DE2716515A1 - Verfahren und vorrichtung zur bestimmung von diphenylhydantoin, nortriptylin und aehnlicher pharmazeutika in biologischen fluessigkeitsproben - Google Patents

Verfahren und vorrichtung zur bestimmung von diphenylhydantoin, nortriptylin und aehnlicher pharmazeutika in biologischen fluessigkeitsproben

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Description

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Patentanwälte Dr.-Ing. Wilhelm Beichel Dipl-Ing. Wolfgang ΒβκΛβΙ
6 Franldurt a. M.
Paxkabaße 13
8745
TECHNICON INSTRUMENTS CORPORATION, Tarrytovn, N.Y., VStA
Verfahren und Vorrichtung zur Bestimmung von Diphenylhydantoin, Nortriptylin und ähnlicher Pharmazeutika in biologischen Flüssigkeitsproben
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Die Erfindung betrifft immunologische Bestimmungen (Immunoassays) und insbesondere ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Bestimmung von Diphenylhydantoin, Nortriptylin und ähnlichen Fharmazeutika in biologischen Flüssigkeitsproben, wie beispielsweise Blutserum.
Diphenylhydantoin der Formel:
NH
auch als 5f5-Diphenylhydantoin, 5,5-Diphenyl-2t4-iaidazolidindion, Phenytoin oder Dilantin bezeichnet, wird in hohem HaBe als Anticonvulsivum bei der Behandlung und Beherrschung der Epilepsie verwendet. Es wird normalerweise in Form des Natriumsalzes, nämlich als Diphenylhydantoinnatrium verabfolgt.
Es 1st eine bekannte Tatsache, daß die optimale therapeutische Konzentration von Diphenylhydantoin im Blut (Serum) etwa 10/Ug/ml beträgt. Niedrigere Konzentrationen führen nornalerweisa nicht zu einer Unterdrückung der Anfälle, während sich bei höheren Konzentrationen unerwünschte Nebenwirkungen einstellen, wie beispielsweise Nystagmus (unwillkürliche rasche Bewegungen der Augäpfel), der bei etwa 20/Ug/ml beginnt, AtaxLe (Störung der Muskelkoordination) bei etwa 30 /Ug/ml und Veränderungen des Geisteszustandes bei über etwa 40/Ug/ml. Wegen des engen sicheren therapeutischen Bereiches ist es allgemein üblich, den Blutspiegel von Patienten, die Diphenylhydantoin erhalten, messend zu verfolgen.
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Die gebräuchlichste Bestimnningsmethode für Diphenylhydantoin ist zur Zeit die Gas/Flüssigkeits-Chromatographie. Aufeinanderfolgende Extraktionsstufen, denen ein Verdampfungsschritt nachgeschaltet ist, sind erforderlich, um das Arzneimittel von der Serumprobe zu isolieren, bevor man es in einen Gas/Flüssigkeits-Chromatographen injizieren und das zu ihm gehörige Maximum auf dem erhaltenen Chromatogramm ausmessen kann. Die Extraktion, Verdampfung und Chromatographie stellen sämtlich zeitraubende und schwierig automatisierbare Verfahrens schritte dar. Daher ist der Probendurchsatz bei diesem Verfahren gering. Weiter sind verhältnismäßig voluminöse Proben erforderlich (typischerweise 1 ml Serum), was, beispielsweise in der Kinderheilkunde, von Nachteil sein kann.
In den vergangenen Jahren wurden Antisera gegen Diphenylhydantoin und immunologische Bestimmungen unter Verwendung dieser Antisera entwickelt. Ferner sind Radioimmunoassays unter Verwendung von entweder mit C oder tritiummarkiertem Diphenylhydantoin bekannt. Diese Verfahren gestatten es, Diphenylhydantoin in sehr geringen Serummengen (unter 1 /Ul) zu bestimmen. Jedoch sind damit die Gefahren radioaktiver Strahlung verbunden, und aufwendige Flüssigkeitsszintillationszähleinrichtungen und Reagenzien müssen eingesetzt werden. Außerdem ist bei Radioimmunoassays eine Trennung der freien und antikörpergebundenen Fraktionen des radioaktiven Diphenylhydantoins erforderlich. Es ist daher erwünscht, derartige Verfahrensschritte, wenn möglich, zu vermeiden.
Immunologische Bestimmungen von Dipbsnylhydantoin, die weder ein radioaktives Markieren noch eine Trennung erfordern, sind kürzlich bekannt geworden. Bei einer dieser Bestimmungen werden Arzneinittelmoleküle kovalent derart an ein Enzym gebunden, daß die Aktivität des Enzyms inhibiert wird, wenn die daran geknüpften Arzneimittelmoleküle an ein spezifisches Antiserum gebunden werden. Diphenylhydantoin selbst, beispielsweise aus einer zugesetzten Serumprobe,
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konkurriert um die Bindungsstellen an dem spezifischen Antiserum und reduziert das Ausmaß der Inhibierung. Eine Messung der Enzymaktivität kann daher als Maßstab für die Menge an zugesetztem Diphenylhydantoin verwendet werden. Normalerweise wird eine kinetische Zweipunktbestimmung (two-point kinetic determination) vorgenommen, die eine oder zwei Minuten dauert und die Verwendung eines in geeigneter Weise ausgerüsteten Spektrophotometers erfordert· Wegen des kinetischen Endpunktes ist die Bestimmung, wie sie normalerweise durchgeführt wird, nicht sehr gut für eine Automatisierung des kontinuierlichen Durchflußtyps geeignet.
Eine zweite Art von immunologischer Bestimmung ohne Abtrennungsschritt beruht auf einer sog. nSpinmarkierungw von Diphenylhydantoin mit einem ein freies Radikal aufweisenden Rest. Derart markiertes Diphenylhydantoin weist in einem Elektronenspinnresonanzspektrometer Je nachdem, ob es frei in Lösung rotiert oder an spezifische Antidlphenylhydantoin-Antikörper gebunden ist, ein unterschiedliches Spektrum auf. In Gegenwart von unterschiedlichen Mengen Diphenylhydantoin, beispielsweise aus einer zugesetzten Serumprobe, können die unterschiedlichen Verhältnisse von freiem zu gebundenem spinnmarkiertem Diphenylhydantoin durch Aufzeichnung eines Elektronenspinnresonanzspektruns verfolgt und dadurch die Konzentration an Diphenylhydantoin bestimmt werden. Dieses Verfahren erfordert eine umfangreiche und aufwendige apperativa Einrichtung, die 3ich in dem Durchschnittslaboratorium für klinische Chemie nicht findet. Außerdem sind bei derartigen Bestimmungssystemen bisher Inkubationszeiten von einer Stunde oder darüber erforderlich, während typischerweise 2 bis A min notwendig sind, um ein Elektronenspinnresonanzspektrum zu überprüfen. Aus diesen Gründen eignen sich derartige Bestimmungen nicht für eine Automatisierung nach dem kontinuierlichen Durchflußprinzip·
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Eines der am häufigsten verwendeten tricyclisehen Antidepressiva ist Nortriptylin, das außerdem als Metabolit von Amitriptylin Bedeutung besitzt.
