DE2142915B2

DE2142915B2 - Verfahren zur quantitativen Analyse einer Probe und Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens

Info

Publication number: DE2142915B2
Application number: DE2142915A
Authority: DE
Inventors: Leon Waldwick N.J. Chaparian; Alfred Mt. Vernon N.Y. Kiederer; Stanley W. Teaneck N.J. Morgenstern; Leonard T. Kirtland Ohio Skeggs; Daniel L. Pomona N.Y. Vlastelica
Original assignee: Technicon Instruments Corp
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1970-08-31
Filing date: 1971-08-27
Publication date: 1975-02-20
Also published as: AU448249B2; US3699004A; CH535956A; DE2142915A1; FR2106221A5; IT942525B; CA948972A; GB1335860A; DE2142915C3; JPS5737823B1; AU3274071A; US3700562A; BE770739A; NL166546C; NL7111890A

Description

einem Reaktionspartner durchmischt, das Proben-Reaktionspartner-Gemisch zum Bewirken
einer Substanz-Reaktionspartner-Geschwindigkeitsreaktion durch eine Inkubationseinrichtung io
geleitet, durch die Substanz-Reaktionspartner-

Geschwindigkeitsreaktion hervorgerufene unter- Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur

schiedliche Änderungen in einem Kennwert des quantitativen Analyse einer Probe in bezug auf den resultierenden Proben-Reaktionspartner-Ge- Gehalt einer in der Probe enthaltenen Substanz, bei mischs erzeugt und nachgewiesen und aus den >5 dem die Probe mit einem Reaktionspartner durchunterschiedlichen Kennwertänderungen auf die mischt, das Proben-Reaktionspartner-Gemisch zum Geschwindigkeit der Substanz-Reaktion und da- Bewirken einer Substanz-Reaktionspartner-Gemit den Gehalt der Substanz in der Probe ge- schwindigkeitsreaktion durch eine Inkubationseinschlossen wird, dadurch gekennzeich- richtung geleitet, durch die Substanz-Reaktionspartnet, daß durch Andern des Durchflusses des 20 ncr-Geschwindigkeitsreaktion hervorgerufene unterdie Inkubationseinrichtung durchsetzenden Pro- schiedliche Änderungen in einem Kennwert des reben-Reaktionspartner-Gemischs unterschiedlich sultiercnden Proben-Reaktionspartner-Gemischs erlange Reaktionszeiten für verschiedene Gemisch- zeugt und nachgewiesen und aus den unterschiedlianteile der Probe eingestellt werden und daß chen Kennwertänderungen auf die Geschwindigkeit durch Feststellen des Grads bis zu dem die Ge- 25 der Substanz-Reaktion und damit den Gehalt der schwindigkeitsreaktion in den verschiedenen An- Substanz in der Probe geschlossen wird. Ferner beteilen des Proben-Reaktionspurtner-Gemischs faßt sich die Erfindung mit einer Vorrichtung zur fortgeschritten ist, eine differentielle Kennwert- Duichführung des Verfahrens mit mindestens einer veränderung des Gemischs gewonnen wird, die einen Proben- und Reaktionspartnerstrom zuführenein Maß für die Reaktionsgeschwindigkeit ist. 30 den Einrichtung, einer die Zufuhr der Ströme dosie-

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch ge- remien Pumpe, einer den P-oben- und Reaktionskennzeichnet, daß die Inkubationszeiten der Ge- partnerstrom zusammenführenden Mischeinrichtung, mischanteile linear geändert werden. einer von dem gemischten Strom durchsetzten Inku-

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch ge- bationseinrichtung, einer den inkubierten Strom anakennzeichnet, daß zur Änderung der Inkuba- 35 lysierenden Meßeinrichtung sowie einem die vorgetionszeiten der Durchfluß des Gemischs durch nannten Einrichtungen verbindenden Leitungssydie Inkubatioiiseinrichtung nach einer hyperboli- stern.

sehen Funktion geändert wird. Derartige Verfahren und Vorrichtungen finden

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch ge- beispielsweise zur vollkommen automatisch ausgekennzeichnet, daß zur Änderung der Inkuba- 4° führten quantitativen Analyse einer Reihe von Protionszeiten det Durchfluß des Proben-Reaktions- ben Anwendung, die kontinuierlich zugeführt, behanpartner-Gemischs durch die Inkubationseinrich- delt und verarbeitet werden. Dabei handelt es sich tung schrittartig geändert wird. insbesondere um Blutproben, die in bezug auf eine

5. Verfahren nach einem der vorstehenden An- oder mehrere Enzymarten analysiert werden sollen, sprüche, dadurch gekennzeichnet, daß den Pro- 45 Aus der Literaturstelle »Methoden der Enzymatiben-Reaktionspartner-Gemischanteilen zum Be- sehen Analyse«, herausgegeben von Hans Ulrich wirken einer sekundären Reaktion ein Reagenz Bergmeyer, 2. Auflage, 1970, Band I, Seiten 106 und zugegeben wird. 107 sowie 195 bis 200, sind ein Verfahren und eine

6. Vorrichtung zur Durchführung des Verfah- Vorrichtung der beschriebenen Art bekannt, bei derens nach einem der vorstehenden Ansprüche, 50 nen zur Bestimmung von Enzymaktivitäten die Mesmit mindestens einer einen Proben- und Reak- sung der Extinktion der gemischten und inkubierten tionspartnerstrom zuführenden Einrichtung, einer Probe in zwei räumlich getrennten Durchflußküvetdie Zufuhr der Ströme dosierenden Pumpe, einer ten mit einer bestimmten Zeitdifferenz erfolgt. Aus den Proben- und Reaktionspartnerstrom zusam- der ermittelten Extinktionsdifferenz und der vorgegerhenführenden Mischeinrichtung, einer von dem 55 benen Zeitdifferenz kann anschließend die Aktivität gemischten Strom durchsetzten Inkubationsein- berechnet werden.

richtung, einer den inkubierten Strom analysie- Abgesehen von dem hohen Aufwand bezüglich der

renden Meßeinrichtung sowie einem die vorge- Meß- und Auswerttechnik besteht bei dieser bekannnannten Einrichtungen verbindenden Leitungssy- ten Anordnung die Schwierigkeit darin, daß die Enstetn, dadurch gekennzeichnet, daß an die Do- 60 zymbestimmung lediglich durch Messen und Eichen sierpumpe (52, 60) eine auf die Pumpgeschwin- von zwei Punkten der relevanten Enzymreaktionsgedigkeit einwirkende Steuereinrichtung (24) ange- schwindigkeitskurve vorgenommen wird. Dies, setzt schlossen ist. die nicht immer zutreffende Annahme voraus, daß

7. Vorrichtung nach Ansprüche, dadurch ge- die Ergebnisse der Enzymreaktion zwischen diesen kennzeichnet, daß die Steuereinrichtung (24) mit 65 beiden Punkten linear verlaufen. Die Messung von einem Taktgeber (48) in Verbindung steht, der mehr als zwei Extinktionswerten würde einen noch auch auf die Arbeitsweise der Probenzufuhrein- größeren gerätetechnischen Aufwand bedeuten. Ferrichtung (22) einwirkt. ner könnte sich der Nachteil bemerkbar marhm H_nR

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die Messungen nicht immer bei optimalen Bedingun- standard bestimmt wurde Dadurch können ganze

gen vorgenommen werden können, wie sie im An- Enzymbestimmungsreihen wertlos werden. Selbst

fsngsabschmtt der Reaktionsgeschwindigkeitskurven wenn man von den möglichen Fehlerquellen absieht,

auftreten. Bei längerem Verlauf der Reaktionen kön- ist ein derartiges Vorgehen äußerst aufwendig.

nen nämlich Substratinhibitionen vorkommen, die 5 Darüber hinaus sind die bekannten Verfahren und

die gewünschte Enzym-Substrat-Vorwärtsreaktion Vorrichtungen nicht besonders flexibel, so daß der

hemmen, so daß verfälschte Ergebnisse auftreten. Wechsel von der Bestimmung eine? Enzyms zu der

Aus deer wissenschaftlichen Zeitschrift, der TH für Bestimmung eines anderen Enzyms mit Schwierigkei-

Chemie, Leuna-Merseburg, Band VI (1964), Heft 2, ten verbunden ist.

