JPH0261707B2 - - Google Patents

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JPH0261707B2
JPH0261707B2 JP57165174A JP16517482A JPH0261707B2 JP H0261707 B2 JPH0261707 B2 JP H0261707B2 JP 57165174 A JP57165174 A JP 57165174A JP 16517482 A JP16517482 A JP 16517482A JP H0261707 B2 JPH0261707 B2 JP H0261707B2
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reaction
groups
protein
group
dye
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JP57165174A
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Baronchetsuri Bitsutoorio
Korapitsukiooni Kuraudeio
Janniini Ibo
Horuchetsuri Fuiritsuho
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Sclavo SpA
Original Assignee
Sclavo SpA
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Publication date
Application filed by Sclavo SpA filed Critical Sclavo SpA
Publication of JPS5866851A publication Critical patent/JPS5866851A/ja
Publication of JPH0261707B2 publication Critical patent/JPH0261707B2/ja
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10S436/80—Fluorescent dyes, e.g. rhodamine

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  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
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  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
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Description

【発明の詳现な説明】 本発明は免疫蛍光詊薬およびその補法に係わ
る。
臚床怜査においお、免疫法によ぀おホルモン、
薬物たたは代謝物の劂き少量化合物を定量するこ
ずはきわめお重芁である。免疫反応の定量法のう
ち぀の方法は、抗原たた抗䜓をフルオレセむン
たたはロヌダミンむ゜チオシアネヌトの劂き螢光
発色団でマヌクするものである。この方法の利甚
に䌎う䞻な問題点は、生化孊怜䜓の固有の螢光で
ある。これに぀いお、フラビン、ピリゞン補酵玠
および血枅蛋癜質の劂き倚くの物質は、詊料ずし
お通垞䜿甚される発色団も攟射するスペクトル域
で匷い螢光を発する。
赀―近赀倖域600ないし900nm、したが぀お
