した。メチレンク
ロリド溶液を無水硫酸ナトリウム（250ｇ）上で
乾燥させ、溶液を乾燥剤から傾瀉させそしてメチ
レンクロリドをフラツシユエバポレーター（生成
物の温度は決して35℃以上にはさせない）中で蒸
発させた。すべての痕跡量のメチレンクロリドの
除去を確実ならしめるために、残渣を無水の阻害
剤不含テトラヒドロフラン200mlに溶解させ、そ
して次いで溶媒を同一条件下にフラツシユエバポ
レーター中で除去させた。 (B) ポリエーテルポリアミン（PEPA）の製造 前記(A)からのポリエチレンエーテルジトシレー
ト228ｇを1500mlの純無水阻害剤不含テトラヒド
ロフランに溶解させ、そしてこの溶液をステンレ
ススチールのオートクレーブ中に入れた。このオ
ートクレーブをシールし、そして無水アンモニア
（600ｇ）をポンプで汲み入れた。この撹拌混合物
を100℃に加熱し、そしてこの温度に自己発生圧
力下に４時間保持した。オートクレーブを室温ま
で冷却させ、そして圧力を徐々に解放した。この
ポリエーテルポリアミン−THF溶液は残存トシ
ルクロリド〔(A)から〕とアンモニアとからの生成
物である結晶性アンモニウムトシレートおよび塩
化アンモニウムを含有していた。固体を過によ
り除去し、そしてTHFをフラツシユエバポレー
ター中で蒸発させた。残渣をその重量の４倍の冷
水に加えそしてこの混合物を約１時間水中で冷却
させた。パラトルエンスルホンアミドが多量の沈
殿として分離した。この混合物を過しそして最
初の残渣の重量の1/4に等しい量の活性炭（ダル
コＧ−60）を加えた。この水性混合物を時々撹拌
しつつ加熱沸騰させ、室温まで冷却させ、そして
次いでカーボンを除去するために珪藻土を通して
過させた。60〜70℃の浴温でフラツシユエバポ
レーター中で水を除去した。酸滴定により測定し
た残渣のアミン含量は6.8meq／ｇであり、これ
はｘ＝2.1およびｙ＝約４に相当する（表Ａ参
照）。 (C) テオフイリン−ポリエーテルポリアミンコン
ジユゲートの製造 Ｎ−エチル−N′−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）カルボジイミド塩酸塩（260ｇ）をジメチル
スルホキサイド（30ml）中の８−（３−カルボキ
シプロピル）−１，３−ジメチルキサンチン（ペ
ニンスラ・ラボラトリース社製品、340mg）の溶
液に加えた。そしてこの溶液を23℃で３時間撹拌
した。20mlのジメチルスルホキサイド中前記(B)か
らのポリエーテルポリアミン（1.13ｇ、7.7meqの
アミン）を加え、そして撹拌を23℃で更に18時間
つづけた。このようにして得られたコンジユゲー
ト溶液を４℃で保存した。 (D) テオフイリン−ポリエーテルポリアミン粒子
試薬の製造 前記(C)からのテオフイリン−PEPAコンジユゲ
ート溶液（27ml）を5mM燐酸ナトリウム（450
ml、PH8.0）および10％GAFAC RE−610（GAF
社より入手可能な陰イオン性表面活性剤を含有す
る0.15M燐酸バツフアー5.4mlと共に混合した。
0.2Mおよび0.02M水酸化ナトリウムの添加によ
つてPHを10.0〜10.1に調整した。米国特許出願第
315922号明細書の例４に記載のようにして製造さ
れたエポキシ官能性粒子含有重合体粒子ラテツク
ス（17％固体分、64.8ml）を次いで加えそしてこ
の混合物を２時間撹拌しつつ70℃に加熱した。 この反応混合物を冷却し、0.1％GAFAC RE−
610を含有する15mM燐酸バツフアー（PH7.0）
600mlを加え、そして６区分量で、16時間
8000rpmで遠心させた。上澄液を傾瀉させ、そし
て各ペレツトを0.1％GAFACを含有する15mM燐
酸バツフアー（200ml、PH7.0）中で超音波処理す
ることによつて再懸濁させ、再び13000rpmで6.5
時間遠心させ、上澄液を傾瀉させ、そして各ペレ
ツトを50mlの最終バツフアー（0.35％GAFACお
よび0.01％チメロサールを含有する15mMホスフ
エート）に再懸濁させた。各試料を３分間超音波
処理して単分散粒子懸濁液を生成させた。６個の
試料を一緒に混合して450mlの最終容量とし、そ
して0.8μフイルターに通した。 (E) アツセー アツセーは分析テストパツク（米国再交付特許
第29725号参照）中でaca〓クリニカルアナライ
ザー（デユポン社製品）上で実施された。０〜
40μｇ／mlの既知のテオフイリン濃度を含有する
プールされた人血清40μを自動的に機械の充填
ステーシヨンで試験パツクに注入させ、次いで
4.96mlの0.15M燐酸バツフアー（PH7.8）、1.3％最
終濃度を与えるPEG8000（65.0mg）、5.8mgのDTE、
0.05mlのGAFAC RE−610溶液（10％ｗ／ｖ、蒸
留水中）および0.06mlの前記(D)からの粒子試薬を
ブレーカー／ミキサーでパツクに加えた。３1/
２分後、2μの抗テオフイリン抗体（10mg／μ
HSA、1M NaCl、0.05MK2HPO4、0.1％
（ｗ／ｖ）NaN3および0.002％（ｗ／ｖ）チメロ
サールを含有する溶液（PH7.8）で１：24に希釈
を加えることによつてブレーカー／ミキサーで
反応を開始させた。この抗体は30／15と称される
テオフイリンに対するマウスモノクローン抗体
（ハイブリドーマセルラインから得られる、
ATCCの受理番号HB8152）であり、そしてこれ
は減菌過腹水として使用された。その製造はこ
こに参照として包含されている米国特許出願第
406554号明細書に記載されている。 粒子凝集の凾数としての濁りの変化速度を抗体
添加の29秒および46秒後の340nmにおける吸収の
差として記録した。データは以下の表に示され
ている。 表 テオフイリンによる濁りの阻害テオフイリン（μｇ／ml）
速度（340nmにおけるmA／分） ０ 220 2.5 186 5.0 148 10.0 87 20.0 43 40.0 18 例 ２ テオフイリン−HSA粒子試薬およびテオフイ
リン−PEPA粒子試薬を使用したアツセー性能
の比較 テオフイリン−HSA粒子試薬を使用した粒子
強化濁り阻害イムノアツセーを前記１(E)に記載の
ようにして実施したがただしこの場合試料サイズ
は20μであり、PEGの最終濃度は３％であり、
そして28μの未希釈抗体がブレーカー／ミキサ
ーで加えられた。 表ＡはHSAリンカーに対して本発明のポリ
