DE2902677A1 - Unloeslich gemachte proteine und immunoassays unter verwendung dieser proteine - Google Patents
Unloeslich gemachte proteine und immunoassays unter verwendung dieser proteineInfo
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Description
TECHNICON INSTRUMENTS CORPORATION, Tarrytown, N.Y. VStA
Unlöslich gemachte Proteine und Immunoassays unter Verwendung dieser Proteine
Die Erfindung betrifft Immunoassays und insbesondere solche, bei denen unlöslich gemachte Antikörper oder Proteinantigene
als Reagenzien verwendet werden, sowie derartige Reagenzien, ein Verfahren zu ihrer Herstellung und bestimmte
Brückensubstanzen, die dafür verwendbar sind.
Bekanntlich werden unlöslich gemachte Antikörper und Antigene als Reagenzien bei verschiedenen Immunoassays verwendet.
Diese Reagenzien werden normalerweise hergestellt, indem man entweder das Antigen oder den Antikörper an einen
wasserunlöslichen Träger adsorbiert oder Antikörper oder Antigen an einen wasserunlöslichen Träger kovalent bindet,
wobei eine bifunktionelle Brückengruppe eingesetzt wird. Unter den am allgemeinsten verwendbaren bifunktionellen
Brückengruppen sind die Dialdehyde, wie beispielsweise Glutaraldehyd, zu nennen. Derartige Brückengruppen reagieren
leicht mit freien Aminogruppen im Antikörper oder im Proteinantigen.
Bei vielen Immunoassayverfahren, bei denen unlöslich
gemachte Antikörper oder Proteinantigene verwenden werden, treten die wohlbekannten immunospezifischen Reaktionen zwischen
einem bestimmten Antikörper (oder Antigen) und dessen entsprechendem Antigen (bzw. Antikörper) auf. Bekanntlich
gibt es in den Proteinmolekülen bestimmte aktive Stellen, die für derartige Umsetzungen spezifisch sind, und es ist
weiter bekannt, daß an diesen aktiven Stellen oder ihnen benachbart freie Aminogruppen sitzen. Wenn ein Antikörper
(oder Proteinantigen) durch kovalentes Überbrücken gemäß den
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üblichen Verfahren unlöslich gemacht wird, werden daher die aktiven Stellen in gewissem Ausmaß blockiert. Dadurch
wird die Aktivität des Proteins bei einer folgenden immunspezifischen Reaktion, wie beispielsweise bei einem Immunoassay,
verringert, was von Nachteil ist.
Es wurde nun ein Verfahren zur Überwindung oder Verminderung dieses Nachteils gefunden. Insbesondere wurde
gefunden, daß Antikörper und Proteinantigene durch kovalente Bindung an ein wasserunlösliches Substrat unlöslich gemacht
werden können, wobei als Brückenmittel eine Substanz verwendet wird, die sich eher an die im Protein vorhandenen
Schwefelatome als an die Aminogruppen bindet.
Gegenstand der Erfindung ist ein Reagenz zur Verwendung bei Immunoassays, bei denen eine immunspezifische
Reaktion zwischen einem Antikörper und einem Antigen auftritt, das ein Reagenz zur Verwendung bei Immunoassays enthält,
das aus einem Proteinantigen, einem Antikörper oder den F(ab1^-Untergruppen eines Antikörpers besteht, der
bzw. die kovalent an ein wasserunlösliches Substrat über eine Brückengruppe gebunden ist bzw. sind, die unmittelbar
an Schwefelatome in dem Antigen, dem Antikörper bzw. den
Untergruppen eines Antikörpers gebunden ist.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Durchführung eines Immunoassays, das dadurch gekennzeichnet
ist, daß man eine immunspezifische Reaktion zwischen einem Antigen und einem Antikörper oder F(ab1)p-Untergruppen
davon unter Verwendung eines Reagenzes gemäß der Erfindung durchführt.
Gegenstand der Erfindung ist schließlich ein Verfahren zur Herstellung eines Reagenzes zur Vervrendung bei
Immunoassays, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man ein Proteinantigen oder einen Antikörper oder die F(ab')o-
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Untergruppen davon mit einem Brückenreagenz unter kovalenter Bindung des Brückenreagenzes unmittelbar an Schwefelatome
in dem Antigen, dem Antikörper oder den Untergruppen davon umsetzt, wobei vor oder nach der Umsetzung das
Brückenreagenz kovalent an ein wasserunlösliches Substrat gebunden wird.
