DE2858792C2

DE2858792C2 -

Info

Publication number: DE2858792C2
Application number: DE2858792A
Authority: DE
Inventors: Anthony Keith Campbell; John Stephen Alexander; James Stuart Glamorgan Gb Woodhead
Original assignee: WELSH NATIONAL SCHOOL OF MEDICINE CARDIFF GLAMORGAN GB
Current assignee: WELSH NATIONAL SCHOOL OF MEDICINE CARDIFF GLAMORGAN GB
Priority date: 1977-11-17
Filing date: 1978-11-16
Publication date: 1991-08-22
Anticipated expiration: 1998-11-17
Also published as: SE7811630L; GB2095830B; FR2409516B1; CH640061A5; US4478817A; DE2849708C2; FR2409516A1; DE2849708A1; GB2095830A; CH645725A5; CA1113392A

Description

Die Erfindung betrifft ein immunologisches Verfahren zum Nachweis oder zur quantitativen Bestimmung eines Antigens oder Antikörpers mit Hilfe von Lumineszenzmarkierungen, bei dem man das (den) mit einer chemo- oder biolumineszierenden Komponente markierte(n) Antigen (Antikörper) mit einem Antikörper (Antigen) umsetzt, der (das) mit einer fluoreszierenden Komponente markiert ist, und eine Lumineszenzreaktion auslöst, so daß die Energie aus der Lumineszenzreaktion die fluoreszierende Komponente auf dem Antikörper bzw. dem Antigen unter Erzeugung einer Wellenlängenverschiebung in der Lichtemission oder einer Veränderung in der Quantenausbeute anregt.

Der Ausdruck "mit einer chemo- oder biolumineszierenden Komponente markierte(n) Antigen (Antikörper)", nachfolgend als "Lumineszenzreagenz" bezeichnet, beschreibt einen Komplex zwischen einem Molekül, das normalerweise keine Lumineszenzreaktion einzugehen vermag, und einem anderen Molekül, das eine solche Reaktion eingehen kann. Eine Lumineszenzreaktion ist eine unter Emission von Licht vor sich gehende Reaktion. Die Menge des "Lumineszenzreagenzes" wird durch Messung des emittierten Lichts festgestellt, nachdem man die entsprechenden Bedingungen für den Verlauf der Lumineszenzreaktion eingestellt hat. Das Licht kann intensiv oder ganz schwach sein. Seine Ausstrahlung muß aber genügend lang dauern, um eine Feststellung und Messung des Lichts zu ermöglichen. Die Lumineszenz ist klar von der Fluoreszenz und der Phosphoreszenz zu unterscheiden.

Eine Lumineszenzreaktion findet normalerweise zwischen mindestens zwei Molekülen (S und L) mit oder ohne anderen Reaktionsteilnehmern, Cofaktoren, Katalysatoren (D) oder unter dem Einfluß eines physikalischen Auslösemittels statt. L ist die Substanz, die Licht erzeugt, wie Luminol. S ist die Substanz, die sich mit L umsetzt, um einen Anregungszustand zu ergeben, z. B. mit Sauerstoff oder Wasserstoffperoxid. D stellt, wenn es vorhanden ist, einen Cofaktor dar und/oder einen Katalysator oder ein Auslösemittel, wie ein Enzym, eine Luciferase oder Kaliumferricyanid. Die Umsetzung zwischen L und S führt zur Umwandlung von L in ein angeregtes Molekül L*, und die Rückführung dieses angeregten Moleküls in einen nicht angeregten Zustand verursacht die Emission eines Photons. Die Umsetzung zwischen L und S und der Rückgang von L* in den nicht angeregten Zustand kann spontan vor sich gehen, oder die Gegenwart eines Cofaktors oder eines Katalysators D oder eines physikalischen Auslösemittels, wie Temperatur oder Strahlung erfordern. Ein Beispiel für eine solche Reaktions ist die Oxydation von Luminol durch H₂O₂.

Die Katalysatoren und Cofaktoren stellen wie hier oft anorganische Verbindungen dar, können jedoch auch aus biologischen Materialien extrahiert sein, wie die Enzymperoxidase, die die Lumineszenzreaktion von Luminol katalysiert.

