DE2741862C2

DE2741862C2 -

Info

Publication number: DE2741862C2
Application number: DE2741862A
Authority: DE
Inventors: David S. Wimbledon Gb Smith
Original assignee: Technicon Instruments Corp
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1977-08-19
Filing date: 1977-09-16
Publication date: 1989-01-26
Also published as: JPS616940B2; BE858722A; DE2741862A1; NL7709977A; FR2393308A1; JPS5379024A; GB1583869A; FR2393308B1; CA1106280A; SE7710000L; US4272505A; AU2864977A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Thyroidhormonen in biologischen Flüssigkeiten.

Störungen der Schilddrüsenfunktion stellen eine der häufigsten endocrinen Abnormitäten dar, die in der klinischen Praxis auftreten, und Bestimmungsmethoden für Thyroidhormone, wie beispielsweise Thyroxin (T₄) und Trÿodthyronin (T₃), werden häufig benötigt. Diese Bestimmungen werden im allgemeinen mit Hilfe der sogenannten kompetitiven Proteinbindungstechnik durchgeführt. Bei dieser Methode wird ein Gemisch aus der Probe, die das zu bestimmende Thyroidhormon enthält, einer Menge an markiertem Thyroidhormon und einem Antikörper oder einem anderen Bindungsprotein gebildet, das sich mit dem markierten und unmarkierten Thyroidhormon unter Ausbildung von Komplexen mit ihm ins Gleichgewicht setzt:

Ag + AG* + Ab Ab : Ag + Ab : Ag*

wobei Ag das unmarkierte zu untersuchende Thyroidhormon, Ag* das markierte Thyroidhormon und Ab das Bindungsprotein bedeuten. Durch Messen des markierten Ag*, das einerseits in dem Komplex (gebundene Fraktion) und andererseits als freie Fraktion in Lösung, d. h. nicht komplexiert, vorhanden ist, ist es möglich, die Menge an Thyroidhormon, die in der ursprünglichen Serumprobe vorhanden ist, zu berechnen (vgl. Z. Anal. Chem. 277 (1975), Seite 251).

Zur Markierung dient ein radioaktives Isotop, gewöhnlich ¹²⁵I, aber während Bestimmungen dieser Art verhältnismäßig zuverlässig und empfindlich sind, besitzen sie doch eine Reihe von Nachteilen.

Aus der Literaturstelle Immunochemistry 10 (1973), S. 219-227 ist ein Fluoreszenz-Immunoassay zur Bestimmung von Hormonen wie Thyroxin bekannt, der auf Fluoreszenzpolarisation beruht.

Schließlich ist aus US-PS 39 01 654 ein Verfahren zur immunologischen Bestimmung einer biologisch aktiven Substanz bekannt, bei dem Fluoreszenzverstärkung oder Fluoreszenzlöschung eines Fluorophors durch Umsetzung mit einer bindenden Substanz herbeigeführt und gemessen wird. Dabei wird im Falle der Fluoreszenzverstärkung von der bindenden Substanz auf den Fluorophor Lichtenergie übertragen, weshalb das Absorptionsspektrum des Fluorophors dem Emissionsspektrum der bindenden Substanz (des Rezeptors) entsprechen muß. Es muß also eine spektrale Überlappung des Emissionsspektrums des Rezeptormoleküls und des Absorptionsspektrums der fluoreszierenden Substanz gegeben sein, was den Kreis der geeigneten Vertreter aus beiden Substanzgruppen natürlich einschränkt.

Gegenstand der Erfindung ist das in Anspruch 1 angegebene Verfahren.

Wenn sich das Konjugat XF an die bindende Substanz (das Bindungsprotein) unter Ausbildung eines Komplexes bindet, wird die Fluoreszenz des Fluorophors F vergrößert, und es ist daher möglich, in einer Probe das Thyroidhormon zu bestimmen, ohne daß ein Abtrennungsschritt erforderlich ist, d. h. ohne Abtrennung des Komplexes von dem Reaktionsgemisch. Die Notwendigkeit einer derartigen Abtrennung stellt einen Hauptnachteil des eingangs erwähnten Radioimmunoassays dar.