Antikörper-Immunglobuline enthalten eine Anzahl von Polypeptidketten, die in bestimmten Abständen durch Disulphidbindungen
miteinander verknüpft sind. Die Ketten selbst können ebenfalls Disulphidgruppen enthalten. In
einer bevorzugten Durchführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die Disulphidbindungen einer milden Reduktion
zu Sulphhydrylgruppen-SH unterworfen, wobei diese
dann mit der einen funktionellen Gruppe eines bifunktionellen Brückenmittels umgesetzt werden. Die genannte funktionelle
Gruppe ist eine, die eher mit -SH-Gruppen als mit freien Aminogruppen reagiert. Eine derartige bevorzugte
funktioneile Gruppe ist eine Chloracetylgruppe, wie beispielsweise die Monochloracetylgruppe -Co-CHp-Cl (I).
Die andere funktionelle Gruppe des bifunktionellen Brückenmittels reagiert mit dem wasserunlöslichen Substrat,
an das der Antikörper oder das Proteinantigen gebunden werden soll. Die Natur dieser funktionellen reaktiven
Gruppe hängt von der Art des gewählten Substrats ab, und es sind viele geeignete Substrate (sowie mit ihnen reaktionsfähige
funktionelle Gruppen) bekannt. Das Substrat kann beispielsweise in Folienform oder in Form eines Rohres
vorliegen. Im letztgenannten Fall kann das Antigen oder der Antikörper an der Innen- oder der Außenseite des Rohres
oder an beiden Seiten immobilisiert v/erden. Vornehmlich liegt das Substrat jedoch in Teilchenform vor, und die Reagenzien
gemäß der Erfindung können dann beispielsweise aus den Teilchen in Suspension in einer xräßrigen Flüssigkeit
bestehen, die zweckmäßigerweise einen Puffer enthalten
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kann. In einer bevorzugten Durchführungsform ist das
teilchenförmige Substrat magnetisch anziehbar, so daß es leicht durch Anwendung eines Magnetfeldes aus einem Gemisch
abgetrennt werden kann. Die Verwendung von teilchenförmigem Material in Immunoassays ist ebenfalls bekannt.
Ein besonders bevorzugtes teilchenförmiges Substrat besteht
aus Latexteilchen.
Die Art des Materials, aus dem das Substrat zusammengesetzt ist, ist nicht von entscheidender Bedeutung, wenn es
nur in der Lage ist, mit einem Ende oder Teil des Brückenmittels zu reagieren. Künstliche polymere Materialien, die
wasserunlöslich sind, können zur Ausbildung des Substrats verwendet werden, wobei normalerweise derartige Substrate
mit einem reaktionsfähigen Überzug versehen werden, beispielsweise einem Proteinüberzug. Ein typisches Protein, das
sich für diesen Zweck eignet, ist Albumin. In derartigen Fällen enthält die Brückengruppe als eine fraktionelle Gruppe
eine Gruppe, die leicht mit Albumin reagiert. Zwar sind mehrere derartige Gruppen bekannt, jedoch wird gemäß einem
bevorzugten Merkmal der Erfindung ein Anhydrid verwendet, das bevorzugt als ein solches der Formel
CO 0
XC = O II
CH NBT
vorliegt. Eine derartige Gruppe reagiert leicht mit freien Aminogruppen eines Proteins, wie beispielsweise des Albumins.
Zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Reagenzes, in dem ein Antikörper oder ein Proteinantigen kovalent an
ein Protein, wie beispielsweise Albumin, gebunden ist, wird vorzugsweise eine bifunktionelle Brückensubstanz verwendet,
die an dem einen Ende die Chloracetylgruppe I und am anderen Ende die Anh3rdridgruppe II aufweist. Eine besonders
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bevorzugte Klasse für derartige Brückenmittel ist diejenige der allgemeinen Formel
0-C-NH
CO CH (CH2^n — NH-CO-CH2 - Cl III
CO CH (CH2^n — NH-CO-CH2 - Cl III
worin η eine ganze Zahl von 1 bis 10 und vorzugsweise 4 bedeutet.. Diese Verbindungen sind selbst neu und als
solche Gegenstand der Erfindung. Die Verbindung gemäß Formel III mit η = 4 wird im folgenden als "NCA" bezeichnet.
