DE2824917A1 - Biologisch aktive konjugate - Google Patents
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Description
Die Erfindung betrifft Konjugate aus biologisch aktiven Stoffen, die mit chemischlumineszenten Stoffen durch kovalente Bindung gekoppelt sind.
Es ist bekannt, die Ortung oder Analyse biologisch aktiver Stoffe durch Kennzeichnung der Moleküle zu erleichtern; als Kennzeichen werden beispielsweise Radioisotope, US-PS 3,555,143, fluorgene Stoffe, US-PS 3,940,475, oder Enzyme, US-PS 3,645,090, mit den biologisch aktiven Stoffen, wie Antikörpern, Antigenen, Enzymen, Hormonen und dergleichen, verbunden. Durch diese Kennzeichen kann z.B. der Verlauf pharmazeutischer Stoffe in lebenden Organismen verfolgt werden oder es kann Vorhandensein und Menge von Stoffen qualitativ und quantitativ analysiert werden, z.B. im Wege der Immunanalyse.
Mit Ausnahme der Kennzeichnung von Thyroxin nach H.R. Schroeder u.a. in Clinical Chemistry, Bd. 23, Nr. 6, S. 1132 (1977) sind Vorschläge zur chemolumineszenten Kennzeichnung biologisch aktiver Stoffe bisher nicht bekannt geworden.
Die Erfindung hat die Schaffung von chemolumineszent gekennzeichneten, biologisch aktiven Stoffen zur Aufgabe.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß durch Stoffe in Form eines Konjugats dadurch gelöst, dass dieses aus einer chemolumineszenten Komponente und einer biologisch aktiven Komponente besteht, welche neben einer funktionellen, chemolumineszenten bzw. biologisch aktiven Gruppe wenigstens je eine weitere, für die chemische Umsetzung geeignete Gruppe aufweisen, und über diese letzteren Gruppen kovalent miteinander verbunden sind.
Überraschenderweise ergibt die Bindung chemolumineszenter Kennzeichen an biologisch aktive Stoffe in der oben erläuterten Weise brauchbare Konjugate, in denen die chemolumineszenten und biologisch aktiven Eigenschaften voll erhalten bleiben.
Ein Anwendungsbeispiel dieser Konjugate ist z.B. die Verwendung als eine Komponente einer Antikörper-Antigen(Hapten)-Reaktion, die beispielsweise in Immunanalysen eine wichtige Rolle spielt.
An Hand der Zeichnungen sei die Erfindung weiter erläutert.
Das Schaubild der Figur 1 zeigt das Verhältnis der ausgesendeten Lichtenergie (Senkrechte) zum Luminolgehalt (in Mol. 10[hoch]12, Waagerechte).
Das Schaubild der Figur 2 zeigt eine Preizipitin-Kennlinie für ein Luminol-Immunoglobulin-Konjugat (Kaninchen).
Das Schaubild der Figur 3 zeigt die Dosis-(Mengen-) Kennlinie für ein Konjugatbeispiel.
Das Schaubild der Figur 4 zeigt eine Verdrängungskennlinie für ein Luminol-(Human-) Immunoglobulin-Konjugat.
Überraschenderweise erhält man erfindungsgemäß durch kovalente Bindung chemolumineszenter und biologisch aktiver Verbindungen Konjugate, in denen beide Eigenschaften fortbestehen.
Als chemolumineszente Verbindungen (CLC) werden hier Verbindungen oder deren Reste bezeichnet, welche unter bestimmten Umsetzungsbedingungen (z.B. oxidierenden Verhältnissen) zur Aussendung sichtbarer Lichtenergie fähig sind. Im Gegensatz zu Phosphor erfolgt die Stimulierung chemisch, nicht durch Strahlung. Dabei steht im Regelfall die ausgesendete Lichtmenge in Beziehung zur vorhandenen Menge der chemolumineszenten Verbindung oder Rest.