In einer bevorzugten Durchführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Bestimmung von Thyroxin in einer biologischen Flüssigkeit dergestalt durchgeführt, daß man

(1) ein Gemisch aus der Probe mit
- (a) einer bekannten Menge von mit Fluorescein markiertem Thyroxin und
- (b) Antithyroxinantiserum
herstellt,
(2) die Fluoreszenz des auf diese Weise hergestellten Gemisches mißt und
(3) die Menge an Thyroxin in der Probe aus der Fluoreszenzmessung und aus Standarddaten berechnet.

Die bindende Substanz, die bei dem Verfahren gemäß der Erfindung verwendet wird, kann jedes beliebige bindende Protein, wie beispielsweise ein Antikörper, sein, das sich sowohl mit dem zu bestimmenden Thyroidhormon als auch mit dem markierten Konjugat XF verbindet.

Die markierte Verbindung XF setzt sich mit der bindenden Substanz unter Ausbildung eines Komplexes ins Gleichgewicht. Die Substanz X kann selbst das zu bestimmende Thyroidhormon sein, was es auch gewöhnlich und im allgemeinen in bevorzugter Weise ist. Jedoch braucht die Substanz X mit dem zu bestimmenden Hormon nicht identisch zu sein, sondern kann eine leicht unterschiedliche Struktur besitzen, vorausgesetzt, daß sie mit der bindenden Substanz einen Komplex eingeht. In den Fällen, in denen es schwierig ist, eine fluoreszierende Markierung an einem Thyroidhormon selbst anzubringen, kann daher eine Verbindung X verwendet werden, die dem Hormon strukturell ähnlich ist, jedoch leichter markiert werden kann.

Als Markierung F wird Fluorescein bevorzugt, wenngleich auch andere Substanzen, wie Rhodamin, Dansyl, Fluorescamin, Pyren und 2-Methoxy-2,4-diphenyl-3(2H)-furanon (MDPF) verwendet werden können.

Wenn bei dem Verfahren gemäß der Erfindung das Gemisch in Stufe 1 gebildet worden ist, wird das markierte Konjugat XF an die bindende Substanz unter Ausbildung eines Komplexes gebunden, dessen Fluoreszenz größer ist als diejenige des Konjugats allein. Auf diese Weise wird die Fluoreszenz des Gemisches erhöht. Im Falle einer Bestimmung von T₄ unter Verwendung eines Konjugats aus T₄ und Fluorescein wird das Freisetzen unterdrückter Fluoreszenz nach Bildung des Komplexes vermutlich durch einen sterischen Hinderungseffekt verursacht. Die Bindung des Antikörpers an den T₄-Rest des markierten T₄ hindert die unterdrückende Wirkung des T₄-Restes auf die Fluoreszenz des Fluoresceinrestes sterisch, was zu einer Freisetzung der unterdrückten Fluoreszenz führt.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird die Fluoreszenz des in Stufe 1 gebildeten Reaktionsgemisches in Stufe 2 gemessen. (Selbstverständlich umfaßt die Fluoreszenz des gesamten Reaktionsgemisches nicht nur die Fluoreszenz des Fluorophors, sondern auch jegliche Hintergrundfluoreszenz, die von anderen anwesenden Materialien verursacht wird. Diese Hintergrundfluoreszenz muß zugelassen werden, wie die Fachwelt weiß.) Durch Vergleichen des Ergebnisses mit Standarddaten, beispielsweise einer Standardkurve, kann die Menge an in der zu untersuchenden Probe vorhandenen Thyroidhormon errechnet werden. Die Standardkurve für jedes beliebige System kann wie folgt erhalten werden. Lösungen bekannter Konzentration an dem Thyroidhormon werden in einem geeigneten Puffer hergestellt. Jede dieser Lösungen wird mit einer konstanten Menge des fluoreszenzmarkierten Konjugats XF und einer hinreichenden Menge bindender Substanz versetzt, daß eine Lösung mit einer vorherbestimmten Konzentration anbindender Substanz erhalten wird. Die Fluoreszenzintensitäten der Lösungen werden anschließend gemessen, und es wird eine Standardkurve der Fluoreszenzintensität in Abhängigkeit der Konzentration an unmarkiertem Thyroidhormon aufgetragen. Eine derartige Kurve wird anschließend dazu verwendet, um die Menge an (unmarkiertem) Thyroidhormon in einer zu untersuchenden Probe wie folgt zu bestimmen. Ein bekanntes Volumen der Probe (nötigenfalls gepuffert) wird mit der genannten konstanten Menge an markierter Substanz XF und einer Menge an bindender Substanz versetzt, die ausreicht, um die Konzentration an ihr herzustellen, die zur Aufstellung der Standardkurve verwendet worden war. Von dem erhaltenen Gemisch wird die Fluoreszenzintensität gemessen, wonach aus der Standardkurve die Menge an vorhandenem Thyroidhormon bestimmt werden kann.