CH.CH2.CH2.NH.CH3 CH.CH2.CH2.N(CH3)2
Nortriptylin Amitriptylin
Es ist zweckmäßig, die Blutspiegel dieser beiden Pharmaka messend zu verfolgen, weil trotz der positiven Korrelation zwischen Blutspiegel und klinischer Besserung beträchtliche Abweichungen zwischen den Blutspiegeln von einzelnen Patienten, die dieselbe Dosis des Arzneimittels erhalten haben, gefunden werden.
Zur Zeit erfolgt die Bestimmung mit Hilfe spektrophotometrischer Methoden von kaum angemessener Empfindlichkeit oder durch Gas/Flüssigkeits-Chromatographle. Diese Verfahren erfordern zeitraubende Manipulationen, die sich nicht für eine Automatisierung eignen. Der Durchsatz ist demzufolge gering. Ehe man mit der Entwicklung von Radio» immunoassays beginnen kann, muß man erst radioaktivmarkierte Pharmaka hinreichender Reinheit und Aktivität zur Verfügung haben.
Es wurde nun eine immunologische Bestimmungsmethode für Diphenylhydantoin, Nortriptylin und Arzneimittel mit ähnlicher chemischer Struktur gefunden, die die Verwendung radioaktiver Materialien nicht erfordert und eine Reihe von Vorteilen gegenüber den oben erwähnten Bestimmungsmethoden aufweist. Insbesondere wurde gefunden, daß die genannten Arzneimittel mit hoher Empfindlichkeit mittels einer
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Fluoreszenzlöschungstechnik bestimmt werden können, die die Verwendung sehr kostspieliger Apparaturen nicht erfordert, Strahlenunfälle ausschließt und mit kleinen Proben verhältnismäßig rasch durchgeführt werden kann. Außerdem kann das Verfahren automatisiert werden.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Bestimmung substituierter Hydantoine oder tricyclischer Antidepressiva In biologischen Flüssigkeitsproben, das dadurch gekennzeichnet 1st, daß man ein Gemisch aus der Probe mit einer fluoreszenzmarkierten Verbindung mit einem Antikörper herstellt, der sowohl gegenüber dem zu bestimmenden Arzneimittel als auch gegenüber der fluoreszenzmarkierten Verbindung aktiv ist, und die Fluoreszenz der fluoreszenzmarkierten Verbindung la dem Gemisch und damit die Menge des in der Probe vorhandenen Arzneimittels bestimmt.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich insbesondere für die Bestimmung von Dlphenylhydantoin, läßt sich Jedoch auch auf ähnliche Arzneimittel anwenden, die den Hydantoinrlng oder stark verwandte Strukturen enthalten, wie beispielsweise Albutoln, Aloxldon, 5-( , -Dibronphenethyl)-5-methylhydantoin, 5,5-Diphenyl-2-thiohydantoin, Ethadlon, Ethosuxlmld, Ethotoin, 5-Ethyl-5-phenylhydantoin, Mephenytoin, Methetoin, Methsuximld, 3-Methyl-5-phenylhydantoin, Paramethadlon, Pemolin, Phensuxlmld, Tetrantoin und Trlmethadlon.
Unter den tricyclischen Antidepressiva, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren bestimmt werden können, sind Nortriptylin selbst sowie Amltriptylin, Butriptylin, Desipramln, Debenzepin, Hepzidin, Imlpramln, Melitracen, Opipramol, Protriptylin und Trimipramin zu nennen.
Unter "fluoreszenzaarkierter Verbindung" ist eine Verbindung zu verstehen, die eine fluoreszierende Gruppe
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enthält, deren Fluoreszenz reduziert wird, wenn die Verbindung sich mit dem Antikörper im Verlaufe des erfindungsgemäßen Verfahrens verbindet. Auf diese Weise ist die Fluoreszenz des Gemisches geringer als die Fluoreszenz der markierten Verbindung allein, und zwar um einen Betrag, der von der Menge des in der ursprünglichen Probe vorhandenen zu bestimmenden Arzneimittels abhängt. Durch Messung der Fluoreszenz des Gemisches und Vergleichen des Ergebnisses mit beispielsweise einer Standardkurve, die im folgenden näher beschrieben wird, kann die Menge des Arzneimittels bestimmt werden.
Die fluoreszenzmarkierte Verbindung muß mit dem bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Antikörper einen Komplex bilden können, und der Antikörper muß ebenfalls einen Komplex mit dem zu bestimmenden Arzneimittel bilden können. Daraus folgt, daß die markierte Verbindung entweder bis auf den markierenden Teil die gleiche Struktur oder eine sehr eng verwandte Struktur wie die des zu bestimmenden Arzneimittels besitzen muß, weil sie sich sonst nicht mit dem Antikörper verbindet. Somit ist die markierte Verbindung, die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Bestimmung des Arzneimittels A verwendet werden muß, entweder A selbst mit einer fluoreszierenden Markierung oder eine Verbindung, die A sehr ähnlich ist und die ihrerseits eine fluoreszierende Markierung trägt. Im Falle der Arzneimittel vom Nortriptylintyp, von denen einige einander in der Struktur sehr ähnlich sind, kann die markierte Verbindung verschieden von der zu bestiomenden Arzneimittelverbindung sein.
Im Falle von Diphenylhydantoin selbst besteht die bevorzugte fluoreszierende Markierung aus Fluorescein. Es ist nicht möglich, Fluorescein (im Form des Thiocyanate) unmittelbar mit Diphenylhydantoin umzusetzen, so daß vorzugsweise als markierte Verbindung eine Verbindung verwen-
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det wird, die hinreichend stark dem Diphenylhydantoin ähnelt, um sich mit den Antidiphenylhydantoin-Antikörpern zu verbinden. Alternativ muß, wie weiter unten beschrieben, die die Markierung tragende Verbindung hinreichend eng mit Diphenylhydantoin verwandt sein, damit Diphenylhydantoin an Antikörper gebunden werden kann, die gegen die zu markierende Verbindung oder andere ähnliche Verbindung erzeugt werden.