Hierzu gehören beispielsweise Laminol und seine Derivate, Luciferin, Lucigenin, Acridin, Pyrogallol, Indole, Riboflavin, Lophin, Tiazinfarbstoffe, oxalische Anhydride, Siloxene, Grignard´sche Verbindungen u.a.m. Weiteres Erfordernis der geeigneten Verbindung ist lediglich das Vorhandensein wenigstens einer für die Lichtaussendung nicht benötigten Gruppe, die direkt oder indirekt über zwischengelagerte Stoffe kovalente Bindungen mit einem biologisch aktiven Stoff eingehen kann, ohne dessen biologische Aktivität zu hemmen. Derartige nichtfunktionelle chemische Gruppen bestimmter chemolumineszenten Verbindungen können vom Fachmann auf Grund der Strukturkenntnis oder im Wege routinemäßiger Versuche bestimmt werden. Die biologisch aktiven Stoffe (meist Verbindungen) besitzen wenigstens eine funktionelle Gruppe oder aktive Stelle, welche an einer oder mehreren biologischen Reaktion in Organismen teilnimmt, und wenigstens eine nicht-funktionelle, also für die biologische Aktivität unwesentliche chemische Gruppe, welche für die direkte oder indirekte kovalente Bindung mit der einen oder mehreren Gruppe bzw. Gruppen der chemolumineszenten Verbindung zur Verfügung steht. Hierzu gehören beispielsweise Antikörper, Antigene, Haptene, Enzyme, Kofaktoren, Hormone, Drogen, Pharmazeutika, und dergleichen die alle eine oder mehrere biologisch aktive Stellen aufweisen. Die zur Bindung an die chemolumineszente Verbindung geeignete, nicht-funktionelle chemische Gruppe kann vom Fachmann ohne weiteres bestimmt werden.
Die erfindungsgemäß erzielten Konjugate sind generell zur Kennzeichnung (Etikettierung) biologisch aktiver Stoffe geeignet. Ein besonders günstiges Anwendungsgebiet ist die Immunanalyse, welche die Spezifizität der Komplexbildungen zwischen einem Antikörper und einem spezifischen Komplexbildner, z.B. einem spezifischen Antigen oder Hapten, für die Bestimmung des Vorhandenseins und der Menge geringer Stoffmengen z.B. in Organismenflüssigkeiten, insbesondere auch im menschlichen Körper, ausnützt. Hierbei muß eine der Komplexkomponenten (Antikörper, Antigen, Hapten) mit einem leicht feststellbaren Kennzeichen, wie z.B. einem Radioisotop, einem fluorgenen Stoff oder einem Enzym gekennzeichnet (etikettiert) werden. Das Kennzeichen oder ein Teil desselben lässt sich quantitativ messen. Verschiedene Immunanalysemethoden sind bekannt. Eine typische Immunanalyse, die beispielsweise unter Verwendung gekennzeichneter Antigene, erfordert die vier Schritte: Inkubation, Trennung, Quantifizierung des Kennzeichens und Korrelation.
Bei der Inkubation tritt eine unbekannte, ungekennzeichnete Antigenmenge mit einer bekannten, gekennzeichneten Antigenmenge um eine begrenzte Anzahl komplexbildender Stellen auf den für das Antigen (in gekennzeichneter und ungekennzeichneter Form) spezifischen Antikörpern in Wettbewerb. Nach der Inkubation werden die wenigstens einen Teil des gekennzeichneten Materials enthaltenden Komplexe von den (das restliche gekennzeichnete Material enthaltenden) übrigen Inkubationsstoffen in bekannter
Weise getrennt. Zur Erleichterung der Trennung kann einer der Komponenten auf einem unlöslichen Träger fixiert werden, sodaß eine feste Phase entsteht. Die US-PS 3,55,143 beschreibt organische, die US-PS 3,652,761 und 3,975,511 anorganische Träger.
Nach der Trennung wird die Menge der in den abgetrennten Komplexen, oder in der übrigen Lösung verbleibenden Kennzeichen bestimmt und mit einem Standard- oder Vergleichswert in Beziehung gesetzt. Damit ist Vorhandensein und Menge der unbekannten Verbindung bestimmt.
Verschiedene Ausbildungen und Abänderungen dieser Methode sind bekannt, vgl. z.B. Radioimmunoassay Methods, herausgegeben von K.E. Kerkham und W.M. Hunter Churchill, Livingston, Edinburgh & London (1971), und L. Wide, a.a.O., s. 405-413.
Die Beispiele erläutern die Erfindung für den Anwendungsfall der Immunanalyse, jedoch ist die Erfindung generell für die Kennzeichnung biologisch aktiver Stoffe geeignet.