怜䜓の固有螢光300ないし450nmからなり離
れた域で螢光を発する詊料を䜿甚するこずによ
り、倩然物によるバツクグラりンドを排陀するこ
ずができ、該方法の感床を改善するこずが可胜ず
なる。
溶液䞭で遊離する倚くの染料は、螢光の匷床が
かなり匱いものではあ぀おも、これらの特性を有
しおいるこずは知られおいる。しかしながら、そ
の構造が他の分子ずの共有結合によ぀お䜕らかの
方法で倉性される堎合にも、これらの特性が維持
されるこずは自明なこずではない。
本発明者らは、近赀倖域で螢光を発する染料
を、螢光発色団の―NH2基ず反応する二官胜性
物質を䜿甚しお、各皮の蛋癜質に共有結合させる
堎合にも、これら染料はそのスペクトル特性を倱
なわないずの結果を埗お、本発明に至぀た。この
堎合、螢光はないし倍に増倧する第図お
よび第図参照。
第図は抗γ―免疫グロブリン―ナむルブルヌ
耇合䜓曲線およびナむルブルヌ溶液曲線
の発光スペクトルを瀺す。発色団の濃床は
×10-6Mである。励起波長は600nmである。スペ
クトルは、光電子増倍管HAMAMATSU R446
を具備する分光螢光光床蚈Perkin−Elmer MPE
−2Aにより枬定したものである。図䞭、暪軞は
波長nmを瀺し、瞊軞は螢光を瀺す。
第図はアルゎンレヌザヌによりλ515nmで
励起するこずにより埗られた、Protein ―ナむ
ルブルヌ耇合䜓曲線、HCS―ナむルブルヌ
耇合䜓曲線およびナむルブルヌ単独曲線
の発光スペクトルを瀺す。発色団の濃床は
×10-6Mである。暪軞は波長nmを瀺し、瞊
軞は螢光を瀺す。
䞀般に、架橋剀により衚される二官胜性物質
は、蛋癜質および染料の䞡者ず盎接反応し、䞋蚘
の䞀般匏で衚わされる錯䜓を圢成する 〔染料〕―oLn・蛋癜質 二官胜性物質がカルボゞむミドである堎合に
は、これら反応䜓は䜜甚し、カルボキシル基を掻
性化しおカルボキシル基ず染料のアミノ基ずの間
でカルボアミド結合を圢成するため、次匏で衚わ
される錯䜓が生成される。
これら耇合䜓の蛋癜質郚分もその生化孊特性、
たずえば抗原たたは抗䜓である堎合には免疫性、
を維持しおいる。
これら免疫蛍光詊薬を䜿甚する堎合にも、装眮
における特別な倉曎はない。すなわち、通垞の分
光螢光光床蚈に赀倖線感応光電子増倍管を取付け
るだけである。特殊な感床の枬定は、ヘリりム―
ネオンレヌザヌ、ルビヌレヌザヌたたは簡䟿には
色玠レヌザヌの劂き赀色光たたは近赀倖の連続レ
ヌザヌたたはパルス化レヌザヌにより螢光発色団
を励起させるこずにより行なわれる。
これらの耇合䜓、特に螢光抗䜓を怜鏡の際䜿甚
するこずは、䜕ら問題点を生ずるものではなく、
赀倖線感光フむルムが必芁ずされるのみである。
たた、同䞀怜鏡プレパヌラトにおいお、スペクト
ルの緑―黄色域で螢光を発する埓来の螢光発色団
によりマヌクした抗䜓で着色した区域に察しおの
識別が可胜になる利点がある。
本発明は、䞋蚘䞀般匏を有する新芏な免疫蛍光
詊薬に係わる。
匏䞭、 ないしの敎数 に等しい敎数ただし、架橋剀がカルボむ
ミドの堎合には、 抗原たたは抗䜓から遞ばれる蛋癜質 架橋剀残基 酞玠たたはむオり原子 NH、NH2、NR″、NR′R″こでR′および
R″は同䞀たたは異なる眮換たたは未眮換の
アルキル基、アリヌル基、アリヌルアルキル
基たたはアルキルアリヌル基であるたたは
OCOR′ここでR′は前蚘ず同意矩であるの
䞭から遞ばれる基 R1、R2、R3、R4、R5、R7およびR8同䞀たたは
異なる氎玠原子たたはアミノ基、たたは眮換
たたは未眮換のアルキル基、アリヌル基、ア
ルキルアリヌル基たたはアリヌルアルキル基
R1およびR2およびたたはR7およびR8は
互いに結合しお芳銙環ずの瞮合環を圢成する
䟡の基であ぀おもよい。これらのうち少な
くずも぀倚くの堎合R3は架橋剀ずの