Die Bildung und Feststellung des "Lumineszenzreagenzes" kann durch die folgenden allgemeinen Reaktionen beschrieben werden:

Die Synthese des "Lumineszenzreagenzes" läßt sich veranschaulichen durch:

A + B + andere Reagenzien und/oder Katalysatoren → AB + andere Produkte

Hierbei bedeutet
A die Substanz (Antigen oder Antikörper), die normalerweise nicht zu einer Lumineszenzreaktion fähig ist,
B die Substanz, die eine Lumineszenzreaktion eingehen kann, und
AB das "Lumineszenzreagenz".

A ist normalerweise, aber nicht immer die interessierende Substanz, die ermittelt oder analysiert werden soll. Sie ist von biologischer oder chemischer Beschaffenheit und besteht aus einem Antikörper oder einem Antigen. Das Antigen kann ein Hapten, ein Hormon, ein Arzneimittel, eine andere Substanz von pharmakologischem Interesse, ein Stoffwechselprodukt, eine Nukleinsäure oder generell irgendein Makromolekül oder ein nicht polymeres Molekül sein.

B ist normalerweise aber nicht immer die bindende Substanz und hinsichtlich der Lumineszenz und anderen möglichen Reaktionen, die das Verfahren beeinträchtigen könnten, im wesentlichen beständig. B kann aus L und/oder S und/oder D bestehen und im allgemeinen eine oder mehrere beständige Komponenten eines Mehrfachkomponentenlumineszenzreagenzes umfassen. Gewöhnlich wird bei der synthetischen Herstellung von AB eine oder mehrere der wesentlichen Komponenten oder Bestandteile weggelassen, so daß die Lumineszenzreaktion durch Zugabe der fehlenden Komponente(n) ausgelöst wird.

In einigen Fällen muß nur die Substanz A festgestellt, gemessen oder analysiert werden. Die beständige bindende Substanz B wird dann gewöhnlich in einer frühen Stufe des Verfahrens zu A gegeben, während man die übrige(n) Komponente(n) des Lumineszenzreagenzes erst in dem Augenblick zugibt, wenn das emittierte Licht wahrgenommen werden soll.

Die Substanz A (Antigen oder Antikörper) soll mit einer anderen Substanz C (Antikörper oder Antigen) umgesetzt werden, wobei sowohl A oder C von Interesse sein können und ermittelt oder analysiert werden sollen. Die Umsetzung kann dann wie folgt veranschaulicht werden:

nAB + C → C(AB)n

wobei
C (Antikörper oder Antigen) die mit A (Antigen oder Antikörper) reagierende, mit einer fluoreszierenden Komponente markierte Substanz ist,
n=die Anzahl der Moleküle an AB, die sich mit C vereinigt.

Für die Analyse wird C(AB)n als Lichtemission der fluoreszierenden Komponente gemessen.

Zur endgültigen Bestimmung des "Lumineszenzreagenzes" kann die Umsetzung wie folgt geschrieben werden:

AB + weggelassene Komponente (L, S oder D) oder physikalisches Auslösemittel → Produkt + Licht.

Das zur Zeit populärste Mittel zur Markierung von Proteinen ist ein radioaktives Isotop, wie ¹²⁵I. Bei dieser Methode wird die Menge der AB-Umsetzung mit C durch Messung der Radioaktivität ermittelt. Radioaktive Reagenzien haben drei Hauptnachteile. Erstens, das Verfahren der Markierung erfordert die Anwendung stark radioaktiver und damit potentiell gefährlicher Reagenzien. Zweitens, die Lebensdauer der radioaktiv markierten Substanz ist oft verhältnismäßig kurz, nicht nur, weil das radioaktive Isotop kontinuierlich zerfällt, sondern auch, weil die radioaktiv markierten Proteine oft unbeständig sind. Drittens, es ist oft schwierig, Proteine in ausreichender Weise zu markieren, um sie zu einem empfindlichen und rasch feststellbaren Reagenz zu machen. Das erfindungsgemäße Verfahren ist nicht nur stark empfindlich, sondern läßt sich auch sehr rasch durchführen. Die Messung erfordert nur Sekunden im Gegensatz zur Messung der Radioaktivität, die gewöhnlich mehrere Minuten erfordert.