Es wurde eine mit Fluorescein markierte Verbindung gefunden, die für die Zwecke der vorliegenden Erfindung im Hinblick auf ihre Struktur dem Diphenylhydantoin hinreichend ähnlich ist·
Gegenstand der Erfindung ist daher weiterhin die Verbindung Fluoresceinthiocarbamyl- (et,cfr-diphenylglycin) .
Diese Verbindung wird im folgenden als STC-DPG bezeichnet und besitzt die folgende Strukturformel:
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Gegenstand der Erfindung ist schließlich ein Verfahren ztir Herstellung von Fluoresceinthiocarbamyl-(α,α-diphenylglycin), das dadurch gekennzeichnet ist, daß man o,°l-diphenylglycin gemäß der folgenden Reaktionsgleichung mit Fluoresceinisothiocyanat umsetzt:
NH1
coo"
STC-DPG
Theoretisch ist es möglich, STC-DPG zu in Dreistellung mit fluoresceinaarkiertem 5,5-Diphenyl-2-thiohydantoin zu cyclisieren: Für die erfindungsgemäßen Zwecke eignen sich ferner andere Hydantoinverbindungen, die dem STC-DPG ähneln und die in analoger Weise hergestellt werden können. Sie sind dem Diphenylhydantoin oder den anderen verwandten Arzneimitteln für die Zwecke der vorliegenden Erfindung hinreichend ahnlich. Insbesondere können nach derselben allgemeinen Vorschrift mit Fluorescein markierte Verbindungen hergestellt werden, die den folgenden Arzneimitteln für die Zwecke der vorliegenden Erfindung hinreichend ähnlich sind: Albutoin, 5-(«,ß-Dibromphenethyl)-5-methylhydantoin, 5,5-Diphenyl-2-thiohydantoin, Ethotoin, 5-Ethyl-5-phenylhydantoin, Mephenytoin, Methetoin, 3-Methyl-5-phenylhydantoin und Tetrantoin. Die Erfindung umfaßt auch derartige
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mit Fluorescein markierte Verbindungen und das Verfahren zu ihrer Herstellung.
Bei der Bestimmung von Nortriptylin nach den erfindungsgemäßen Verfahren ist die bevorzugte fluoreszierende Markierungsverbindung Fluorescein. Dieses kann an Nortriptylin beispielsweise dadurch gebunden werden, daß man Nortriptylin mit Fluoresceinisothiocyanat zu Fluoresceinthiocarbamyl-nortriptylin, das im folgenden als FTC-NT bezeichnet wird, umsetzt.
Bei dem Verfahre» gemäß der Erfindung ist es nicht wesentlich, Antikörper zu verwenden, die dadurch erzeugt worden sind, daß man entweder das zu bestimmende einzelne Arzneimittel oder die (falls anwendbar) nahe verwandte Verbindung verwendet, die die fluoreszierende Markierung tragen soll· Anstattdessen können die Antikörper auch durch Verwendung eines anderen Materials erzeugt werden, jedoch ist dieses notwendigerweise in seiner Struktur dem zu bestimmenden Arzneimittel und der markierten Verbindung nahe verwandt, da sich die Antikörper sonst mit diesen beiden Materialien nicht verbinden würden. Wie oben erwähnt, besitzen viele Arzneimittel des Nortriptylintyps einander sehr ähnliche Strukturen, so daß Antikörper, die gegen eines dieser Arzneimittel erzeugt worden sind, auch in der Lage sein können, sich mit einem anderen Arzneimittel zu verbinden. Kreuzreaktionsfähigkeiten dieser Art besitzen den Nachteil, daß sie Bestimmungen von Gemischen zweier eng verwandter Arzneimittel ergeben, die schwierig durchzuführen sind. Jedoch wird eine solche Bestimmung in der Praxis sehr selten benötigt. Andererseits besitzen sie den Vorteil, daß man zwei oder mehr Arzneimittel unter Verwendung nur eines Antiserums und bzw. oder einer fluoreszenzmarkierten Verbindung analysieren kann. Die Vorteile liegen sowohl in der Verringerung der erforderlichen Lagehaltung an Reaktionsteilnehmern in analytischen Laboratorium als
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auch in der Vermeidung der Notwendigkeit, solche Arzneimittel zu markieren, die nur schwer mit einer fluoreszierenden Gruppe versehen werden können.
Um die Menge dee zu bestimmenden Arzneimittels aus der Fluoreszenz des bei dem Verfahren gemäS der Erfindung gebildeten Gemisches zu bestimmen, ist es zweckmäßig, jedoch nicht erforderlich, eine Standardkurve zu verwenden.
Eine Standardkurve für ein bestimmtes System, d.h. ein System aus Arzneimittel, fluoreszenzmarkierter Verbindung und Antikörper, kaan beispielsweise wie folgt erhalten werden. Lösungen mit bekannter Konzentration des Arzneimittels werden in einem Genisch aus Normalserum (pooled normal serum) oder eine» geeigneten Puffer hergestellt. Jede dieser Lösungen wird mit einer konstanten, bekannten Menge einer fluoreszenzmarkierten Verbindung sowie hinreichend spezifischem Antiserum oder Immunoglobulinpräparat versetzt, daß eine Lösung mit vorherbestimmter Verdünnung erhalten wird. Die Fluoreszenzintensitäten der Lösungen werden danach gemessen, und eine Standardkurve für die Fluoreszenzintensität gegen die Konzentration an nicht markiertem Arzneimittel wird aufgetragen.
Eine derartige Kurve kann dann bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wie folgt verwendet werden. Ein bekanntes Volumen der biologischen Flüssigkeitsprobe, die eine Puffersubstanz enthalten kann, wird mit einer konstanten, bekannt sn Menge der 'für die Karstellung der Standardkurve verwendeten fluoreszenzmarkierten Verbindung versetzt. Danach wird eine Menge Antiserum oder Immunoglobulinpräparat zugesetzt, um die bei der Bestimmung der Standardkurve angewandte Verdünnung herzustellen. Die Fluoreszenzintensität des erhaltenen Gemisches wird gemessen, und aus der Standardkurve kann die Menge an in der biologischen Flüssigkeitsprobe enthaltenem Arzneimittel bestimmt werden.