反応の際、―NH―たたは――基を
圢成するアミノ基でなければならない。 䞊蚘詊薬は、以䞋の各矀から遞ばれる各々少な
くずも皮類の化合物を反応させるこずにより調
補される。
(a) 抗原たたは抗䜓から遞ばれる蛋癜質 (b) 䞀般匏 匏䞭、R1、R2、R3、R4、R5、R7、R8、お
よびは前蚘ず同意矩であるで衚される可芖
域に吞収λmaxは550ないし800nmを有し
か぀少なくずも぀の遊離NH2および600ない
し900nmでの螢光を有するオキサゞンたたはチ
アゞンから遞ばれ染料 (c) 架橋剀䞀般に、染料のアミノ基ず反応しう
る基を有する二官胜性物質 各矀を構成するいく぀かの化合物を参考のため
に䟋瀺する。
蛋癜質 (i) スタフむロコツカス アりレりス
Staphylococcous aureusからのProtein  (ii) ホルモン蛋癜質 (iii) 各皮のγ―免疫グロブリンIgたずえば
IgG、IgM、IgA、IgD、IgE 染 料 (i) ナむルブルヌC.I.51180 (ii) クレゞルバむオレツトCresyl violet (iii) トルむゞンブルヌC.I.52040 (iv) ブリリアントクレゞルブルヌC.I.51010 架橋剀 (i) 䞀般匏 ―― ここでは眮換たたは未眮換のアルキレン
基、アリヌレン基、アルキルアリヌレン基たた
はアリヌルアルキレン基であるで衚わされる
ゞむ゜シアネヌト (ii) 䞀般匏 ――R′ ここでおよびR′は同䞀たたは異なる眮換
たたは未眮換のアルキル基、アリヌル基、アル
キルアリヌル基たたはアリヌルアルキル基であ
るで衚わされるカルボゞむミド (iii) 䞀般匏 CHO――CHO ここでは眮換たたは未眮換のアルキレン
基、アリヌレン基、アルキルアリヌレン基たた
はアリヌルアルキレン基であるで衚わされる
ゞアルデヒド (iv) 構造匏 で衚わされる゚チレン―無氎マレむン酞共重合
䜓EMA (v) 匏 を有するゞニトロベンれン これら぀の化合物の間の反応は、これら化合
物を単独で䜿甚しお行なうこずができ、たたこれ
ら化合物甚の溶媒、たずえば氎、少なくずも皮
類の塩の氎溶液たたは緩衝剀混合物の存圚䞋でも
行なうこずができる。溶媒のPHは4.5ないし9.5
で、染料の溶解床を高めるために少量の有機溶媒
を添加しおもよい。反応枩床はほが宀枩〜
℃ないし蛋癜質倉性枩床である。
蛋癜質―蛋癜質間の反応を防止するため、蛋癜
質に察しお倧過剰量ないし50倍のモル濃床
の染料を䜿甚しお反応を行なう。
たた、蛋癜質ず染料ずの総量に察しお倧過剰量
の架橋剀を䜿甚しお反応を行なう。
操䜜䞊の詳现に぀いおは以䞋の実斜䟋により明
らかになるであろう。しかしながら、これらの実
斜䟋は本発明を限定するものではなく、いかなる
皮類の物質に぀いおも有利に適甚できる。
実斜䟋  抗ヒト免疫グロブリン家兎血枅抗ヒト
IgGの免疫グロブリンフラクシペンを、二官胜
性物質ずしおグルタルアルデヒドを䜿甚しお、ナ
むルブルヌ・I.51180およびトルむゞンブ
ルヌC.I.52040でマヌクした。
たず、リン酞カリりム緩衝剀0.01MPH7.1
ml䞭に抗ヒトIgG2mgおよびナむルブルヌ1.3×
10-4ミリモルを含有する溶液に、最終のグルタル
アルデヒド濃床が0.05ずなるたでグルタルアル
デヒドを添加した。宀枩においお撹拌しながら反
応を30分間行ない、぀いで遊離のアルデヒド基を
亜硫酞氎玠ナトリりムにより捕集するこずにより
反応を停止した。Sephadex G25のクロマトグラ
フむヌにより未反応の染料を陀去した。
代衚的な実隓䟋では、蛋癜質染料のモル比が
1.8の螢光抗ヒトIgG―ナむルブルヌ耇合䜓、
あるいは1.2の抗ヒトIgG―トルむゞンブルヌ
耇合䜓が埗られた。
染料の濃床を、ナむルブルヌに぀いおはモル吞
収係数5.8×104を䜿甚しおλ635nmにおいお、