Eine Substanz, die zur Herstellung eines "Lumineszenzreagenzes" und damit zur Markierung verwendet werden kann, sollte vorzugsweise vier Erfordernisse erfüllen:

a) Sie sollte befähigt sein, eine Lumineszenzreaktion einzugehen,
b) sie sollte sich unter Bildung eines Reagenzes, das verhältnismäßig beständig ist, an die Substanz binden lassen, die normalerweise kein Licht emittiert,
c) sie sollte nach der Bildung des Reagenzes noch fähig sein, eine Lumineszenzreaktion einzugehen,
d) sie sollte die Eigenschaften des Moleküls, an das sie gebunden ist, nicht wesentlich ändern.

Die Verwendung von Chemolumineszenz-Reaktionen zum Nachweis von Signalen bei Immuno-Assays ist aus der DE-OS 26 18 419 bekannt. Diese betrifft jedoch die Verwendung von Enzymmarkern, welche anhand ihrer Fähigkeit zur Katalyse von Lumineszenzreaktionen nachgewiesen werden können. Zwar wird auch die Möglichkeit einer direkten Markierung der Substanzen mit Luminol erwähnt, jedoch offenbart dieses Dokument lediglich den Nachweis des Lumineszenz- Signals durch direkte Messung der gebundenen oder der gelösten Fraktion im Anschluß an die Trennung dieser beiden Phasen.

Die Druckschrift enthält ferner keinerlei Hinweis darauf, einzelne Aspekte der Lumineszenzreaktionen so zu modifizieren, daß die Bildung eines Antigen/Antikörper-Komplexes in einem homogenen System nachgewiesen werden kann, in welchem die Merkmale der Emission infolge der Immunreaktion derart geändert werden, daß eine Trennung der gebundenen und gelösten Phasen unnötig wird.

Demgegenüber liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Ermittlung, Analyse, quantitativen Feststellung oder Lokalisierung einer Substanz zur Verfügung zu stellen, bei dem die Substanz oder eine assoziierte Substanz durch Bindung an eine oder mehrere Komponenten, die eine Lumineszenzreaktion eingehen können, markiert wird, worauf die Lumineszenzreaktion ausgelöst und die emittierte Energie auf eine Fluoreszenz-Verbindung übertragen und die Fluoreszenz gemessen und/oder aufgezeichnet wird, um über die interessierende Substanz Informationen zu erhalten.

Der Erfindung unterliegt demgemäß die Erkenntnis, daß die durch eine Chemo- oder Biolumineszenz-Verbindung emittierte Energie strahlungslos auf eine Fluoreszenz-Verbindung übertragen werden kann, sofern sich die Reaktanten in direkter Nähe zueinander befinden, wie es z. B. bei einem Antigen/Antikörper-Komplex der Fall ist.

Diese Aufgabe wird durch die Merkmale des Anspruchs 1 gelöst.

Die Lumineszenzreaktion kann chemisch mit einem chemischen Reagenz oder Katalysator, oder durch Veränderung des pH-Werts, oder physikalisch, z. B. durch Anwendung von Wärme oder Bestrahlung, ausgelöst werden. Vorzugsweise umfaßt das Lumineszenzreagenz mindestens zwei chemische Komponenten, mit oder ohne Cofaktor oder Katalysator, und die bindende oder Markierungskomponente umfaßt eine unvollständige Anzahl der Komponenten oder Elemente, so daß die Lumineszenzreaktion durch nachfolgende Zugabe der wesentlichen fehlenden Komponente(n) oder Elemente ausgelöst wird.

In jedem Fall ist (sind) die Markierungskomponente(n) für die Umsetzung vorzugsweise beständig und verändern die Substanz, an die sie gebunden sind, nicht wesentlich.