Wenn wie bei der Verbindung NCA und den anderen Verbindungen der Formel III das Brückenmittel eine funktionelle
Gruppe enthält, die leicht mit den Aminogruppen des Proteins reagiert, ist es wichtig, sicherzustellen, daß
diese funktioneile Gruppe nicht mit freien Aminogruppen in dem Antigen, dem Antikörper bzw. den F(ab1)2-Untergruppen
davon reagiert. Das kann dadurch geschehen, daß man beispielsweise
das Brückenmittel zunächst mit dem wasserunlöslichen Träger umsetzt und lediglich danach mit dem Immunglobulin-Antikörper
oder Proteinantigen in Berührung bringt.
Im folgenden wird ein Beispiel für ein Verfahren zur Herstellung eines Reagenzes gemäß der Erfindung beschrieben.
Latexteilchen werden mit Albumin (oder einem anderen Protein oder Polypeptid, wie Lactoferrin) überzogen, wobei das Albumin
an die Latexteilchen adsorbiert wird. Im Falle eines Sulfidgruppen enthaltenden Überzuges, die mit den Brückengruppen
reagieren können, wie beispielsweise im Falle einer Beschichtung mit Albumin, wird das Beschichtungsmaterial
(vor oder nach Ausbildung der Beschichtung) alkyliert, um derartige Gruppen zu zerstören oder zu inaktivieren. Die
mit Albumin überzogenen Teilchen werden anschließend etwa 24 h bei neutralem pH-Wert (beispielsweise 7,1) mit NCA
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bebrütet, und die Anhydridgruppen des NCA reagieren mit den Aminogruppen an dem Albumin. (Alternativ kann das NCA
zunächst an das alkylierte Albumin gekuppelt werden, und die Teilchen können mit der erhaltenen Verbindung beschichtet
werden.)
Der Antikörper wird unter milden Bedingungen reduziert (beispielsweise mit Dithiothreit), um an ihm Sulphhydrylgruppen
zu erzeugen. Anschließend wird er mit den Latex-Albumin-NCA-Teilchen vermischt und das Ganze bei
Raumtemperatur 36 h bebrütet. Der Antikörper reagiert mit
den Chloracetylgruppen am NCA und wird somit kovalent über das NCA an das Albumin gebunden.
Von den verschiedenen Antikörper-Immunglobulinen ist
das IgG das gebräuchlichste» Bekanntlich nehmen IgG-Moleküle
leicht die Form eines Y an, wobei die beiden oberen Glieder (F(abI)2""Anteile) an ihren äußeren Enden die Stellen für die
Antigenbindung enthalten und das untere Glied (F(c)-Anteil) unter anderem Stellen enthält, an denen beispielsweise Umsetzungen
mit dem Rheumatoidfaktor und der Komponente C1q ablaufen. Die Stelle, an der die drei Glieder des Y zusammenstoßen,
wird der Verzweigungsbereich (hinge area) genannt. In diesem Bereich treten Disulphidbindungen zwischen
benachbarten Polypeptidketten auf, und vermutlich mit diesen Bindungen reagieren die bevorzugten Brückenreagenzien gemäß
der Erfindung. Es ergibt sich deshalb, daß die Brückengruppen die Antigenbindungsstellen an den F(ab»)^-Anteilen der
Moleküle nicht stören.
Erfindungsgemäß ist es bevorzugt, eine Brückengruppe zu verwenden, die eine Kette von mindestens 5 Atomen Länge,
enthält (noch stärker bevorzugt sind Brückenreagenzien gemäß Formel III, in denen η 4 oder größer ist), um den Antikörper
(beispielsweise IgG) oder das Antigen in einer gewissen Entfernung von der Substratoberfläche, an die sie
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gebunden sind, zu halten. Dies führt dazu, daß das Antigen oder der Antikörper für Umsetzungen besser zugänglich sind
als bei früheren Verfahren, bei denen beispielsweise als Brückensubstanzen Bromcyan oder Glutaraldehyd verwendet
werden. Somit wurde gefunden, daß die Aktivität eines Antikörpers an einem erfindungsgemäßen Reagenz unter Verwendung
von NCA sehr viel größer ist als in dem Fall, wenn derselbe Antikörper unmittelbar an das Substrat adsorbiert
worden ist. Beispielweise ist die Empfindlichkeit des
Tests bei einem Agglutinierungsassay unter Verwendung von
Latex-Rinderserumalbumin-NCA-Antikörper und -Antigen etwa 50mal größer als in dem Fall, in dem der Antikörper lediglich
unmittelbar an den Latex adsorbiert war (in diesem Falle war das Antigen Pferdeferritin und der Antikörper
Kaninchenantiferritin).