エーテルポリアミンリンカーを使用して得られた
精度（μｇ／mlでの％C.V.、20パツクの平均）
を比較している。精度は本発明のリンカーの使用
によつてテオフイリン水準10μｇ／mlおよび20μ
／mlの両方で約４倍改善された。 表Ｂは異つた結合剤を使用したテオフイリン
アツセーにおける340nmの濁度の変化速度を比較
している。必要な抗体量の14倍の減少に加えて、
全シグナルおよび分離の両者はHSA粒子を使用
した場合よりも本発明の粒子試薬の使用の場合よ
り良好であつた。
【表】
【表】
例 ３
テオフイリンアツセー
一連のポリエーテルポリアミン（PEPA）を例
１記載の方法によつて種々の分子量のポリエチレ
ンエーテルグリコールから製造した。次いでこれ
らポリエーテルポリアミンを使用して例１記載の
ようにしてテオフイリン粒子試薬を製造した。 例１(E)のアツセーをくりかえしたが但し2μ
の代りに3μの抗体を使用し、DTEを除外し、
そしてPEGおよびGAFACを機械の充填ステーシ
ヨンでバツフアーと共に加えた。表は出発グリ
コールの分子量の凾数としてのゼロキヤリブレー
ター水準の最大シグナルに対してアツセー中で要
求されるPEG8000の最終濃度が示されている。
分子量範囲の低い方および高い方の端において
は、合成リンカー粒子試薬を使用するアツセーに
おいてはHSAリンカー使用の場合よりも一層多
量のPEGが要求される。出発グリコールがo＝
150または200（それぞれｘ＝１および2.1）を有し
ている場合には、PEG要求は２のフアクターだ
け低下する。中間的分子量（o＝390または595）
においては、PEG要求は大約同一である。適当
なｘおよびｙ値は表ＡおよびＢから、既知の
Ｍo値および表に与えられている種々のPEPA
製品中のmeq／ｇ試料の窒素含量から確立させる
ことができる。窒素含量は酸滴定により決定され
た。試料中のすべての不純物は分析窒素値を理論
値よりも減少させてより高いみかけのｙ値を与え
る結果となる。この理由の故に、そのようにして
計算されたｙ値は大約のものでありそしてすべて
の試料に対する上限である。
１記載の方法によつて種々の分子量のポリエチレ
ンエーテルグリコールから製造した。次いでこれ
らポリエーテルポリアミンを使用して例１記載の
ようにしてテオフイリン粒子試薬を製造した。 例１(E)のアツセーをくりかえしたが但し2μ
の代りに3μの抗体を使用し、DTEを除外し、
そしてPEGおよびGAFACを機械の充填ステーシ
ヨンでバツフアーと共に加えた。表は出発グリ
コールの分子量の凾数としてのゼロキヤリブレー
ター水準の最大シグナルに対してアツセー中で要
求されるPEG8000の最終濃度が示されている。
分子量範囲の低い方および高い方の端において
は、合成リンカー粒子試薬を使用するアツセーに
おいてはHSAリンカー使用の場合よりも一層多
量のPEGが要求される。出発グリコールがo＝
150または200（それぞれｘ＝１および2.1）を有し
ている場合には、PEG要求は２のフアクターだ
け低下する。中間的分子量（o＝390または595）
においては、PEG要求は大約同一である。適当
なｘおよびｙ値は表ＡおよびＢから、既知の
Ｍo値および表に与えられている種々のPEPA
製品中のmeq／ｇ試料の窒素含量から確立させる
ことができる。窒素含量は酸滴定により決定され
た。試料中のすべての不純物は分析窒素値を理論
値よりも減少させてより高いみかけのｙ値を与え
る結果となる。この理由の故に、そのようにして
計算されたｙ値は大約のものでありそしてすべて
の試料に対する上限である。
【表】
例 ４
テオフイリンアツセー
(A) テオフイリン−ポリプロピレンエーテルポリ
アミンコンジユゲートの製造 Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−N′−エ
チルカルボジイミド塩酸塩（453mg）をジメチル
スルホキサイド（44ml）中の８−（３−カルボキ
シプロピル）−１，３−ジメチルキサンチン（592
mg）の溶液に加えた。そしてこの溶液を23℃で３
時間撹拌した。44mlのジメチルスルホキサイド中
のポリプロピレンエーテルポリアミン（ジエフア
ミンＤ−230、テキサコ・ケミカル社製品、1.562
ｇ）を加え、そして撹拌を23℃で更に18時間つづ
けた。このようにして得られたコンジユゲート溶
液を４℃で保存した。 (B) テオフイリン−ポリプロピレンエーテルポリ
アミン粒子試薬の製造 前記(A)からのテオフイリン−PPPAコンジユゲ
ート溶液（90ml）を0.12％GAFAC RE−610
（GAF社より入手可能な陰イオン性表面活性剤）
を含有する5mM燐酸ナトリウム（1500ml、PH
8.0）と共に混合した。0.2M水酸化ナトリウムの
添加によつてPHを10.0〜10.1に調整した。この混
合物を70℃に加熱し、そして米国特許出願第
315922号明細書例４に記載のようにして製造され
たエポキシ官能性粒子を含有する重合体粒子ラテ
ツクス（17％固体分、216ml）を２時間撹拌しつ
つ加えた。 反応混合物を冷却し、0.1％GAFAC RE−610
を含有する15mM燐酸ナトリウム（PH7.0）1500
mlで希釈し、そして100μおよび3μフイルターの
両方を使用して過した。この混合物を高性能中
空繊維超過系（アミコン社型式DC 10EM）お
よび0.1％GAFAC RE−610を含有する15mM燐
酸ナトリウム（60、PH7.0）を使用した超過
にかけて未反応コンジユゲートを除去した。ラテ
ツクス懸濁液を1500mlの最終容量とした。 (C) アツセー アツセーは分析テストパツク（米国再交付特許
第29725号参照）中でaca〓クリニカルアナライ
ザー上で実施された。０〜40μｇ／mlの既知濃度
のテオフイリンを含有するプールされた人血清
40μを自動的に機械の充填ステーシヨンでテス
トパツク中に注入させ、次いで4.91mlの0.15M燐
酸バツフアー（PH7.8）、55mgのPEG8000、6.0mg
のジチオエリスリトール、60μのGAFAC
RE610溶液（16.7％、ｗ／ｖ、蒸留水中）および
52.4μの前記(B)からの粒子試薬をブレーカー／
ミキサーでパツクに加えた。３1/2分後、前記
例１記載の抗テオフイリン抗体溶液3.48μ（１
部のマウス腹水流体を10mg／mlHSA、1M