Beispiel I
Luminol wurde hier als repräsentatives Beispiel für chemolumineszente Verbindungen gewählt, welche als Kennzeichen für Antigen- oder Antikörpermoleküle in Immunanalysen verwendet werden können. In Frage kommen alle Immunanalysen mit einer Trennung freier und durch Antikörper gebundener Antigene. Luminol wird hierbei oxidiert
und erzeugt sichtbares Licht der Wellenlänge 430 nm, das mit einem Photovervielfacher gemessen wird. Die Lichtstärke ist dann der Menge der mit Luminol gekennzeichneten Antigene oder Antikörper unmittelbar proportional, und diese nehmen mit steigenden Anteilen ungekennzeichnete Antigene oder Antikörper ab. Auf Grund einer erstellten Mengen-Intensitätskennlinie können unbekannte Antigenmengen in Seren bestimmt werden.
Im Beispielfall wurde als gekennzeichnetes Antigen das Gamma-Globulin von Kaninchen (RIgG) und als Antikörper hierzu Ziegen-Antikörper gezüchtet, und eine Mengen-Intensitätskennlinie für 5-25 µg Kaninchen-IgG aufgestellt. Die Analyse einer Probe normalen Kaninchenserums ergab 10 mg/ml IgG. Dies entspricht dem allgemein üblichen Annahmewert für IgG in normalen Kaninchenseren.
Ein wesentlicher Vorteil bei dieser Analyse ist die Möglichkeit der Verwendung einfach strukturierter Moleküle, wie Luminol, anstatt der bisher notwendigen Enzyme, radioaktiver Stoffe oder der Kennzeichnung auf Grundlage molekularem Spins. Die erfindungsgemäße Immunanalyse ist wesentlich einfacher, und die Kennzeichnung ist beständiger als Enzyme oder radioaktive Kennzeichen.
Kovalente Bindung von Luminol.
Luminol hat die Strukturformel
Die aromatische Amingruppe eignet sich auf verschiedene Weise zur Bildung eines kovalenten Komplexes von Luminol mit Proteinen, Hormonen, Kohlehydraten oder anderen chemisch aktiven Molekülen. Im Beispiel wurden drei verschiedene Kopplungsarten angewendet.
Im ersten Fall wurde das Luminol mit Natriumnitrit in Essigsäure direkt diazotisiert
Das diazotisierte Luminol bildet durch Umsetzung mit Tyroxin und Histidinresten in Proteinen eine Diazobindung.
Bei der zweiten Bindungsmethode wurden durch Perjodatoxidation von Kohlenwasserstoffgruppen von Glucoproteinen oder Kohlehydratmolekülen Aldehydgruppen gebildet. Diese Aldehydgruppen bilden durch Umsetzung mit der Aminogruppe des Luminols eine Iminkette (Schiff´sche Umsetzung). Mit dieser Methode wurde Luminol an Kaninchen-IgG gebunden.
Bei der dritten Methode wurde mit Zyanursäure ein Dichlortriazinylderivat von Luminol bereitet:
Die Chlorgruppe des DTAL (Dichlortriazinyl-Luminol) bildet durch Umsetzung mit zahlreichen verschiedenen Nucleophilen wie Amin- oder Hydroxylgruppen eine beständige chemische Bindung mit sehr vielen verschiedenen Molekülen.
Luminol-Kaninchen IgG Konjugat 1 mg Luminol und 10 mg Kaninchen IgG werden in 5 ml Wasser gelöst, 3 ml einer 1,5 mg/ml KIO[tief]4 enthaltenden Lösung zugesetzt, der pH mit 4N HCl auf 4,7 eingestellt, und die Lösung abgedunkelt 45 Minuten lang gerührt. Dann wurde noch 1 ml KIO[tief]4 zugesetzt und der pH mit 4N NaOH auf 7,2 eingestellt. Nach 2 Stunden weiterer Umsetzung im Dunkeln wurde die Lösung durch eine Sephadex (G-25-fein) Kolonne geleitet und nicht umgesetztes Luminol entfernt.
Die Protein enthaltenden Fraktionen wurden zusammen auf chemolumineszente Aktivität untersucht. Die Messung ergab einen äquivalenten Luminolgehalt von 8 x 10[hoch]-7 M. Der geschätzte Proteingehalt betrug etwa 3,5 x 10[hoch]-7 M. Der Komplex hatte somit eine luminolspezifische Aktivität von ca. 1 Luminolmolekül auf 4 IgG Moleküle.