S. 190 bis 197, ist es bekannt, durch Bestimmung der io Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, durch Konzentration des in der Zeiteinheit ausgeschiedenen Bestimmen der Reaktionsgeschwindigkeit eine Reihe Reaktionsprodukts die Reaktionsgeschwindigkeit zu von kontinuierlich strömenden Proben ohne großen messen und aus der gemessenen Reaktionsgeschwin- Aufwand und unter Ausschaltung von möglichen digkeit auf die Konzentration des Katalysators zu Fehlerquellen fortlaufend vollkommen automatisch schließen. Die Konzentration des in der Zeiteinheit 15 und äußerst genau quantitativ zu analysieren,
ausgeschiedenen Reaktionsprodukts oder die dazu in Zur Lösung dieser Aufgabe ist das eingangs beeinem funktioneilen Zusammenhang stehende Ex- schriebene Verfahren nach der Erfindung dadurch tinktion läßt sich als Funktion der Zeit messen, wenn gekennzeichnet, daß durch Ändern des Durchflusses die Konzentration des Katalysators vorgegeben ist. des die Inkubationseinrichtung durchsetzenden Pro-Die auf diese Weise erhaltenen Meßkurven dienen *<> ben-Reaktionspartner-Gemischs unterschiedlich zur Eichung. lange Reaktionszeiten für verschiedene Gemischan-

Dieses bekannte Verfahren wird manuell durchge- teile der Probe eingestellt werden und daß durch führt und läßt sich nicht ohne weiteres zur Analyse Feststellen des Grads, bis zu dem die Geschwindigvon mehreren aufeinanderfolgenden Proben nach keitsreaktion in den verschiedenen Anteilen des Prodem kontinuierlichen Durchflußprinzip anwenden. 25 ben-Reaktionspartner-Gemischs fortgeschritten ist, Zumindest treten bei einem derartigen Versuch die eine differentielle Kennwertveränderung des Geeingangs erwähnten Schwierigkeiten auf. mischs gewonnen wird, die ein Maß für die Reak-

Ferner sind bereits verschiedenartige Verfahren tionsgeschwindigkeit ist. Dabei ist die Kennwertver- und Vorrichtungen zur quantitativen Analyse von änderung ihrerseits eine Funktion der Verweilzeit der Proben, beispielsweise von Blutproben bezüglich 30 verschiedenen Gemischanteile in der Inkubationseineiner oder mehrerer Enzymarten bekannt. Hierzu richtung.

wird beispielsweise auf die Literaturstelle »Diagno- Die eingangs beschriebene Vorrichtung zur Durch-

stic Enzymology«, veröffentlicht von Dade Reagents führung des Verfahrens ist nach der Erfindung da-

Inc, Miami, Florida, 1966, und die Literaturstelle durch gekennzeichnet, daß an die Dosierpumpe eine

»The Theory cf Enzyme Tests«, veröffentlicht von 35 auf die Pumpgeschwindigkeit einwirkende Steuerein-

Boehringer Mannheim Corporation, New York, New richtung angeschlossen ist.

York, ohne Datum, verwiesen. Es ist aber weder ein Eine nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ar-

Verfahren noch eine Vorrichtung bekannt, die in der beitende Vorrichtung kommt mit einer einzigen

Lage sind, mehrere Blutproben im Hinblick auf eine Durchflußküvette aus und bietet den Vorteil, daß die

oder mehrere Enzymarten unter Anwendung eines 40 Reaktionszeiten für die verschiedenen Anteile einer

kontinuierlichen Strömungsverfahrens vollkommen zu analysierenden Probe äußerst einfach und flexibel

automatisch und hochgenau quantitativ zu analysie- verändert werden können. Ferner benötigt man zur

ren. Bestimmung der Reaktionsgeschwindigkeit keinen

Die bekannten Verfahren und Vorrichtungen ar- Bezugsstandard. Darüber hinaus ist die Vorrichtung

beiten nämlich vollständig oder teilweise manuell, so 45 äußerst flexibel und kann zur Bestimmung eines gro-

daß, hervorgerufen durch menschliche Fehler und ßen Reaktionsgeschwindigkeitsbereiches eingesetzt

Irrtümer, sehr leicht falsche Analysenergebnisse auf- werden. Außerdem ist es möglich, vor der Durchmi-

treten können. Darüber hinaus benötigt man zur En- schung die Probentemperatur und die Reaktionspart-

zymbestimmung ein äußerst zuverlässiges und gut ge- nertemperatur auf etwa den gleichen Wert zu brin-

schultes Personal. Daher ist es nicht möglich, das 50 gen.

kontinuierliche Strömungsprinzip ohne weiteres zur Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich ins-Enzymbestimmung heranzuziehen. Dem steht auch besondere zur automatischen quantitativen Analyse entgegen, daß bei vielen herkömmlichen Verfahren einer Reihe von Blutproben in bezug auf die Bestim- und Vorrichtungen zur Enzymbestimmung die Pro- mung einer oder mehrerer Enzymarten. Dazu wird ben- und Substrattemperatur vor der Durchmischung 55 die zu analysierende Blutprobe mit dem Reaktionsauf den gleichen Wert gebracht werden müssen. Dies partner gemischt, der in Form eines Substrats zugeist bei einer automatisch arbeitenden Vorrichtung geben wird, um eine Geschwindigkeitsreaktion ausnicht ohne besondere Maßnahmen möglich. zulösen. Die Konzentration des fraglichen Enzyms in

Darüber hinaus ist es bei vielen bekannten Verfah- der Probe erhält man dadurch, daß die Geschwindigren und Vorrichtungen zur Bestimmung der En- 60 keit bestimmt wird, mit der das Enzym die Reaktion zym-Substrat-Reaktionsgeschwindigkeit erforderlich, katalysiert. Die Konzentration des Enzyms wird daeinen Bezugsstandard zu verwenden, bei dem es sich durch bestimmt, daß die katalytische Wirkung des um ein in einem Serum gelösten Enzym handelt und Enzyms bezüglich eines besonderen Substrats festgedessen Bezugswert anfangs durch ein klassisch ablau- stellt wird. Zu diesem Zweck wird die Menge des in fendes Reaktionsverfahren bestimmt wird. Dies hat 65 einer vorgegebenen Zeitdauer durch die Reaktion erden Nachteil, daß die Genauigkeit und Richtigkeit zeugten Reaktionsprodukts bestimmt. Die einzelnen der weiteren Enzymbestimmungen davon abhängen, Gemischanteile der Probe sind durch Luftschübe mit welcher Genauigkeit und Sorgfalt der Bezugs- voneinander getrennt.

Zur Änderung der Inkubationszeiten der verschie- Sie enthält einen Drehtisch 34, auf dem in einem

denen Gemischanteile ist es zweckmäßig, während Kreis eine Reihe von Blutprobenbehältern 36 gehal-

des Strömens der Gemischanteile durch die Inkuba- tert sind. Eine Probenentnahmeeinrichtung 38 ent-

tionseinrichtung den Durchfluß des Proben-Reak- hält einen Probennehmer 40 und eine Antriebsein-

tionspartner-Gemisches nach einer hyperbolischen S richtung 42 für den Probennehmer 40. Neben dem

Funktion oder schrittartig zu ändern. Drehtisch 34 ist ein Waschflüssigkeitsbehälter 44 an-

Bevorzugte Ausführungsbeispiele der Erfindung geordnet. Ein Antriebsmotor 46 treibt unter der

werden an Hand von Figuren beschrieben. Steuerung eines Taktgebers 48 in synchroner Weise

F i g. 1 zeigt den schematischen Aufbau und den den Drehtisch 34 und die Antriebseinrichtung 42 für

Flußplan einer nach der Erfindung ausgebildeten io den Probennehmer 40 an. Der Taktgeber 48 ist über

und betriebenen Vorrichtung. eine Leitung 50 mit dem Antriebsmotot 46 verbun-

Fig.2 zeigt den schematischen Aufbau und den den.