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Gelegentlich kann eine zu bestimmende biologische FlUssigkeitsprobe Serumproteine enthalten, die die Bestimmung gemäß der Erfindung beispielsweise dadurch sturen können, daß sie sich mit der markierten Verbindung unspezifisch verbinden. Wenn dies eintritt oder befürchtet wird, muß die Flüssigkeitsprobe vor der Bestimmung einer Behandlung unterzogen werden, um die Serumproteine zu entfernen oder zu inaktivieren; Verfahren dafür sind bekannt·
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird vorzugsweise die Probe mit der markierten Verbindung vermischt und anschließend das Gemisch mit dem Antikörper kombiniert. Alternativ kann die Probe dem Antikörper zugesetzt und das Ganze anschließend mit der markierten Verbindung versetzt werden.
Während für die Bestimmung von Diphenylhydantoin oder Nortriptylin Fluorescein die bevorzugte fluoreszierende Markierungsverbindung ist, können im Prinzip auch andere fluoreszierende Gruppen eingesetzt werden, wie beispielsweise Dansyl, Rhodamin, Fluorescamin, Pyren und 2-Methoxy-2, 4-diphenyl-3(2H)-furanon. Die Eignung einer bestimmten fluoreszierenden Gruppe für ein bestimmtes System aus Arzneimittel und Antikörper läßt sich leicht durch routinemäßige Versuche und Proben bestimmen. Die fluoreszierende Gruppe muß mit dem System als Ganzem verträglich sein, so daß ein zuverlässiger und reproduzierbarer Fluoreszenzlöschungseffekt nach der Bildung des Komplexes aus markierter Verbindung und Antikörper eintritt.
In diesem Zusammenhang ist zu beachten, daß die Fluoreszenzlöschung nicht nur von der im einzelnen als Markierung verwendeten fluoreszierenden Gruppe, sondern auch von der Natur des Arzneimittels oder der anderen Verbindung, an die sie gebunden wird, sowie von dem zu bestimmenden Arzneimittel und dem Antikörper abhängt.
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Dieser muß auch im Hinblick auf seine Eignung in dem Gesamtsystem ausgewählt werden. Wiederum läßt sich die Eignung eines bestimmten Antiserums oder Immunoglobulinpräparats für ein bestimmtes System aus Arzneimittel und fluoreszierender Gruppe leicht feststellen. Es wurde gefunden, daß bei STC-OPG ein Immunoglobulinpräparat aus Antiserum vom Schaf, das durch Injizieren von Diphenylhydantoin, das nach der Carbodiimldmethode an Rinderserumalbumin gekoppelt war, hergestellt worden 1st, zufriedenstellende Ergebnisse liefert. Im Falle von FTC-NT eignen sich Antisera vom Schaf, die durch Injizieren von mit Hilfe der Carbodiimidmethode an Rinderserumalbumin gekoppeltes N-(4-Aminobutyl-)nortriptylin hergestellt worden sind.
Das Verfahren gemäß der Erfindung umfaßt auch die sog. Bestimmung mit kompetitiver Bindung, bei der zwischen der markierten Verbindung und dem unmarkierten Arzneimittel (beides Antigene) ein Wettbewerbsverhältnis im Hinblick auf die Bindung mit einer beschränkten Menge Antikörper (Antiserum oder Immunoglobulinpräparat) besteht. Immunologische Bestimmungen mit kompetitiver Bindung sind sehr gut bekannt und erfordern normalerweise die Abtrennung der gebundenen Komplexe aus Antikörper und Antigen von freiem Antigen. Diese Abtrennung, die beispielsweise in Radioimmunoassays erforderlich ist, stellt eine praktische Schwierigkeit dar. Das Verfahren gemäß der Erfindung umfaßt jedoch eine derartige Abtrennungsstufe nicht, weshalb es sich in idealer Weise für Analysen nach dem kontinuierlichen Durchflußprinzip eignet. Demzufolge ist auch ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens nach der kontinuierlichen Durchflußmethode Gegenstand der Erfindung.
Bei der kontinuierlichen Durchflußanalyse gemäß der Erfindung wird das Gemisch aus Probe, Antikörper und fluoreszenz-
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markierter Verbindung in einer Leitung entlanggeführt, und die Fluoreszenz gemessen. In einer bevorzugten Durchführungsform gemäß US-PS 2 797 149 werden einzelne Abschnitte des Gemisches, getrennt durch inerte Fluidsegmente, wie beispielsweise Luft, und gewünschtenfalls ein Waschflüssigkeit ssegment, in der Leitung entlanggeführt. Das Gemisch kann in der Leitung selbst gebildet werden, indem man der Leitung phasengleich mit den Abschnitten der Komponenten des Gemisches, die sich schon in Ihr befinden, die weitere Komponente bzw. weiteren Komponenten zuführt, wobei das Vermischen der Komponenten in der Leitung beim Hindurchfließen des Gemisches erfolgt.
Ein äußerst vorteilhaftes Merkmal des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, daß Analysen der in Rede stehenden Arzneimittel verhältnismäßig einfach nach dem kontinuierlichen Durchflußprinzip durchgeführt werden können, was hauptsächlich darauf zurückzuführen ist, daß bei dem erfindungsgemäßen Verfahren keine Abtrennungsstufe erforderlich ist. Somit kann das in der Leitung fließende Gemisch zur direkten Messung unmittelbar an eine Fluoreszenzzelle heran- oder durch sie hindurchgeführt werden. Es ist daher nach dem erfindungsgemäßen Verfahren möglich, die in Rede stehenden Arzneimittel nach dem Durchflußprinzip zu bestimmen, was bisher nach den bekannten Verfahren unmöglich oder äußerst schwierig war.
Zu den Vorteilen des erfindungsgemäßen Verfahrens gehören:
1. STC-DPG und FTC-NT können aus leicht zugänglichen und wohlfeilen Ausgangsprodukten hergestellt werden.
2. STC-DPG und FTC-NT besitzen eine gute Haltbarkeit.
3. Das Verfahren ist nicht strahlung3gefährlich und erfordert nicht Radioaktivitätszähleinrichtungen.
4. Eine Abtrennungsstufe ist nicht erforderlich.
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5. Die Messung erfolgt durch eine einmalige Berechnung aufgrund herkömmlicher Fluorimetrie.
6. Wegen der Punkte 4. und 5. kann das Verfahren leicht automatisiert werden.
7. Die Bestimmung erfolgt rasch. Lediglich wenige Minuten sind erforderlich, um das immunologische Gleichgewicht zwischen Antikörper, STC-DPG und Diphenylhydantoin oder Antikörper FTC-NT und Nortriptylin einstellen zu lassen.