Vorzugsweise ist die interessierende oder gebundene Verbindung ein Protein, ein Antikörper, ein Antigen, Hapten, ein Hormon, ein Stoffwechselprodukt, Nukleinsäure oder ein Steroid. Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfaßt das Lumineszenzreagenz Antikörper oder Antigene, die an ein lumineszierendes Material gebunden sind. Die so markierten Antikörper (Antigene) werden verwendet, um die entsprechenden Antigene (Antikörper) aufzufinden, zu analysieren und quantitativ festzustellen. Vorzugsweise sind mindestens 60% und insbesondere mindestens 80% der Antikörper im Lumineszenzreagenz biologisch wirksam, d. h. sie vermögen die entsprechenden Antigene zu binden.

Die erfindungsgemäß verwendbaren gebundenen bzw. markierten Antikörper können dadurch hergestellt werden, daß man ein die Antikörper enthaltendes Medium, wie Serum, vorzugsweise in fester Phase mit den entsprechenden Antigenen in Berührung bringt, um eine Antikörper- Antigen-Bindung herbeizuführen, bevor oder nachdem die Bindung eingetreten ist, eine lumineszierende Substanz zufügt und anschließend die markierten bzw. gebundenen Antikörper von den Antigenen trennt. Die Antigene binden nur die für sie spezifischen Antikörper, und die nachfolgende Dissoziation ergibt lumineszierende Antikörper mit hoher biologischer Wirksamkeit. Die Dissoziation kann durch Einstellung des pH-Werts des Systems oder durch eine Reduktionsreaktion herbeigeführt werden. Aufgrund der Selektivität der Antigen-Antikörper-Reaktion erhält man "gereinigte" markierte Antikörper. Die Antigene werden vorzugsweise an ein in fester Phase vorliegendes Immuno-Adsorptionsmittel gebunden. Die lumineszierende Substanz kann dem die Antikörper enthaltenden Medium zugegeben werden, bevor oder nachdem dieses Medium mit den Antigenen in Kontakt gebracht wurde. Das Ergebnis ist das gleiche, insofern, als die nicht an die Antigene gebundenen Komponenten des Mediums ausgewaschen werden können und so einen markierten Antigen-Antikörper-Komplex zurücklassen, aus dem die markierten Antikörper dissoziiert werden können. Diese Art der Reinigung ist als immunologische Reinigung bekannt und, wenn das Antigen ein Immunoglobulin ist, kann es zur Herstellung markierter Anti-Immunoglobuline verwendet werden, die in immunologischen Untersuchungen als Universalreagenzien eingesetzt werden können.

Ein markierter Antikörper ist von Natur aus ein Immunoglobulin. In den meisten Fällen können diese gegen Antigene, wie Proteinhormone, Haptene oder andere Moleküle gerichtet werden. In besonderen Fällen können Immunoglobuline selbst als Antigene verwendet werden, z. B. verhält sich Kaninchen IgG (ein Immunoglobulin) wie ein Antigen, wenn es Schafen injiziert wird. Der erzeugte Antikörper bindet Kaninchen IgG, einschließlich spezifischer in Kaninchen erzeugter Antikörper. Zum Beispiel kann Alphafoetoprotein (AFP) dadurch quantitativ bestimmt werden, daß man markierten Kaninchenantikörper an AFP bindet. Alternativ kann AFP dadurch quantitativ bestimmt werden, daß man es zuerst mit nicht markiertem Kaninchen- AFP Antikörper umsetzt und dann den gebildeten Komplex durch die Aufnahme von markiertem Schaf-(anti-Kaninchen IgG) Antikörper feststellt. Dieses indirekte Verfahren hat den Vorteil, daß viele immunologische Testsysteme Kaninchenantikörper anwenden. Anstatt sie einzeln zu markieren, kann markierter Schaf-(anti- Kaninchen IgG) Antikörper als "Universalreaktionsmittel" verwendet werden. Andere bevorzugte Universalreagenzien sind Antikörper für Meerschweinchen IgG, Schaf IgG, Ziegen IgG und Esel IgG, da Antiseren gegen bestimmte Moleküle in diesen Arten erzeugt werden können. Die am häufigsten verwendeten Universalreagenzien sind jedoch Schaf-(anti-Kaninchen IgG) und Schaf-(anti-Meerschweinchen IgG). Das erfindungsgemäß verwendbare "gereinigte" markierte Antikörperpräparat ist außerordentlich beständig, insbesondere, wenn es bei einem pH-Wert von etwa 7 bis 8 und einer Temperatur unter 0°C, vorzugsweise von etwa -20°C, aufbewahrt wird. Es hat eine Lebensdauer von vielen Monaten. Gegenüber den Radioisotopen, die aufgrund ihrer kontinuierlichen Zersetzung nur eine begrenzte Lebensdauer haben, ist dies von großem Vorteil. Ein weiterer Vorteil besteht darin, daß die Radioisotopen Proteine zerstören, während dies die Lumineszenzmarkierungsmittel nicht tun. Erfindungsgemäß verwendbare markierte Antikörper können für die folgenden Hormone und Proteine erhalten werden: Insulin, Wachstumshormon, Parathyroidhormon, Follikel stimulierendes Hormon, luteinierendes Hormon, Thyroid stimulierendes Hormon, adrenocorticotrophes Hormon, Glucagon, Prolactin, Calcitonin, Alpha- Ferritin, Alphafoetoprotein, Humanimmunoglobulin G (IgG), Kaninchen IgG, Schaf IgG, Meerschweinchen IgG, Esel IgG, die Humanimmunoglobuline E und M und Zellenoberflächenantigene. Markierte Antikörper für Haptene können ebenfalls hergestellt werden. Sie binden Arzneimittel oder cyclische Nucleotide. Die von diesen Hormonen, Proteinen und Haptenen abgeleiteten Antikörper sind besonders wertvoll für die rasche Durchführung immunologischer Untersuchungen. Diese Untersuchungen werden zweckmäßig unter Anwendung sogenannter immunoradiometrischer oder "Doppeltests" durchgeführt.