Wie in der Immunoassaytechnik bekannt, kann Serum Proteine enthalten, die in nichtspezifischer Weise mit beispielsweise Ag (in diesem Falle Thyroidhormonen) Bindungen eingehen und so zu einem falschen Ergebnis führen können. Wenn dies eintritt oder mit Wahrscheinlichkeit eintritt, ist es erforderlich, vor der Durchführung der Bestimmung diese bindenden Proteine im Serum zu entfernen oder zu desaktivieren. Beispielsweise ist es zur Bestimmung von T₄ in menschlichem Serum erforderlich, zunächst das Serum zu behandeln, um die Serumproteine zu entfernen oder zu desaktivieren. Dies kann auf verschiedene Weise geschehen, wie der Fachwelt bekannt. Selbstverständlich umfaßt daher das Verfahren gemäß der Erfindung nötigenfalls die Vorstufe der Entfernung oder Desaktivierung von Serumproteinen, die die Bestimmung stören könnten.

Das Verfahren gemäß der Erfindung kann nach dem Prinzip des kontinuierlichen Stroms durchgeführt werden, wobei Abschnitte aus dem in Stufe 1 gebildeten Gemisch in eine Leitung, voneinander durch Abschnitte eines inerten Fluids getrennt, entlanggeführt und die Fluoreszenz der Gemischsegmente gemessen wird, ohne daß eine Abtrennung von Reaktionsprodukt aus dem Gemisch erfolgt. Ein derartiges Verfahren kann in einer automatisierten Vorrichtung durchgeführt werden, die eine oder mehrere Vermischungseinrichtungen zur Bildung eines Gemisches aus der zu untersuchenden Probe und einer bekannten Menge des markierten Konjugats XF und der bindenden Substanz, Mittel zum Hindurchleiten des Gemisches durch einen Fluorimeter zur Bestimmung der Fluoreszenzintensität ohne vorherige Abtrennung von freiem oder komplexiertem, markiertem Konjugat XF aus dem Gemisch sowie Mittel zur Aufzeichnung des Meßergebnisses umfaßt.

Die Erfindung wird im folgenden an Hand von Zeichnungen und Beispielen näher erläutert, wobei bei den Zeichnungen

Fig. 1 eine grafische Darstellung von Fluoreszenzintensitäten von Gemischen aus mit Fluorescein markiertem T₄ und Anti-T₄-Serum, aufgetragen gegen variierende Anti-T₄-Gehalte des Gemisches,

Fig. 2 eine Standardkurve für das System aus mit Fluorescein markiertem T₄ und Anti-T₄-Serum vom Schaf sowie

Fig. 3 eine schematische Anordnung einer Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens gemäß der Erfindung nach dem kontinuierlichen Durchflußprinzip zeigen.

Beispiel 1 Herstellung von mit Fluorescein markiertem T₄ (im folgenden als FTC-T₄ bezeichnet)

Lösungen (20 mg/ml) von L-Thyroxin (freie Säure) und Fluoresceinisothiocyanat (FITC) wurden in einem Lösungsmittel aus Pyridin/Wasser/Trieethylamin (9 : 1,5 : 0,1 V/V) hergestellt. Ein ml der T₄-Lösung wurde mit 0,5 ml der FITC-Lösung versetzt, was äquimolare Mengen der Reagenzien ergab. Dieses Reaktionsgemisch wurde eine Stunde im Dunkeln bei Raumtemperatur stehengelassen. Danach wurden 10 ml 0,2 m Ammoniumacetat, mit Essigsäure auf pH 4,0 eingestellt, langsam unter dauerndem Rühren zur Ausfällung des FTC-T₄-Produktes zugesetzt. Nach dem Zentrifugieren (MSE Multex, 3 min, 2000 UpM) wurde die überstehende Lösung verworfen und der Niederschlag kurz in 10 ml destilliertem Wasser erneut suspendiert und dann wiederum ausgefällt. Dieser ausgewaschene Niederschlag wurde in 4 ml 0,05 m Ammoniumbicarbonat vom pH-Wert von etwa 9 gelöst. Die Lösung wurde auf eine kleine (1×5 cm) Säule von Sephadex G-25 (Feinqualität) in 0,05 m Ammoniumbicarbonat gegeben. Das FTC-T₄ wurde an dem Sephadex adsorbiert, und geringe Mengen fluoreszierender Verunreinigungen wurden entfernt, indem man 40 ml 0,05 m Ammoniumbicarbonat über die Säule laufen ließ. Das gebildete FTC-T₄ wurde anschließend mit etwa 10 ml destilliertem Wasser eluiert.

