DE3143423C2

DE3143423C2 - Verfahren zur Bestimmung von Antigenen, Antikörpern und deren Komplexen

Info

Publication number: DE3143423C2
Application number: DE19813143423
Authority: DE
Inventors: Bernd Dr. 8000 München Frenzel
Original assignee: Individual
Current assignee: Seromed Medizinische Vertriebs-Gesellschaft Mbh Fr
Priority date: 1980-12-22
Filing date: 1981-11-02
Publication date: 1984-08-30
Also published as: DE3143423A1

Abstract

Beschrieben wird ein Verfahren zur quantitativen und qualitativen Bestimmung von Antigenen, Antikörpern und deren Komplexen mittels einer chemolumineszierenden Markierungssubstanz und einem Anregungsmittel hierfür unter Anwendung an sich bekannter heterogener Fest- oder Flüssigphasenassays. Dabei wird eine der folgenden Kombinationen aus Anregungsmittel und Markierungssubstanz a) H ↓2O ↓2/Chloramin (bzw. -derivat) - Fluoreszein (bzw. -derivat), Methylenblau (bzw. -derivat) oder Thionin (bzw. -derivat) und b) Calciumhypochlorit - Fluoreszein (bzw. -derivat) verwendet. Dieses Verfahren läßt sich einfach, ohne Gefährdung des befaßten Personals und mit hoher Wirksamkeit durchführen.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur quantitativen und qualitativen Bestimmung von Antigenen, Antikörpern und deren Komplexen mittels einer chemolumineszierenden Markierungssubslanz und einem Anregungsmittel hierfür unter Anwendung an sich bekannter heterogener Fest- oder Flüssigphasenassays.

Es ist von großer Bedeutung, Antigene, Antikörper oder deren Komplexe in Sekreten, Exkreten und Körperflüssigkeiten von Wirbeltierorganismen sowie von Menschen zu messen. Auf diese Weise können u. a. diagnostische Aussagen gemacht werden.

Es ist bekannt, eine serologische Reaktion durch Markierung einer oder mehrerer Reaktionskomponenten mit einem radioaktiven Isotop, durch Konjugierung mit einem Enzym, einem Fluoreszenzfarbstoff oder einer chemolumineszierenden Substanz, wie Luminol oder Luciferin, nachzuweisen.

Der Radioimmunoassay wird in lournal Clinical Endocrinology 27 (1967), S. 973 und Ibid 28 (1968), S. 343, beschrieben. Der wesentliche Nachteil dieses Assays liegt in dem notwendigen Umgang mil strahlcnemitlierenden Isotopen und in der erforderlichen aufwendigen Ausrüstung zur Durchführung eines solchen Ass;iys.

Bei der Markierung einer Reaktionskomponente mit einem Enzym besteht der Nachteil darin, dall diese Markierung kompliziert durchzuführen und das hergestellte Reaktionsprodukt schwierig aufzubewahren und zu gebrauchen ist. Darüber hinaus handelt es sich bei den einzusetzenden Enzymen um biologisch aktive Substanzen extrem komplexer Natur, auf die die erwähnten Schwierigkeiten zurückgehen. Die schließlich zum Nachweis des gebundenen Enzyms einzusetzenden Substrate sind darüber hinaus noch kanzerogen. Das ist nachteilig. Das Enzym-Assay der beschriebenen Art wird in Bull. World Health Organ 53 (1976) abgehandelt.

ic Bei der Fluoreszenztechnik wird ein Antigene und Antikörper enthaltendes Reaktionsprodukt durch Fluoreszenz unter Bestrahlung mit kurzwelligem Licht nachgewiesen. Hierbei muß das Anregungslicht vom emittierten Licht nachteiligerweise mit großem apparativem Aufwand abgetrennt werden.

Bei den bisher zur Chemolumineszenz herangezogenen chemolumineszierenden Substanzen handelt es sich um solche, die nur sehr schwer an die Reaktionspartner einer serologischen Reaktion zu binden sind und darüber hinaus bis zu 993% ihrer ursprünglichen Lumineszenz nach der Bindung verlieren. Das ergibt sich z. B. aus Nature, Vol. 299 (1979), S. 646—647. Des weiteren wird in Journal of Immunological Methods 21 (1978), S. 178—184, darüber berichtet, daß das chemolumineszierende Luminol aus diesem Grunde für klinische Rcutinclabortests ungeeignet ist.