Die Vielzahl der erfindungsgemäß verwendbaren Lumineszenzmarkierungsmittel ist außerordentlich groß.

Die in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendbaren Lumineszenzmarkierungsmittel können zweckmäßig in zwei Klassen unterteilt werden, nämlich in

1) chemische Lumineszenzmarkierungsmittel und
2) biologische Lumineszenzmarkierungsmittel.

Chemische Lumineszenzmarkierungsmittel umfassen anorganische oder organische Moleküle, die unter Erzeugung von Licht mit anderen Molekülen reagieren können. Diese Substanzen können aus biologischen Materialien extrahiert sein, sind aber in diesem Fall in ihrer natürlichen Umgebung normalerweise nicht an der Emission von Licht beteiligt. Die Lumineszenzreaktion unter Verwendung chemischer Lumineszenzmarkierungsmittel wird durch Zugabe eines bzw. mehrerer geeigneter Reagenzien ausgelöst.

Das Auslösemittel kann ein oxydierendes Mittel, vorzugsweise in einem alkalischen Medium, oder ein Katalysator sein. Ein für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens bevorzugter chemischer Lumineszenzmarkierungsstoff ist eine Verbindung der allgemeinen Formel (I)(a) oder (I)(b)

in denen R₁, R₂ und R₃ Wasserstoff, gegebenenfalls substituierte C₁- bis C₁₀-Alkyl- oder Alkenylgruppen, Amino-, substituierte Amino-, Carboxyl- oder Hydroxylgruppen bedeuten, R₄ und R₅ jeweils die gleiche Bedeutung wie R₁, R₂ oder R₃ haben oder eine Diazobindung, eine Hemi-dicarboxylatbindung oder eine Amidbindung, ein organisches Säurehalogenid oder eine Isothiocyanatgruppe darstellen, mit der Maßgabe, daß mindestens einer der Substituenten R₁ bis R₅ eine Amino- oder substituierte Aminogruppe ist. Vorzugsweise ist die Verbindung Luminol (R₁ bis R₃ sind jeweils Wasserstoff).

Vorteilhaft bedeuten R₄ und R₅ jeweils durch Hemisuccinat, Aminoethyl oder Chloracetyl substituierte Aminogruppen.