8. Die Bestimmung kann unter Berücksichtigung der oben angegebenen Kreuzreaktionen für das im einzelnen zu bestimmende Arzneimittel immunospezifisch sein.
9. Die erforderliche Serumprobe ist klein. 1,5/Ul oder weniger genügen bereits für eine Einzelbestimmung von Diphenylhydantoin, wenngleich zur Bestimmung von Nortriptylin etwas größere Mengen erforderlich sind.
10. Wegen der geringen Menge erforderlicher Serumprobe kann der Anteil der Eigeafluoreszenz der Serumprobe an dem Gesamtsignal vernachlässigt werden, wenngleich dieser Anteil in jedem Falle leicht bei den Fluoreszenzmessungen berücksichtigt werden kann.
Die Erfindung wird im folgenden an Hand von Beispielen näher erläutert.
Beispiel 1. Herstellung von STC-DPG
43 niM ct,cx-diphenylglycin und 215 mM Fluoresceinisothiocyanat wurden jeweils in Pyridin/'rfasser/Triethylamin vom Volumenverhältnis 11 : 8 : 1 gelöst. Ein ml der CXjCtf-diphenylglycinlösung und 0,2 ml der Fluor esc eini sothiocyanatlösung wurden vermischt und 6 Tage im Dunklen bei Raumtemperatur stehengelassen. Die Produkte wurden durch Zusatz von 10 Volumenteilen 0,2m Ammoniumacetat vom pH 4,0 ausgefällt und der Niederschlag abzentrifugiert und in 1 Volumenteil 0,1n Natronlauge erneut gelöst. Ein aliquo-
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ter Teil von 0,1 ml wurde der präparat!.ven Elektrophorese auf einen 5 cm breiten Streifen Whatman Nr. 17-Papier in 0,02m Natriumcarbonat/Bicarbonat-Puffer vom pH 9,0 zwei Stunden lang bei etwa 10 V/cm unterworfen. Drei fluoreszierende Zonen wurden erhalten, und nach dem Trocknen des Streifens wurde die mittlere Zone ausgeschnitten und das Produkt durch Schütteln mit 2 ml 0,05m Ammoniumbicarbonat eluiert.
Das Produkt erwies sich nach den Kriterien der analytischen Elektrophorese mit Whatman Nr. 1-Papier in 0,02m Natriumcarbonat/Bicarbonat-Puffer vom pH 9,0 und Papierchromatographie mit Whatman Nr. 3MM Papier unter Verwendung von 0,05m Natriumcarbonat/Bicarbonat-Puffer vom pH 9t0 als Entwickler als rein.
Unter der Annahme eines Spitzenextinktionskoeffizienten für das Dian!on der Fluoresceingruppe von
a -1-1
8,72 χ 10 1 mole cm , berechnet für Fluorescein von Dandliker und Alonso, Iiamunochemistry 4, 191-196 (1967)» wurde die Konzentration der Produktlösung als 76 /Umolar errechnet. Konzentrationen, die unten angegeben sind, beziehen sich auf diese Berechnung.
Das Produkt wurde gefroren aufbewahrt und erschien unter diesen Bedingungen stabil.
Beispiel 2. Herstellung von Antidiphenylhydantoin-Immuno-
globulinen
Antidiphenylhydantoinserum aus einem Schaf., das mit mit Hilfe der Carbodilmidmethode an Rinderserumalbumin gekoppeltem Diphenylhydantoin Immunisiert worden war, wurde mit der gleichen Volumenmenge zu 70% gesättigter Amaoniumsulfatlösung vom pH 7,0 vermischt und 4 h bei Raumtemperatur stehengelassen. Der erhaltene Niederschlag wurde abzentrifugiert und durch Zugabe von entionisiertem Wasser erneut gelöst und die Lösung auf das ursprüngliche Serumvolumen
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gebracht. Ein Volumenteil 70%ige Ammoniumsulfatlösung wurde anschließend unter Vennischen langsam zugesetzt und der erhaltene Niederschlag unmittelbar abzentrifugiert (spun down) und durch Zugabe von entionisiertem Wasser erneut gelöst und die Lösung auf das ursprüngliche Serumvoluaen gebracht. Die letzte Stufe wurde wiederholt. Die erneut gelösten Immunoglobuline wurden über Nacht gegen 0,1m Natriumphosphatpuffer vom pH 7,5 zu dem gewünschten Produkt dialysiert.
Beispiel 3. Zerstörung der Fähigkeit von STC-DPG. in
menschlichen Serumproben Proteine zu binden
Das unspezifische Binden von Proteinen» die wahrscheinlich hauptsächlich Albumine sind, an STC-DPG in Proben aus menschlichem Serum wurde durch enzymatischen Abbau in einem Vorbehandlungsschritt wie folgt vermieden: 0,050 ml menschliches Serum wurden mit 1,95 ml einer Lösung von 10 /Ug Pepsin/ml, das aus Schweinemagenschleimhaut stammte, zweimal umkristallisiert und lyophilisiert war, in 0,1n HCl versetzt. Eine Bebrütungszeit von 30 min bei 25 0C erwies sich danach als ausreichend, um sämtliche unspezifischen STC-DPG-Bindungen in dem schließlich angewandten immunologischen Bestimmungssystem aufgrund von Fluoreszenzlöschung zu zerstören (siehe die folgenden Beispiele 4 und 5)φ Bei dem pH-Wert des Bestimmungssystems ist Pepsin inaktiv und stört daher nicht.
Beispiel 4. Immunologische Bestimmung von Diphenylhydantoln durch Fluoreszenzlöschung
(I) Antikörperverdünnungskurve. Um die optimalen Bestimmungsbedingungen auszuwählen, wurde eine konstante Menge STC-DPG in 0,1m Natriumphosphatlösung vom pH 7,5 zu sich jeweils verdoppelnden Verdünnungen des Antidiphenylhydantoin-Immunoglobulin-Präparats in denselben Puffer gegeben, so daß man eine Endkonzentration an STC-DPG von
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1 nH in einem Endvolumen von 1,5 ml erhielt. Die Fluoreszenzintensität wurde gemessen (vgl. Fig. 1 der Zeichnungen). Von dieser Kurve wurde eine EndverdUnnung an Immunoglobulin von 1 zu 200 zur Herstellung der Standardkurve ausgewählt.