Messung der chemolumineszenten Aktivität
Die Luminoloxidation ergibt ein Phthalatjon, Stickstoff und Photonen:
H[tief]2 O[tief]2 ist das Oxidiermittel, Haemin wirkt als Katalysator. Andere Katalysatoren oder Umsetzungsbeschleuniger sind Metalljonen wie Fe(II), Fe(CN)[hoch]-3 [tief]6, Cr(II) und Co(II). Weitere CL erzeugende Oxidiermittel sind z.B. Hypochlorit, Jod, Permanganat, Sauerstoff.
Luminol, H[tief]2 O[tief]2 und Haemin wurden in einer Durchlaufzelle in Nähe eines Photovervielfachers gemischt. Die Lichtenergie wird mit einer Anstiegszeit von 1,5 Sek. erzeugt und erreicht die Höchstintensität 30 Sek. nach Mischung der Umsetzungsteilnehmer. Die erzeugte Lichtenergie wird verstärkt und aufgezeichnet. Bei Einführen einer Luminol enthaltenden Probe entsteht ein Rechteckimpuls, dessen Impulshöhe oder Spitze der molaren Luminolkonzentration direkt proportional ist, s. Fig. 1. Mit dieser Standard- oder Vergleichskennlinie kann die äquivalente Luminolkonzentration (ELC) der Luminolkomplexe bestimmt werden.
Messung der immunologischen Aktivität von luminolgekennzeichnetem Kaninchen IgG.
Die Praecipitinumsetzung zwischen Ziegen-anti-IgG und Kaninchen-IgG wurde zur Bestimmung der immunologischen Aktivität des Luminol-Kaninchen IgG Komplexes (RIgG-LUM) benützt, und dabei in folgender Weise vorgegangen.
Eine Endkonzentration von 8 x 10[hoch]-7 M RIgG-LUM wurde mit verschiedenen Mengen (1-50 µls) Ziegen Anti-Kaninchen IgG Serum über
Nacht bei 25°C in 0,03 M phosphatgepufferter Salzlösung - 0,1% BSA, pH 7,5, Endvolumen etwa 0,4 mls - inkubiert.
Die Ausfällungen wurden bei 1000 g, 4°C, 4 Min. zentrifugiert und mit 0,15 M NaCl gewaschen.
Zur Prüfung der Luminol-Aktivität wurden die Ausfällungen in 0,1 ml 0,5 M KOH 30 Min. gelöst, und mit 0,03 M PBS (phosphatgepufferter Salzlösung) wieder auf 7,5 pH, bei einem Endvolumen von 1 ml, eingestellt. 0,1 ml dieser Lösung wurden auf die äquivalente Luminolkonzentration (ELC) untersucht. Figur 2 zeigt die Ergebnisse, als Prozentsatz der Gesamt-ELC, oder gebundene %. An Hand der diese gebundenen Prozent ergebenden Konzentration Antiserum und gekennzeichnetes IgG wurde die Mengen-Intensitäts- oder Verdrängungskennlinie für ungekennzeichnetes Kaninchen-IgG ermittelt.
Verdrängung von RIgG Luminol durch RIgG.
Einer Endkonzentration von 8 x 10[hoch]-7 M RIgG-LUM und 20 µls GARIgG Serum in 0,4 mls Volumen wurden 0-25 µgs Kaninchen IgG in Steigerungsraten von je 5 µgs zugesetzt. Die Ausfällungen wurden mit 1000 g 45 Min. bei 4°C zentrifugiert und dann in 0,15 M Salzlösung gewaschen. Zur Prüfung der Chemolumineszenzaktivität wurden die Ausfällungen in 0,5 M KOH gelöst und der pH mit 0,5 M HCl und 0,03 M PBS wieder auf 7,5 gebracht, bei einem Endvolumen von 1 ml. 0,1 M dieser Lösung wurden auf ELC geprüft. Figur 3 zeigt die Standard- oder Vergleichskennlinie
mit dem gebundenen ELC Prozentsatz (Senkrechte) und dem log µg Kaninchen IgG pro Reagenzglas (Waagerechte), wobei für den Bereich 5-25 µg Kaninchen IgG eine lineare Kennlinie entsteht. Drei Proben von normalem Kaninchenserum (NRS) wurden in der gleichen Weise auf IgG Gehalt analysiert, wobei als Ergebnis ein Anteil von 10,3 plus/minus 1,4 mg IgG/ml erhalten wurde. Da der allgemeine Annahmewert 10 mg IgG/ml ist, ist das Ergebnis also richtig und bestätigt die Brauchbarkeit des Verfahrens.