Ein wichtiger Vorteil der Verbindung der Formel (I) ist, daß sie leicht mit Antikörpern, z. B. über Peptidbindungen, Brücken bilden können. Die Bindung an Peptide kann dadurch bewirkt werden, daß man eine Kupplung mit gemischten Anhydriden, Carbodiimid, Suberimidat oder Hemisuccinat herbeiführt. Andere in dem erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugte chemische Lumineszenzmarkierungsstoffe sind

(i) Lophin und dessen Derivate, d. h. Verbindungen der allgemeinen Formel (II) in der R₆, R₇ und R₈ jeweils gegebenenfalls substituierte Phenylreste darstellen,
(ii) Lucigenin und dessen Derivate, d. h. Verbindungen der allgemeinen Formel (III): in der R₉, R₁₀, R₁₁ und R₁₂ jeweils die gleiche Bedeutung haben wie R₁, R₂, R₃, R₄ und R₅ in der allgemeinen Formel (I)
(iii) Verbindungen der allgemeinen Formel (IV) in der R₁₃ und R₁₄ jeweils die gleiche Bedeutung haben wie R₁, R₂, R₃, R₄ und R₅ in der allgemeinen Formel (I)
(iv) trans-Azodicarboxylate der allgemeinen Formel (V) in der R₁₅ und R₁₆ jeweils Wasserstoff oder niedere Alkylreste sind
(v) Oxalatester der allgemeinen Formel (VI) in der R₁₇ und R₁₈ jeweils niedere Alkylreste bedeuten,
(vi) Pyrogallol.

Bevorzugte Auslösemittel sind Wasserstoffperoxid, Kaliumpermanganat, Kaliumferricyanid oder Sauerstoff in Gegenwart von Dimethylsulfoxid. Katalysatoren aus biologischen Quellen, wie Enzyme, können ebenfalls als Auslösemittel verwendet werden. Ein bevorzugter Katalysator ist Peroxidase.

Beispiele für Umsetzungen unter Verwendung von Luminol, die zur Emission von Licht führen, sind:

Die Lumineszenzreaktion kann auch durch eine Veränderung des pH-Werts oder der physikalischen Bedingungen, wie durch die Temperatur, die Polarität des Lösungsmittels und durch Strahlungen, z. B. durch Röntgenstrahlen, Gammastrahlen und Teilchen von radioaktiven Isotopen ausgelöst werden.

Erfindungsgemäß verwendbare biologische Lumineszenzmarkierungsstoffe sind Komponenten, die an einer Reaktion unter Erzeugung von Licht teilnehmen, wobei mindestens eine der Komponenten aus einem biologischen Material extrahiert und in ihrer natürlichen Umgebung bei der Erzeugung von Licht beteiligt ist. Dies schließt Reaktionen ein, die mit synthetischen Verbindungen der gleichen oder einer ähnlichen Struktur durchgeführt werden und die synthetisiert wurden, um die natürlich auftretende Verbindung nachzuahmen.

Für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens bevorzugte biologische Lumineszenzmarkierungsstoffe sind

(i) Firefly-Luciferin und dessen Derivate der allgemeinen Formel (VII) in der X₁, X₂, X₃ und X₄ jeweils die gleiche Bedeutung haben wie R₁, R₂, R₃, R₄ und R₅ in der allgemeinen Formel (I).
(ii) Coelenteratchromophore der allgemeinen Formel (VIII) in der X₅, X₆ und X₇ jeweils die gleiche Bedeutung haben wie R₁, R₂, R₃, R₄ und R₅ in der allgemeinen Formel (I) oder sind.

Im allgemeinen sind für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens alle beständigen Luciferin- und Coelenteratderivate geeignet.

Eine große Anzahl der mit biologischen Lumineszenzmarkierungsstoffen durchgeführten Reaktionen erfordert Sauerstoff. Ein Beispiel hierfür ist wie folgt:

Die Reaktion wird durch ein Enzym katalysiert, das als Luciferase bekannt ist. Für die Umsetzung können auch andere oxydierende Mittel, wie sie bei Verwendung chemischer Lumineszenzmarkierungsstoffe eingesetzt werden, verwendet werden.