NaCl、0.05M K2HPO4、0.1％（ｗ／ｖ）NaN3
および0.002％（ｗ／ｖ）チメロサールを含有す
る溶液（PH7.8）24部で希釈することにより製造）
を加えることによつてブレーカー／ミキサーで
反応を開始させた。 粒子凝集の凾数としての濁りの変化速度を抗体
添加の29秒後および46秒後の340nmにおける吸収
の差として記録した。データは以下の表に示さ
れている。 表 テオフイリンによる濁りの阻害テオフイリン（μｇ／ml）
速度（340nmにおけるmA／分） ０ 213 2.5 172 5.0 119 10.0 77 20.0 38 40.0 18 例 ５ テオフイリン−HSA粒子試薬およびテオフイ
リン−PPPA粒子試薬を使用したアツセー性能
の比較 テオフイリン−HSA粒子試薬を使用した粒子
強化濁り阻害イムノアツセーを例４記載のように
して実施したが但しこの場合試料サイズは20μ
であり、PEGの最終濃度は３％でありそして28μ
の未希釈抗体がブレーカー／ミキサーで加え
られた。 表はHSAリンカーに対して本発明のポリプ
ロピレンポリアミンリンカーを使用して得られた
精度（μｇ／mlの％C.V.、20パツクの平均）を
比較している。精度は本発明のリンカーの使用に
よつて約２〜３倍改善された。
アミンコンジユゲートの製造 Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−N′−エ
チルカルボジイミド塩酸塩（453mg）をジメチル
スルホキサイド（44ml）中の８−（３−カルボキ
シプロピル）−１，３−ジメチルキサンチン（592
mg）の溶液に加えた。そしてこの溶液を23℃で３
時間撹拌した。44mlのジメチルスルホキサイド中
のポリプロピレンエーテルポリアミン（ジエフア
ミンＤ−230、テキサコ・ケミカル社製品、1.562
ｇ）を加え、そして撹拌を23℃で更に18時間つづ
けた。このようにして得られたコンジユゲート溶
液を４℃で保存した。 (B) テオフイリン−ポリプロピレンエーテルポリ
アミン粒子試薬の製造 前記(A)からのテオフイリン−PPPAコンジユゲ
ート溶液（90ml）を0.12％GAFAC RE−610
（GAF社より入手可能な陰イオン性表面活性剤）
を含有する5mM燐酸ナトリウム（1500ml、PH
8.0）と共に混合した。0.2M水酸化ナトリウムの
添加によつてPHを10.0〜10.1に調整した。この混
合物を70℃に加熱し、そして米国特許出願第
315922号明細書例４に記載のようにして製造され
たエポキシ官能性粒子を含有する重合体粒子ラテ
ツクス（17％固体分、216ml）を２時間撹拌しつ
つ加えた。 反応混合物を冷却し、0.1％GAFAC RE−610
を含有する15mM燐酸ナトリウム（PH7.0）1500
mlで希釈し、そして100μおよび3μフイルターの
両方を使用して過した。この混合物を高性能中
空繊維超過系（アミコン社型式DC 10EM）お
よび0.1％GAFAC RE−610を含有する15mM燐
酸ナトリウム（60、PH7.0）を使用した超過
にかけて未反応コンジユゲートを除去した。ラテ
ツクス懸濁液を1500mlの最終容量とした。 (C) アツセー アツセーは分析テストパツク（米国再交付特許
第29725号参照）中でaca〓クリニカルアナライ
ザー上で実施された。０〜40μｇ／mlの既知濃度
のテオフイリンを含有するプールされた人血清
40μを自動的に機械の充填ステーシヨンでテス
トパツク中に注入させ、次いで4.91mlの0.15M燐
酸バツフアー（PH7.8）、55mgのPEG8000、6.0mg
のジチオエリスリトール、60μのGAFAC
RE610溶液（16.7％、ｗ／ｖ、蒸留水中）および
52.4μの前記(B)からの粒子試薬をブレーカー／
ミキサーでパツクに加えた。３1/2分後、前記
例１記載の抗テオフイリン抗体溶液3.48μ（１
部のマウス腹水流体を10mg／mlHSA、1M
NaCl、0.05M K2HPO4、0.1％（ｗ／ｖ）NaN3
および0.002％（ｗ／ｖ）チメロサールを含有す
る溶液（PH7.8）24部で希釈することにより製造）
を加えることによつてブレーカー／ミキサーで
反応を開始させた。 粒子凝集の凾数としての濁りの変化速度を抗体
添加の29秒後および46秒後の340nmにおける吸収
の差として記録した。データは以下の表に示さ
れている。 表 テオフイリンによる濁りの阻害テオフイリン（μｇ／ml）
速度（340nmにおけるmA／分） ０ 213 2.5 172 5.0 119 10.0 77 20.0 38 40.0 18 例 ５ テオフイリン−HSA粒子試薬およびテオフイ
リン−PPPA粒子試薬を使用したアツセー性能
の比較 テオフイリン−HSA粒子試薬を使用した粒子
強化濁り阻害イムノアツセーを例４記載のように
して実施したが但しこの場合試料サイズは20μ
であり、PEGの最終濃度は３％でありそして28μ
の未希釈抗体がブレーカー／ミキサーで加え
られた。 表はHSAリンカーに対して本発明のポリプ
ロピレンポリアミンリンカーを使用して得られた
精度（μｇ／mlの％C.V.、20パツクの平均）を
比較している。精度は本発明のリンカーの使用に
よつて約２〜３倍改善された。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 下記すなわち (A) ナトリウムＤ線の波長で測定して1.54以上の
屈折率を有する重合体である内側コア、および (1) エポキシ、カルボキシおよびアルデヒドよ
りなる群から選ばれた親水性重合体リンカー
と反応しうる官能基を有するエチレン性不飽
和単量体、 (2) 場合により重合体粒子を実質的に水不溶性
とするに充分量のその他のエチレン性不飽和
単量体、および (3) 外側シエルの10重量部を越えない内側コア
の単量体 の重合体であつてしかも前記内側コアの存在下の
重合により形成された外側シエルを有し、そして
大約0.03〜0.1μｍの直径範囲を有している重合体
粒子、そして (B) 実験式 Ｈ〔NHC2H3R（OC2H3R）xOC2H3R〕yNH2 （式中ＲはＨおよびCH3よりなる群から選ばれ
た少くとも１員であり、ｘは０〜70でありそし
てｙは１〜20である）の親水性重合体リンカー
を介して前記(A)の重合体粒子と共有結合的に結
