DD202474A5 - Verfahren zur herstellung von antigenen, antikoerpern und deren komplexen - Google Patents

Abstract

Beschrieben wird ein Verfahren zur quantitativen und qualitativen Bestimmung von Antigenen, Antikoerpern und deren Komplexen mittels einer chemolumineszierenden Markierungssubstanz und einem Anregungsmittel hierfuer unter Anwendung an sich bekannter heterogener Fest- oder Fluessigphasenassays. Dabei wird eine der folgenden Kombinationen aus Anregungsmittel und Markierungssubstanz a) H tief 2 O tief 2 /Chloramin (bzw. -derivat) - Fluoreszein (bzw. -derivat), Methylenblau (bzw. -derivat) oder Thionin (bzw. -derivat) und b) Calciumhypochlorit - Fluoreszein (bzw. -derivat) verwendet. Dieses Verfahren laesst sich einfach, ohne Gefaehrlichkeit des damit befassten Personals und mit hoher Wirksamkeit durchfuehren.

Description

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Verfahren zur Bestimmung von Antigenen, Antikörpern und deren Komplexen

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur quantitativen und qualitativen Bestimmung von Antigenen, Antikörpern und deren Komplexen mittels einer chemolumineszierenden Markierungssubstanz und einem Anregungsmittel hierfür unter Anwendung an sich bekannter heterogener Assays.

Das Verfahren wird angewandt zum Messen von Antigenen, Antikörpern oder deren Komplexen in Sekreten,- Bxkreten und Körperflüssigkeiten von Wirbeltierorganismen sowie von Menschen. Auf diese Weise können u. a· diagnostische Aussagen gemacht werden·

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Es ist bekannt, eine serologische Reaktion durch Markierung einer oder mehrerer Reaktionskomponenten mit einem radioaktiven Isotop, durch Konjugierung mit einem Enzym, einem Fluoreszenzfarbstoff oder einer chemolumineszierenden Substanz, wie Luminol oder luciferin, nachzuweisen.

Das Radioimmunoassay wird in Journal Clinical Endocrinology 27 (1967), S. 973 und Ibid 28 (1968), S. 343, beschrieben. Der wesentliche Hachteil dieses Assays liegt in dem notwendigen Umgang mit strahlenemittierenden Isotopen und in der erforderlichen aufwendigen Ausrüstung zur Durchführung eines solchen Assays.

Bei der Markierung einer Reaktionskomponente mit einem Enzym besteht der Nachteil darin, daß diese Markierung kompliziert durchzuführen und das hergestellte Reaktionsprodukt schwierig

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aufzubewahren und zu gebrauchen ist.

Darüber hinaus handelt es sich bei den einzusetzenden Enzymen um biologisch aktive Substanzsnextrem komplexer Natur, auf die die erwähnten Schwierigkeiten zurückgehen· Die schließlich zum Nachweis des gebundenen Snzyms einzusetzenden Substrate sind darüber hinaus noch kanzerogen. Das isir nachteilig· Das Enzym-Assay der beschriebenen Art wird in Bull. World Health Organ £3. (1976) abgehandelt.

Bei der Fluoreszenztechnik wird ein Antigene und Antikörper enthaltendes Reaktionsprodukt durch Fluoreszenz unter Bestrahlung mit kurzwelligem Licht nachgewiesen· Hierbei muß das Anregungslicht vom emittierten Licht nachteiligerweise mit großem, apparativem Aufwand abgetrennt werden.

Bei den bisher zur Chemolumineszenz herangezogenen chemolumineszierenden Substanzen handelt es sich um solche, die nur sehr schwer an die Reaktionspartner einer serologischen Reaktion zu binden sind und darüber hinaus bis zu 99,3 %

(' '; "" "ihrer" ursprünglichen Lumineszenz nach der Bindung verlieren«

Das ergibt sich z. B. aus Nature, Vol. 299 (1979), S. 646-647· Des weiteren wird in Journal of Immunological Methods 21_ (1978), S. 178-184, darüber berichtet, daß das chemolumineszierende Luminol aus diesem Grunde für klinische Eoutinelabortests ungeeignet ist.