Bei einigen, die Emission von Licht bewirkenden Komponenten trifft dieses Schema jedoch nicht zu. Einige der Umsetzungen werden durch Zugabe geeigneter Cofaktoren ausgelöst. Ein Beispiel hierfür ist die Zugabe von Calciumionen zu den Photoproteinen, die aus einer Anzahl von Coelenteraten isoliert werden:

wobei X₅, X₆ und X₇ die für die allgemeine Formel (VII) angegebene Bedeutung haben. In dem erfindungsgemäßen Verfahren kann jede, eine Lumineszenzreaktion eingehende Komponente als Markierungsstoff für ein "Lumineszenzreagenz" verwendet werden. Ein chemischer Lumineszenzmarkierungsstoff kann eine organische Verbindung, wie Luminol, ein anorganisches Ion oder Molekül, oder ein Katalysator, wie das Enzym Peroxidase sein. In ähnlicher Weise kann ein biologischer Lumineszenzmarkierungsstoff ein Luciferin oder Luciferase, ein Strukturanaloges eines Luciferins oder einer der folgenden Cofaktoren sein:

1. Firefly
ATP
2. Bakterien	NADH
	FMNH
	R.CHO, wobei R eine aliphatische Gruppe ist
3. Fungi	NADH
	NADPH

Die Erfindung ist insbesondere für die Untersuchung von kleinen Molekülen in einem homogenen System geeignet. Diese Untersuchungen haben den Vorteil einer raschen Analyse, ohne daß eine Trennstufe erforderlich ist.

Bei der herkömmlichen radioimmunologischen Technik wird ein Antigen mit einer begrenzten Menge eines bindenen Reagenzes, d. h. eines Antikörpers, umgesetzt. Der Anteil des gebundenen Antigens ist der zugefügten Konzentration umgekehrt proportional. Die Umsetzung wird durch Zugabe einer Spurenmenge von markiertem Antigen verfolgt. Ein wesentliches Merkmal dieser Technik besteht darin, daß gebundenes Antigen von nicht gebundenem Antigen getrennt werden kann.

Demgegenüber ist die erfindungsgemäße homogene Untersuchungsmethode so angelegt, daß eine Eigenschaft des markierten Antigens bei der Umsetzung mit dem Antikörper verändert wird. Es läßt sich somit die Umsetzung verfolgen, ohne daß eine Trennung der gebundenen von der nicht gebundenen Fraktion notwendig ist. Bei einer Markierung mit Radioisotopen ist dieser Weg nicht gangbar. In einem homogenen Test verursacht das Licht, das von einem Antigen (oder Antikörper) das mit einem lumineszierenden Stoff markiert ist, emittiert wird, daß das von einem Antikörper (oder Antigen), der mit einem fluoreszierenden Molekül markiert ist, emittierte Licht eine abweichende Wellenlänge hat. Die Verwendung eines entsprechenden Filters in der Analysiervorrichtung führt somit zur Messung von Licht aus der Fluoreszenz, die von der Antigen-Antikörper Reaktion herrührt. Das System ist homogen, weil es nicht nötig ist, nicht umgesetztes Antigen von der Probe zu trennen, da seine Emission eine größere Wellenlänge hat und daher nicht registriert wird.

Die Erfindung stellt somit eine Methode zur Durchführung eines homogenen Tests zur Verfügung, bei dem ein mit einem lumineszierenden Stoff markiertes Antigen oder ein markierter Antikörper mit einem Antikörper (Antigen) umgesetzt wird, der (das) mit einem fluoreszierenden Stoff markiert ist, worauf eine Lumineszenzreaktion ausgelöst wird und die Energie aus der Lumineszenzreaktion den fluoreszierenden Stoff auf dem Antikörper oder Antigen so anregt, daß eine Wellenlängenverschiebung in der Lichtemission oder eine Veränderung in der Quantenausbeute auftritt.

Vorzugsweise ist der Antikörper oder das Antigen mit Fluorescein markiert. Die Lumineszenzreaktion wird zweckmäßig durch Zugabe von Peroxidase ausgelöst.