Flußplan eines Teils der in der F i g. 1 dargestellten Eine Dosierpumpe 52 kann beispielsweise in der

Vorrichtung mit einer weiteren Reaktionseinrichtung. gleichen Weise aufgebaut sein, wie die in der US-PS

F i g. 3 zeigt den Fluidstrom, der durch die Misch- 15 3 227 091 beschriebene Schlauchquetschpumpe. Die

und Inkubationsschlange der in der F i g. 1 darge- Dosierpumpe 52 enthält zusammenquetschbare Pum-

stellten Vorrichtung strömt. penschläuche 54, 56 und 58, die in der Darstel-

F i g. 4 zeigt in einer grafischen Darstellung die lung nach der F i g. 1 von links nach rechts fort-

Pumpenausgangsleistung und Strömungsgeschwindig- schreitend von nicht dargestellten Pumpenwalzen zu-

keit in der Misch- und Inkubationsschlange der in 20 sammengequetscht werden, um durch die Schläuche

den F i g. 1 und 2 dargestellten Vorrichtung in Ab- 45, 56. 58 Fluide zu pumpen. Die Pumpe 52 wird von

hängigkeit von der Echtzeit, wobei der Durchfluß der einem mit Gleichspannung betriebenen Pumpenan-

Pumpe und die Strömungsgeschwindigkeit hyperbo- triebsmotor 60 angetrieben, wobei der Durchfluß

lisch geändert werden. durch jeden der zusammenquetschbaren Pumpen-

F i g. 5 zeigt an Hand einer grafischen Darstellung, 25 schläuche 54, 56 und 58 von dem Innendurchmesser die von dem Schreiber der in der F i g. 1 dargestellten der betreffenden Schläuche 54, 56, 58 und der GeVorrichtung aufgezeichnet ist, die Abhängigkeit der schw indigkeit abhängt, mit der die Pumpe 52 von durch die Enzym-Substrat-Reaktion bewirkten opti- dem Gleichspannungsmotor 60 angetrieben wird, sehen Dichte der Proben-Substrat-Gemischanteile in Das Austrittsende des Probennehmers 40 ist an das Abhängigkeit von der Inkubationszeit der betreffen- 30 Eintrittsende des Pumpenschlauchs 54 angeschlosden Gemischanteile. sen. Das Eintrittsende des Pumpenschlauchs 56 er-

F i g. 6 zeigt an Hand einer grafischen Darstellung streckt sich in einen mit Substrat gefüllten Behälter

die stufenweise Änderung der Pumpenausgangslei- 62, um aus diesem Substrat abzusaugen. Das Ein-

stung und der Strömungsgeschwindigkeit in der trittsende des Pumpenschlauchs 58 ist zur Atmo-

Misch- und Inkubationsschlange der in den F i g. 1 35 Sphäre hin offen, um Luft anzusaugen,

und 2 dargestellten Vorrichtung in Abhängigkeit von Die Steuereinrichtung 24 enthält einen Operations-

der Echtzeit. verstärker 64. Der Operationsverstärker 64 ist in an

F i g. 7 zeigt an Hand einer grafischen Darstellung sich bekannter Weise über eine Leitung 67 mit einem

die Proben-Substrat-Inkubationszeit in Abhängigkeit Rückführwiderstand 66 überbrückt. An den Eingang

von der Echtzeit. 40 des Operationsverstärkers 64 ist über eine Leitung 70

F i g. 8 zeigt an Hand einer grafischen Darstellung ein Potentiometer 68 mit einem veränderbaren die auf Grund der Reaktion bewirkten optischen Widerstandswert RV angeschlossen. Der Operations-Dichte der Proben-Substrat-Gemischanteile in Ab- verstärker 64 speist über eine Leitung 71 den Gleichhängigkeit von der Inkubationszeit der betreffenden spannungsmotor 60. Wie es durch eine gestrichelte Gemischanteile. 45 Linie angedeutet ist, nimmt der Taktgeber 48 Ein-

F i g. 9 zeigt an Hand einer grafischen Darstellung, fluß auf die Stellung des Potentiometers 68, um den die von dem Schreiber der in der Fig. 1 dargestellten veränderbaren Widerstand RV und damit die drehvorrichtung aufgezeichnet ist, die Abhängigkeit der zahl des Gleichspannungsmotors 60 während jedes durch die Reaktion bewirkten optischen Dichte der von dem Taktgeber 48 bestimmten Zeitpunkts genau Proben-Subsirat-Gemischanteile in Abhängigkeit von 50 einzustellen. Insbesondere wird die Drehzahl des der Ech'-'£it. Pampenantriebsmotors 60 in jedem Zeitpurakt derart

In der F i g. 1 ist eine nach der Erfindung ausgebü- eingestellt, daß sie der folgenden Gleichung (1) ge-

dete Vorrichtung 20 dargestellt, die vollautomatisch nfigt:

und äußerst genas eine Reihe von kontinuierlich _.

strömenden Ftaidproben bezüglich ihres Gehalts an 55 Vm — k · E

einer oder mehreren Enzymarten quantitativ unter- RV sucht. Die Anaiysravorrichtang 20 enthält eine

Fluidproben- und Substratzufuhreinrichtung 22, eine Dabei ist Vm die Drehzahl des Ptunpenantriebs-Steuerernrichtung 24 zum Verändern der Zufuhrge- motors 60, k eine Konstante, E die dem Potentiomeschwindigkeit der Fluidproben and des Substrats. 60 ter 68 zugeführte Eingangsspannung, RF der Widereine Misch- und Behandlungseinrichtung 26 für die standswert des Rückfuhrwiderstands 66 und RV der Fluidproben und das Substrat, eäie Nachwciseinrich- Widerstandswert des Potentiometers 68. tung 30 für die Reaktionsgeschwindigkeit und eine Die Drehzahl des Pompenantriebsmotors 60 und Aufzeichnungseinrichtung 32 für die von der Reak- damit die von der Pompe 52 bewirkt« Proben- π ad tionsgcschwindigkeit abhängigen Analysenergebnisse. 65 Substratfördergeschwindigkeit werden von dem

Die Zufuhreinrichtung 22 kann beispielsweise in Taktgeber 48 genau bestimmt und eingestellt,

der gleichen Weise aufgebaut sein wie die in der Die Misch- und Behandlungseinricbtong 26 eat-

US-PS 3 134 263 beschriebene Zufuhreinrichtung. hält eine das Substrat vorerwänneode Vorinkubn-

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tionsschlange 72, deren Umgebungstemperatur gere- keit von einem Wechselstrommotor 86 angetrieben, gelt ist und die zu diesem Zweck beispielsweise in ein Die Pumpe 84 enthält zusammenquetschbare Pumtemperaturgeregelles Bad 74 eingesetzt ist, das die penschläuche 86, 88 und 90, die von nicht därgestell-Temperatur der Schlange 72 praktisch auf einem ge- ten Pumpenwalzen bei der Darstellung nach der wünschten Sollwert hält. Die beiden Eintrittsenden 5 Fig.2 fortschreitend von links nach rechts zusameines Verzweigungsstücks 76 sind an die Pumpen- mengequetscht werden, um in dieser Richtung Fluide schläuche 56 und 58 angeschlossen. Das Austritts- durch die Schläuche 86, 88, 90 zu pumpen, ende des Verzweigungsstücks 76 ist über eine Lei- Das Eintrittsende eines Abzweigstücks 98 ist mit

tung 77 mit dem Eintrittsende der Substratvorinku- dem Austrittsende der Leitung 96 verbunden, um bationsschlange 72 verbunden. io dem Abzweigstück 98 den Proben-Substrat-Gemisch-

Eine Inkubationsschlange 78 für das Substrat-Pro- strom zuzuführen. Das eine Austrittsende des Abben-Gemisch ist ebenfalls in dem temperaturgeregel- zweigstücks 98 führt zum Abfluß, während das anten Bad 74 angeordnet, das auch die Temperatur die- dere Austrittsende an das Eintrittsende des Pumpenser Inkubationsschlange auf dem gewünschten Soll- schläuche 86 angeschlossen ist. Das Eintrittsende des wert hält, wie es für die Vorinkubationsschlange 72 15 zusammenquetschbaren Pumpenschlauchs 88 führt der Fall ist. Ein Verzweigungsstück 82 ist ebenfalls zu einem Behälter 92, der mit einem farberzeugennahezu vollständig in dem temperaturgeregelten Bad den Reagenz gefüllt ist. Das Eintrittsende des zusam-74 angeordnet. Das Austrittsende des Pumpen- menquetschbaren Pumpenschlauchs 90 ist gegenüber schlauchs 54 und das Austrittsende der Substrat vor- der Atmosphäre offen.

inkubationsschlange 72 sind an die beiden Eintiits- 20 An die beiden Eintrittsenden eines Verzweigungsenden des Verbindungsstücks 82 angeschlossen. Das Stücks 104 sind die Austrittsenden der Pumpen-Austrittsende des Verbindungsstücks 82 ist mit dem schläuche 88 und 90 angeschlossen, um in dem Ver-Eintrittsende der Mischschlange 78 verbunden. Durch zweigungsstück 104 den Reagenzstrom mit Luftsegdie beschriebene Anordnung wird erreicht, daß sich menten zu unterteilen. In einem weiteren Verzweidie Proben und das Substrat vor ihrer Vereinigung in 25 gungsstück 106 wird der luftsegmentierte Reagenzdem Verbindungsstück 82 etwa auf der gleichen strom mit dem von dem Pumpenschlauch 86 kom-Temperatur befinden. menden Proben-Substrat-Strom zusammengeführt.