合せしめられた生物学的関心のある化合物 から本質的になることを特徴とする、粒子試薬。 ２ Ｒ＝Ｈである前記特許請求の範囲第１項記載
の粒子試薬。 ３ リンカーがプロピレンオキサイド末端閉止さ
れたポリエチレングリコールから導かれる前記特
許請求の範囲第１項記載の粒子試薬。 ４ ｘ＝１〜15そしてｙ＝１〜15である前記特許
請求の範囲第１項記載の粒子試薬。 ５ ｘ＝１〜15そしてｙ＝１〜15である前記特許
請求の範囲第２項記載の粒子試薬。 ６ ｘ＝１〜２そしてｙ＝１〜５である前記特許
請求の範囲第５項記載の粒子試薬。 ７ 生物学的関心のある化合物を測定するにあた
り、 (A) (1) (a) ナトリウムＤ線の波長で測定して
1.54以上の屈折率を有する重合体である内
側コアおよび (i) エポキシ、カルボキシルおよびアルデ
ヒドよりなる群から選ばれた親水性重合
体リンカーと反応しうる官能基を有する
エチレン性不飽和単量体、 (ii) 場合によりその粒子を実質的に水不溶
性とするに充分な量のその他のエチレン
性不飽和単量体、および (iii) 外側シエルの10重量部を越えない内側
コアの単量体 の重合体であつて前記内側コアの存在下の重合に
より形成された外側シエルを有し、そして大約
0.03〜0.1μｍの直径範囲を有している重合体粒
子、および (b) 実験式 Ｈ〔NHC2H3R（OC2H3R）xOC2H3R〕y
NH2 （式中ＲはＨおよびCH3よりなる群から
選ばれた少くとも一つであり、ｘは０〜70
でありそしてｙは１〜20である）の親水性
重合体リンカーを介して前記重合体粒子と
共有結合的に結合されている生物学的に関
心ある化合物から本質的になる高屈折率を
有する粒子試薬、 (2) 生物学的関心ある化合物を含有すると考え
られる液体および (3) 凝集剤 を培養し、そして (B) 凝集から生じた増大された粒子サイズを光学
的に測定する 各段階を包含することを特徴とする方法。 ８ Ｒ＝Ｈである前記特許請求の範囲第７項記載
の方法。 ９ ｘ＝１〜15そしてｙ＝１〜15である前記特許
請求の範囲第８項記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/511,751 US4581337A (en) | 1983-07-07 | 1983-07-07 | Polyether polyamines as linking agents for particle reagents useful in immunoassays |
| US511,751 | 1983-07-07 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6038655A JPS6038655A (ja) | 1985-02-28 |
| JPH0260269B2 true JPH0260269B2 (ja) | 1990-12-14 |
Family
ID=24036281
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59139182A Granted JPS6038655A (ja) | 1983-07-07 | 1984-07-06 | イムノアツセー用粒子試薬 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4581337A (ja) |
| EP (1) | EP0134660B1 (ja) |
| JP (1) | JPS6038655A (ja) |
| CA (1) | CA1239344A (ja) |
| DE (1) | DE3472302D1 (ja) |
| DK (1) | DK334984A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPWO2005075997A1 (ja) * | 2004-02-03 | 2007-10-11 | 旭化成株式会社 | 磁気ビーズを用いた被検物質の検出方法 |
Families Citing this family (59)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4760142A (en) * | 1984-11-27 | 1988-07-26 | Hoechst Celanese Corporation | Divalent hapten derivatives |
| US4560504A (en) * | 1984-12-06 | 1985-12-24 | Uop Inc. | Carboxyl anchored immobilized antibodies |
| DE3782394T2 (de) * | 1986-03-28 | 1993-05-19 | Toray Industries | Immobilisiertes, physiologisch aktives material. |
| US4727024A (en) * | 1986-05-12 | 1988-02-23 | Martin Koocher | Binding assays involving formation and detection of light scattering crystals |
| US5527524A (en) * | 1986-08-18 | 1996-06-18 | The Dow Chemical Company | Dense star polymer conjugates |
| EP0279525A1 (en) * | 1987-01-23 | 1988-08-24 | Seitetsu Kagaku Co., Ltd. | Blood group substance-carrying latex and process for preparing the same |
| US4997772A (en) * | 1987-09-18 | 1991-03-05 | Eastman Kodak Company | Water-insoluble particle and immunoreactive reagent, analytical elements and methods of use |