In der Patentanmeldung Gegenstand der gleichzeitig eingereichten Patentanmeldung (britische Patentanmeldung
3237/78) ist ein Verfahren zur Durchführung eines Immunoassays, bei dem anstelle des Gesamtimmunglobulins
die F(ab!)p-Untergruppen davon verwendet werden. Die Reagenzien
gemäß der Erfindung können anstelle des Antikörpers auch die F(ab')p-Untergruppen davon enthalten. Derartige
Reagenzien können in äußerst vorteilhafter Weise unter Verwendung der Verbindungen gemäß Formel III, vorzugsweise von
NCA, wie folgt hergestellt werden. Nach Herstellung der Latex-Albumin-NCA-Antikörperteilchen, bei denen der Antikörper
beispielsweise IgG ist, wie oben ausführlich beschrieben, werden die Teilchen mit Pepsin digeriert. Dies
führt zur Bildung von Latex-Albumin~NCA-F(ab')2>
°!»h. die F(c)-Untergruppe ist nicht länger anwesend. Am meisten bevorzugt
ist es, daß die Reagenzien gemäß der Erfindung, die die F(abf )2-Untergruppen von IgG enthalten, praktisch frei
von dem entsprechenden Gesamt-IgG und den F(c)-Untergruppen
sind. Weitere Einzelheiten bezüglich der Verwendung der F(ab' ^-Untergruppen in Immunoassays sind der genannten
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gleichzeitig eingereichten Patentanmeldung zu entnehmen.
Die erfindungsgemäßen Reagenzien können in einer großen Vielfalt von Immunoassayverfahren verwendet werden,
wie dem Fachmann klar ist«, Ein Verfahren gemäß der Erfindung zur Bestimmung eines Antigens in einer Flüssigkeit
besteht darin, daß man
a) ein Gemisch einer Probe der Flüssigkeit mit einem erfindungsgemäßen Reagenz, das einen Antikörper
oder eine F(ab'^-Untergruppe davon, die an das zu
bestimmende Antigen gebunden werden, enthält, herstellt,
b) das Gemisch zur Ermöglichung der Umsetzung bebrütet und
c) das Gemisch zur Bestimmung des Ausmasses der Umsetzung und dadurch der Menge an Antigen in der
Flüssigkeitsprobe untersucht.
Wenn ein Reagenz gemäß der Erfindung verwendet wirdf das
F(ab')p-Untergruppen enthält, ist das Umsetzungsgemisch
vorzugsweise praktisch frei von dem entsprechenden Immunglobulin
und den F(c)-Untergruppen davon.
Ein analoges Verfahren kann zur Bestimmung eines Antikörpers in einer Flüssigkeit angewandt werden, wobei
ein entsprechendes Proteinantigen verwendet wird, an das sich der Antikörper bindet.
Ein sehr bevorzugter Assay gemäß der Erfindung ist der Latexagglutinierungsassay» Bei diesem Assay wird ein
Reagenz in der Form einer Suspension von Latexteilchen verwendet, wobei die Teilchen nach Umsetzung mit dem zu ermittelnden
Antigen oder Antikörper agglutinieren. Das Ausmaß der Umsetzung wird durch Beobachten des Ausmasses der
Agglutinierung bestimmt, woraus sich die Menge an dem zu bestimmenden Antigen oder Antikörper in der Flüssigkeits-
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probe ermitteln läßt. Am meisten bevorzugt ist es, das Ausmaß der Agglutinierung durch selektives Auszählen der
nicht agglutinierten Latexteilchen zu bestimmen, die in
dem Umsetzungsgemisch zurückbleiben.
Bei einem weiteren bevorzugten Assay gemäß der Erfindung enthält das Reagenz Teilchen, die anschließend
aus dem Reaktionsgemisch abgetrennt werden, wobei entweder die abgetrennten Teilchen oder das zurückbleibende Gemisch
oder beides analysiert werden, um die Menge an zu bestimmendem Antigen oder Antikörper festzustellen. Vorzugsweise
sind die Teilchen magnetisch anziehbar und werden unter Anwendung eines Magnetfeldes abgetrennt. Die Verwendung von
magnetischen Teilchen auf diese Weise ist in der belgischen Patentschrift 852327 im einzelnen beschrieben.