(II) Standardkurve. Proben von 0,05 ml mit einer bekannten Konzentration an Diphenylhydantoin in vermischtem (pooled) normalem menschlichem Serum wurden mit 1,95 ml Pepsinlösung (Beispiel 3) versetzt. Nach 30minÜtigern Bebrüten bei 25 0C wurden aliquote Teile von 0,050 ml der behandelten Proben zu 1 ml 0,1m Natriumphosphatpuf Verlosung vom pH 7,5 hinzugegeben, wonach dieselbe Menge STC-DPG, wie sie für die Herstellung der AntikörperverdUnnungskurve verwendet wurde, zugegeben wurde. Danach wurden die Antidiphenylhydantoinimmunoglobuline zugesetzt, so daß eine Endverdünnung von 1 zu 200 in einem Endvolumen von 1,5 ml erzielt wurde. Nach einigen Minuten Bebrüten bei 25 0C zur Einstellung des Gleichgewichtes wurde die Fluoreszenzintensität des Bestimmungsgemisches gemessen.
Der Anteil der Eigenfluoreszenz des vermischten (pooled) normalen menschlichen Serums an der Gesamtfluoreszenzintensität des Bestimmungsgemisches wurde gemessen, indem man die oben angegebene Verfahrensweise mit der Abweichung wiederholte, daß man die STC-DPG- und Immunoglobulinlösungen durch Phosphatpuffer ersetzte. Durch Subtrahieren der Eigenfluoreszenzintensität da3 Serums von der Gesamtintensität des Bestimmungsgemisches erhielt man die in Fig. 2 dargestellte Standardkurve·
Beispiel 5. Bestimmung von Diphenvlhydantoin in Proben von Patientenserum
Serumproben von Patienten, die mit Diphenylhydantoin behandelt wurden/ wurden nach der in Beispiel 4,
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Abschnitt II beschriebenen Verfahrensweise bestimmt. Der Anteil der Eigenfluoreszenz jeder Serumprobe, unabhängig voneinander gemessen, wurde von der Gesamtfluoreszenzintensität des entsprechenden Bestimmungsgemisches subtrahiert und das erhaltene Ergebnis zur Bestimmung der Arzneimittelmenge in der Serumprobe, ausgehend von einer geeigneten Standardkurve, verwendet.
Fig. 3 zeigt die Korrelation zwischen den Spiegeln an Diphenylhydantoin, die durch immunologische Bestimmung aufgrund von Fluoreszenzlöschung und solchen, die mittels der herkömmlichen Verfahrensweise unter Verwendung der Gas/Flüssigkeits-Chromatographie von einem unabhängigen Labor bestimmt wurden. Die Übereinstimmung zwischen beiden Methoden erweist sich als für klinische Zwecke zufriedenstellend.
Beispiel 6. Kontinuierliches Durchflußsystem für die
automatische Bestimmung von Diphenylhydantoin
Fig. 4 der Zeichnungen stellt eine Form eines Fließsystems dar, das sich für eine kontinuierliche Durchflußbestimmung eignet. Das System besteht aus einer Probeneinlaßleitung 1, einer Pepsinreagenzeinlaßleitung 2, einer Lufteinlaßleitung 3» einer Einlaßleitung 4 für mit Pepsin behandelte Proben, eine STC-DPH-Einlaßleitung 5, eine Lufteinlaßleitung 6 und eine Einlaßleitung 7 für Antiserum oder Immunoglobulin. Leitungen 2 und 3 treffen sich am Abschnittsbilder 9, der mit der Einmündungs3telle 10 verbunden ist, wo Leitung 1 in Leitung 2 mündet. Stromabwärts der Einmündung 10 ist in Leitung 2 eine Mischschlange 11 angeordnet, die ihrerseits mit der Verzweigungsstelle 12 verbunden ist, wo der Strom geteilt wird, so daß ein Anteil durch Leitung 4 in das System zurückgeführt, der andere Jedoch durch Auslaß 13 in's Freie geleitet wird. Die Leitungen 5 und 6 treffen an dem Abschnittsbilder 14 zusammen, der mit der Einmündungsstelle 15 verbunden ist, wo Lei-
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tung 4 in Leitung 5 einmündet. Stromabwärts von der EInmilndungsstelle 15 ist in Leitung 5 eine Mischschlange 16 vorgesehen, die ihrerseits mit der Einmündungsstelle 17 verbunden ist, wo Leitung 7 einmündet. Unterhalb der Einmündungsstelle 17 ist wiederum eine Mischschlange 18 vorgesehen und schließlich ein Fluorimeter 19, das einen Ablaß 20 und einen Auslaß 21 unterhalb der Fluoreszenzzelle besitzt, der über Leitung 8 in's Freie führt. Das Fluorimeter 19 1st an das Aufzeichnungsgerät 22 angeschlossen·
Im Betrieb wird eine gesteuerte Menge Pepsinreagenz (zur Zerstörung von allfälligen störenden Serumproteinen) in Leitung 2 eingebracht und im Abschnittsbildner 9 durch Luft in Abschnitte eingeteilt. Die zu untersuchende Probe (beispielsweise Serum) wird in den in Abschnitte eingeteilten Strom an der Einmüadungsstelle 10 eingeführt, wonach in der Schlange 11 gemischt und bebrütet wird. Eine gesteuerte Menge STC-DPG wird in Leitung 5 eingeführt und durch Abschnittsbildner 14 in durch Luft voneinander geschiedene Abschnitte eingeteilt. Eine gesteuerte Menge der mit Pepsin behandelten Probe wird an der Verzweigungsstelle 12 abgeführt und an der Einmündungsstelle 15 in den in Abschnitte eingeteilten STC-DPG-Strom eingeleitet, wonach in Schlange 16 vermischt wird. Danach wird eine gesteuerte Menge Antiserum oder Immunoglobulin an der Einmündungsstelle 17 eingeführt, wonach in Schlange 18 vermischt wird, bevor das Ganze in das Fluorimeter 19 gelangt.
Zur Messung der Eigenfluoreszenz der Proben (beispielsweise Serum) in dem kontinuierlichen Durchflußsystem wird in den Leitungen 5 bzw. 7 wäßrige Pufferlösung eingesetzt.