Das gebildete FTC-T₄ erwies sich nach Papierchromatografie mit Whatman No. 1 Papier unter Verwendung von Methanol/ 0,2 m Na₂HPO₄ (1 : 2 V/V) als Entwicklungslösungsmittel als rein. Das Produkt wurde im gefrorenen Zustand bei -18°C aufbewahrt und erwies sich unter diesen Bedingungen mindestens fünfzehn Monate lang als stabil.

Eine Wiederholung der beschriebenen Synthese unter Verwendung einer T₄-Lösung, die mit einer Spurenmenge an radioaktivem (¹²⁵I) T₄ zugegeben worden war, ermöglichte die Bestimmung des Extinktionskoeffizienten von FTC-T₄ beim Maximum der Fluoresceingruppenabsorption in 0,075 m Barbitalpuffer von pH 8,6 zu 4,3×10⁴ mol^-1 cm^-1. Die weiter unten angegebenen FTC-T₄-Konzentrationen beruhen auf dieser Bestimmung.

Beispiel 2 Antikörper-Verdünnungskurve

FTC-T₄ in 0,075 m Barbitalpuffer von pH 8,6 wurde zu jeweils verdoppelten Verdünnungen von Anti-T₄-Serum vom Schaf hinzugegeben, die in demselben Puffer hergestellt worden waren, so daß eine Endkonzentration von FTC-T₄ von 9,3 nmol erzielt wurde. Nach fünfzehnminütiger Inkubationsdauer zur Gleichgewichtseinstellung wurde die Gesamtfluoreszenzintensität jedes Gemisches gemessen. Das Fluoreszenzhintergrundsignal der verschiedenen Endverdünnungen von Antiserum wurde getrennt in Abwesenheit von FTC-T₄ bestimmt, wonach nach Korrigierung der Gesamtfluoreszenzintensität um diesen Beitrag die in Fig. 1 dargestellten Ergebnisse erzielt wurden. Die Ergebnisse zeigen, daß, wenn das FTC-T₄-Konjugat durch Antikörper gebunden ist, die Fluoreszenzintensität des Komplexes annähernd dreimal so groß ist wie die des Konjugats allein. Aus der Antikörper-Verdünnungskurve wurde eine Endverdünnung des Antiserums von 1 : 3000 zur Aufstellung einer Standardassaykurve ausgewählt.

Beispiel 3 Standardkurve

T₄ (unmarkiert) wurde in bekannten Konzentrationen in Barbitalpuffer hergestellt, und aliquote Teile wurden der gleichen Menge an FTC-T₄ hinzugegeben, wie bei der Herstellung der Antikörper-Verdünnungskurve verwendet. Dann wurde Anti-T₄-Serum zugesetzt, so daß eine Endverdünnung von 1 : 3000 erzielt wurde. Nach fünfzehnminütiger Inkubationszeit wurde die Gesamtfluoreszenzintensität von jedem Bestimmungsgemisch gemessen. Das Hintergrundfluoreszenzsignal des Antiserums allein bei einer Verdünnung von 1 : 3000 wurde aufgezeichnet und von der Gesamtfluoreszenzintensität jedes Bestimmungsgemisches abgezogen, wobei die in Fig. 2 dargestellte Standardkurve erhalten wurde.