Die Nachweis°inrichtung 30 für die Reaktionsge- Das Austrittsende des Verzweigungstücks 106 ist

schwindigkeit enthält ein Kolorimeter 124 mit einer an das Eintrittsende einer Mischspule 108 angenicht dargestellten Durchflußzelle und einer vor der 30 schlossen. Die Umgebung der Mischspule 108 ist Durchflußzelle angeordneten Entgasungseinrichtung, ebenfalls temperaturgeregelt. Zu diesem Zweck kann um irgendwelche in dem Fluidstrom enthaltenen die Mischspule 108 in ein temperaturgeregeltes Bad Gas- und Luftseemente zu entfernen. Eine Leitung HO eingesetzt sein, um die Temperatur der Misch- 96 verbindet das Austrittsende der Inkubations- spule 108 auf einem gewünschten Sollwert zu halten, schlange 78 mit dem Eintrittsende des Kolorimeters 35 Vom Austrittsende der Mischspule 108 führt eine 124, um darin in an sich bekannter Weise die opti- Leitung 109 zum Eintrittsende des Kolorimeters 124, sehe Dichte der Fhiidproben zu best.mmen und da- um den gemischten, luftsegmentierten Proben-Subdurch die Enzymreaktionsgeschwindigkeit nachzu- strat-keagenz-Strom der Analyse zu unterziehen. Soweisen. Das Austrittsende 128 des Kolorimeters 124 fern es notwendig ist, kann die sekundäre Einrichleitet den Fluidstrom zum Abfluß. 40 tung 28 einen Dialysator (nicht gezeigt) enthalten.

Die die Reaktionsgeschwindigkeit angebenden Im folgenden wird die Betriebsweise der beispiels-

Analyscnergcbnisse werden von der Aufzeichnungs- weise beschriebenen Vorrichtungen erläutert. Zui einrichtung 32 aufgezeichnet, die einen nach der quantitativen Analyse einer Reihe von kontinuierlich Nullabgleichmtthode arbeitenden, gleichspannungs- strömenden Proben bezüglich einer in ihnen enthaltebetriebenen Streifenblnttschreiber 130 mit einem 45 nen Substanz wird jede Probe mit einem pissender Streifenflatt 132 enihält, dessen Transportrichtung in Reaktionspartner gemischt, um eine Substanz-Reakder F i g. 1 durch einen Pfeil angedeutet ist und auf tionspartner-Reaktion auszulösen, die in der sich erdessen Oberfläche ein Aufzeichnungsstift 134 einen gebenden Proben-Reaktionspartner-Mischung eine Kurvenzug 136 aufzeichnet, der dauerhaft und leicht Veränderung einer nachweisbaren Eigenschaft herreproduzierbar die Analysenergebnisse in Form der 50 vorruft. Das Ausmaß der Reaktion oder das Fort-Enzymreaktionsgeschwindigkeit wiedergibt. schreiten des Reaktionsablaufs wird für verschiedene

Falls bei der in der F i g. 1 dargestellten Vorrich- Anteile des Proben-Reaktionspartner-Gemischs betung 20 die Enzym-Substrat-Reaktionsgeschwindig- einflußt. um in dem Gemisch ein nachweisbares Dif· keit keine hinreichend nachweisbare Änderung in der ferential zu erzeugen, das die Reaktionsgeschwindig optischen Dichte des Proben-Substrat-Gemischs her- 55 keit und damit die Menge der Substanz anzeigt. Zx vorruft, so daß eine kolorimetrisch« Analyse des Ge- diesem Zweck wird das als Unterscheidungsmerkma mischs nicht möglich ist, wird die in der F i g. 2 dar- dienende charakteristische Differential bestimmt, gestellte abgeänderte Vorrichtung 97 benutzt, die im So kann man beispielsweise durch quantitativ«

Vergleich zu der in der F i g. 1 dargestellten Vorrich- Analyse einer Reihe von Blutproben den Gehal tung 20 eine sekundäre Zufuhr-, Misch- und Behänd- 60 einer Enzymart, beispielsweise alkalische Phospha lungseinrichtang 28 für das Proben-Substrat-Ge- tase, in jeder der Blutproben bestimmen. Zu diesen misch und ein farberzeugendes Reagenz enthält und Zweck wird jede Blutprobe mit einem geeignete! die zwischen der Inkubationsschlange 78 und dem Reaktionspartner zur Reaktion gebracht Bei den Kalorimeter 124 angeordnet ist Reaktionspartner kann es sich um ein Substrat han

Die sekundäre Einrichtung 28 weist eine Dosier- 6s dein, beispielsweise ein synthetisches Substrat in de pumpe 84 auf, bei der es sich wie bei der Pumpe 52 Form von Para-Nitrophenylphosphat. Dabei wird eh um eine Schlauchquetschpumpe handeln kann. Die Gemisch aus dem Enzym und dem Substrat gebildei Dosierpumpe 84 .wird mit konstanter Geschwindig- Während der Reaktion wird bei einer großen Anzar

Ί-

von verschiedenen Inkubationszeiten die Reaktions- 72 zugeführt. Der luftsegmentierte Substralstrora

, ,r ä

peraturgeregelte Bad 74 wird derart eingestellt, daß io dem er mit ,ι™ r.t," * uu

die Substratvorinkubationsschlange 72 und die Sub Pumpeüch 54f L^TT^C"^que!^SChbaren strat-Proben-Gemischinkubationstchlange 78 eine Sentrifft ^zu8^efuhr^n Probenstrom zuTemperatur von etwa 37° C annehmen. Der Taktee- 7nr hpcc^r^r. ei··. · · , ^- -,,■■,

ber 48 und das Potentiometer 68 werden derart efn- kubatLmS£ 7?T^g ·'* '" ^I^ Y'' ^In" gestellt, daß die Drehzahl Vm des gleichspannungs- .5 dargeSh Wi™ h, ''"? «f ^adliⁿ!^8e J^¹S* betätigten Pumpenantriebsmotors 60 konlinuierliche sammen h_r ^man. ^sie,^ht' entsteht mfolge des ZuZyklen durchläuft, wobei für jedes Proben-S- IrTtGeLt hstron^H " ^T- *" FfT^ strat-Gemisch entsprechend einer hyperbolischen mkdem S.b Γί ,,Γ ^a"^feinanderfol,f ^ndf · Funktion von einer ersten schnellen Geschwindigkeit St dte ievlli η ^8emi£chten _u Blutserumprobar, be- V2 zu einer zweiten langsamen GeschwindigkeitV1 _{ao Lu}ft- 2nd Wa eh?!"' w'"' ^abT^{chsclnde Fol}f ^von übergegangen wird. ^" ""dWasphflussigkeitsschuben voneinander ge-

Dies wird noch im einzelnen beschrieben. gunTssS 82 Γτ ?Τ· ^wild _fcf^{ber daS} ^Wa%*

Der Drehtisch 34 der Vorrichtung 20 wird schritt- Wenn m ^der.^Inkubatlo„^nsschIanS^{e 78} zugeführt,

weise gedreht, um die Behälter 36 mit den Blut - GemXch ZrchT^K** ,?? ^P^^be«-^Subf*-

rumproben der Reihe nach dem Probennehmer 40 25 S PrnS Ϊ ^daf™chengeschaltete Luftschübe m

darzubieten. Der Probennehmer 40 wird ebenfalls in- Γ,ηΗ \ "^"■^torat-Oemischschübe unterteiilt ist

terminierend betätigt. Zunächst wird das Einlaßende scLtlm^TT™? u™* ^ ?Ψ ^WeiS%'^

des Probennehmers 40 für eine vorgegebene Zeit- S₁₁ ^Proben-Substrat-Gemischs etwa 25 »/0

spanne in einen Probenbehälter 36 getaucht um über Kl₁ « p^esamtvolumen der Inkubations-

den Pumpenschlauch 54 ein vorgegebenes Volumen 30 Fiρ W ·*}' ^dann _r ^{Ist die} Darstellung nach der

der in dem betreffenden Behälter enthaltenen Blutse- 7Λ £^e'^sP^ielsweise fur die Vorrichtung 20 einem

rumprobe anzusaugen. Im Anschluß daran wird das SrIt r ^zuge° ^{et>
bei dem das erste} Probcⁿ"^Sub-