| US4988630A (en) * | 1987-04-27 | 1991-01-29 | Hoffmann-La Roche Inc. | Multiple beam laser instrument for measuring agglutination reactions |
| US5240602A (en) * | 1987-06-08 | 1993-08-31 | Chromatochem, Inc. | Chromatographic material |
| US6251278B1 (en) * | 1987-06-08 | 2001-06-26 | Chromatochem, Inc. | Process for separating a substance from a mixture |
| US5002883A (en) * | 1987-10-30 | 1991-03-26 | Abbott Laboratories | Covalent attachment of antibodies and antigens to solid phases using extended length heterobifunctional coupling agents |
| CA1316858C (en) * | 1988-06-10 | 1993-04-27 | Keith E. Taylor | Method and device for attachment of biologically useful materials to a solid phase |
| EP0348174A3 (en) * | 1988-06-23 | 1991-05-22 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Sperm antibody test |
| FR2634023B1 (fr) * | 1988-07-08 | 1994-03-25 | Bio Merieux | Reactif sous forme de support solide permettant de fixer par covalence un ligand biologique amine, sa preparation et son utilisation |
| CA2053449A1 (en) * | 1990-10-16 | 1992-04-17 | Henry K. Hui | Optical fiber ph microsensor and method of manufacture |
| US5401633A (en) * | 1992-10-01 | 1995-03-28 | Eastman Kodak Company | Biologically active reagent prepared from aldehyde-containing polymer, test kit, analytical element and methods of use |
| AU2118195A (en) * | 1994-03-07 | 1995-09-25 | Dendritech Inc. | Bioactive and/or targeted dendrimer conjugates |
| GB9406094D0 (en) * | 1994-03-28 | 1994-05-18 | Univ Nottingham And University | Polymer microspheres and a method of production thereof |
| DE19640121B4 (de) | 1996-09-28 | 2007-04-26 | Dade Behring Marburg Gmbh | Verfahren zur Bestimmung einer sich zeitabhängig ändernden Meßgröße |
| US5981296A (en) * | 1997-02-18 | 1999-11-09 | Dade Behring Inc. | Stabilization of particle reagents |
| US6224948B1 (en) | 1997-09-29 | 2001-05-01 | Battelle Memorial Institute | Plasma enhanced chemical deposition with low vapor pressure compounds |
| EP1127381B1 (en) | 1998-11-02 | 2015-09-23 | 3M Innovative Properties Company | Transparent conductive oxides for plastic flat panel displays |
| TW439308B (en) | 1998-12-16 | 2001-06-07 | Battelle Memorial Institute | Environmental barrier material for organic light emitting device and method of making |
| US6228436B1 (en) | 1998-12-16 | 2001-05-08 | Battelle Memorial Institute | Method of making light emitting polymer composite material |
| US6268695B1 (en) | 1998-12-16 | 2001-07-31 | Battelle Memorial Institute | Environmental barrier material for organic light emitting device and method of making |
| US6207239B1 (en) | 1998-12-16 | 2001-03-27 | Battelle Memorial Institute | Plasma enhanced chemical deposition of conjugated polymer |
| US6274204B1 (en) | 1998-12-16 | 2001-08-14 | Battelle Memorial Institute | Method of making non-linear optical polymer |