Das Assayverfahren gemäß der Erfindung kann auf
eine Vielzahl von Flüssigkeiten angewandt werden, jedoch werden üblicherweise am meisten menschliche Körperflüssigkeiten,
wie Blut, Serum oder Plasma, untersucht.
Die erfindungsgemäßen Verfahren können manuell oder automatisch durchgeführt werden, beispielsweise nach dem
Prinzip des kontinuierlichen Durchflusses, wobei einzelne Abschnitte des Reaktionsgemisches, getrennt durch Inertstoff segmente,
wie beispielsweise Luft, und gewünschtenfalls
durch Abschnitte aus einer Waschflüssigkeit, eine Leitung entlanggeschickt werden. Dieses Verfahren ist im einzelnen
in der US-PS 2 797 149 beschrieben.
Im allgemeinen können die teilchenförmigen Reagenzien gemäß der Erfindung eine beliebige zweckmäßige Teilchengröße
aufweisen. Für die meisten Zwecke ist eine Teilchengröße von etwa 1 bis 20 ,n geeignet. Besonders, jedoch
nicht ausschließlich in dem Falle der Verwendung bei der kontinuierlichen Durchflußtechnik muß das spezifische Ge-
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wicht der Teilchen vorzugsweise etwa 1,4 bis 3»2 betragen
(oder mindestens demjenigen der Flüssigkeit des Reaktionsgemisches
benachbart sein), um ein übermäßiges Aufschwimmen oder Absetzen der Teilchen in dem fließenden
flüssigen Reaktionsgemisch zu vermeiden.
Die Erfindung wird im folgenden an Hand von Beispielen
näher erläutert.
Eine Serum- oder Plasmaprobe mit einem zu bestimmenden Gehalt an Antigen wird mit einer Suspension aus Latexteilchen
vermischt, an die Antikörper gegenüber diesem Antigen gebunden sind. Das Gemisch wird in eine mit Luftabschnitten
versehene Leitung geführt. Es wird in einer Verzögerungsschlange gehalten und dort 15 bis 20 min bei
50 Hz einer Vibrationsbehandlung unterzogen, um die starke
Agglutinierung zu beschleunigen«, Die Latexteilchen wurden nacheinander im Verhältnis 1:80 und nocheinmal 1:80 verdünnt,
so daß eine Endverdünnung von 1:6400 erhalten wurde. Anschließend wurden die Teilchen durch eine Zählapparatur
geführt, die elektronisch speziell so modifiziert worden war, daß sämtliche nichtmonomeren Teilchen zurückgewiesen
wurden.
Die Abnahme in der Monomerenanzahl ist direkt proportional
der Konzentration an dem vorhandenen Antigen.
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Zusätze
Serum Latex (Antigen) (Antikörper)
Puffer als
Verdünnungsmittel
Verdünnungsmittel
Analytisches
Verfahren
Verfahren
gezählte
Latex-"Monomere
Entfernte
Bestandteile
Bestandteile
Agglutinierter Latex (elektronisch abgewiesen)
Herstellung des Reagenzes Latexteilchen
Dow, 0,794/U Durchmesser (Standardabweichung (S.D.)
0,044/u) No. 41943, Serva, Feinbiochemica, D-6900 Heidelberg
1 (10?6ige Suspension).
Alkyliertes Rinderserumalbumin wurde wie folgt hergestellt.
Eine Lösung von Rinderserumalbumin in 0,1m Phosphatpuffer vom pH 8,5 wurde mit dem fünf molaren Überschuß von Dithiothreit
vermischt und 1 h bei 37 0C belassen. Das Dithiothreit
reduziert das Rinderserumalbumin. Danach wird Jodessigsäure
im zehnfachen Überschuß, bezogen auf Dithiothreit, zugesetzt. Nach 2 h Stehen bei Raumtemperatur wurde das
Rinderserumalbumin abgetrennt und der alkalische Anteil an Sephadex G25 in einer Phosphatpufferlösung (0,1m, pH 7,2)
ins Gleichgewicht gebracht.
Das alkylierte Rinder serumalbumin in 0,1m Phosphatpuffer vom pH 7,2 wurde mit 1/7 seines Gewichtes an NCA bei 4 0C
über Nacht bebrütet. Das Protein kann nach Dialyse bei pH 7 unmittelbar verwendet oder nach Dialyse in Ammoniumbicarbonat
lyophilisiert werden.