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Beispiel 7. Herstellung von FTC-Nortriptylin (FTC-NT)
6,7 mg/ml Nortriptylinhydrochloridlösung und 2,97 mg/ml Fluoresceinisothiocyanatlösung (FITC) wurden in 0,05m Natriumcarbonat/Bicarbonat-Pufferlösung vom pH 9,O/Methanol im Volumenverhältnis 1 : 1 hergestellt. 0,3 ml der FITC-Lösung wurden mit 0,1 ml der Nortriptylinlösung vermischt und 105 min bei Raumtemperatur belassen. Das Produkt wurde mit 0,4 ml 0,2m Ammoniumacetatlösung vom pH 4,0 ausgefällt, abzentrifuglert und die überstehende Lösung verworfen. Nach dem Waschen mit 0,8 ml entionisiertem Wasser wurde das Produkt erneut zentrifugiert und die überstehende Lösung verworfen. Das Produkt wurde in 2 ml 0,05m Ammoniumbicarbonat gelöst, wobei Ammoniak zugesetzt wurde (0,01 Gew.-# Endkonzentration)·
Papierchromatographie (Whatman Nr. 3MM Papier, Entwicklung mit 0,05m Natriumcarbonat/Bicarbonat-Pufferlösung vom pH 9,0) und Elektrophorese (Whatman Nr. 1 Papier 0,02m Natriumcarbonat /Bicarbonat-Pufferlösung vom pH 9,0) (etwa 10 V/cm) ergaben lediglich Spuren an Verunreinigungen in dem Produkt.
Unter der Annahme eines Spitzenextinktionskoeffizienten für das Dianion der Fluoresceingruppe von 8,72 χ 10 1 mole" cm" gemäß (Dandliker und Alonso, Immunochemistry 4, 191-196 (1967), wurde die Konzentration der Produktlösung als 0,9 mM berechnet. Weiter unten angegebene: Konzentrationen beruhen auf dieser Berechnung.
Das FTC-NT wurde in gefrorener Lösung aufbewahrt und erschien in dieser Form stabil.
Beispiel 8. Herstellung von Antinortrlptylinimmunoglobulinen
Ein Volumenteil von in einem Schaf hergestelltem Antinortriptylinserum wurde mit einem Volumenteil Ammoniumsulfatlösung von 70#iger Sättigung und einem pH-Wert von 7,0
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vermischt und 4 h bei Raumtemperatur stehengelassen. Der Niederschlag wurde abzentrifügiert und durch Zugabe von entionisiertem Wasser erneut gelöst und die Lösung bis zum ursprünglichen Serumvolumen aufgefüllt. Ein Volumenteil 70#iger Ammoniumsulfatlösung wurde unter Vermischen langsam zugesetzt und der erhaltene Niederschlag unmittelbar darauf abzentrifügiert und erneut durch Zugabe von entionisiertem Wasser gelöst und die Lösung auf das ursprüngliche Serumvolumen gebracht. Der letzte Schritt wurde wiederholt. Die erneut gelösten Immunoglobuline wurden über Nacht gegen O9Im Natriumphosphatpufferlösung vom pH 7,5 zu dem gewünschten Endprodukt dialysiert.
Beispiel 9. Immunologische Bestimmung für Nortriptylln
aufgrund von Fluoreszenzlöschung; Standardkurve
0,1-ml-Proben von Nortriptylin bekannter Konzentration in O,O75m Barbitalpufferlösung vom pH 8,8 wurden mit 1,4 ml des Präparats der Antinortriptylinimmunoglobuline, in der Verdünnung 1 zu 28 in derselben Pufferlösung versetzt. Nach einigen Minuten Stehenlassen bei 25 0C wurden 0,05 ml einer 750 mM-Löeung von PTC-NT in demselben Puffer zugesetzt · Nach 45 min Stehen bei 25 0C wurde die Fluoreszenz des Gemisches gemessen (siehe Fig. 5). Die Endkonzentration an FTC-NT war 24 nH, und die Endverdünnung der Antinortriptylinimmunoglobuline betrug 1 zu 31·
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Claims (17)

Patentansprüche
1. Verfahren zur Bestimmung substituierter Hydantoine oder tricyclischer Antidepressiva in einer biologischen Flüssigkeitsprobe,
dadurch gekennzeichnet, daß man ein Gemisch aus der Probe mit dner fluoreszenzmarkierten Verbindung und einem Antikörper bildet, der sowohl gegenüber dem zu bestimmenden Arzneimittel als auch gegenüber der markierten Verbindung aktiv ist, und die Fluoreszenz der markierten Verbindung in dem Gemisch mißt und dadurch die Menge an in der Probe vorhandenem Arzneimittel bestimmt.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, daß man als fluoreszenzmarkierte Verbindung ein mit einer fluoreszierenden Gruppe versehenes Arzneimittel verwendet, das dasselbe wie das zu bestimmende Arzneimittel ist.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, daß man als fluoreszenzmarkierte Verbindung eine mit einer fluoreszierenden Gruppe versehene Verbindung verwendet, die von dem zu bestimmenden Arzneimittel verschieden ist.
4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1,2 oder 3, dadurch geken τι zeichnet, daß man als Antikörper einen solchen verwendet, der entweder gegenüber dem zu bestimmenden Arzneimittel oder gegenüber der fluoreszenzmarkierten Verbindung erzeugt worden ist.
5. Verfahren gemäß Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, daß man als zu bestimmendes Arzneimittel Diphenylhydantoin
verwendet. 709843/0930
ftfttftlNM. INSPECTED
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6. Verfahren gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als fluoreszenzmarkierte Verbindung ein Fluoresceinderivat verwendet.
7. Verfahren gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als fluoreszenzmarkierte Verbindung Fluoresceinthiocarbamyl-(cx,cc-diphenylglycin) verwendet.
8. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als zu bestimmendes Arzneimittel Nortriptylin verwendet.
9. Verfahren gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man als fluoreszenzmarkierte Verbindung mit Fluorescein markiertes Nortriptylin verwendet.
10. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadur ch gekennzeichnet, daß man als zu bestimmendes Arzneimittel Albutoin, Aloxidone, 5-(α ,β -Dibromphenethyl)-5-methylhydantoin, 5,5-Diphenyl-2-thiohydantoin, Ethadion, Ethosuximid, Ethotoin, 5-Ethyl-5-phenylhydantoin, Mephenytoin, Methetoin, Methsuximid, 3-Methyl-5-phenyl-hydantoin, Paramethadion, Pemoline, Phensuximid, Tetrantoin, Trimethadion, Amitriptylin, Butriptylin, Desipranin, Dibenzepin, Hepzidin, Imipramin, Melitracen, Opipramol, Protriptylin oder Trimipramin verwendet.
11. Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man als fluoreszierende Gruppe für die fluoreszenzmarkierte Verbindung Fluorescein, Dansyl, Rhodamin, Fluorescanin, Pyren oder 2-Methoxy-2,4-diphenyl-3(2H)-furanon verwendet.