Dem stehen Angaben in der US-PS 41 93 983 entgegen. Dort wird gerade Luminol als eine besonders geeignete Verbindung für diesen Zweck angegeben. Als

ω Anregungsmittel für die Chemolumineszenz sollen Wasserstoffperoxid oder Calciumhypochlorit in Betracht kommen. Des weiteren wird in dieser US-Patentschrift Fluoreszeinisothiocyanat für ein homogenes Fluorcszenz-Assay erwähnt. &

Trotz intensiver Bemühungen war es bisher nicht || möglich, ein Verfahren der eingangs beschriebenen Artjfej bezüglich Aufwand und Effizienz zufriedenstellend ^JS durchzuführen. Das gilt zum Beispiel auch für den in der|V US-PS 42 38 195 sowie DE-OS 29 52 498 beschriebenen^ Assay. Dort werden Markierungssubstanzen in Form»! von Fluoreszein und dessen Derivaten vorgeschlagen, die mittels besonders energiereicher Produkte angereg werden sollen. Diese Produkte werden durch eine seh komplexe Reaktion zwischen Oxalsäurederivaten, u. a,

4^r> Oxalylchlorid, und Wasserstoffperoxid hergestellt. Ihn Herstellung erfordert einen hohen Arbeitsaufwand Darüber hinaus sind derartige Produkte nicht unbe denklich, da sie unter Umständen das giftige Phosgen^ entwickeln können. in

Der Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, aus de

Vielzahl der bekannten chemolumineszierenden Mar|| kierungssubstanzen und Anregungsmittel solche Korn«! binationen derselben aufzufinden, die es gestatten, dai'i; eingangs beschriebene Verfahren so zu verbessern, da^I

es gefahrlos, einfach und mit hoher Effizienz durchfuhr^

bar ist. $

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe dadurch gelöst;?

daß als Anregungsmittel die Kombination HjOj/Chlor-?

ramin T und als Markierungssubstanz Fluoreszein, Meir,

en thylcnblau oder Thionin bzw. Derivate dieser Verbin-¹ düngen verwendet weiden. ;

Wenn im Ziisanimenhang mit der Erfindung von Anti*·,! genen und Antikörpern gesprochen wird, so sollen diese Begriffe weiiesigehcnd verstanden werden. Bei Antige-

h5 neu handelt es sich um Stoffe, die nach Einführung in den Organismus von Menschen und Tieren die Bildung von Antikörpern hervorrufen. Als Antigene wirken artfremde Eiweißstoffe tierischer und pflanzlicher Her-

kunft, besonders diejenigen von Infektionserregern, sowie viele Stoffe komplizierter Natur mit fett-, saccharid (bzw. zuckei)-, amin- und azoartiger Struktur. So kann es sich dabei um Substanzen, z. N. Proteide, Proteine. Polysaccharide. Lipide oder Nucleinsäuren handeln, die im Organismus von Wirbeltieren sowie von Menschen die Bildung von Antikörpern hervorrufen und spezifisch mit diesen reagieren. Auch sollen hierzu ganz allgemein Haptene gezählt werden, zu denen man auch »unvollständige Antigene« sagt, die wegen ihrer geringen Größe allein keine Bildung von Antikörpern bewirken, jedoch mit den entsprechenden Antikörpern eine spezifische Bindung eingehen können. Antigene können z. B. Viren, Bakterien oder Pilze oder Teile von diesen sein. Darüber hinaus sind z. B. auch bestimmte Hormone. Vitamine, Enzyme oder bestimmte Medikamente dem Begriff »Antigen« unterzuordnen. Zur Definition der Begriffe »Antigene« und »Antikörper« sei auf Kabat »Einführung in die Immunchemie und Immunologie«, Springer Verlag, 19'/LS. 9-25 und S. 143-197 verwiesen.

Im Sinne der Erfindung handelt es sich bei Antikörpern um spezifische Produkte der Immunantwort, die im Wirbeltier- bzw. im menschlichen Organismus nach einem Antigenkontakt gebildet werden und spezifisch mit dem Antigen reagieren können. Neben die Antikörper 2^r> sollen ausdrücklich bestimmte Bindeproteinc gestellt werden, die sich spezifisch an ein oder mehrere Substanzen, wie z. B. Antikörper, binden können. Ein Beispiel hierfür ist das Protein A. Von besonderer Bedeutung sind die Antikörper, die den Immunglobulinen der Klasse IgG, IgM, IgA und IgE unterzuordnen sind. Diese Vr'erden im einzelnen in Kabat »Einführung in die Immunchemie und Immunologie«, Springer Verlag, 1971, S. 143-197, beschrieben.