Einlaßende des Probennehmers 40 durch die Umee „Γκ ''^llsch«gment ESl der Probe 3 gerade die

bungsluft zum Waschflüssigkeitsbehälter '44 L ^lni^^bai'^onsschlange 78 verlassen hat.

schwenkt und dort in die Waschflüssigkeit einee » ™„ i^t% ^erwahnt' ^{ist de}r Taktgeber 48 derart

taucht, um zunächst während einer vorgegebenen w^»¹, ^ausgebildet, daß er fortlaufend den

Zeitspanne ein vorgegebenes Luftvolumen und an- ZZJm u^rt ^RV ^{des Pote}ntiometers 68 während

schließend für eine vorgegebene Zeitspanne ein vor ^BlutPr"benanalysenzyklus zwischen einer obe-

gegebenes Waschflüssigkeitsvohimen anzusaueen ZbJ? *■ ,^{unteren Grenze} bzw. zwischen den Ge-

Der Luftschub und der Waschflüssigkeitsschub die- ₄₀ 3m $?'^te? ^V2 ^Und ^V1 ^andert· ^{um die Dreh}-

nen zum Trennen der einzelnen Proben und zum änH ^Ole'^chspa»nungsmotors 60 hyperbolisch zu

Reinigen des Leitungssystems. Vom Waschflüssie- Do "" ^{in ents}Prechender Weise über die

keitsbehälter 44 wird das Eingangsende des Proben ·„ ^p"^mP^{e 52 d}*e Pumpengeschwindigkeit in den

nehmers 40 wiederum durch die Umgebungsluft zu ^^u^^a™^meniiuctschbaren Pumpenschläuchen 54, 56

dem nächsten Probenbehälter 36 bewegt, der durch ₄? u/

eine Drehung des Drehtische 34 in der Zwischenzeit η υ i" ^ma" ^{ZUr autom}at'schen, aufeinanderfolgenden Platz des vorhergehenden Behälters 36 einge- h i_> ^olonmetrischen Analyse von mehreren Blulpronommen hat. Auf diese Weise wird ein weiteres vor- t · ^U8^{lich des} Gehalts von alkalischer Phosphagegebenes Umgebungsvolumen und im Anschluß «t t P ^J · ^{der Blut}P^roben das synthetische Subdaran das vorgegebene Volumen der nächsten Blut- so Pi ^Fara-^Nltrophenylphosphat verwendet, wird der serumprobe angesaugt. ""npenantriebsmotor 60 unter Bezugnahme anf die Auf diese Weise erhält man einen Fluidstrom der nü m"u '" ^{der F}'⁸' ^{3 so Ian}^ ^{mit der hohral} aus aufeinanderfolgenden vorgegebenen Volumen h .· ^bzw· ^schnellen Geschwindigkeit V 2 betrieder Blutserumproben besteht, die jeweils durch einen FVi .T n^{S erste Proben}-Substrat-Gemischsegrneat Luftschub, einen Waschflüssigkeitsschub und einen « «ο μ °^b°³ ^S⁰¹¹¹¹Cn hat, durch die Inkubaweiteren Luftschub voneinander getrennt sind Die- zahl η D^{ge 78} ^m ^slrömen Danach wird die Drehser von dem Probennehmer 40 berdtgestellte Strom senk» ^umP^enantriebsmotors hyperbolisch angewird über den zusammenquetschbaren Pumpen- scWi' -r"l ^d'^{C niedri}S^e Drehzahl bzw. geringe Geschlauch 54 dem einen Eintrittsende des Verzwei- _p ^rawina|peit Vl zu erreichen, gerade wenn afle gungsstücks 82 zugeführt. _6o Z^**'^^ubstr.a«-Gemischsegmente ESl bis ESM Gleichzeitig wird aus dem Substratbehälter 62 bald ri° λ ^dc ^Sch!anS^{e 78} durchströmt haben. Soaber den zusammenquetschbaren Pumpenschlauch fin m ^ist' ^¹^^der Pumpenantriebsmotor ein Substrafötrom und über den Pumpenschlauch Gesch ^me|J?^{an auf die} b°be Drehzahl bzw. schnelle ein Umgebiingsiuftstrom angesaugt. Im Verzwei- ZritTT ^8keit ^V2 zurückgesteflt, die eine gewisse jungsstück 76 werden diese beiden Ströme zusam- 6_S die „» uZ?* ^&ltea "^ ^um ^die Ansangzeiten for nengeführt, so daß ein durch Luftsegmente unterteil- «AsfeTrf^endefl Blutproben, Wascfaflissigkeits- :er Substratstiom entsteht Dieser Strom wird über a y_t cT^{1 s}^^tntschabi so ^klein ^^β "»ög⁰**

lie Leitung 77 der Snbstratvorinkabationsschlanse KmTiS" ~ ^!d ^Se ^v°nierkante d^s ersten Pto-

™ge ben-Substrat-r-^^t.-^-^ _{£S1 ύα} _pfobe4 ^

11 12

Eintrittsende der Inkubationsschlange 78 ankommt Schüben und Waschflüssigkeitsschüben befindlichen und durch die Schlange zu fließen beginnt, wird wie- Luftschübe A entfernt. Der von den Luftschüben A der begonnen, die Pumpengeschwindigkeit hyperbo- befreite Strom strömt als nächstes durch die Durchlisch auf die geringe Geschwindigkeit V1 abzusen- flußzelle, um die kolorimetrische Analyse vorzunehken. 5 men. Von dort gelangt der Strom über das Austritts-Auf Grund der hyperbolischen Änderung der ende 128 des Kolorimeters zum Abfluß.
Gleichspannungsmotordrehzahl und der entsprechen- Die F i g. 5 zeigt einen Kurvenzug 136, der auf den Änderung des Durchflusses der Proben-Sub- Grund der hyperbolischen Arbeitsweise der beschriestrat-Gemischschübe der Probe 3 durch die Inkuba- benen Vorrichtung 20 auf dem Streifenblatt 132 des tionsschlange 78 weist der erste Proben-Substrat-Ge- i° Schreibers 130 aufgezeichnet wird. Der Kurvenvermischschub ESl der Probe 3 die kürzeste Strö- lauf 136 gibt im vorliegenden Fall direkt die optische mungszeitdauer durch die Inkubationsschlange 78 Dichte der einzelnen Proben-Substrat-Gemischanauf. Der letzte Proben-Substrat-Gemischschub ESlO teile an. Die optische Dichte ist das Ergebnis der der Probe 3 verweilt hingegen am längsten in der In- Probenenzym-Substrat-Reaktion. Dabei ist in der kubationsschlange 78. Die dazwischenliegenden Pro- 15 Fig. 5 die optische Dichte in Abhängigkeit von der ben-Substrat-Gemischschübe ES 2 bis ES 9 der Probeninkubationszeit Tl dargestellt. Die Steigung Probe 3 haben in der genannten Reihenfolge eine zu- M des Kurven Verlaufs 136 kann man ohne Umwandnehmend größer werdende Strömungszeitdauer durch lung direkt verwenden, um das gewünschte Ergebnis die Inkubationsschlange 78. Auf diese Weise ver- in internationalen Millieinheiten Enzym pro Milliliter bringt jeder der Proben-Substrat-Gemischanteile 20 Blutprobe zu erhalten.