Dem stehen Angaben in der US-PS 4 193 983 entgegen. Dort wird gerade Luminol als eine besonders geeignete Verbindung für diesen Zweck angegeben. Als Anregungsmittel für. die Chemolumineszenz sollen Wasserstoffperoxid oder Calciumhypochlorit in Betracht kommen» Des weiteren wird in dieser US-Patentschrift Fluoreszeinisothiocyanat für ein homogenes Fluoreszenz-Assay erwähnt»

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Trotz intensiver Bemühungen war es bisher nicht möglich, ein Verfahren der eingangs beschriebenen Art bezüglich Aufwand und Effizienz zufriedenstellend durchzuführen· Das .gilt zum Beispiel auch für das in der US-PS 4 238 195 beschriebene Assay. Dort werden Markierungssubstanzen in Form von !Fluoreszein und dessen Derivaten vorgeschlagen, die mittels besonders energiereicher Produkte angeregt werden sollen. Diese Produkte werden durch eine sehr komplexe Reaktion zwischen Oxalsäurederivaten, u. a. Oxalylchlorid, und Wasserstoffperoxid hergestellt. Ihre Herstellung erfordert einen hohen Arbeitsaufwand. Darüber hinaus sind derartige Produkte nicht unbedenklich, da sie unter Umständen das giftige Phosgen entwickeln können·

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines verbesserten "Verfahrens zur Bestimmung von Antigenen, Antikörpern und deren Komplexen, das die Nachteile der bekannten Bestimmungsverfahren vermeidet.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, aus der Vielzahl der bekannten chemoluminessierenden Markierungssubstanzen und Anregungsmitteln solche Kombinationen derselben aufzufinden, die es gestatten, das eingangs beschriebene Verfahren so zu verbessern, daß es gefahrlos, einfach und mit hoher Effizienz durchführbar ist«

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe dadurch gelöst, daß eine der folgenden Kombinationen aus Anregungsmittel und Markierungssubstanz

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a) H₂Op/Chloramin (bzw* -derivat) - Fluoreszein (bzw. -derivat), Methylenblau (bzw. -derivat) oder Thionin (bzw. -derivat)

und

b) Calciumhypochlorit - Fluoreszein (bzw. -derivat).

verwendet werden.

Wenn im Zusammenhang mit .der Erfindung von Antigenen und Antikörpern gesprochen wird, so sollen diese Begriffe weitestgehend verstanden werden. Bei Antigenen handelt es sich um Stoffe, die nach Einführung in den Organismus von Menschen und Tieren die Bildung von Antikörpern hervormfen. Als Antigene wirken artfremde Eiweißstoffe tierischer und pflanzlicher Herkunft, besonders diejenigen von Infektionserregern, sowie viele Stoffe komplizierter latür mit fett-, saccharid (bzw. zucker)-, amin- und azoartiger Struktur. So kann es sich dabei um Substanzen, z. B. Proteide, Proteine, Polysaccharide, Lipide oder nucleinsäuren handeln, die im Organismus—von Wirbeltieren sowie von Menschen die Bildung von Antikörpern hervorrufen und spezifisch mit diesen reagieren· Auch sollen hierzu ganz allgemein Haptene gezählt werden, zu denen man auch "unvollständige Antigene" sagt, die ?/egen ihrer geringen Größe allein keine. Bildung von Antikörpern bewirken, jedoch mit den entsprechenden Antikörpern eine spezifische Bindung eingehen können. Antigene können z. B. Viren, Bakterien oder Pilze oder Teile von diesen sein» Darüber hinaus sind z. B. auch bestimmte Hormone, Vitamine, Enzyme oder bestimmte Medikamente dem Begriff "Antigen" unterzuordnen. Zur Definition der Begriffe "Antigene" und "Antikörper" sei auf Kabat "Einführung in die Immunchemie und Immunologie", Springer Verlag, 1971, S. 9-25 und S. 143-197 verwiesen.

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Im Sinne der Erfindung handelt es sich bei Antikörpern um spezifische Produkte der Immunentwort, die im Wirbeltierbzw· im menschlichen Organismus nach einem Antigenkontakt gebildet werden und spezifisch mit dem Antigen reagieren können, lieben die Antikörper sollen ausdrücklich bestimmte Bindeproteine gestellt werden, die sich,spezifisch an ein oder mehrere Substanzen, wie z« B. Antikörper, binden können» Ein Beispiel hierfür ist das Protein A. Von besonderer Bedeutung sind die Antikörper, die den Immunglobulinen der Klasse IgG, IgTi, IgA und IgE unterzuordnen sind. Diese werden im einzelnen in Kabat "Einführung in die Immunchemie und Immunologie", Springer Verlag, 1971, S· 143-197, beschrieben.

Von besonderer Bedeutung ist das erfindungsgemäße Verfahren zum nachweis von Antigenen und Antikörpern bei viralen und bakteriellen Erkrankungen. Dabei ist der lachweis des Oberflächenantigens des Hepatitis-B-Virus von ganz besonderer Bedeutung· Mit besonderem Vorteil gelingt auch der !Nachweis von Antikörpern gegen die Herpes- oder Toga-Viren.