Von besonderer Bedeutung ist das trfindungsgemäßc Verfahren zum Nachweis von Antigenen und Antikörpern bei viralen und bakteriellen Erkrankungen. Dabei ist der Nachweis des Oberflächenantigcns des Hcpatitis-B-Virus von ganz besonderer Bedeu'.ung. Mit besonderem Vorteil gelingt auch der Nachweis von Antikörpern gegen die Herpes- oder Toga-Viren.

Bei der Verwendung von Fluoreszein oder Fluorcszeinderivaten hat es sich gezeigt, daß sie sich besonders gut an Proteine bzw. Proteide binden lassen. Das bedeutet, daß Fluoreszein mit einer oder mehreren Gruppen 4"; substituiert ist, die dessen Affinität im Hinblick auf die Kopplung mit den erwähnten Antigenen und Antikörpern begünstigen. Als besonders vorteilhaft haben sich dabei die Isothiocyanat- und Isocyanatgruppe als die Kopplung vermittelnde bzw. begünstigende Substituen- w ten erwiesen. Eine besonders bevorzugte Stellung der Isothiocyanatgruppe ergibt sich aus der nachfolgenden Formel (FITC).

SCN γ,

COOH

HO

Die Kopplungsfähigkeit des Fluorcszeins, das gegebenenfalls neben den die Kopplung begünstigenden bzw. vermittelnden Substituenten auch noch mit nicht koppelnden Substituenten versehen sein kann, kann hervorgerufen bzw. verbessert werden, indem ein geeignetes Reagens hinzugegeben wird, das eine Kopplunesreaktion bzw. eine Brückenbildung /wischen dem Fluorcszeingrundkörper und dem jeweiligen Antigen bzw. Antikörper oder deren Äquivalente hervorruft.

Der Vorteil bei der Verwendung von Methylenblau liegt darin, daß, insbesondere im basischen Medium, zur Kopplung mit Antigen, Antikörpern oder deren Komplexen keine zusätzliche koppelnde Gruppe erforderlich ist.

Im Falle der Verwendung von Thionin als Markierungssubstanz muß eine koppelnde Gruppe eingeführt werden. Zu dieser koppelnden Gruppe gilt das im Zusammenhang mit Fluoreszein Gesagte entsprechend. In der Praxis hat es sich gezeigt, daß Carbodiimidderivate hierzu besonders geeignet sind, so insbesondere (N-Äthyl-N'-illl-methylamino-propylJ-carbodiimid-Hydrochlorid.

Wenn im Sinne der Erfindung von »Kopplungsfähigkeit« gesprochen wird, so soll auch diese Eigenschaft weitestgehend verstanden werden. In keinem Fall soll damit ausdrücklich auf eine ganz bestimmte Bindungsart abgestellt werden. Vielmehr soll nur zum Ausdruck gebracht werden, daß durch eine Wechselwirkung zwischen der Markierungssubstanz und dem Partner einer serologischen Reaktion in irgendeiner Form ein bindender bzw. ein bindendes komplexartiges Gebilde entsteht.

In Einzelfällen ist es denkbar, daß das zu markierende Antigen nicht oder nicht in ausreichendem Maße mit der jeweils herangezogenen chemolumineszierenden Markierungssubstanz reagieren kann. In solchen Fällen werden dem Fachmann geläufige Proteine oder Proteide verwendet, die zunächst an das Antigen gebunden werden, so daß nachfolgend die Markierungssubstanz an das Protein des entstandenen Reaktionsproduktes gebunden wird. Hierbei kann auch umgekehrt verfahren werden, indem die Markierungssubstanz zunächst an das Protein bzw. Proteid gebunden wird und ein derartiges ehemolumineszierendes Konjugat mit dem fraglichen Antigen in Wechselwirkung gebracht wird. Im übrigen hat es sich gezeigt, daß die Empfindlichkeit der vorliegenden Assays ganz beachtlich gesteigert werden kann, wenn bei der Herstellung des chemolumineszierenden Konjugais die chemolumineszierende Markierungssubstan/ in Form von Fluoreszein bzw. dessen Derivaten an ein Protein, insbesondere ein Immunglobolin gebunden wird.