Beispiel 4 System zur automatisierten Bestimmung von T₄ nach dem kontinuierlichen Durchflußprinzip

In Fig. 3 der Zeichnungen ist eine Art Durchflußsystem dargestellt, das sich für eine Analyse nach dem kontinuierlichen Durchflußprinzip eignet. Das System besteht aus einer Probeneingangsleitung 1, einer FTC-T₄-Eingangsleitung 2, einer Lufteinlaßleitung 3 sowie einer Antiserum-Eingangsleitung 4. Leitungen 2 und 3 treffen sich beim Abschnittsbildner 6, der mit der Abzweigung 7 verbunden ist, wo Leitung 1 mit Leitung 2 zusammentrifft. Stromabwärts der Verzweigung 7 ist in Leitung 2 eine Mischschlange 8 vorgesehen, wonach die Leitung 2 zur Abzweigung 9 führt, wo Leitung 4 dazustößt. Stromabwärts von Verzweigung 9 ist eine Mischschlange 10 und schließlich ein Fluorimeter 11 angeordnet, das einen Abfallauslaß 12 und einen Auslaß 13 stromabwärts der Fluoreszenzzelle aufweist, der mit Leitung 5 verbunden ist und von dort nach außerhalb führt. Das Fluorimeter 11 ist mit dem Aufzeichnungsgerät 14 gekoppelt.

Im Betrieb wird eine gesteuerte Menge FTC-T₄ durch Leitung 2 eingeführt und im Abschnittsbildner 6 durch Luft in Abschnitte geteilt. Die zu untersuchende Probe (beispielsweise Serum) wird, nachdem sie wie erforderlich behandelt und verdünnt worden ist, in den segmentierten Strom bei Verzweigung 7 eingeführt, in Schlange 8 gemischt und bei Verzweigung 9 mit einer gesteuerten Menge Antiserum versetzt, danach in Schlange 10 erneut gemischt und dem Fluorimeter 11 zugeleitet.

Claims

1. Verfahren zur Bestimmung eines Thyroidhormons in einer Probe einer biologischen Flüssigkeit nach der kompetitiven Proteinbindungstechnik, dadurch gekennzeichnet, daß man

(1) ein Gemisch aus der Probe mit einer bekannten Menge eines aus einer Substanz X und einer fluoreszierenden Markierung F gebildeten kovalenten Konjugats XF, das eine durch die Bindung der Markierung F an die Substanz X im wesentlichen unterdrückte Fluoreszenz aufweist, herstellt,
(2) das Gemisch mit einer bindenden Substanz versetzt, die sowohl mit dem Thyroidhormon als auch mit dem Konjugat XF unter Ausbildung von Komplexen und eines Gleichgewichtszustandes Bindungen eingeht, wobei die Fluoreszenz des zwischen dem Konjugat XF und der bindenden Substanz gebildeten Komplexes infolge des Freisetzens von in dem freien Konjugat XF unterdrückter Fluoreszenz größer ist als die Fluoreszenz des Konjugats XF allein, so daß nach Bildung des Komplexes eine Verstärkung der Fluoreszenz des Gemisches eintritt,
(3) die Fluoreszenz des Gemisches mißt und
(4) die Menge an Thyroidhormon in der Probe aus der Fluoreszenzmessung und Standarddaten errechnet.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Probe der biologischen Flüssigkeit eine solche verwendet, die als Thyroidhormon Thyroxin oder Trÿodthyronin enthält.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Substanz X, aus der das Konjugat gebildet worden ist, das zu untersuchende Thyroidhormon selbst verwendet.

4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Markierung F, aus der das Konjugat gebildet worden ist, Fluorescein verwendet.

5. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Markierung F, aus der das Konjugat gebildet worden ist, Dansyl, Rhodamin, Fluorescamin, Pyren oder 2-Methoxy- 2,4-diphenyl-3(2H)-furanon verwendet.

6. Verfahren nach Anspruch 2 zur Bestimmung von Thyroxin, dadurch gekennzeichnet, daß man

(1) ein Gemisch aus der Probe mit
- (a) einer bekannten Menge von mit Fluorescein markiertem Thyroxin und
- (b) Anti-Thyroxin-Antiserum herstellt,
(2) die Fluoreszenz des so gebildeten Gemisches mißt und
(3) die Menge an Thyroxin in der Probe aus der Fluoreszenzmessung und aus Standarddaten errechnet.

7. Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man ein mit Fluorescein markiertes Thyroxin verwendet, das durch Umsetzen von L-Thyroxin mit Fluoresceinisothiocyanat hergestellt worden ist.

8. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es nach dem kontinuierlichen Durchflußprinzip durchgeführt wird, wobei Abschnitte des in Stufe 1 gebildeten Gemisches längs einer Leitung strömen gelassen und durch Abschnitte aus einem inerten Fluid getrennt werden und die Fluoreszenz der Gemischabschnitte gemessen wird, ohne daß eine Abtrennung eines Reaktionsproduktes aus dem Gemisch erfolgt.