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Kuppeln von Rinderserumalbumjn/NCA an Latex
0,4 ml Phosphatpuffer vom pH 7,1 wurden in einem Glasrohr mit 250 mg Rinderserumalbumin/NCA in Phosphatpuffer sowie
50 ml der 1Obigen Latexsuspension vermischt. Kurz bevor
dem Gebrauch wurde der zu behandelnde Latex zweimal mit 0,1m Pufferlösung vom pH 9,6 gewaschen und dann erneut in
demselben Puffer suspendiert.
Antiferritinantiserum vom Schaf wurde unter milden Bedingungen
in Dithiothreit wie folgt reduziert. Das IgG wurde 1 h in Gegenwart eines zweimolaren Überschusses von Dithiothreit
in einer Lösung von 0,1m Bicarbonat vom pH 8,5 bebrütet.
50 ml 1Obiger Suspension von Latex-Rinderserumalbumin/NCA
wurden mit 1 mg reduziertem IgG vermischt. Das' Gemisch
wurde 30 min mit Stickstoff durchspült und anschließend
unter weniger als 5mm Hg Druck in einem Glasrohr verschlossen und im Dunklen gehalten. Vor seiner Verwendung wurde
es zweimal mit 1 ml Puffer aus 0,17m NaCl, 0,1m Glycin
(pH 9,2) und 0,05% Tween 20 gewaschen und anschließend in
1%igem Rinderserumalbumin in demselben Puffer (0,27m), jedoch in Abwesenheit von Tween 20 suspendiert.
Der Agglutinierungsassay auf Ferritin im Serum wurde durchgeführt,
wie oben beschrieben. Es wurden Sera mit 27 unterschiedlichen Ferritingehalten untersucht, wobei jedes Serum
mehrere Male bestimmt wurde. Die Sera wurden außerdem nach dem Radioimmunoassay-Verfahren RAMCO untersucht. Der Korrelationskoeffizient
zwischen den beiden Assaymethoden betrug 0,92. Die Serumproben wurden bei einer Verdünnung von 20:1
dem Assay unterzogen und besaßen einen normalen Gehalt von 20 bis 300/Ug Ferritin/l.
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442 mg (0,00123 Mol) £-N-Chloracetyl-oD-carbobenzoxy-L- ■
lysin wurden bei 25 0C in 1 ml Dioxan gelöst. Die Lösung
wurde mit 80 ml eines Gemisches aus Benzol und Ethylether (1 Volumen zu 1 Volumen) vermischt und das erhaltene Gemisch
bei 25 0C 3 h lang in trockener Atmosphäre mit
256 mg Phophorpentachlorid in Berührung gebracht.
Das Lösungsmittel wurde bei 25 0C unter einem Druck von
30mm Hg während etwa 2 h in trockener Atmosphäre verdampft und die erhaltene Flüssigkeit zweimal mit je 10 ml Ethylether
gewaschen. Der Ether wurde entfernt und der Rückstand zur Trockene eingedampft. Er wurde anschließend erneut in
5 ml Essigester gelöst und bei 4 0C mit 20 ml niedrigsiedendem
Petrolether (40 bis 60 0C) erneut gefällt. Analyse:
NCA gemäß Formel
0
M
M
O-C-NH
CO -CH — (CH 2)n --NH-CO-CH2-Cl
mit η = 4.
Ber.: C 43,47, H 5,27, N 11,26
Gef.: C 43,44, H 5,31, N 11,27
Gef.: C 43,44, H 5,31, N 11,27
Zur Herstellung analoger Verbindungen, bei denen η beispielsweise
größer als 4 ist, wird ein Derivat einerd.-Aminosäure
verwendet, >das eine zweite Aminogruppe innerhalb der langen Kette enthält, oder das entsprechende Amid wurde aus einer
Beta-, Gamma- oder Delta-Aminosäure hergestellt. Beispielsweise erhält man aus
£ - NH2 + HOOC - (CH2)n - NH - CO-CH2 - Cl
das Produkt:
t- NH- CO- (CH2)n - NH - COCH2Cl.
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Claims (31)
1.) Reagenz zur Verwendung "bei Immunoassays, enthaltend
ein Proteinantigen, einen Antikörper oder die F^b1)?""
Untergruppen eines Antikörpers, kovalent über eine Brückengruppe an ein wasserunlösliches Substrat gebunden,
wobei die Brückengruppe unmittelbar mit Schwefelatomen in dem Antigen, dem Antikörper oder den Untergruppen verknüpft ist«
2. Reagenz gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß der Anteil der Brückengruppe, der unmittelbar an die Schwefelatome gebunden ist, von einer Monochloracetylgruppe
abgeleitet ist.