Das crfindiingsgemäß einzusetzende Anregungsmitlei reagiert grundsätzlich mit der mit dem Antigen, dem Antikörper oder deren Komplexen gekoppelten chemolumineszierenden Markierungssubstanz in der Weise, daß letztere Photonen aussendet.

Für die erfindungsgemäß herangezogenen chemolumineszierenden Markierungssubstanzen hat sich also die Kombination aus Wasserstoffperoxid und Chloramin T als sehr geeignet erwiesen. Es muß verwundern, daß Wasserstoffperoxid, das in der Literatur häufig ganz allein als einziges Anregungsmittel genannt wird, für die Zwecke der Erfindung allein nicht geeignet ist. Es ist daher überraschend, daß die Kombination aus diesen beiden Ausgangsmaterialien zu einer besonders günstigen Lösung der gestellten Aufgabe führt. Bei Chloramin T handelt es sich um den internationalen Freinamen für N-Chlor-4-toluolsulfonsäureamid-Natrium bzw. Tosylchloramid-Nairiuni. Diese Substanz, ist sehr stabil und

gewährleistet eine besonders gute Reproduzierbarkeit des jeweiligen Assays. Die im Einzelfall eingesetzte Menge an Chloramin T ist mit der Wasserstoffperoxidmenge abzustimmen. Dabei spielt es auch eine Rolle, in welcher Konzentration die Wasserstoffperoxidlösung gewählt wird. So hat es sich gezeigt, daß mit folgenden Konzentrationen vorzügliche !Ergebnisse erzielbar sind, wenn gleiche Lösungsvolumina der beiden Reagenzien zusammengegeben werden: eine 0,5 bis 30 volumenprozentuale Wasserstoffperoxidlösung und eine 0,1 bis 8 gewichtsprozentuale Lösung an Chloramin T. In jedem Faii wird der Fachmann im Rahmen eines geringfügigen Arbeitsaufwandes und ohne erfinderisches Zutun die wirksame Zusiimmensetzung des Anregungsmittels aus Wasserstoffperoxid und Chloramin T ermitteln können.

Das erfinduOgsgemäße Verfahren kann, wie bereits einleitend ang^edeutet, auf der Grundlage an sich bekannter heterOgender Assays durchgeführt werden. Derartige Verfahren werden in vielfältiger Weise in der Literatur beschrieben. Hierzu soll zum Beispiel verwiesen werden auf die US-PS 42 38 195 (s. insbesondere Spalten 7 bis 11.2eile 15).

Das erfindungsgemäße Verfahren läßt sich demzufolge in vielfältiger Weise, was dem Fachmann ohne weiteres erkennbar ist, verwirklichen. Grundsätzlich muß zunächst, was in an sich bekannter Weise geschieht, der Antigen/Antikörper-Komplex auf Grund einer serologischen Reaktion gebildet werden. Dies kann auf verschiedene Weise erfolgen, indem zunächst entweder das Antigen und der Antikörper in Lösung vorliegen oder ein Partner, d. h. das Antigen oder der Antikörper an einer festen Phase gebunden ist. Hierbei spricht man entweder von einem Flüssigphasen- oder einem Festphasen-Assay. Nach Abschluß der serologischen Reaktion wird in beiden Fällen der Antigen/Antikörper-Komplex von dem verbleibenden Reaktionsmediuni abgetrennt. Bei dem Festphasen-Assay kann das in einfacher Weise dadurch geschehen, daß die überstehende Flüssigkeit, gegebenenfalls nach Zentrifugieren, dekantiert wird. Beim Flüssigphasen-Assay erfolgt die Trennung zum Beispiel durch Zentrifugieren mit anschließendem Dekantieren bzw. Filtrieren, insbesondere durch Ultrafiltration, Chromatographieren und dergleichen. Der in der geschilderten oder einer ähnlichen Weise isolierte Antigen/Antikörper-Komplex wird anschließend mit einem flüssigen Medium in Kontakt gebracht, welches das damit in Wechselwirkung zu bringende chemolumineszierende Konjugat enthält.