ESl bis ESlO in der genannten Reihenfolge eine H- Die tatsächliche quantitative Bestimmung des Genear zunehmende Zeitdauer in der Inkubations- halts des interessierenden Enzyms in der Blutprobe 3 schlange 78. Infolgedessen nimmt das Ausmaß, mit erfolgt mit der folgenden Gleichung (3):
dem die Enzym-Substrat-Reaktion in dieser Inkubationsschlange 78 für die einzelnen Schübe fortschrei- 25 mlu _ ^₆ 7T J_
tet, ebenfalls praktisch linear zu, so daß eine Zu- _m/ $V e
nähme der optischen Dichte in jedem der Proben-Substrat-Gemischschübe ESl bis ESlO zu verzeich- Dabei bedeutet mlulml internationale Millieinheinen ist, und zwar als Folge des unterschiedlichen ten von Enzym pro Milliliter Blutprobe, M die Stei-Ablaufs der Enzym-Substrat-Reaktion in den einzel- 30 gung der in der F i g. 5 dargestellten und von dem nen Schüben. Auf diese Weise wird ein optisches Schreiber 130 aufgezeichneten Kurve 136, TV das Dichtedifferential erzeugt, das man benutzen kann, gesamte Proben- und Substratvolumen, SV das Proum den Gehalt des interessierenden Enzyms in den benvolumen, dessen Teilung durch TV den Verdün-Proben zu bestimmen. nungsfaktor ergibt, und e der für die Vorrichtung 20

Die Wirkung der hyperbolischen Geschwindig- 35 bestimmte molare Extinktionsfaktor,
keitssteuerung auf den Proben-Substrat-Gemisch- Die gesamte Zykluszeit für eine einzige Blutprodurchfluß wird im einzelnen an Hand der Fig. 4 er- benanalyse beträgt etwa 3 Minuten. Dabei stehen läutert. Der Kurvenverlauf 154 stellt die Pumpenaus- für die Mischung und Inkubation der Blutprobe und gangsgeschwindigkeit bzw. Strömungsgeschwindig- des Substrats etwa 160 Sekunden zur Verfügung. Die keit durch die Misch- und Inkubationsschlangc 78 in 40 restlichen 20 Sekunden werden zum Ansaugen der Abhängigkeit von der Editzeit TR dar. Wie man Blutprobe, der Waschflüssigkeit und der Luft versieht, entspricht die Strömungsgeschwindigkeit beim wendet. Dabei wird der Pumpenantriebsmotor 60 für Ansaugen der Blutprobe, der Waschflüssigkeit und etwa 20 Sekunden mit der hohen Geschwindigkeit der Luft zunächst der hohen Geschwindigkeit V 2 V 2 betrieben, um während einer Periode von etwa des Pumpenantriebsmotors 60. Sobald der erste Pro- 45 20 Sekunden das Ansaugen der Blutprobe, der ben-Substrat-Gemischschub ESl in die Inkubations- Waschflüssigkeit und der Luft vorzunehmen. Die schlange 78 eintritt, beginnt die hyperbolische Ge- maximale Inkubationszeit für den Gemischanteil schwindigkeitsänderung. Diese hyperbolische Ände- ESlO kann 160 Sekunden betragen. Das Verhältnis rung wird bis zum Erreichen der niedrigen Ge- zwischen den Geschwindigkeiten V 2 und Vl des schwindigkeit Vl des Pumpenantriebsmotors 60 5° Pumpenantriebsmotors 60 beträgt vorzugsweise 6 :1 fortgesetzt. Dies fällt mit demjenigen Zeitpunkt zu- Für die beschriebene Analyse der Blutproben bezügsammen, bei dem die gesamte Probe 3 gerade voll- lieh des Enzyms alkalischer Phosphatase bei Verständig durch die Inkubationsschlange 78 geströmt Wendung des synthetischen Substrats Para-Nitropheist. Sobald der letzte Proben-Substrat-Gemischschub nylphosphat können die Innendurchmesser der zu- ES 10 der Probe 3 diese Schlange verlassen hat, wird 55 sammenquetschbaren Pumpenschläuche 54 und Si die Geschwindigkeit augenblicklich von dem Wert derart gewählt sein, daß sich ein Substrat-Enzym- Vl auf die hohe Geschwindigkeit V 2 angehoben. Verhältnis von etwa 20:1 einstellt.
Dadurch wird das nachfolgende Ansangen der nach- Wenn man die beschriebene Vorrichtung zui sten Blutprobe, der Waschflüssigkeit und der Luft- quantitativen Analyse von mehreren Blutproben be-Schübe so schnell wie möglich vorgenommen. Sobald 60 züglich eines Enzyms in der Form von Creatin-Phos die Probe 4 durch die Misch- und Inkubations- phokinase verwendet und dabei als Reaktäonspartnei schlange 78 zu strömen beginnt, setzt wieder die ein Substrat in der Form von Creatin-Phosphat be· hyperbolische Geschwindigkeitsabsenkung ein. nutzt, ist es notwendig, die in der F i g. 2 dargestellt Nach dem Verlassen der Inkubationsschlange 78 Vorrichtung 97 mit der sekundären Zufuhr-, Misd strömt der Proben-Substrat-Strom S durch die Lei- 65 and Behandlungseinrichtung 28 zu verwenden, an rung 96 zu dem Kolorimeter 124. Sofern das Kolon- dem inkubierten und reagierten Proben-Snbstrat-Ge meter 124 eine Entgasungseinrichtmg enthält, wer- misch ein geeignetes farberzeugendes Reagenz hinzu den von dieser die zwischen den einzelnen Proben- zufügen, damit optische Dichteänderungen leich

»i

13 14

nachgewiesen werden können. Dabei treibt der Pum- Fig.3 gerade derjenige Zeitpunkt beim Betriebs penantriebsmotor 86 die Dosierpumpe 84 mit einer ablauf der Vorrichtung 20 dargestellt, bei dem de konstanten Geschwindigkeit an. Wenn man den Ge- erste Proben-Substrat-Gemischschub £51 _de halt von Creatin-Phosphokinase bestimmen will, Probe 3 die Inkubationsschlange 78 gerade verlassei wird der Reagenzbehälter 92 mit einem passenden 5 hat Dabei hat der erste Gemischschub £51 di< farberzeugenden Reagenz gefüllt, beispielsweise Dia- Misch- und Inkubationsschlange 78 mit einen cstylorcinol. Durchfluß bzw. einer Strömungsgeschwindigkei

Beim Betrieb der Vorrichtung Ψ1 arbeiten die Zu- durchströmt, die der niedrigen Geschwindigkeit V] fuhreinrichtung 22, die Steuereinrichtung 24, die des Pumpenantriebsmotors 68 entspricht. Wenn de Misch- und Behandlungseinrichtung 26, die Nach- n» erste Proben-Substrat-Gemischschub ES 1 die darge weiseinrichtung 30 und die Aufzeichnungseinrich- * stellte Lage erreicht hat, schaltet der Taktgeber 4! rung 32 grundsätzlich in der bereits oben beschriebe- den veränderbaren Widerstandswert RV des Polen nen Weise. Dies gilt zumindest für den Betriebs- tiometers 68 augenblicklich derart um, daß der Pum ablauf bis zum Austrittsende der Inkubations- penantriebsmotor 60 jetzt mit der hohen Geschwin schlange 78. Wenn nun der inkubierte Proben-Sub- 15 digkeit V 2 arbeitet. Damit wird auch der Durchflul strat-GemischstromS über die Leitung 96 zu dem des Proben-Substrat-Gemischstroms 5 durch die In Verzweigungssriick 98 strömt, wird dieser Strom kubationsschlange 78 augenblicklich in entsprechen durch den relevanten Auslaß des Verzweigungsstücks der Weise e. höht. Die erhöhte Geschwindigkeit V \ und den zusammenquetschbaren Pumpenschlauch 86 des Pumpenantriebsmotors 60 bleibt auch für di< praktisch mit einem konstanten Durchfluß »abgeta- *> Dauer bestehen, während der alle übrigen Probenstet«. Der überschüssige Teil des Stroms wird über Substrat-Gemisc.'ischübe £52 bis £510 der Probe 3 den anderen Auslaß des Verzweigungsstücks 98 zum durch die Inkubationsschlange 78 strömen. Dies« Abfluß geleitet. Der konstante Durchfluß durch den Änderung in der Pumpengeschwindigkeit bzw. Strö· zusammenquetschbaren Pumpenschlauch 86 wird mungsgeschwindigkeit durch die Misch- und Inkuba durch geeignete Wahl des Innendurchmessers des »5 tionsschlange 78 ist in der Fig.6 dargestellt. Der ge Pumpenschlauchs 86 und der Pumpengeschwindig- zeigte Kurvenverlauf 148 zeigt die Geschwindigkeii keit derart eingestellt, daß dieser Durchfluß unter al- bzw. den Durchfluß durch die Schlange 78 in Ab len Bedingungen geringer ist als der Durchfluß durch hängigkeit von der Echtzeit TR für die Prboen: die Leitung 96. und 4.