Beispiel II
Luminol IgG Konjugate von Menschen
Mit dem für Kaninchen IgG Verfahren nach Beispiel I wurde Luminol mittels Perjodat an IgG vom Menschen chemisch gekoppelt. Der erhaltene Komplex hatte eine luminolspezifische Aktivität von annähernd 1 Luminolmolekül für je 6 IgG Moleküle. Nach Beispiel I wurde für dieses Luminol-HIgG Konjugat die in Figur 4 dargestellte Kennlinie entwickelt. Sie zeigt die Luminolaktivität der Immunausfällung (R-Anti-Human IgG) als Funktion des ungekennzeichneten Human IgG. Die Reagenzgläser mit den Analysestoffen wurden 48 Std. bei 4°C inkubieren gelassen. Ähnliche Ergebnisse wurden bei 16 Std. Inkubation bei 25°C erhalten. Anschließend wurden im Handel erhältliche Vergleichsseren mit bekanntem hohen, durchschnittlichen und niedrigen Human IgG Gehalt unter Verwendung des Luminol-IgG-Kennzeichens in der folgenden Weise analysiert, (HIgG-LUM-Praezipitinmethode).
Auf der Grundlage von 0,05 mls HIgG-LUM (5 x 10[hoch]-6 M) und Mengen von 0,5 - 10 - 15 - 30,25 und 50 µgs/Reagenzglas von HIgG (Cappel) und 0,05 mls IgG Fraktion vom Kaninchen-Anti-HIgG Serum (Miles) wurde eine Standardkennlinie aufgestellt. HIgG Standardseren (Hyland) wurden mit je 0,1 ml Proben der 1:100 verdünnten Seren I, II und 1:20 verdünntem Serum III - verdünnt in 0,03 M PBS - 0,1% BSA, pH 7,5 - analysiert. Die Reagenzgläser wurden 48 Std. bei 4°C inkubiert, Endvolumen 0,4 mls in 0,03 MPBS - 0,1% BSA, pH 7,5. Die entstandene Ausfällung wurde mit 3000U/Min. 30 Min. lang zentrifugiert, der Überstand abgesaugt, und der Rückstand einmal mit 1 ml 0,15 M NaCl gewaschen. Zur Luminolbestimmung wurde die Ausfällung in 0,5 N KOH erneut gelöst, mit HCl auf pH 7 eingestellt, auf 1 ml in PBS ergänzt und auf 1:5 in BPS verdünnt.
Tabelle I enthält die Ergebnisse (Einzelbestimmung)
Tabelle I
Beispiel III Luminol-Digoxin-Konjugate
Als typisch niedrig-molekularer Stoff wurde Digoxin in der folgenden Weise kovalent an Luminol gebunden:
3 mg Digoxin wurden in 3 ml Alkohol (denaturierter, 95%-iger Äthylalkohol) gelöst. Die Lösung wurde einer zweiten 15 mg Luminol in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,2, enthaltenden Lösung beigegeben. Dann wurden 5 ml einer 1,8 mg Kaliummetaperjodat tropfenweise und unter Umrühren zugesetzt. Die Umsetzung wurde im Dunkeln bei Zimmertemperatur und ständigem Rühren 5 Std. fortdauern gelassen. Das nicht umgesetzte Luminol wurde vom Luminol-Digoxin in einer mit Digoxinlösung vorbehandelten Sephadexsäule getrennt. Die Analyse des Konjugats durch Luminolaktivität und UV-Absorption ergab 1 aktives Luminolmolekül auf 25 Digoxinmoleküle.
Beispiel IV
Luminol wurde an Chorionisches Gonadotropin vom Menschen (HGC) kovalent gebunden, indem zunächst das HGG mit dem Azyliermittel 3-(4-Hydroxyphenyl) Propionester und N-Hydroxysucciniumidester (Bolton-Hunter-Reagens-BHR) vorumgesetzt, und dann mit diazotisiertem Luminol umgesetzt wurde. Zweck der Vorumsetzung ist die Schaffung mit dem diazotisierten Luminol umsetzungsbereiter, zusätzlicher tyrosinähnlicher Reste.
Es wurde folgendermaßen vorgegangen:
0,5 mg gereinigtes HCG wurden in 5 ml 0,05 M NaHCO[tief]3, pH 9 gelöst und dann auf 0°C gekühlt. Dann wurden 3,5 mg BHR zugesetzt und die Lösung bei 0°C 60 Min. gerührt. Während die HCG-BHR-Umsetzung fortschritt, wurden zur Luminol-Diazotisierung 2,3 g
Luminol in 3 ml Eisessigsäure gelöst, dann 4 ml Wasser zugesetzt, die Lösung auf 0°C gekühlt, 1,3 mg NaNO[tief]2 zugesetzt, und die Diazotisierung 35 Min. bei 0°C fortschreiten gelassen. Das diazotisierte Luminol wurde der auf 0°C gehaltenen HCG-HBR-Umsetzungslösung tropfenweise zugesetzt und der pH mit 4 N NaOH auf 9 gehalten und 20 Std. bei pH 9 und 4°C umsetzen gelassen. Die nichtumgesetzten Stoffe wurden mit einer Sephadexsäule (G - 25 - superfein) vom HCG-Luminol-Konjugat abgetrennt. Die HCG enthaltenden Fraktionen wurden auf Luminol- und HCG-Gehalt wie oben beschrieben bzw. durch Radioimmunanalyse geprüft, was ein Konjugat mit 1 Molekül Luminol auf je 2 Moleküle HCG ergab.
Beispiel V
Luminol wurde an Rinderserumeiweiß (BSA) gebunden, indem zunächst durch Umsetzung mit Zyanursäure Dichlortriazinylaminoluminol (DTAL) gebildet, und dieses mit BSA umgesetzt wurde.
Hierzu wurden zunächst 60 mg Luminol in 75 ml heißem Methylalkohol gelöst und die Lösung auf 0°C gekühlt. Dann wurden 64,5 mg Zyanurchlorid in 5 ml Azeton gelöst, auf 0°C gekühlt und der Luminollösung beigefügt und 63 Std. bei Zimmertemperatur umsetzen gelassen. Die entstandene gelbe Ausfällung wurde abfiltriert, mit kaltem Azeton gewaschen und bei 25°C im Vakuumofen getrocknet. Zur Kopplung von DTAL an BSA wurden 13,3 mg BSA in 2,5 ml 0,1 M Borsäure, pH 9, gelöst. Dann wurden 4,5 mg DTAL in 8 ml 0,1 M Borsäure, pH 9 gelöst, der BSA-Lösung beigegeben und 20 Std. bei 4°C umsetzen gelassen. Schließlich wurde
nicht umgesetztes DTAL von dem BSA-Luminolkonjugat mit einer Sephadexsäule (G-25) getrennt. Die Untersuchung der BSA enthaltenden Fraktionen auf Luminolaktivität ergab ein BSA-Luminolkonjugat mit 1 Luminolmolekül auf 10 BSA Moleküle.
Beispiel VI
Als Beispiel einer weiteren chemolumineszenten Verbindung wurde Luciferin gewählt, das in Gegenwart von Luciferase, Mg[hoch]+2 und ATP, Licht aussendet. Zur Herstellung eines Luciferin-BSA-Konjugats wurde durch Diazotisierung von 4,4´-Methylendianilin (MDA) eine bifunktionelle Diazoniumverbindung hergestellt, welche kovalente Bindungen sowohl mit Luciferin als auch mit BSA eingeht. Hierzu wurden zunächst 1,3 mg MDA in 3 ml Wasser gelöst, der pH mit 4N HCl auf 1,8 eingestellt und die Lösung auf 0°C gekühlt, dann 1,6 mg NaNO[tief]2 zugesetzt, und 35 Min. umsetzen gelassen. Gleichzeitig wurden 2 mg Luciferin zusammen mit 19,3 mg BSA in 8 ml 0,1 M Na[tief]2 CO[tief]3, pH 10 gelöst und auf 0°C gekühlt. Das diazotisierte MDA wurde dann der gleichmolarigen BSA-Luciferinmischung zugesetzt und 20 Std. bei 4°C umsetzen gelassen. Die nicht umgesetzten Stoffe wurden vom BSA mit einer Sephadexsäule (G-25) getrennt. Die Untersuchung der BSA enthaltenden Fraktionen auf Luminolaktivität ergab eine effektive Konzentration von 1 Molekül Luciferin auf 50 Moleküle BSA.
Beispiel VII
Als weiteres Beispiel wurde Lucigenin, das Licht in Gegenwart von Wasserstoffperoxid und Haematin aussendet, an BSA gebunden. Hierzu wurde die Umsetzungsbereitschaft des Lucigeninmoleküls mit verschiedenen Nucleophilen nach folgender Formel ausgenützt:
Zunächst wurden 10 mg BSA und 6 mg Lucigenin in 10 ml 0,1 M Zitronensäure, pH 6, gelöst, dann die Mischung bei Zimmertemperatur 24 Std. lang gerührt. Sodann wurde das nicht umgesetzte Lucigenin vom Lucigenin-BSA Konjugat mit einer Sephadexsäule (G-25) abgetrennt. Mit der oben erwähnten Durchlaufzelle wurde die chemolumineszente Aktivität des Konjugats gemessen und ergab 1 aktives Lucigeninmolekül auf 30 Moleküle BSA.
Die Tabelle zeigt Beispiele von Konjugaten biologisch aktiver Stoffe verschiedenen Molekulargewichts, die in verschiedener Weise gekoppelt werden, und das effektive Verhältnis der chemolumineszenten Moleküle zu den biologisch aktiven Stoffen.
Tabelle III
In weiteren Versuchen wurde Luminol an Kaninchen-Antikörpermoleküle durch Perjodatbindung gekoppelt. Auch hier zeigten die Immunausfällungen Luminolaktivität.
Claims (10)
1. Biologisch aktives, gekennzeichnetes Konjugat, dadurch gekennzeichnet, dass es aus einer chemolumineszenten Komponente und einer biologisch aktiven Komponente besteht, welche neben einer funktionellen, chemolumineszenten bzw. biologisch aktiven Gruppe wenigstens je eine weitere, für die chemische Umsetzung geeignete Gruppe aufweisen, und über diese letzteren Gruppen kovalent miteinander verbunden sind.
2. Konjugat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die biologisch aktive Komponente aus einem Antikörper, Antigen, Hapten, Enzym, Hormon oder einem pharmazeutisch aktiven Stoff besteht.
3. Konjugat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die chemolumineszente Komponente aus Luminol oder dessen Derivat, Luciferin, Lucigenin, Acridin, Pyrogallol, Indol, Riboflavin, Lophin, Thiazinfarbstoff, Oxalanhydrid, Siloxen oder Grignardverbindungen besteht.
4. Konjugat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die chemolumineszente Komponente mit der biologisch aktiven Komponente über eine Diazobindung oder eine Iminbindung, oder eine Triazinbindung gekoppelt ist.
5. Konjugat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die beiden Komponenten über für die Chemolumineszenz und die biologische Aktivität unwesentliche Gruppen aneinander kovalent gebunden sind.
6. Konjugat nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die chemolumineszente Komponente Luminol ist, und dieses mit seinem Aminorest über eine Diazobindung an die biologisch aktive Komponente gekoppelt ist.
7. Konjugat nach Ansprüchen 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass die biologisch aktive Komponente ein Protein ist.
8. Konjugat nach einem der Ansprüche 1-7, gekennzeichnet durch die Verwendung in der Immunanalyse.
9. Verfahren zum Nachweis oder zur Konzentrationsbestimmung einer Art der Antigen-Antikörperreaktion, dadurch gekennzeichnet, dass eine die zu bestimmende Art enthaltende wässerige Probe zusammen mit einer Art der Antigen-Antikörperreaktion in ungekennzeichnetem Zustand, und der anderen Art in gekennzeichnetem und kovalent an ein chemolumineszentes Molekül gebundenem Zustand inkubiert wird und dabei wenigstens teilweise die gekennzeichnete Art enthaltende, immunchemische Komplexe erzeugt werden, diese von den übrigen Inkubationsstoffen getrennt, und die in den ersteren oder letzteren enthaltenen
Mengen der gekennzeichneten Art bestimmt und mit einem Standardwert verglichen wird.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die ungekennzeichnete Art an einen wasserunlöslichen Träger gebunden ist.
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Also Published As
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FR2397449A1 (fr) | 1979-02-09 |
JPS5420132A (en) | 1979-02-15 |
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