Das chemolumineszierende Konjugat enthält eine der vorgenannten chemolumineszierenden Markicrungssubstanzen neben dem Antigen oder Antikörper (bzw. Protein). Aus dem chemolumineszierenden Konjugat und dem Antigen/Antikörper-Komplex bildet sich ein neuer chemolumineszierender Komplex, der zum Beispiel anhand einer oder mehrerer der vorgenannten Separationsmethoden isoliert wird. Dabei kann er bereits in der Meßküvette vorliegen bzw. darin entstanden sein oder wird in eine solche überführt. In jedem Fall wird vor Durchführung der Messung das jeweilige Anregungsmiitel hinzugegeben, bei dem es nicht wesentlich ist, in Welcher Art von Lösungsmittel, sofern erforderlich, e? vorliegt. Bevorzugt wird ein wäßriges Medium, insbesondere ein alkalisches, in dem das Anregungsmittel entfalten ist.

Oben v^urde ein Vorgehen geschildert, bei dem »indirekt« die chemolumineszierende Markierungssubstanz an den jeweiligen Reaktionspartner einer serologischen Reaktion gründen wird. Daneben besteht aber auch noch die Möglichkeit, einen »direkten« Assay anzuwenden. Dabei wird entweder ein Antigen oder ein Antikörper vorgegeben. In Abhängigkeit vom Vorgabematerial wird ein Antikörper- bzw. Antigen-Konjugat (mit der chemolumineszierenden Markierungssubstanz} hinzugegeben und ein chemolumineszierender Komplex gebildet, der anschließend isoliert wird. Danach folgt die Chemolumineszenzmessung nach Zugabe des Anregungsmittels.

ίο Mit großem Vorteil läßt sich das erfindungsgemäße Verfahren auch auf der Grundlage eines Sandwich-Assays durchführen. Ein Sandwich-Assay kann grundsätzlich sowohl im Rahmen eines Flüssigphasen- als auch eines Festphasenassays angewandt werden. Das weis seniliehc Kennzeichen eines im Verlaufe eines Sandwich-Assays gebildeten chemolumineszierenden Konjugats ist darin zu sehen, daß in dem bezüglich der Chemolumineszenz gemessenen Komplex der nachzuweisende Reaktionspartner in Form eines Antigens oder eines Antikörpers sowohl mit seinem konjugierten als auch mit seinem nicht-konjugierten Reaktionspartner reagiert hat. Bei Außerachtlassen der gekoppelten Markierungssubstanz handelt es sich also um einen symmetrisch aufgebauten Komplex, bei dem die zentrale Reaktionskomponente das Antigen oder der Antikörper ist, die nachzuweisen ist. Der vorgegebene Reaktionspartner bzw. die vorgegebene Reaktionskomponente tritt an zwei Seiten dieser zentralen Reaktionskomponenten damit in Wechselwirkung.

jo Dem erfindungsgemäßen Gedanken sollen jedoch auch übliche kompetitive Bindungsassays untergeordnet werden. Bei einem derartigen Assay liegt ein Reaktionspartner einer serologischen Reaktion einerseits markiert und andererseits nicht markiert vor. Diese bei-

)^ri den Reaktionspartner treten mit einem entsprechenden anderen Reaktionspartner in Wechselwirkung. So kann es sich bei dem ersten Reaktionspartner (markiert oder unmarkiert) um ein Antigen handeln. Dann ist der zweite Reaktionspartner ein Antikörper. Erster markierter Reaktionspartner und zweiter Reaktionspartner (Antigen bzw. Antikörper) sind mengenmäßig vorgegeben. Nach Ablauf der serologischen Reaktion wird entweder der nicht gebundene Teil des markierten ersten Reaktionspartners oder der gebildete Komplex in üblicher Weise nach Zugabe des Anregungsmittels gemessen.

Diese Technik ist allgemein bekannt (siehe US-PS 42 38 195 a.a.O.). Ihre Variationen sind demzufolge dem Fachmann geläufig.

Die Chemolumineszenz kann mit handelsüblichen

so Photometern gemessen werden. Dabei läßt sich so vorgehen, daß mit vorgegebenen bekannten Mengen an Antigen und Antikörper eine Eichkurve ermittelt wird. Mit einer unbekannten Substanz (sei es ein Antigen oder ein Antikörper) ermittelte Werte werden dann quantitativ unter Zugrundelegung der Eichkurve ausgewertet.