Gleichzeitig wird das farberzeugende Reagenz aus 30 Infolge der absatzweisen Änderung der Drehzah dem Behälter 92 mit konstantem Durchfluß abge- des Pumpenantriebsmotors 60 und der entsprechen saugt und in dem Verzweigungsstück 104 durch über den Änderung des Durchflusses der Proben-Subden Pumpenschlauch 90 angesaugte Luftsegmente strat-Gemischschübe der Probe 3 durch die Inkubagetrennt. Der luftsegmentierte Reagenzstrom wird in tionsschlange 78 strömt der erste Proben-Substratdem Verzweigungsstück 106 mit dem Proben-Sub- 35 Gemischschub £51 der Probe 3 mit einem der gerinstrat-Gemischstrom 5 zusammengeführt. Der sich er- gen Motorgeschwindigkeit Vl entsprechenden Strögebende Proben-Substrat-Reagenz-Gemischstrom mungsgeschwindigkeit durch die gesamte Inkuhnwird zum Mischen und Erhitzen und bzw. oder ledig- tionsschlange 78. Der letzte Proben-Substrat-Gelich zum Einschalten einer Zeitverzögerung, was von mischschub £510 der Probe 3 strömt hingegen mil der Art der gewünschten Reaktion abhängt, durch 40 einer der hohen Motorgeschwindigkeit V 2 entspredie Schlange 108 geleitet. chtnden Strömungsgeschwindigkeit durch die ge-

Nach dem Austritt aus der Schlange 108 wird der samte Inkubationsschlange 78. Die dazwischenlieinkubierte und reagierte Proben-Substrat-Reagenz- genden Proben-Substrat-Gemischschübe £52 bis Gemischstrom über die Leitung 109 der Durchfluß- £59 der Probe 3 verbringen infolge des Umschaltens zelle des !Colorimeters 124 zugeführt, um dort eine fs von der geringen Geschwindigkeit Vl auf die hohe automatische, aufeinanderfolgende kolorimetrische Geschwindigkeit Vl eine zunehmend geringer wer-Analyse der Blutproben vorzunehmen und auf dem dende Zeit in der Inkubationsschlange 78. Die Pro-Streifenblatt 134 des Schreibers 130 den bereits er- ben-Substrat-Gemischschübe £51 bis £510 haben läuterten Kurvenzug 136 aufzuzeichnen. daher in der genannten Reihenfolge eine linear ab-

Den in der Fig. 1 dargestellten Aufbau der Vor- 5° nehmende Inkubationszeit in der Misch- und Inkurichtung zum Bestimmen des Enzymgehalts in Blut- bationsschlange 78. Das Ausmaß, mit dem die Enproben kann man auch verwenden, um an Stelle einer zym-Substrat-Reaktion bezüglich der einzelnen hyperpolischen Geschwindigkeitsänderung eine stu- Schübe £51 bis £510 in der Inkubationsschlange fenweise Änderung des Durchflusses jedes Proben- fortschreitet, nimmt daher ebenfalls linear ab, so daß Substrat-Gemischs in der Inkubationsschlange 78 55 auch die auf Grund der Reaktion hervorgerufene opvorzunehmen. P.ihei arbeitet die Proben- und Sub- tische Dichteänderung in den Gemischschüben abstratzufuhreinrichtung 22 in der beschriebenen nimmt. Auf diese Weise entsteht ein optisches Dich-Weise, um wiederum einen Proben-Substrat-Ge- tedifferential, das man in der bereits beschriebenen mischstrom herzustellen. Weise ausnutzen kann, um den Gehalt des interessie-

Dieser Strom wird, wie bereits beschrieben, der In- 60 renden Enzyms zu bestimmen.

kubationsschlange 78 zugeführt, die in der F i g. 3 als Dieses Differential ist für die Inkubationszeit TI

geradlinige Leitung dargestellt ist. der Proben-Substrat-Gemischschübe £51 bis £510

Wenn man beispielsweise annimmt, daß jedes Pro- in Abhängigkeit von der Echtzeit TR in der F i g. 7 ben-Substrat-Gemisch in zehn luftsegmentierte Pro- durch den Kurvenverlauf 150 dargestellt. Die Steiben-Substrat-Gemischschübe unterteilt ist und das 65 gung des Kurvenverlaufs ISO entspricht 1-V 2/V1.
Gesamtvolumen des luftsegmentierten Proben-Sub- Von der Inkubationsschlange 78 strömt der Pro-

strat-Gemischs etwa 25 °/o größer ist als das Gesamt- ben-Substrat-Strom 5 über die Leitung 96 zu dem volumen der Inkubationsschlange 78, dann ist in der Kolorimeter 124. Dort wird der Strom von den Luft-

Segmenten mit Hilfe der Entgasungseinrichtung be- Iakubationsschlange 78 sprungartig herabgesetzt. Sc

freit und strömt dann durch die Durchflußzelle, um bald der erste Proben-Substrat-Gemischschub ES.

durch kolorimetrische Analyse die Veränderung in der Probe 4 die Misch- und Inkubationsschlange 7:

der optischen Dichte der einzelnen Schübe zu be- durchströmt hat, wird der Pumpenantriebsmotor wie

stimmen, die Gemischanteile bilden. Das Analysen- 5 der augenblicklich mit der hohen Geschwindigkei

ergebnis wird von dem Schreiber 130 in Form eines V 2 betrieben.

leicht interpretierbaren und reproduzierbaren Kur- Die Vorrichtung 20 arbeitet vollkomr-= antoma

venverlaufs auf dem Streifenblatt 132 aufgezeichnet. tisch, wobei der Pumpenantriebsmotor 6v uuf die ge

Das sich ergebende optische Dichtedifferential der ringe Geschwindigkeit umgeschaltet wird, gprade be

, betreffenden Proben-Substrat-Gemischanteile £510 ίο vor der erste Proben-Substrat-Gemischschub ES]

ι bis ES 1 ist in Abhängigkeit von der Inkubationszeit der Blutproben in die Inkubationsschlange 78 ein

TI in der Fig. 8 dargestellt. Dabei ist der lineare tritt, und zur schnellen Geschwindigkeit V2 zurück

Kurvenzug 152 für einen linearen Verlauf der Reak- geschaltet wird, gerade wenn der erste Proben-Sub-

tionsgeschwindigkeit charakteristisch. Die Stei- strat-Gemischschub £51 die Inkubationsschlange

,. ι gungAf des Kurvenzugs 152 der Fig. 8 stellt in be- 15 durchströmt hat.

zug auf die Konzentration der fraglichen Enzymart Wenn die gesamte Zykluszeit der Vorrichtung zui in der Blutprobe 3 den interessierenden Wert dar. Analyse einer Blutprobe etwa 3 Minuten beträgt, Die Fig. 9 zeigt die tatsächliche Kurve 136', die von denen 160 Sekunden zum Mischen und Inkubieder Streifenblattschreiber 130 für die Probe 3 liefert. ren der Blutprobe und des Substrats verwendet wer-Der Kurvenzug 136' ist zwar auch linear, hat jedoch ao den und während der übrigen 20 Sekunden die nachan Stelle der Steigung M der Kurve 152 der Fig. 8 folgende Blutprobe, die Waschflüssigkeit und die eine Steigung 5, da in der F i g. 9 die optische Dichte Luftsegmente angesaugt werden, läuft der Gleichin Abhängigkeit von der Echtzeit TR dargestellt ist. spannungsmotor 60 für etwa 160 Sekunden mit der Zwischen der Steigung5 der Kurve 136' der Fig.9 niedrigen Geschwindigkeit Vl, um eine maximale und der interessierenden Steigung M der Kurve 152 25 Proben-Substrat-Inkubationszeit von 160 Sekunden der Fig. 8 besteht eine Beziehung, die durch die fol- vorzusehen, und für etwa 20 Sekunden mit der hohen gende Gleichung (2) gegeben ist: Geschwindigkeit V 2, um für etwa 20 Sekunden die

nachfolgende Blutprobe, die Waschflüssigkeit und

_ 5 die Luftsegmente anzusaugen. Das Verhältnis zwi-

ρ, 3° sehen den Geschwindigkeiten V 2 und Vl des Pum-

1 penantriebsmotors 60 betragt ebenfalls vorzugsweise

^l 6:1. Zur Ar.alysc der Blutproben bezüglich des Enzyms alkalische Phosphatase unter Verwendung des