トルむゞンブルヌに぀いおはモル吞収係数3.1×
104を䜿甚しおλ620nmにおいお枬定した。
蛋癜質濃床に぀いおは、ε14、λ
280nmを䜿甚し、玫倖域での染料の吞収を補正す
るこずにより、あるいはケルダヌルミクロ法によ
り窒玠を枬定するこずにより算定した。
䞡耇合䜓ずも、結合ヒト免疫グロブリンの抗䜓
特性を明確に維持しおいた。
実斜䟋  二官胜性物質ずしおグルタルアルデヒドを䜿甚
し、ヒト絚毛膜性゜マトマモトロピンHCS
ずオキサゞン系染料、すなわちブリリアントクレ
ゞルブルヌC.I.51010ずの間の耇合䜓を調補
した。
HCS2.5mgおよび染料×10-4ミリモルを含有
するリン酞ナトリりム緩衝剀0.05M、PH7.8
mlに、最終グルタルアルデヒド濃床が0.1ず
なるたで、グルタルアルデヒドを添加した。宀枩
で時間反応を行な぀たのち、実斜䟋11の倍く反
応溶液を凊理しおHCSブリリアントクレゞル
ブルヌのモル比がの耇合䜓を埗た。
染料の割合に぀いおはモル吞収係数16500を䜿
甚しおλ633においお、HCSに぀いおはε
8.3を䜿甚しおλ278においお枬定した。
実斜䟋  架橋剀ずしおグルタルアルデヒドを䜿甚し、実
斜䟋ず同じ条件䞋で、ナむルブルヌずスタフむ
ロコツカス アりレりスからのProtein ずの間
の耇合䜓を調補した。
この耇合䜓の蛋癜質染料のモル比は1.5
であ぀た。
この堎合、Protein の枬定にあたり、ケルダ
ヌルミクロ法を䜿甚しない堎合には、ε
1.65、λ275を䜿甚する。
実斜䟋  構造匏 を有するトルむレン――ゞむ゜シアネヌト
TDICを二官胜性物質ずしお䜿甚し、抗ヒト
免疫グロブリン抗ヒトIgGをナむルブルヌ
C.I.51180でマヌクした。
反応を段階で行な぀た。第段階では、䜍
のむ゜シアネヌト基を抗ヒトIgGのNH2ず反応さ
せる。第段階では、遊離のTDICを含有しない
抗ヒトIgG―TDIC耇合䜓に37℃でナむルブルヌ
を添加し、第のむ゜シアネヌト基を染料のアミ
ノ基ず反応させる。
工皋 リン酞カリりム緩衝剀PH4.5、0.05M䞭に
γ―免疫グロブリンmgを含む溶液℃に冷华
したものにTDIC0.05mlを添加した。激しく撹
拌しながら℃で玄30分間反応を行ない、混合物
を遠心分離しお℃においお氎溶液䞭で沈殿する
未反応のゞむ゜シアネヌトを陀去した。溶解した
TDICを反応させるため、䞊枅液を℃でさらに
時間反応させた。
工皋 工皋の溶液に、ナむルブルヌ10-4ミリモルを
含有するリン酞塩緩衝剀0.1mlを添加した。反応
溶液を37℃で時間撹拌し、぀いで未反応む゜シ
アネヌト基を分解するために0.1M炭酞アンモニ
りムに察しお透析した。遊離の染料に぀いおは、
蒞留氎たたは䞭性の緩衝剀に察する透析および
Sephadex G25のクロマトグラフむヌにより陀去
した。
埗られた耇合䜓における蛋癜質ナむルブルヌ
のモル比は2.4であ぀た。なお、これらの算
定にあた぀おは、実斜䟋で蛋癜質および染料に
぀いお瀺した方法およびモル吞収係数を䜿甚し
た。
この耇合䜓の螢光匷床は、同じ濃床で遊離の発
色団を励起する際に埗られるものよりもかなり高
いものであ぀た。
実斜䟋  構造匏 CH3―CH2――CH2 ―CH2―CHNH―CH32 を有する―゚チル―――ゞメチルアミノ
プロピル―カルボゞむミドECDIを䜿甚し
お、ナむルブルヌC.I.51180をスタフむロコ
ツカス アりレりスからのProtein ず結合させ
た。
蒞留氎1.2ml䞭にProtein A5mgおよび倧過剰量
玄10倍モルのナむルブルヌを含有する溶液に
ECDI50mgを添加した。撹拌しながら宀枩で時
間反応を続け、その間、垌HClを添加するこずに
よりPHをないし6.8に維持した。その埌、氎を
たたは回亀換しながら生成物を48時間透析し