Des weiteren ist es auch möglich, wenngleich dieses unter halbquantitativen Gesichtspunkten zu sehen ist, einen Vergleich bezüglich der Empfindlichkeit mit anderen bekannten Assays zu ziehen. Das bisher als besonders nachweiscmpfindlich angesehene Radioimmunoassay, mit den vorstehend geschilderten Nachteilen behaftet, liegt in der Mehrzahl der Anwendungsgebiete bezüglich der Empfindlichkeit weit unter derjenigen des

h'> erfindungsgemäßen Verfahrens. So wurde zum Beispiel der Antikörperiitcr eines Hyperimmunserums gegen Rinderscrumalbumin, hergestellt im Kaninchen, mit 1 : 4069 im Radioimnuinoassay ermittelt, während erfin-

dungsgemäß (HiCVC'hloramin Ί — I ITC ) eine l'.mpfindlichkcii von I :32 78H(!) er/ielbar ist. Hierbei handelt es sich also um eine nahe/u 8mal so große l-mplincllichkcit. Andere übliche Assays waren weitaus weniger empfindlich als die oben verglichenen. So wurden folgende Antikörpertiter mit bekannten Assays ermittelt:

im Nephelometer I : Ib

beim Immunodiffusionstest 1:64

in der Komplementbindungsreaktion I : 128 und

im ELISA 1 : 512

Miii'kieniMgssubst.in/

Methylenblau
Methylenblau
Methylenblau

Thionin

¹⁽¹ Thionin

Menpi: (np) l'hoinnen/ JO s

Die mit der Erfindung erziclbarcn Vorteile sind insbesondere darin zu sehen, daß die jeweils verwendete chcmolumineszierende Markierungssubstanz außerordentlich einfach an einen Reaktionspartner einer serologischen Reaktion, nämlich in Form von Antigenen und Antikörpern bzw. Bindeproteinen, zu binden ist. Zudem sind die erfindungsgemäß in Betracht kommenden Markierungssubstanzen wie auch das Anregungsmittel einfach aufgebaut und für das mit dem erfindungsgemäßen Verfahren befaßte Personal, insbesondere bezüglich der Freisetzung von giftigen Verbindungen, unbedenklich. Die damit hergestellten Konjugate beziehungsweise Komplexe sind relativ stabil, was für die Verfahrensführung von Vorteil ist.

Der mit der Erfindung erzielbare technische Erfolg muß als außergewöhnlich überraschend angesehen werden. So zeigt zum Beispiel das Fluoreszein beziehungsweise dessen Derivate nach der Bindung an einen der Reaktionspartner einer serologischen Reaktion eine wesentlich höhere Empfindlichkeit als die entsprechende ungebundene Verbindung. Die Zahl der ausgesandten Photonen des chemolumincsziercnden Konjugats bzw. des chemolumineszierenden Komplexes ist etwa lOOOmai höher als die Zahl der Photonen, die von der jeweils ungebundenen Substanz ausgesandt werden. In diesem Zusammenhang ist es von Bedeutung, daß in Journal of Physical Chemistry. Vol. 78, Nr. 17. S. 1681-1683 (1979) ausdrücklich darauf hingewiesen wird, daß zur F.rzielung einer meßbaren Photonenausbeute eine unverhältnismäßig große Menge an Fluoreszein oder Fluoreszeinisothiocyanat eingesct/l worden muß. Diejes hat die Fachwelt bisher davon abgehalten. Fluoreszein bzw. seine Derivate im praktischen Rahmen zur Durchführung serologischer Assays auf der Grundlage einer Chemolumineszenzmessung heranzuziehen.

Nachfolgend soll die Erfindung noch näher anhand von Beispielen erläutert werden.

Beispiel 1

Fhotonenausbeuten bei der Verwendung von
Methylenblau oderThionin als Markierungssubstanz

Mit Methylenblau und Thionin erzielbare
Photonenausbeute

20
2
0,2

20
2

0,2
Beispiel 2

21 963
1 237

243 204

22 728
2013

Nachweis von Antikörpern gegen Rinderserum-¹^ albumin (BSA) in einem Kaninchenserum

An eine flexible Mikrotiterplatte wurde BSA adsorbiert. Dazu wurde das BSA in einer Menge von 0.1 mg/ ml in einer Lösung, die mit einem Natriumcarbonat-Puf-

-° for auf den pH-Wert von 9,6 gepuffert worden war, gelöst. Davon wurden je 100 μΐ in einen Napf der Mikrotiterplatte pipcltiert.