Die zu untersuchende Substanz ist vorzugsweise ein Hapten und umfaßt die folgenden Substanzen: cyclische Nucleotide (cyclisches AMP, cyclisches GMP und cyclisches CMP), 25-Hydroxycholecalciferol, 1,25-Dihydroxycholecalciferol, Thyroxin, Trÿodthyronin, Progesteron, Östradiol, Östriol, Testosteron, Aldosteron, Cortisol, Glycocolsäure, Taurocolsäure, Barbiturate, Salicylate, Phenitoin, Morphin, Heroin, Methotrexat und Digoxin.

Die in dem erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugten chemischen lumineszierenden Markierungsstoffe für die Haptene, insbesondere Thyroxin, sind Oxalatester.

Beispiele 1. Anregung von Luminol-Schaf-(anti-Kaninchen IgG)

Ein Lumineszenzreagenz wird durch Kupplung des Diazoniumsalzes von Luminol an Schaf-(anti-Kaninchen IgG) Antikörper hergestellt. Die Lumineszenzreaktion wird durch Anregung des Reagenzes mit Sauerstoff in Gegenwart von Alkali ausgelöst, worauf Licht einer Wellenlänge von 400 bis 500 mm emittiert und mit einer Photon-Zählvorrichtung gemessen wird.

Die Lichtemission aus dem Reagenz nach der Anregung verläuft außerordentlich rasch. Es sind weniger als 2 Sekunden erforderlich, um das vorhandene Luminol exakt zu messen.

2. Homogene Untersuchung von cyclischem AMP

Ein Antikörper für cyclisches AMP (oder GMP) wird wie in den Beispielen 2 und 3 mit Luminol markiert. Cyclisches Succinyl AMP (oder GMP) wird mit Fluorescein markiert. Der markierte Antikörper wird mit dem markierten cyclischen AMP (oder GMP) bei pH 7,4 im Reaktionsröhrchen umgesetzt. Peroxidase (10 mU) und Wasserstoffperoxid (1 mMol) werden zugegeben und die Lichtemission bei 540 mm wird gemessen. Emission bei dieser Wellenlänge kann nur von der mit Fluorescein markierten Komponente herrühren, die an den Antikörper gebunden ist. Nicht gebundener Antikörper emittiert bei einer anderen Wellenlänge (d. h. bei 460 mm).

Das vom Luminol emittierte Licht wird am wirksamsten vom Fluorescein absorbiert, wenn die beiden Moleküle nahe beieinander sind, d. h. weniger als 100 Å. Die Wellenlängenverschiebung tritt somit nur auf, wenn das markierte cyclische AMP und der Antikörper miteinander verbunden sind. Die gleiche Reaktion kann durchgeführt werden, wenn das cyclische AMP mit Luminol und der Antikörper mit Fluorescein markiert ist.

Claims

1. Immunologisches Verfahren zum Nachweis oder zur quantitativen Bestimmung eines Antigens oder Antikörpers mit Hilfe von Lumineszenzmarkierungen, dadurch gekennzeichnet, daß man das (den) mit einer chemo- oder biolumineszierenden Komponente markierte(n) Antigen (Antikörper) mit einem Antikörper (Antigen) umsetzt, der (das) mit einer fluoreszierenden Komponente markiert ist, und eine Lumineszenzreaktion auslöst, so daß die Energie aus der Lumineszenzreaktion die fluoreszierende Komponente auf dem Antikörper bzw. dem Antigen unter Erzeugung einer Wellenlängenverschiebung in der Lichtemission oder einer Veränderung in der Quantenausbeute anregt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das zu untersuchende Antigen aus einem Hapten besteht.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Hapten ein cyclisches Nucleotid (cyclisches AMP, cyclisches GMP, cyclisches CMP), 25-Hydroxycholecalciferol, 1,25-Dihydroxycholecalciferol, Thyroxin, Trÿodthyronin, Progesteron, Östradiol, Östriol, Testosteron, Aldosteron, Cortisol, Glykocolsäure, Taurocholsäure, ein Barbiturat, ein Salicylat, Phenitoin, Morphin, Heroin, Methotrexat oder Digoxin ist.

4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper oder das Antigen mit Fluoreszin markiert sind.

5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man die Lumineszenzreaktion durch Peroxidase oder Wasserstoffperoxid auslöst.