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12«, Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß nan die Fluoreszenz des Gemisches mit der Fluoreszenz eines Standardgemisches vergleicht, das bekannte Mengen des zu bestimmenden Arzneimittels enthält, und die Menge an in der Probe anwesendem Arzneimittel auf diese Weise bestimmt.
13. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man das Verfahren nach dem kontinuierlichen Durchflußprinzip durchführt.
14. Verfahren gemäß Anspruch 13,
dadurch gekennzeichnet, daß man Abschnitte des Gemisches, getrennt durch Abschnitte eines inerten Fluids, eine Leitung entlangströmen läßt und die Fluoreszenz der Gemischabschnitte ohne Abtrennung eines Reaktionsproduktes aus dem Gemisch mißt.
15. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens gemäß Anspruch 13 oder 14, enthaltend eine Leitung, Mittel zum Strömenlassen des Gemisches in der Leitung, Mittel zum Messen der Fluoreszenz des Gemisches und Mittel zum Vergleichen der Fluoreszenz mit Standardergebnissen zur Bestimmung der Menge an zu bestimmenden Arzneimittel in der Probe.
16. Fluoresceinthiocarbamyl-(oC,«-diphenylglycin).
17. Verfahren zur Herstellung von Fluoresceinthiocarbamyl-(α,α-diphenylglycin,
dadurch gekennzeichnet, daß nan α ,α-diphenylglycin mit Fluoresceinthiocyanat umsetzt.
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DE19772716515 1976-04-15 1977-04-14 Verfahren und vorrichtung zur bestimmung von diphenylhydantoin, nortriptylin und aehnlicher pharmazeutika in biologischen fluessigkeitsproben Withdrawn DE2716515A1 (de)

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SE (1) SE443238B (de)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4238195A (en) 1979-01-18 1980-12-09 Miles Laboratories, Inc. Fluorescer-labeled specific binding assays
WO1997040033A1 (en) * 1996-04-19 1997-10-30 Lexigen Pharmaceuticals Corp. Inhibition of the binding of human ige to its receptor by tetracyclic compounds for the alleviation of ige-mediated immune response

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1583869A (en) * 1977-08-19 1981-02-04 Technicon Instr Competitive binding analysis by fluorescence
US4540548A (en) * 1977-04-07 1985-09-10 Yamanouchi Pharmaceutical Co., Ltd. Method of detecting fluorescent materials and apparatus for their detection
US4171311A (en) * 1978-01-16 1979-10-16 International Diagnostics Tech. Inc. Imides of thyroxin and triiodothyronine
EP0040224A4 (de) * 1979-11-19 1982-09-09 Prince Charles Hospital Dev Ct Verbessertes analyseverfahren für nichthomogene enzyme.
US4372745A (en) * 1979-12-19 1983-02-08 Electro-Nucleonics, Inc. Chemical luminescence amplification substrate system for immunochemistry involving microencapsulated fluorescer
WO1981001883A1 (en) * 1979-12-19 1981-07-09 Electro Nucleonics Chemical luminescence amplification substrate system for immunochemistry
US4329461A (en) * 1980-01-11 1982-05-11 Syva Company Fluorescent thyroid hormone conjugates and their uses
NL8000173A (nl) * 1980-01-11 1981-08-03 Akzo Nv Toepassing van in water dispergeerbare, hydrofobe kleurstoffen als label in immunochemische testen.
US4430435A (en) 1980-12-24 1984-02-07 Burroughs Wellcome Co. Assay system
CA1248086A (en) * 1981-12-11 1989-01-03 Stephen D. Stroupe Fluorescence polarization immunoassay
DE3150878A1 (de) * 1981-12-22 1983-06-30 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim "verfahren und reagenz zur bestimmung von creatinin"
SE454115B (sv) * 1982-09-13 1988-03-28 Wallac Oy Homogenfasanalys med lantanidkelat som merksubstans
EP0104926A3 (de) * 1982-09-27 1986-11-12 Unilever Plc Prüfungsverfahren und dafür geeignete Mittel
US4670381A (en) * 1985-07-19 1987-06-02 Eastman Kodak Company Heterogeneous immunoassay utilizing horizontal separation in an analytical element
US4752568A (en) * 1986-01-13 1988-06-21 Eastman Kodak Company Labeled hydantoin conjugate and its use in analytical element and immunoassays
JPH0752194B2 (ja) * 1988-03-05 1995-06-05 常廣 北川 固体抗原に対する抗体を用いるイムノアッセイ
US5407835A (en) * 1991-07-31 1995-04-18 Abbott Laboratories Reagents and methods for the quantification of amitriptyline or nortriptyline in biological fluids
CA2804843C (en) * 2012-02-06 2021-02-02 Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. Multiple time windows for extending the range of an assay

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2797149A (en) * 1953-01-08 1957-06-25 Technicon International Ltd Methods of and apparatus for analyzing liquids containing crystalloid and non-crystalloid constituents
US3901654A (en) * 1971-06-21 1975-08-26 Biological Developments Receptor assays of biologically active compounds employing biologically specific receptors
US3995021A (en) * 1972-05-15 1976-11-30 Biological Developments, Inc. Antigens of 5,5'alkylphenyl barbituric acids and related hydantoin compounds
US3998943A (en) * 1973-10-02 1976-12-21 Syva Company Double receptor fluorescent immunoassay
US3996345A (en) * 1974-08-12 1976-12-07 Syva Company Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays
US4036946A (en) * 1975-10-20 1977-07-19 Marcos Kleinerman Immunofluorometric method for measuring minute quantities of antigens, antibodies and other substances

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4238195A (en) 1979-01-18 1980-12-09 Miles Laboratories, Inc. Fluorescer-labeled specific binding assays
WO1997040033A1 (en) * 1996-04-19 1997-10-30 Lexigen Pharmaceuticals Corp. Inhibition of the binding of human ige to its receptor by tetracyclic compounds for the alleviation of ige-mediated immune response
US5965605A (en) * 1996-04-19 1999-10-12 Heska Corporation Inhibition of the binding human IgE to its receptor by tetracyclic compounds for the alleviation of IgE-mediated immune response

Also Published As

Publication number Publication date
SE7704305L (sv) 1977-10-16
FR2348493A1 (fr) 1977-11-10
SE443238B (sv) 1986-02-17
FR2348493B1 (de) 1982-10-22
NL7704125A (nl) 1977-10-18
JPS5337668A (en) 1978-04-06
CA1087980A (en) 1980-10-21
US4160818A (en) 1979-07-10

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