Bei der Verwendung von Fluoreszein oder Fluoreszeinderivaten hat es sich gezeigt, daß sie sich besonders gut- an Proteine bzw. Proteide binden lassen. Das bedeutet, daß Fluoreszein mit einer oder mehreren Gruppen substituiert ist, die dessen Affinität im Hinblick auf die Kopplung mit den erwähnten Antigenen und Antikörpern begünstigen. Als besonders vorteilhaft haben sich dabei die Isothiocyanat- und Isocyanatgruppe als die Kopplung vermittelnde bzw. begünstigende Substituenten erwiesen. Eine besonders bevorzugte Stellung der Isothiocyanatgruppe ergibt sich aus der nachfolgenden Formel (FITC).

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SCl

COOH

Die Kopplungsfähigkeit des Fluoreszeins, das gegebenenfalls neben den die Kopplung begünstigenden bzw. vermittelnden Substituenten auch noch mit nicht koppelnden Substituenten versehen sein kann, kann hervorgerufen bzw. verbessert werden, indem ein geeignetes Reagens hinzugegeben wird., das eine Kopplungsreaktion bzw· eine Brückenbildung zwischen dem Fluoreszeingrundkörper und dem jeweiligen Antigen bzw· Antikörper oder deren Äquivalente hervorruft.

Der Vorteil bei der Verwendung von Methylenblau liegt darin, daß, insbesondere im basischen Medium, zur Kopplung mit Antigen, Antikörpern oder deren Komplexen keine zusätzliche koppelnde Gruppe erforderlich ist»

Im Falle der Verwendung von Thionin als Markierungssubstanz muß eine koppelnde Gruppe eingeführt werden. Zu dieser koppelnden Gruppe gilt das im Zusammenhang mit Fluoreszein Gesagte entsprechend. In der Praxis hat es sich gez.eigt, daß Carbodümidderivate hierzu besonders geeignet sind, so insbesondere (l-Äthyl-lⁱi^f-(III-methylamino-propj^rl)-carbodii- mid-Hydrochlorid.. .

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Wenn im Sinne der Erfindung von "Kopplungsfähigkeit" gesprochen wird, so soll auch diese Eigenschaft weitestgehend verstanden werden. In· keinem Pail soll damit ausdrücklich auf eine ganz bestimmte Bindungsart abgestellt werden· Vielmehr soll nur zum Ausdruck gebracht werden, daß durch eine Wechselwirkung zwischen der Markierungs sub stanz und dem Partner einer serologischen Reaktion in irgendeiner Form ein bindender bzw· ein bindendes komplexartiges Gebilde entsteht.

In Einzelfällen ist es denkbar, daß das zu markierende Antigen nicht oder nicht in ausreichendem Maße mit der jeweils herangezogenen chemolumineszierenden Markierungssubstanz reagieren kann· In solchen Fällen werden dem Fachmann geläufige Proteine oder Proteine verwendet, die'zunächst an das Antigen gebunden werden, so daß nachfolgend die Markierungssubstanz an das Protein des entstandenen Reaktionsproduktes gebunden wird. Hierbei kann auch umgekehrt verfahren werden, indem die Markierungssubstanz zunächst an das Protein bzw. Proteid gebunden wird und ein derartiges chemolumineszi er ende s Konjugat mit dem fraglichen Antigen in Wechselwirkung gebracht wird·

Im übrigen hat es sich gezeigt, daß die Empfindlichkeit der vorliegenden Assays ganz beachtlich gesteigert werden kann, wenn bei der Herstellung des chemolumineszierenden Konjugats die chemolumineszierende Markierungssubstanz in Form von Fluoreszein bzw. dessen Derivaten an ein Protein, insbesondere ein Immunglobol-in gebunden wird.

Die erfindungsgemäß einzusetzenden Anregungsmittel reagieren grundsätzlich mit der mit dem Antigen, dem Antikörper oder deren Komplexen gekoppelten chemolumineszierenden Markierungssubstanz in der Weise, daß letztere Photonen aussendet.