た。透析膜内で圢成されたコロむド状懞濁液を遠
心分離により陀去し、溶液䞭になお存圚する遊離
の染料をSephadex G25のクロマトグラフむヌに
より陀去した。
耇合䜓䞭におけるナむルブルヌの濃床に぀いお
は、氎䞭におけるモル吞収係数5.8×104を䜿甚
し、λ635で枬定した。蛋癜質の濃床に぀いお
は、ε1.65を䜿甚しおλ275nmで枬定
し、玫倖郚における染料の吞収を補正するこずに
より算定した。たた、より正確には、ケルダヌル
ミクロ法により窒玠を枬定するこずにより算定す
る。
代衚的な反応により、Protein ナむルブル
ヌのモル比がないし1.5このモル比は反応
時間および反応枩床を倉えるこずにより倉えられ
るであり、λ680nmにおける螢光匷床が同じ
濃床で遊離の発色団を励起するこずによ぀お埗ら
れるものよりも倧きい耇合䜓が埗られた。この方
法でマヌクしたProteni は、家兎免疫グロブ
リンで感䜜した矊赀血球のProtein −ナむルブ
ルヌによる凝集反応でなる受動血球凝集テストに
より瀺される劂く、結合免疫グロブリンの特性を
維持しおいた。
実斜䟋  実斜䟋の方法に埓぀お、ECDIの存圚䞋、ホ
ルモン蛋癜質、すなわちヒト絚毛膜性゜マトマモ
トロピンHCSをナむルブルヌでマヌクした。
各詊薬の量に぀いおは、HCS2.5mg、メタノヌ
ル0.05mlに溶解したナむルブルヌ10-3ミリモルお
よびECDI45mgであり、反応を氎ml䞭で行な぀
た。
蛋癜質の濃床はε8.3を䜿甚し、λ278
で枬定した。
埗られた螢光耇合䜓はモル比HCG染料
を有しおおり、ホルモンは抗HCG抗血枅
ず反応させる際、その抗原特性を維持しおいた。
実斜䟋  ECDIの存圚䞋で家兎γ―免疫グロブリンをマ
ヌクするためにトルむゞンブルヌC.I.52040
を䜿甚した。
反応の詳现は次のずおりである。
氎ml䞭にγ―免疫グロブリンmgおよびトル
むゞンブルヌ×10-4ミリモルを含有する反応混
合物を、垌HClでPH5.6に調敎した。ECDI25mgを
加え、撹拌しながら宀枩で反応を行な぀た。玄
時間埌、さらにECDI25mg加え、さらに時間反
応を続けた。最埌に、氎たたはむオン匷床の䜎い
䞭性緩衝剀に察しお48ないし72時間透析した。
染料に぀いおはモル吞収係数3.1×104、λ
620nm、蛋癜質に぀いおはε14、ε
280nmにより枬定しお、調補された耇合䜓のモル
比蛋癜質トルむゞンブルヌを算定したずころ、
1.1あ぀た。
このようにしおマヌクしたγ―免疫グロブリン
は抗γ―免疫グロブリンの存圚䞋で、その免疫特
性を維持しおいた。
【図面の簡単な説明】
第図および第図は、本発明による調補され
た各皮の耇合䜓および察照の発光スペクトルを瀺
すグラフである。

Claims (1)

  1. 【特蚱請求の範囲】  䞀般匏 匏䞭、はないしの敎数であり、は前蚘
    に等しい敎数たたはであり、は抗原たたは
    抗䜓から遞ばれる蛋癜質であり、は架橋剀の残
    基であり、は酞玠原子たたはむオり原子であ
    り、はNH、NH2、NR′およびNR′R″ここで
    R′およびR″は同䞀たたは異なる眮換たたは未眮
    換のアルキル基、アリヌル基、アリヌルアルキル
    基たたはアルキルアリヌル基であるおよび
    OCOR′ここでR′は前蚘ず同意矩を有するの䞭
    から遞ばれる基であり、R1、R2、R3、R4、R5、
    R7およびR8は同䞀たたは異なる氎玠原子、アミ
    ノ基たたは眮換たたは未眮換のアルキル基、アリ
    ヌル基、アルキルアリヌル基たたはアリヌルアル
    キル基であり、R1およびR2およびたたはR7お
    よびR8は互いに結合しお芳銙環ずの瞮合環を圢
    成する䟡の基であ぀おもよく、R1、R2、R3、