Zur Interpretation des Kurvenverlaufs 136' auf synthetischen Substrats Para-Nitrophenylphosphat

dem Streifenblatt ist es somit zunächst erforderlich, 35 werden die Innendurchmesser der zusammenquetsch-

die Steigung 5 des Kurven Verlaufs 136' zu bestimmen baren Pumpenschläuche 54 und 56 derart gewählt,

und anschließend diese Steigung unter Verwendung daß sich ein Substrat-Enzym-Verhältnis von etwa

der Gleichung (2) umzuformen. Die tatsächliche 20:1 einstellt.

quantitative Bestimmung des interessierenden En- Wenn man nach dem gerade beschriebenen absatz-

zymgehalts in der Blutprobe 3 kann man dann mit 40 weisen Umschaltverfahren mehrere Blutproben

der bereits erwähnten Gleichung (3) vornehmen: quantitativ in bezug auf ein Enzym in der Form von

Creatin-Phosphokinase unter Verwendung eines Sub-

HüHiL = Λ/ · 10· · ~ · — strats in Form von Creatin-Phosphat analysiert, wird

ml SV e die in der F i g. 2 dargestellte Vorrichtung 97 ver-

45 wendet, die die sekundäre Zufuhr-, Misch- und Beim folgenden wird noch einmal auf die Betriebs- handlungseinrichtung 28 enthält, um ein passendes drehzahl des gleichspannungsbetriebenen Pumpenan- farberzeugendes Reagenz dem inkubierten und reatriebsmotors 60 und somit auf den Proben-Enzym- gierten Proben-Substrat-Gemisch hinzuzufügen, so Gemischdurchfluß durch die Misch- und Inkuba- daß eine Veränderung in der optischen Dichte des tionsschlange 78 sowie den in der F i g. 6 dargestell- 50 Gemischs leicht nachgewiesen werden kann. Auch ten Kurvenverlauf 148 Bezug genommen. Wie man hier wird der Pumpenantriebsmotor 86 derart betäsieht, wird die hohe Geschwindigkeit V 2 beibehal- tigt, daß er die Dosierpumpe 84 mit konstanter Geten, auch nachdem der letzte Schub einer Probe die schwindigkeit antreibt. Zur quantitativen Analyse Schlange 78 durchströmt hat, um die Zeit zum An- des Enzyms Creatin-Phosphokinase wird der Behälsaugen der nachfolgenden Blutproben, der Wasch- 55 ter 92 mit einem geeigneten farberzeugenden Reaflüssigkeit und der Luftsegmente so gering wie mög- genz gefüllt, beispielsweise mit Diacetylorcinol. Trotz Hch zu halten. Die hohe Geschwindigkeit wird daher der Tatsache, daß im vorliegenden Fall der Durchbeibehalten, bis der erste Proben-Substrat-Gemisch- fluß durch die Inkubationsschlange 78 absatzweise schub £51 der nachfolgenden Blutprobe 4 das Ein- geändert wird, wird die Vorrichtung 97 in der gleitrittsende der Inkubationsschlange 78 erreicht hat. 60 dien Weise betrieben, wie es bereits beschrieben ist. Sobald dies der Fall ist, betätigt der Taktgeber 48 Obwohl die beschriebenen Ausführungsbeispiele augenblicklich das Potentiometer 68, um den ver- die kolorimetrische quantitative Analyse einer Reihe änderbaren Widerstand RV momentan zu verändern, von Blutscrumproben in bezug auf den Gehalt eines und zwar derart, daß der Gleichspannungsmotor 60 besonderen Enzyms betreffen, ist das erfindungsgemit der niedrigen Geschwindigkeit Vl arbeitet. 65 mäße Verfahren und die entsprechend ausgebildete Gleichzeitig damit wird der Durchfluß bzw. die Strü- Vorrichtung auch zur Enzymbestimmung in anderen mungsgeschwindigkeit der Proben-Substrat-Gemisch- Fluidproben als Blutserumproben verwendbar. Darschübe der Blutprobe 4 zu und durch die Misch- und über hinaus kann man die Erfindung zur

17 18

mung der Reaktionsgeschwindigkeit zwischen ande- kann es weiterhin erforderlich machen, daß an Stelle ren Substanzen als Enzymen und Substraten verwen- der beschriebenen Nachweiseinrichtung 30 in Form den. Dabei braucht es sich nicht um Blutproben zu einer kolorimetrischen Analysiereinrichtung beihandeln, spielsweise ein Fluorometer benutzt wird. Darüber

Darüber hinaus kann man die beschriebene hyper- 5 hinaus ist es möglich, an Stelle des beschriebenen

bolische Geschwindigkeitsänderung auch in umge- Gleichspannungsmotors 60 einen Wechselstrommo-

kehrter Richtung vornehmen, d. h., man kann hyper- tor zu veiwenden.

bolisch von einer niedrigen auf eine hohe Geschwin- Die Luftsegmente, insbesondere die zwischen den digkeit übergehen. In gleicher Weise kann die i-bsatz- Proben-Substrat-Gemischen eingefügten Luftsegweise Änderung in umgekehrter Richtung vorgenom- io mente, dienen zur Reinigung und können in manchen men werden. Fällen weggelassen werden. Die Ausdrücke »Schub«

Ferner kann es sich bei der Vorrichtung an Stelle und »Anteil« sind nicht auf verschiedene Teile eines des beschriebenen Ein-Kanal-Geräts um ein Mehr- Proben-Substrat-Gemischs beschränkt, die durch ein Kanal-Gerät handeln, um die Anzahl der in einer trennendes Fluid, beispielsweise Luftsegmente, von-Stunde ausgeführten Analysen zu erhöhen. Der 15 einander getrennt sind, sondern beziehen sich ledig-Drehtisch 34 kann beispielsweise vier konzentrische Hch auf verschiedene Teile eines Proben-Substratkreisförmige Reihen mit Probenbehältern aufweisen Gemischs. Die Aufzeichnungseinrichtung 32 kann und mit vier gleichzeitig arbeitenden Probenentnah- mit digitalen Lese- und bzw. oder Druckeinrichtunmeeinrichtungen 38 ausgerüstet sein, die dann mit gen ausgerüstet sein, die gleichzeitig mit dem Streientsprechend zugeordneten zusammenquetschbaren 20 fenblattschreiber 130 betrieben werden können. Zu Pumpenschläuchen, Vorinkubationsschlangen, Misch- diesem Zweck können geeignete Schaltungsanord- und Inkubationsschlangen, kolorimetrischen Durch- nungen und Schalteinrichtungen vorhanden sein, beiflußzellen und Streifenblattschreibern zusammen- spielsweise die durchschnittliche Steigung nachweiarbeiten, um gleichzeitig während eines Zyklus sende Einrichtungen, die die von dem Kolorimeter der Vorrichtung vier Blutproben auf ihren Enzymge- 25 124 über eine Leitung 131 kommenden Analoghalt zu untersuchen. Abweichend davon kann man signale in Digitalsignale umwandeln, die dann einem auch jede von mehreren Blutproben in bezug auf vier Digitalleser und bzw. oder Digitaldrucker zugeführt verschiedene Enzymarten untersuchen. Dazu kann werden.

man eine angesaugte Blutprobe in vier Teilproben Das Verfahren und die Vorrichtung nach der Eraufteilen, die dann in verschiedenen Einrichtungen 30 findung können insbesondere in Verbindung mit gleichzeitig gemischt, inkubiert und kolorimetrisch automatischen Blutprobenanalysiergeräten verwendet auf verschiedene Enzyme analysiert werden. werden, wie sie beispielsweise in den US-PS

Die Art des Ablaufs einer besonderen Reaktion 3 134263 und 3 241432 beschrieben sind.

Hierzu 5 Blatt Zeichnungen

Claims

8. Vorrichtung nach Anspracht» oder7, da- Patentansmiiche- durch gekennzeichnet, daß hinter der Inkuba- raieniansprucnc. tJonseinrichtung (26) eine Zusatzeinrichtung (28)

1. Verfahren zur quantitativen Analyse einer angeordnet ist mit der den Proben-Reaktions-

Probe in bezug auf den Gehalt einer in der Probe 5 partner-Gemischanteilen em farberzeugendes enthaltenen Substanz, bei dem die Probe mit Reagenz zusetzbar ist.