Anschließend wurde die Platte 16 h lang bei 4°C inkubiert. Nach Absaugen und dreimaligem Waschen der Platte mit einer Phosphat-gepufferten Salzlösung eines pH-Wertes von 7,4, die 1% Sorbimacrogollaurat (vgl. Römpps Chemielexikon, 7. Auflage. 1967, Bd. 6, S. 3711, 1. Sp. unter T.20) enthält, wurde eine Verdünnungsreihe des Kaninchenserums in die Näpfe gegeben und 90 min

ⁱ⁽⁾ lang bei 37"C inkubiert. Nach Absaugen und erneutem dreimaligem Waschen der Platte wurde jeder Napf mit 100 μΙ eines FITC-inarkierten Anti-Kaninchenserums inkubiert (90 min bei 37"C). Nach erneutem dreimaligem Waschen wurden die einzelnen Näpfe ausgeschnit-

■·^Γ> ten und die Chemolumineszenz in einem handelsüblichen Photometer gemessen. Dieses Mal wurde die Chemolumineszenz durch Zugabe von 100 μΐ HiO: (30%ig) und 100 μΙ Chloramin T (79 mg/ml) ausgelöst. Das Ergebnis der Messung ergibt sich aus der anliegenden Fi-

4¹' gur. Die Zahlenwerie an der Ordinate geben die Anzahl der gemessenen Photonen an. Die Zahlenwcrte an der Abszisse drücken den Verdünnungsgrad des Kaninchenhyperiminunserums aus, während es sich bei dem Leerwert um einen Wert handelt, der in spezieller Weise

⁴^ ermittelt wurde. So wurden von mehreren Leerwerten die Durchschnittslecrwerte X ermittelt und zu diesem das Produkt aus 2,58 χ 2 addiert, wobei der Faktor 3 die .Standardabweichung darstellt. Die Figur zeigt, daß der Grenztitcr des Kaninchenserums bei etwa 1 :32 788

^w liegt. Das gleiche Kaninchenserum hatte im Festphasenradioimmunoassay einen Grenztiter von 1 :4096 und im

f-* 1 Ι ί~· A "" f~* — ,*'*«._ __1 Fl Λ

·-· * I ^* l\ *· % fl r» r\ I * ~ f* π r TIT £■ ~ Λ' t\ Π I » I /

Gleichermaßen gute Ergebnisse wurden erzielt, wenn

das Anti-Kaninchenserum mit Methylenblau oder mit

^r>^r> Thionin, das mit Hilfe von (N-Äthyl-N'-(3-dimethylamino-propyi)-carbodiimid-Hydrochlorid gekoppelt war, markiert wurde.

Methylenblau und Thionin wurden in einer Menge bo von jeweils 20 μΐ in den aus der nachfolgenden Tabelle ersichtlichen Mengen vorgegeben. Die Anregung erfolgte nach einer Zugabe von jeweils 100 μΙ einer wäßrigen Chloramin T-Lösung (16 mg/ml) und 100 μΙ einer 10vol.-%igen Wasserstoffperoxidlösung. Dabei wurden b5 bei einer Reaktionszeit von 30 Sekunden die ebenfalls aus der nachfolgenden Tabelle ersichtlichen vorzüglichen Photonenausbeuten gemessen.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Antigenen, Antikörpern und deren Komplexen mittels einer chemolurnineszierenden Markierungssubstanz und einem Anregungsmittel hierfür unter Anwendung an sich bekannter heterogener Fest- oder Flüssigphasenassays, dadurch gekennzeichnet, daß als Anregungsmittel die Kombination HiOi/Chloramin T und als Markierungssubstanz Fluoreszein, Methylenblau oder Thionin bzw. Derivate dieser Verbindungen verwendet werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Anregungsmittel eine Mischung aus gleichen Volumina einer 0,5 bis 30 vol.-prozentualen wäßrigen Wasserstoffperoxidlösung und einer 0,1 bis 8 gew.-prozentualen Lösung an Chloramin T verwendet wird.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß ein Sandwichassay angewandt wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß in einem wäßrigen Medium gearbeitet wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Chemolumineszenz in einem wäßrigen basischen Medium gemessen wird.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche I bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß als Fluoreszeindcrivat Fluoreszeinisothiocyanat und/oder Fluorcszeinisocyanat verwendet werden.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß ein Hepatitis-B-Antigen oder Antikörper gegen Herpcs- und Toga-Viren bestimmt werden.