| US6217947B1 (en) | 1998-12-16 | 2001-04-17 | Battelle Memorial Institute | Plasma enhanced polymer deposition onto fixtures |
| US6228434B1 (en) * | 1998-12-16 | 2001-05-08 | Battelle Memorial Institute | Method of making a conformal coating of a microtextured surface |
| US6207238B1 (en) * | 1998-12-16 | 2001-03-27 | Battelle Memorial Institute | Plasma enhanced chemical deposition for high and/or low index of refraction polymers |
| US6506461B2 (en) | 1999-03-31 | 2003-01-14 | Battelle Memorial Institute | Methods for making polyurethanes as thin films |
| US6358570B1 (en) | 1999-03-31 | 2002-03-19 | Battelle Memorial Institute | Vacuum deposition and curing of oligomers and resins |
| US6866901B2 (en) | 1999-10-25 | 2005-03-15 | Vitex Systems, Inc. | Method for edge sealing barrier films |
| US20070196682A1 (en) * | 1999-10-25 | 2007-08-23 | Visser Robert J | Three dimensional multilayer barrier and method of making |
| US6548912B1 (en) | 1999-10-25 | 2003-04-15 | Battelle Memorial Institute | Semicoductor passivation using barrier coatings |
| US6623861B2 (en) * | 2001-04-16 | 2003-09-23 | Battelle Memorial Institute | Multilayer plastic substrates |
| US6573652B1 (en) | 1999-10-25 | 2003-06-03 | Battelle Memorial Institute | Encapsulated display devices |
| US20100330748A1 (en) | 1999-10-25 | 2010-12-30 | Xi Chu | Method of encapsulating an environmentally sensitive device |
| US20090191342A1 (en) * | 1999-10-25 | 2009-07-30 | Vitex Systems, Inc. | Method for edge sealing barrier films |
| US7198832B2 (en) | 1999-10-25 | 2007-04-03 | Vitex Systems, Inc. | Method for edge sealing barrier films |
| US6413645B1 (en) * | 2000-04-20 | 2002-07-02 | Battelle Memorial Institute | Ultrabarrier substrates |
| US6492026B1 (en) | 2000-04-20 | 2002-12-10 | Battelle Memorial Institute | Smoothing and barrier layers on high Tg substrates |
| US20090208754A1 (en) * | 2001-09-28 | 2009-08-20 | Vitex Systems, Inc. | Method for edge sealing barrier films |
| US8808457B2 (en) | 2002-04-15 | 2014-08-19 | Samsung Display Co., Ltd. | Apparatus for depositing a multilayer coating on discrete sheets |
| US8900366B2 (en) * | 2002-04-15 | 2014-12-02 | Samsung Display Co., Ltd. | Apparatus for depositing a multilayer coating on discrete sheets |
| US6933051B2 (en) * | 2002-08-17 | 2005-08-23 | 3M Innovative Properties Company | Flexible electrically conductive film |
| US7510913B2 (en) * | 2003-04-11 | 2009-03-31 | Vitex Systems, Inc. | Method of making an encapsulated plasma sensitive device |
| US7648925B2 (en) | 2003-04-11 | 2010-01-19 | Vitex Systems, Inc. | Multilayer barrier stacks and methods of making multilayer barrier stacks |
| CN1755366B (zh) * | 2004-09-30 | 2010-06-16 | 深圳华康生物医学工程有限公司 | 精子膜表面抗体混合凝集反应IgG检测试剂及免疫微球的制备方法 |