3. Reagenz gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Brückengruppe eine Kette mit mindestens 5 Atomen
Länge enthält, um das Antigen, den Antikörper oder die Untergruppe von dem Substrat räumlich zu trennen.
4. Reagenz gemäß Anspruch 1, 2 oder 3$
dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper ein Immunglobulin G ist«
5. Reagenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet,,
daß die Untergruppen die F(ab')p~ Untergruppen eines
Immunglobulins G sind.
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6. Reagenz gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet,
daß es praktisch frei von dem Immunglobulin G und den F(c)-Untergruppen davon ist.
7. Reagenz gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet,
daß das Substrat ein Protein enthält, an das das Brückenini ttel unmitterbar gebunden ist.
8. Reagenz gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß derjenige Abschnitt der Brückengruppe, der an das
Protein des Substrats gebunden ist, von einer Anhydridgruppe abgeleitet ist.
9. Reagenz gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet,
daß die Brückengruppe von einer Verbindung der Formel
0 - CO - NH
1 ι
CO CH (CH2^n NHCOCH2Cl
abgeleitet ist, worin η eine ganze Zahl von 1 bis 10 bedeutet.
10. Reagenz gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet,
daß η = 4.
11. Reagenz gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat in folienartiger Form oder in Röhrenform
vorliegt.
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_ 3 —
12. Reagenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10,
dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat ein teilchenförmiges Material ist»
13. Reagenz gemäß Anspruch 12,
dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat ein Latex oder ein teilchenförmiges,
magnetisch anziehbares Material ist.
14. Reagenz gemäß Anspruch 12 oder 13,
dadurch gekennzeichnet, daß das als Substrat verwendete teilchenförmige Material
in Suspension in einer wäßrigen Flüssigkeit vorliegt.
15. Reagenz gemäß Anspruch 14,
dadurch gekennzeichnet, daß die Suspension einen Puffer enthält.
16. Verfahren zur Durchführung eines Immunoass ays,,
dadurch gekennzeichnet, daß man eine immunspezifische Umsetzung zwischen einem Antigen und einem Antikörper oder F(ab1^-Untergruppen
davon unter Verwendung eines Reagenzes gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche durchführt.
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17. Verfahren zur Bestimmung eines Antigens oder Antikörpers in einer Flüssigkeit,
dadurch gekennzeichnet, daß man
a) ein Gemisch aus einer Probe der Flüssigkeit mit einem Reagenz gemäß Anspruch 1, das einen Antikörper
oder die F(abf^-Untergruppe davon bzw. ein
Proteinantigen enthält, die sich an das zu bestimmende Antigen bzw. den zu bestimmenden Antikörper binden,
b) das Gemisch zur Ermöglichung der Umsetzung bebrütet und
c) das Gemisch zur Bestimmung des Ausmaßes der Umsetzung und dadurch zur Bestimmung der Menge an
Antigen bzw. Antikörper in der Flüssigkeitsprobe untersucht.
18. Verfahren gemäß Anspruch 17,
dadurch gekennzeichnet, daß bei Verwendung eines Reagenzes mit einem Gehalt an F(abf)p-Untergruppen das Umsetzungsgemisch frei von dem Proteinantikörper, aus dem die Untergruppen erhalten worden sind, sowie frei von den entsprechenden F(c)-Untergruppen gehalten wird.
dadurch gekennzeichnet, daß bei Verwendung eines Reagenzes mit einem Gehalt an F(abf)p-Untergruppen das Umsetzungsgemisch frei von dem Proteinantikörper, aus dem die Untergruppen erhalten worden sind, sowie frei von den entsprechenden F(c)-Untergruppen gehalten wird.
19. Verfahren gemäß Anspruch 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, daß man das Reagenz in der Form einer Suspension aus Latexteilchen
einsetzt, wobei die Umsetzung die Agglutinierung der Teilchen verursacht, und daß man das Ausmaß der Umsetzung
durch Beobachtung des Ausmaßes der Agglutinierung bestimmt.