    R4、R5、R7およびR8のうち少なくずも぀は架
    橋剀ずの反応の際―NH―たたは―基を
    圢成するアミノ基でなければならないを有す
    る、免疫蛍光詊薬。  䞀般匏 匏䞭、はないしの敎数であり、は前蚘
    に等しい敎数たたはであり、は抗原たたは
    抗䜓から遞ばれる蛋癜質であり、は架橋剀の残
    基であり、は酞玠原子たたはむオり原子であ
    り、はNH、NH2、NR′およびNR′R″ここで
    R′およびR″は同䞀たたは異なる眮換たたは未眮
    換のアルキル基、アリヌル基、アリヌルアルキル
    基たたはアルキルアリヌル基であるおよび
    OCOR′ここでR′は前蚘ず同意矩を有するの䞭
    から遞ばれる基であり、R1、R2、R3、R4、R5、
    R7およびR8は同䞀たたは異なる氎玠原子、アミ
    ノ基たたは眮換たたは未眮換のアルキル基、アリ
    ヌル基、アルキルアリヌル基たたはアリヌルアル
    キル基であり、R1およびR2およびたたはR7お
    よびR8は互いに結合しお芳銙環ずの瞮合環を圢
    成する䟡の基であ぀おもよく、R1、R2、R3、
    R4、R5、R7およびR8のうち少なくずも぀は架
    橋剀ずの反応の際―NH―たたは―基を
    圢成するアミノ基でなければならないを有する
    免疫蛍光詊薬の補法においお、以䞋の矀(a)、(b)お
    よび(c)から遞ばれる各々少なくずも皮類の化合
    物を互いに反応させるこずを特城ずする、免疫蛍
    光詊薬の補法。 (a) 抗原たたは抗䜓から遞ばれる蛋癜質、 (b) 䞀般匏 匏䞭、R1、R2、R3、R4、R5、R7、R8、お
    よびは前蚘ず同意矩であるで衚される可芖
    域に吞収λmaxは550ないし800nmにある
    を有するオキサゞンたたはチアゞンから遞ばれ
    る染料、および (c) 䞀般に前蚘染料(b)のアミノ基ず反応しうる基
    を有する二官胜性物質の圢の架橋剀。  特蚱請求の範囲第項蚘茉の補法においお、
    前蚘぀の化合物の間の反応を、これら化合物の
    みを䜿甚しお、たたはこれら化合物甚の溶媒の存
    圚䞋で行う、免疫蛍光詊薬の補法。  特蚱請求の範囲第項たたは第項蚘茉の補
    法においお、奜たしくは氎、少なくずも皮類の
    塩の氎溶液たたは緩衝剀混合物の存圚䞋で反応を
    行う、免疫蛍光詊薬の補法。  特蚱請求の範囲第項ないし第項のいずれ
    か項に蚘茉の補法においお、PH4.5ないし9.5に
    おいお反応を行う、免疫蛍光詊薬の補法。  特蚱請求の範囲第項ないし第項のいずれ
    か項に蚘茉の補法においお、ほが宀枩においお
    反応を行う、免疫蛍光詊薬の補法。  特蚱請求の範囲第項ないし第項のいずれ
    か項に蚘茉の補法においお、反応枩床が奜たし
    くは℃ないし前蚘蛋癜質の倉性枩床の範囲から
    遞ばれる、免疫蛍光詊薬の補法。  特蚱請求の範囲第項ないし第項のいずれ
    か項に蚘茉の補法においお、前蚘蛋癜質に察し
    お倧過剰量の染料を䜿甚しお反応を行う、免疫蛍
    光詊薬の補法。  特蚱請求の範囲第項ないし第項のいずれ
    か項に蚘茉の補法においお、前蚘蛋癜質に察し
    おないし50倍モル濃床の倧過剰量で染料を
    䜿甚しお反応を行う、免疫蛍光詊薬の補法。  特蚱請求の範囲第項ないし第項のいず
    れか項に蚘茉の補法においお、蛋癜質および染
    料の総量に察しお倧過剰量の二官胜性物質を䜿甚
    しお反応を行う、免疫蛍光詊薬の補法。
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