| US7767498B2 (en) * | 2005-08-25 | 2010-08-03 | Vitex Systems, Inc. | Encapsulated devices and method of making |
| BRPI0721299B1 (pt) * | 2006-12-28 | 2018-07-24 | 3M Innovative Properties Company. | Método para formação de um filme condutivo em um suporte de polímero flexível, filme condutivo e método para a fabricação de um artigo de vitrificação |
| US8350451B2 (en) * | 2008-06-05 | 2013-01-08 | 3M Innovative Properties Company | Ultrathin transparent EMI shielding film comprising a polymer basecoat and crosslinked polymer transparent dielectric layer |
| US9184410B2 (en) | 2008-12-22 | 2015-11-10 | Samsung Display Co., Ltd. | Encapsulated white OLEDs having enhanced optical output |
| US9337446B2 (en) * | 2008-12-22 | 2016-05-10 | Samsung Display Co., Ltd. | Encapsulated RGB OLEDs having enhanced optical output |
| US20100167002A1 (en) * | 2008-12-30 | 2010-07-01 | Vitex Systems, Inc. | Method for encapsulating environmentally sensitive devices |
| US8590338B2 (en) * | 2009-12-31 | 2013-11-26 | Samsung Mobile Display Co., Ltd. | Evaporator with internal restriction |
| CN102086242B (zh) * | 2010-12-23 | 2014-04-16 | 深圳市汇松科技发展有限公司 | 一种表面带有酰胺基团的胶乳微球及其制备方法 |
| CN103597352B (zh) * | 2011-06-07 | 2015-10-21 | 和光纯药工业株式会社 | 凝集促进剂 |
| CN107219282B (zh) * | 2017-05-02 | 2019-11-05 | 鲁东大学 | 一种夹心式免疫传感器的制备方法 |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4264766A (en) * | 1877-09-19 | 1981-04-28 | Hoffmann-La Roche Inc. | Immunological diagnostic reagents |
| FR2321519A1 (fr) * | 1975-08-22 | 1977-03-18 | Rhone Poulenc Ind | Latex de polymeres styreniques |
| US4210723A (en) * | 1976-07-23 | 1980-07-01 | The Dow Chemical Company | Method of coupling a protein to an epoxylated latex |
| CA1101330A (en) * | 1977-09-19 | 1981-05-19 | Ernst A. Fischer | Immunological material bonded to carboxylated latex polymer and process for making it |
| AU528246B2 (en) * | 1978-10-14 | 1983-04-21 | Teikoku Hormone Mfg. Co., Ltd. | Stable immunoassay reagent for hapten determination |
| JPS56115727A (en) * | 1980-02-19 | 1981-09-11 | Kuraray Co Ltd | Carrier for immobilizing physiologically active substance |
| US4401765A (en) * | 1981-09-01 | 1983-08-30 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Covalently bonded high refractive index particle reagents and their use in light scattering immunoassays |
| US4480042A (en) * | 1981-10-28 | 1984-10-30 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Covalently bonded high refractive index particle reagents and their use in light scattering immunoassays |
-
1983
- 1983-07-07 US US06/511,751 patent/US4581337A/en not_active Expired - Lifetime
-
1984
- 1984-07-05 CA CA000458247A patent/CA1239344A/en not_active Expired
- 1984-07-06 JP JP59139182A patent/JPS6038655A/ja active Granted