909 8 3 2/0582
20. Verfahren gemäß Anspruch 19«, dadurch gekennzeichnet,
daß man das Ausmaß der Agglutinierung durch selektives Auszählen der nicht agglutinierten Latexteilchen, die in
dem Umsetzungsgemisch zurückbleiben, bestimmt,,
21. Verfahren gemäß Anspruch 16 oder 17,
dadurch gekennzeichnet, daß man als Reagenz ein solches mit einem Gehalt an
magnetisch anziehbaren Teilchen verwendet und daß man nach der Umsetzung die Teilchen von dem Rest des Umsetzungsgemisches
durch Anwenden eines magnetischen Feldes abtrennt.
22. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 16 bis 21,
dadurch gekennzeichnet, daß man es nach dem Prinzip des kontinuierlichen Durchflusses
durchführt»
23. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 16 bis 22,
dadurch gekennzeichnet, daß man ein Antigen oder einen Antikörper in menschlichem
Serum bestimmt.
24» Verfahren zur Herstellung eines Reagenzes gemäß
Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Proteinantigen oder einen Antikörper oder die
F(ab·)^-Untergruppen davon mit einem Brückenreagenz zur kovalenten
Bindung des Brückreagenzes unmittelbar an Schwefelatome in dem Antigen bzw» dem Antikörper oder den Untergruppen
davon umsetzt und vor oder nach dieser Umsetzung das Brückenreagenz kovalent an ein wasserunlösliches Substrat
bindet.
909832/058 2
25. Verfahren gemäß Anspruch 24,
dadurch gekennzeichnet, daß man als Brückenreagenz ein solches mit einer terminalen Chloracetylgruppe verwendet,, wobei die Schwefelatome in dem Antigen bzw. dem Antikörper oder den F(ab')o~ Untergruppen davon zu Sulphhydrylgruppen reduziert werden und die Chloracetylgruppe des Brückenreagenzes mit den Sulphhydrylgruppen unter Ausbildung einer kovalenten Bindung zwischen dem Brückenreagenz und dem Antigen bzw. dem Antikörper oder den F(ab·)p~Uhtergruppen davon umgesetzt wird.
dadurch gekennzeichnet, daß man als Brückenreagenz ein solches mit einer terminalen Chloracetylgruppe verwendet,, wobei die Schwefelatome in dem Antigen bzw. dem Antikörper oder den F(ab')o~ Untergruppen davon zu Sulphhydrylgruppen reduziert werden und die Chloracetylgruppe des Brückenreagenzes mit den Sulphhydrylgruppen unter Ausbildung einer kovalenten Bindung zwischen dem Brückenreagenz und dem Antigen bzw. dem Antikörper oder den F(ab·)p~Uhtergruppen davon umgesetzt wird.
26. Verfahren gemäß Anspruch 24 oder 25» dadurch gekennzeichnet,
daß man als wasserunlösliches Substrat ein solches verwendet, das freie Aminogruppen enthält, und daß das
Brückenreagenz eine zweite terminale Gruppe enthält, die mit den freien Aminogruppen unter Ausbildung einer kovalenten
Bindung zwischen dem Brückenreagenz und dem Substrat reagiert und eine Umsetzung der zweiten terminalen Gruppe
mit freien Aminogruppen an dem Antigen bzw. dem Antikörper oder den F(abf)p-Untergruppen davon nicht eintritt.
27. Verfahren gemäß Anspruch 26,
dadurch gekennzeichnet, daß man als zweite terminale Gruppe eine Anhydridgruppe verwendet.
dadurch gekennzeichnet, daß man als zweite terminale Gruppe eine Anhydridgruppe verwendet.
28. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 25 bis 27, dadurch gekennzeichnet,
daß man als Brückenreagenz ein solches der Formel
0 C
CO W
O CH (0Vn NHCOCH2Cl
O CH (0Vn NHCOCH2Cl
verwendet, wobei η eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist.
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29. Verfahren gemäß Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet,
daß η 4 ist.
30. Verfahren zur Herstellung eines Reagenzes gemäß Anspruch 1 mit einem Gehalt an F(abf )p-Uhtergruppen,
dadurch gekennzeichnet, daß man ein Reagenz gemäß Anspruch 1 herstellt, in dem
ein Immunglobulin-G-Antikörper mit dem Brückenreagenz
verbunden ist, und dieses Reagenz mit Pepsin zur Abtrennung der F(c)-Untergruppen digeriert.
31. Verbindung der allgemeinen Formel
0 - CO - NH
CO — CH — (CH2)n — NHCOCH2Cl ,
worin η eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist»
32· Verbindung gemäß Anspruch 31,
dadurch gekennzeichnet^ daß η gleich 4 ist.
909832/0582
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