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Für die erfindungsgemäß herangezogenen chemolumineszierenden Markierungssubstanzen hat sich insbesondere die Kombination aus Wasserstoffperoxid und Chloramin bzw. seinen Derivaten als sehr geeignet erwiesen. Es muß verwundern, daß Wasserstoffperoxid, das in der Literatur häufig ganz allein als einziges Anregungsmittel genannt wird, für die Zwecke der Erfindung allein nicht geeignet-ist· Entsprechendes gilt auch für Chloramin bzw. seine Derivate, wenn sie allein eingesetzt werden· Es muß in hohem Maße überraschen, daß die Kombination aus diesen beiden Ausgangsmaterialien zu einer besonders günstigen Lösung der gestellten Aufgabe führt. Unter den in Frage kommenden Chloraminen wird das Chloramin T bevorzugt. Chloramin T- ist der internationale Freiname für N-Chlor-4-toluolsulfonsäure-amid-JÜatrium bzw. Tosylchloramid-Natrium.' Es handelt sich um eine sehr stabile Substanz, die, wie Calciumhypochlorit, eine besonders gute Reproduzierbarkeit des jeweiligen Assays gewährleistet. Die im Einzelfall eingesetzte Menge des Chloramins (bzw* -derivats) ist mit der Wasserstoffperoxidmenge abzustimmen. Dabei spielt es auch eine Rolle, in welcher Konzentration die Wasserstoffperoxidlösung·gewählt wird. So hat es sich gezeigt, daß mit folgenden Konzentrationen vorzügliche Ergebnisse erzielbar sind, wenn gleiche Lösungsvolumina der beiden Reagenzien zusammengegeben werdeni eine 0,5 bis 30 volumenprozentuale Wasserstoffperoxidlösung und eine 0,1 bis 8· gewichtsprozentuale Lösung an Chloramin T. In jedem Fall wird der Fachmann im Rahmen eines geringfügigen Arbeitsaufwandes und ohne erfinderisches Zutun die. wirksame Zusammensetzung des Anregungsmittels aus Wasserstoffperoxid und Chloramin bzwβ dessen Derivaten ermitteln können.

Calciumhypochlorit, das als Anregungsmittel im Falle der Verwendung von Fluoreszeini3ocyanat herangezogen wird, zeigt,

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insbesondere in wäßriger Lösung, verschiedene beachtliche Vorteile. So läßt sich das Assay außergewöhnlich exakt reproduzieren. Die im Einzelfall gewünschte exakte Konzentration des Anregungsmittels läßt sich ohne weiteres festlegen· Allgemein kann gesagt werden, daß eine· etwa 0,1 bis 20 gew.-%ige und insbesondere eine 0,2 bis 10 gew.-%ige Calciumhypochloritlösung zu vorteilhaften Ergebnissen führt. Ganz besonders bevorzugt wird eine etwa 1,0 bis 4,0 gew·- %ige Lösung, wobei sich eine 2 gew.-%ige Lösung als ganz besonders günstig erweist.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann, wie bereits einleitend angedeutet, auf der Grundlage an sich bekannter heterogener Assays durchgeführt werden» Derartige Verfahren werden in vielfältiger Weise in der Literatur beschrieben» Hierzu soll zum Beispiel verwiesen werden auf die US-PS 4 238 195 (siehe insbesondere Spalten 7 bis. 11, Zeile 15)·

Das erfindungsgemäße Verfahren läßt sich demzufolge in vielfältiger Weise, was dem Fachmann ohne weiteres erkennbar ist, verwirklichen» Grundsätzlich muß zunächst, was in an sich bekannter Weise geschieht, der Antigen/Antikörper-Komplex auf Grund einer serologischen Reaktion gebildet werden. Dies kann auf verschiedene Weise erfolgen, indem zunächst entweder das Antigen und der Antikörper in Lösung vorliegen oder ein Partner, d. h. das Antigen oder der Antikörper an einer festen Phase gebunden ist. Hierbei spricht man entweder von einem Flüssigphasen- oder einem Festphasen-Assay· Nach Abschluß der serologischen Reaktion wird in beiden Fällen der Antigen/Antikörper-Komplex von dem verbleibenden Reaktionsmedium abgetrennt. Bei dem Festphasen-Assay kann das in einfacher Weise dadurch geschehen, daß die überstehende Flüssigkeit, gegebenenfalls nach Zentri-

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fugieren, dekantiert wird. Beim Flüssigphasen-Assay erfolgt die Trennung zum Beispiel durch. Zentrifugieren mit anschließendem Dekantieren bzw. Filtrieren, insbesondere durch Ultrafiltration, Chromatographieren und dergleichen. Der in der geschilderten oder einer ähnlichen Y/eise isolierte Antigen/Antikörper-Komplex wird anschließend mit einem flüssigen Medium in Kontakt gebracht, welches das damit in Wechselwirkung zu bringende chemolumineszierende Konjugat enthält.

Das chemolumineszierende Konjugat enthält eine der vorgenannten chemolumineszierenden Markierungssubstanzen neben dem Antigen oder Antikörper (bzw. Protein). Aus dem chemolumineszierenden Konjugat und dem Anti gen/Antikörper-Komplex bildet sich ein neuer chemolumineszierender Komplex, der zum Beispiel anhand einer oder mehrerer der vorgenannten Separationsmethoden isoliert wird. Dabei Sann er bereits in der Meßküvette vorliegen bzw. darin entstanden sein oder wird in eine solche überführt. In jedem Fall wird vor Durchführung der Messung das jeweilige Anregungsmittel hinzugegeben, bei dem es nicht wesentlich ist, in welcher Art von Lösungsmittel, sofern erforderlich, es vorliegt« Bevorzugt wird ein wäßriges Medium, insbesondere ein alkalisches, in dem das Anregungsmittel enthalten ist.

Oben wurde ein Vorgehen geschildert, bei dem "indirekt" die chemolumineszierende Markierungssubstanz an den jeweiligen Reaktionspartner einer serologischen Reaktion gebunden wird. Daneben besteht aber auch noch die Möglichkeit, ein "direktes" Assay anzuwenden. Dabei wird entweder ein Antigen oder ein Antikörper vorgegeben. In Abhängigkeit vom Vorgabematerial wird ein Antikörper- bzw. Antigen-Konjugat (mit der chemolumineszierenden Markierungssubstanz) hinzu-

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gegeben und ein chemolumineszierender Komplex gebildet, der anschließend isoliert wird. Danach folgt die Chemolumineszenzmessung nach Zugabe des Anregungsmittels.

Mit großem Vorteil läßt sich das erfindungsgemäße Verfahren auch auf- der Grundlage eines Sandwich-Assays durchführen* Ein Sandwich-Assay kann grundsätzlich sowohl im Rahmen eines Plüssigphasen- als auch eines Pestphasenassays angewandt werden· Das wesentliche Kennzeichen eines im Verlaufe eines Sandwich-Assays gebildeten chemolumineszierenden Konjugats ist darin zu sehen, daß in dem bezüglich der Chemolumineszenz gemessenen Komplex der nachzuweisende Reaktionspartner in Form eines Antigens oder eines Antikörpers sowohl mit seinem konjugierten als, auch mit seinem nicht-konjugierten Reaktionspartner reagiert hat. Bei Außerachtlassen der gekoppelten Markierungssubstanz handelt es sich also um einen symmetrisch aufgebauten Komplex, bei dem die zentrale Reaktionskomponente das Antigen oder der Antikörper ist, die nachzuweisen ist. Der vorgegebene Reaktionspartner bzw. die vorgegebene Reaktionskomponente tritt an zwei Seiten dieser zentralen Reaktionskomponenten damit in Wechselwirkung.

Dem erfindungsgemäßen Gedanken sollen jedoch auch übliche kompetitive Bindungsassays untergeordnet werden* Bei einem· derartigen Assay liegt ein Reaktionspartner einer serologischen Reaktion einerseits markiert und andererseits nicht markiert vor. Diese beiden Reaktionspartner treten mit einem entsprechenden anderen Reaktionspartner in Wechselwirkung. So kann es sich bei dem ersten Reaktionspartner (markiert oder unmarkiert) um ein Antigen handeln. Dann ist der zweite Reaktionspartner ein Antikörper. Erster markierter Reaktionspartner und zweiter Reaktionspartner (Antigen

O OC Q

L· O *J -*>

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bzw· Antikörper) sind mengenmäßig vorgegeben. Nach Ablauf der serologischen Reaktion wird entweder der nicht gebundene Teil des markierten ersten Reaktionspartners oder der gebildete Komplex in üblicher 7/ei se nach Zugabe des Anregungsmittels gemessen* Diese Technik ist allgemein bekannt (siehe US-PS 4 238 195 a. a. 0.). Ihre Variationen sind -demzufolge dem Fachmann geläufig.

Die Chemolumineszenz kann mit handelsüblichen Photometern . gemessen werden. Dabei läßt sich so vorgehen, daß mit vorgegebenen bekannten Mengen an Antigen und Antikörper eine Eichkurve ermittelt wird· Mit einer unbekannten Substanz (sei· es ein Antigen oder ein Antikörper) ermittelte Werte werden dann quantitativ unter Zugrundelegung der Eichkurve ausgewertet.

Des weiteren ist es auch möglich, wenngleich dieses unter halbquantitativen Gesichtspunkten zu sehen ist, einen Vergleich bezüglich der Empfindlichkeit mit anderen bekannten Assays zu ziehen» Das bisher als besonders nachweisempfindlich angesehene Radioimmunoassay, mit den vorstehend geschilderten Nachteilen behaftet, liegt in der Mehrzahl der Anwendungsgebiete bezüglich der Empfindlichkeit weit unter derjenigen des erfindungsgemäßen Verfahrens* So "würde-zum ·- Beispiel der Antikörpertiter eines Hyperimmunserums gegen Rinderserumalbumin, hergestellt im Kaninchen, mit 1:4069 im Radioimmunoassay ermittelt, während erfindungsgemäß (HpOp/ Chloramin - PITC) eine Empfindlichkeit von 1:32788 (1) erzielbar ist. Hierbei handelt es sich also um eine nahezu 8 mal so große Empfindlichkeit. Andere übliche Assays waren weitaus weniger empfindlich als die oben verglichenen. So wurden folgende Antikörpertiter mit bekannten Assays ermittelt:

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AP	C- 01	1
60	247/1	: 16
	1	: 64
	1	i 128	und
on	1	: 512
	1

im ilephelometer

beim Immunodiffusionstest

in der Komplementbindungsreaktion im ELISA

Die mit der—Erfindung erzielbaren Vorteile sind insbesondere darin zu sehen, daß die jeweils verwendete chemolumineszierende Markierungssubstanz außerordentlich einfach an einen Reaktionspartner einer serologischen Reaktion, nämlich in Form von Antigenen und Antikörpern bzw. Bindeproteinen, zu binden ist. Zudem 3ind die 'erfindungsgemäß in Betracht kommenden larkierungssubstanzen wie auch das Anregungsmittel einfach aufgebaut und für das· mit dem erfindungsgemäßen Verfahren, befaßte Personal, insbesondere bezüglich der Freisetzung von giftigen Verbindungen, unbedenklich· Die damit hergestellten Konjugate beziehungsweise Komplexe sind relativ stabil, was für die Verfahrensführung von Vorteil ist.

Der mit der Erfindung erzielbare technische Erfolg muß als außergewöhnlich überraschend angesehen werden· So zeigt zum Beispiel das Fluoreszein beziehungsweise dessen Derivate nach der Bindung an einen der Reaktionspartner einer serologischen Reaktion eine wesentlich höhere Empfindlichkeit als die entsprechende ungebundene Verbindung« Die Zahl der ausgesandten Photonen des chemolumineszierenden Konjugats bzw. des chemolumineszierenden Komplexes ist etwa 1000 mal höher als die Zahl der Photonen, die von der jeweils ungebundenen Substanz ausgesandt werden· In diesem Zusammenhang ist es von Bedeutung, daß in Journal of Physical Chemistry, Vol.. 78, Fr« 17, S. 1681-1683 (1979) ausdrücklich darauf hinge?/iesen wird, daß zur Erzielung einer meßbaren Photonenausbeute eine unverhältnismäßig große Menge an Fluoreszein oder Fluoreszeinisothiocyanat eingesetzt

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werden muß. Dieses hat die Fachwelt bisher davon abgehalten, Fluoreszein bzw» seine Derivate im praktischen Rahmen zur. Durchführung serologischer Assays auf der Grundlage einer Chemölumineszenzmessung heranzuziehen·

Ausführungsbeispiel

Nachfolgend wird die Erfindung anhand von Beispielen näher erläutert.

Beispiel 1

Bestimmung der Nachweisgrenzen von reinem Fluoreszeinisothiocyanat (PITC) und Bestimmung der Hachweisgrenze eines PITC-Konjugats '_ . __ __

Um die Uachweisgrenze von reinem F¹ITC zu bestimmen, wurde

1 mg FITC in 10 ml destilliertem'Wasser aufgelöst. Anschließend wurde die Extinktion einer 1:1OQ-Verdünnung bei 495 nm im Photometer gemessen. Von der Ausgangslösung wurden weiterhin 10 Verdünnungen·(5-er Schritte) angelegt und jeweils 20 ul davon in einem handelsüblichen Photometer gemessen· Zu Beginn der Messung wurden 100 ul einer

2 gew.--%igen CaIciumhypochloritlösung in die zu messende Probe injiziert. Das Ergebnis der Meßreihen ergibt sich aus der folgenden Zahlenreihe.

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Menge an PITC in ng/ml gemessene Photonen/sec

20 000 18 101

4 000 8 485

800 2 748

160 .735

32 394

Der Leerwert des Geräts bei Messungen ohne FITC lag unter diesen Bedingungen im Höchstfall bei 380 Photonen/sec. Daher liegt die lachweisgrenze für reines PITC bei 32 ng/ml.

Um die nachweisgrenze von an Protein gebundenem FITC zu bestimmen, wurde das FITC an Immunglobolin G von der Ziege nach der Methode von B., T. Wood, S. H. Thomson und G. Goldstein, beschrieben in Journal of Immunology £5_ (1964), S. 225j gebunden. Von dem derartig hergestellten chemolumineszierenden Konjugat wurde ebenfalls·die Extinktion bei 495 nm im Photometer gemessen und so die Menge an gebundenem FITC bestimmt. Anschließend wurde ebenfalls eine Verdünnungsreihe von 10 Verdünnungen angelegt und die Chemolumineszenz einer 20 p.l-Probe jeder Verdünnung gemessen. Das Ergebnis der Meßreihe ist in der folgenden Zahlenreihe dargestellt.

Menge an FITC in ng/ml	gemessene	Photonen/sec
1 000	547	982
200	112	895
40	34	683
8	9	914
1,6	3	835
0,32	1	513
0,064		822
0,0128		378

0 C Q Q 7

w <*J *«? sJ g

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Die Hachweisgrenze für das PITC-Protein-Konjugat lag demzufolge bei 0,064 ng/ml. Daraus ergibt es sich., daß die PITC-Korqugate außergewöhnlich, gut für' den Nachweis von Antige- nen, Antikörpern bzw. deren Komplexen über eine serologische Reaktion mittels Chemolumineszenz geeignet sind»

Beispiel 2

Photonenausbeuten bei der Verwendung von Methylenblau oder Thionin als Markierungsaubstanz

Methylenblau und Thionin wurden in einem Volumen von jeweils 20 ul in den aus der nachfolgenden Tabelle ersichtlichen Mengen vorgegeben» -Die Anregung von Methylenblau erfolgte durch eine Zugabe von jeweils 100 ul einer wäßrigen Chloramin T-Lösung (16 mg/ml)' und 100 μΐ einer 10 vol-%igen Wassers toffperoxidlösung» Die Anregung von Thionin erfolgte durch, eine Zugabe von 20 pl einer wäßrigen Chloramin T-Lösung (20 mg/ml) und 100 ul einer 5 vol.-%igen Wasserstoffperoxid lösung. Dabei wurden bei einer Reaktionszeit von 30 Sekunden die aus der nachfolgenden Tabelle ersichtlichen vorzüglichen Photonenausbeuten gemessen«

Markierungssubstanz Menge	20	ng	Photonen/ 30 see
Methylenblau	2	ng	21 963
Methylenblau	0,2	ng	1 237
Methylenblau	2000	Pg	0
Thionin	200	Pg	990 000
Thionin	20	Pg	780 000
Thionin	2	Pg	210 000
Thionin	0,2	Pg	33 000
Thionin		10 000

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Anmerkung: Der Leerwert betrug im Falle des Thionins 1700 Photonen·

Ea wurde ferner die Photonenausbeute bei der Verwendung von Thionin, angeregt mit HpOp/Chtoramin T, gemessen, wobei die Konzentration der beiden Bestandteile des kombinierten Anregungsmittels verändert wurde« Dabei wurden jeweils 2 pg Thionin in 20 ul destillierten Wassers vorgegeben. Die ermittelten Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt. Der jeweilige Leerwert ist in Klammern gesetzt.

	20	3.	mg/ml CT	40 mg/ml CT	500 300)	60	mg/ml CT	80	mg/ml CT
30%iges H2O2	15 (2	100 000)	15 '(4	300 800)	2.1 (8	000 000)	25 (12	400 000)
20%iges H2O2	15 (1	600 950)	.23 (6	800	29 (8	000 300)	36 (15	000 000),
iO%iges	44	000	61	800)	65	000	77	000
H2°5	(1	700)	(7	000 100)	(1	8 000)	(26	000)
5%iges H2O2	76 (1	000 600)	103 (9		101 000 (24 000)	121 000 (45 000)
Beispiel

Nachweis von Antikörpern gegen Pdnderserumalbumin (BSA) in einem Kaninchenserum

An eine flexible Mikrotiterplatte wurde BSA absorbiert. Dazu wurde das BSA in einer Menge von 0,1 mg/ml in einer Lösung, die mit einem Natriumcarbonat-Puffer auf den pH-V/ert von 9>6 gepuffert worden war, gelöst» Davon wurden je 100 ul in einem 2?apf der Mikrotiterplatte pipettiert.,

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Anschließend wurde-die Platte 16 h lang bei 4 ⁰C inkubiert* Nach Absaugen und dreimaligem Waschen der Platte mit einer Phosphat-gepufferten Salzlösung eines pH-Wertes von 7»4$ die 1 % Sorbimacrogollaurat (vgl..Römpp's Chemielexikon, 7· Auflage, 1967, Bd. 6, S. 3711, 1» Sp.. unter T. 20) enthält, wurde eine Verdünnungsreihe des Kaninchenserums in die Häpfe gegeben und 90 min lang bei 37 ⁰C inkubiert. Nach Absaugen und erneutem dreimaligem Waschen der Platte wurde jeder Napf mit 100 ul eines PITC-markierten Anti-Kaninchenserums inkubiert (90 min bei 37 ⁰C). lach erneutem dreimaligem Waschen wurden die einzelnen Näpfe ausgeschnitten und die Chemolumineszenz in einem handelsüblichen Photometer gemessen. Dieses Mal wurde die Chemolumineszenz durch Zugabe von 100 ul H₂O₂ (30%ig) und 100 μΐ Chloramin (79 mg/ml) ausgelöst. Das Ergebnis der Messung ergibt sich aus der anliegenden Figur. Die Zahlenwerte an der Ordinate geben die Anzahl der gemessenen Photonen an» Die Zahlenwerte an der Abszisse drücken den Verdünnungsgrad des Kaninchenhyperimmunserums aus, während es sich bei dem Leerwert um einen" Wert handelt, der in spezieller Weise ermittelt wurde. So wurden von mehreren Leerwerten die Durchschnittsleerwerte % ermittelt und zu diesem das Produkt aus 2,58 χ 6"addiert, wobei der Paktor 6~die Standardabweichung darstellt. Die Figur zeigt, daß der Grenztiter des Kaninchenserums bei etwa 1:32788 liegt« Das gleiche Kaninchenserum hatte im Festphasenradioimmunoassay einen Grenztiter von 1:4096 und im ELISA einen Grenztiter von 1 ;512. .

Gleichermaßen gute Ergebnisse wurden erzielt, wenn das Anti-Kaninchenserum mit Methylenblau oder mit Thionin, das mit Hilfe von (U-Äthyl-N'-O-dimethylamino-propy^-carbodiimid-Hydrochlorid gekoppelt war, markiert wurde.

Claims (9)

1. "Verfahren zur quantitativen und qualitativen Bestimmung von Antigenen, Antikörpern und deren Komplexen mittels einer chemolumineszierend en Markierungssubstanzr~und einem Anregungsmittel hierfür unter Anwendung an sich bekannter heterogener Pest- oder Flüssigphasenassays, gekennzeichnet dadurch, daß eine der folgenden Kombinationen aus Anregungsmittel und Markierungssubstanz

a)' HgOg/Chloramin (bzw. - derivat) - Fluoreszein (bzw. -derivat), Methylenblau (bzw. -derivat) oder Thionin (bzw. -derivat) und

b) Calciumhypochlorit - Fluoreszein (bzw. -derivat)

verwendet werden*

2« Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß HpOp / Chloramin T als Anregungsmittel verwendet wird*

3. Verfahren nach Punkt 1 oder 2, gekennzeichnet dadurch, daß als Anregungsmittel eine Mischung aus gleichen "Volumina einer 0,5 bis 30 Vol.-prozentualen wäßrigen Wasserstoffperoxidlösung und einer 0,1 bis 8 gew.-prozentualen Lösung an Chloramin T verwendet wird»·

4. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 3, gekennzeichnet dadurch, daß ein Sandwichassay angewandt wird*

5· Verfahren nach einem der Punkte 1 bis'4, gekennzeichnet dadurch, daß in einem wäßrigen Medium gearbeitet wird.

Λ Γ* Π Cl ⁷I C
kJ ^J sJ \J I >J

β·5·1982

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6. Verfahren nach Punkt 5» gekennzeichnet dadurch, daß In einem wäßrigen basischen Medium die Chemolumineszenz gemessen wird»

6.5.1982

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Erfindungsanspruch-

7· Verfahren nach einem der Punkte 1 und 3 bis 6, gekennzeichnet dadurch, daß Calciumhypochlorit in einer 0,2 bis 10 gew.-%igen wäßrigen Lösung bei der Messung der Chemolumineszenz verwendet wird*

8· Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 7, gekennzeichnet dadurch, daß als Fluoreszeinderivat Fluoreszeinisothio- -cyanat und/oder Pluoreszeinisocyanat verwendet werden»

9· Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 8, gekennzeichnet dadurch, daß ein Hepatitis-B-Antigen oder Antikörper gegen Herpes- oder Toga-Viren bestimmt werden»

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