- 1984-07-06 DK DK334984A patent/DK334984A/da not_active Application Discontinuation
- 1984-07-09 EP EP84304683A patent/EP0134660B1/en not_active Expired
- 1984-07-09 DE DE8484304683T patent/DE3472302D1/de not_active Expired
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPWO2005075997A1 (ja) * | 2004-02-03 | 2007-10-11 | 旭化成株式会社 | 磁気ビーズを用いた被検物質の検出方法 |
| JP4646003B2 (ja) * | 2004-02-03 | 2011-03-09 | 旭化成株式会社 | 磁気ビーズを用いた被検物質の検出方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK334984A (da) | 1985-01-08 |
| DE3472302D1 (en) | 1988-07-28 |
| US4581337A (en) | 1986-04-08 |
| JPS6038655A (ja) | 1985-02-28 |
| DK334984D0 (da) | 1984-07-06 |
| EP0134660A1 (en) | 1985-03-20 |
| CA1239344A (en) | 1988-07-19 |
| EP0134660B1 (en) | 1988-06-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JPH0260269B2 (ja) | ||
| EP0073611B1 (en) | Covalently bonded high refractive index particle reagents and their use in light scattering immunoassays | |
| EP0668504B1 (en) | Quaternary ammonium immunogenic conjugates and immunoassay reagent | |
| US4480042A (en) | Covalently bonded high refractive index particle reagents and their use in light scattering immunoassays | |
| US4434236A (en) | Immunoassay wherein labeled antibody is displaced from immobilized analyte-analogue | |
| US4256833A (en) | Enzyme immunoassay for allergic disorders | |
| GB1571992A (en) | Process for binding organic compounds containing carbohydrate moieties to solid supports | |
| EP0664451A1 (en) | Ion-capture reagents for performing binding assays | |
| JPH0731206B2 (ja) | 固定化したビオチン化受容体を用いるリガンド測定のための試験装置，キットおよび方法 | |
| US5401636A (en) | Enhanced sensitivity agglutination assays multivalent ligands | |
| EP0315317B1 (en) | Bidentate conjugate and method of use thereof | |
| JPWO2002090990A1 (ja) | 生体高分子含有ゲル | |
| US5534620A (en) | Method of heterogenous purification using a bidentate conjugate | |
| JPH0651670B2 (ja) | 二官能性ハプテンおよび免疫化学的ハプテン測定法 | |
| JP2968910B2 (ja) | １α，２５（ＯＨ）２ビタミンＤ３に対する抗体及びその用途 | |
| EP0784795B1 (en) | Post synthesis chemical modification of particle reagents | |
| CA1340635C (en) | Attachment of compounds to polymeric particles using dication ethers and a kit containing same | |
| JPH0220067B2 (ja) | ||
| WO1994018567A1 (en) | Reagent for immunoagglutination and immunoanalytical method | |
| US6303759B1 (en) | Dye-labeled and polymerized antibody and method for preparing the same | |
| US6303758B1 (en) | Dye-labeled and polymerized antibody and method for preparing the same | |
| EP0957363A2 (en) | Dye-labeled and polymerized antibody and method for preparing the same | |
| JPS6343412B2 (ja) | ||
| CA1272193A (en) | Divalent hapten derivatives, process for preparing and use of them | |
| JP2021183908A (ja) | 抗体−デンドリマー複合体を用いるヘモグロビンＡ１ｃの測定方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |