DE2905154A1 - Teilchenfoermige reagenzien fuer immunoassays - Google Patents
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Description
TECHNICON INSTRUMENTS CORPORATION, Tarrytown, N. Y., VStA
Teilchenförmige Reagenzien für Immunoassays
Die Erfindung "betrifft ein magnetisch anziehbares
Material,, das sich insbesondere zur Herstellung von teilchenförmigen,
magnetisch anziehbaren Reagenzien für analytische Zwecke eignet, sowie auf diese Weise hergestellte
Reagenzien und immunologische Bestimmungen (Assays) unter Verwendung dieser Reagenzien.
Bekanntlich lassen sich Antigene (und Haptene), Antikörper (und andere bindende Proteine) sowie weitere
Substanzen^ wie Arzneimittel 9 in Flüssigkeiten von beispielsweise
biologischer Herkunft, durch eine kompetitive Bindungsreaktion unter Verwendung eines markierten Reagenzes
bestimmenf wobei die Bestimmung (der Assay) dadurch
bewirkt wirdj, daß man entweder die Menge an Markierung
mißtj die in einem Komplex gebunden vorliegt^ oder diejenige, die in Lösung ungebunden geblieben ist«, Ein Beispiel
für ein derartiges Verfahren ist der bekannte Radioimmunoassajp
bei dem eine radioaktive Markierung verwendet wird©
Analoge Techniken sind unter Verwendung anderer Markierungen;, wie "beispielsweise von Enzymen und Fluorophoren9 bekannt.
Bei diesen Verfahren ist es im allgemeinen erfor·=
aerlichp entweder die gebildeten Komplexe oder das freie s
nicht gebundenes markierte Reagenz von dem Rest des Um
setzungsgemisches abzutrennen, um die Menge an Markierung
in einem der beiden Teile zu bestimmen» Diese Abtrennung läßt sich selten leicht durchführen und stellt daher bei
diesen Assays eine Fehlerquelle dar.
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Um diese Schwierigkeiten zu vermeiden oder zumindestens zu verringern, bedient sich ein Verfahren gemäß
der BE-PS 852 327 magnetisch anziehbarer Teilchen, die auf ihrer äußeren Oberfläche ein kovalent an diese gebundenes
Reagenz aufweisen. Die Teilchen können zusammen mit dem Umsetzungsprodukt zwischen dem Reagenz und einer
markierten Komponente aus dem Umsetzungsgemisch sauber und leicht von dem Rest des Reaktionsgemisches abgetrennt
werden, wonach die Markierung in diesem Rest oder auf den Teilchen selbst gemessen werden kann.
Eine Einschränkung oder ein Nachteil dieses Verfahrens, wie es bisher bekannt war, liegt in der Tatsache,
daß die Herstellung der das Reagenz tragenden magnetischen Teilchen häufig arbeits- und zeitaufwendig ist.
Die Teilchen bestehen aus magnetisch anziehbarem Material, das in einer Polymerisatmatrix eingebettet ist, wofür gewöhnlich
Cellulose verwendet wird, und um ein teilchenförmiges Reagenz daran zu binden, muß man die Cellulose zunächst
aktivieren und anschließend mit dem Reagenz umsetzen, wobei normalerweise eine bifunktionelle Brückengruppe
verwendet wird. Die als Zwischenprodukt auftretenden aktivierten Celluloseteilchen können nicht beliebig lange aufbewahrt
werden, so daß die beiden Herstellungsschritte (Aktivierung und anschließende Umsetzung) jedesmal neu
durchgeführt werden müssen.
Es wurde nun ein Weg zur Vermeidung dieser Schwierigkeiten gefunden. Insbesondere wurde ein lagerungsstabiles
reaktionsfähiges magnetisches Material gefunden, an das bestimmte Reagenzien in einem im wesentlichen einstufigen
Verfahren gebunden werden können.
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Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines selbstreagierendens magnetisch anzieh-Tbaren
Materials, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man. ein oder mehrere Monomere in Gegenwart magnetisch anziehbarer
Festkörperteilchen unter unmittelbarer Ausbildung einer synthetischen,, wasserunlöslichen Polymerisatmatrix,
in der die Festkörperteilchen gleichmäßig eingebettet sind, wobei das bzw. die Monomere derart ausgewählt wird
bzw. werden, daß die gebildete Matrix eine oder mehrere
Aldehyd-^ Keton-, Cyanat~, Isocyanate Thiocyanat-,, Isothiocyanat-f
mit Halogen und bzw. oder Nitrogruppen substituierte aromatische, s-Triazin-s aromatische SuIfonylchlorid-j,
Isoxazoi-,Aziridin-S Imin-j, Imid-, Carboxyl-,
Epoxid- und Säureanhydrid-Gruppen enthält, die frei sind, so daß sie unmittelbar mit einem Reagenz kuppeln können,
das mit ihnen reagieren kann, so daß das Reagenz an das Material gebunden wird.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin das auf diese Weise hergestellte magnetisch anziehbare Material,
das vorzugsweise in Teilchenform vorliegt.
Nach Inberührungbringen der Teilchen gemäß der Erfindung mit einem Reagenz, das reaktionsfähige Gruppen
trägt, und der geeigneten Umsetzungebedingungen, wird das Reagenz unmittelbar an die Teilchen gebunden.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein ,Verfahren
zur Herstellung eines teilchenförmigen, magnetisch anziehbaren Reagenzes zur Verwendung in Immunoassays, das
dadurch gekennzeichnet ist, daß man das erfindungsgemäße teilchenförmige Material mit einem Reagenz in Berührung
bringt, das unmittelbar mit den freien Gruppen in der Polymerisatmatrix der Teilchen reagieren kann, und man
diese Umsetzung zur Bindung des Reagenzes unmittelbar an die Polymerisatmatrix ablaufen läßt.
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2305154
Im folgenden werden diejenigen Teilchen gemäß der Erfindung, die ein an sie gebundenes Reagenz tragen als
"Reagenzteilchen gemäß der Erfindung" bezeichnet.
Von den verschiedenen möglichen freien Gruppen in der gebildeten Polymerisatmatrix sind die Aldehyd- und
Ketongruppen bevorzugt.
Bei einer stark bevorzugten Durchführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Polymerisatmatrix
unmittelbar durch Polymerisation von mindestens einem ethylenisch ungesättigten Monomeren hergestellt, das die
genannten Gruppen enthält, die in dem Polymerisat bleiben und die (anschließend) in der Lage sind, unmittelbar mit
den reaktionsfähigen Gruppen eines Reagenzes zu reagieren. Unter den bevorzugten Monomeren, die auf diese Weise polymerisiert
werden können, sind Acrolein, Methacrolein, Methacrylnitril, Acrylnitril, Dimethylketen, Acryloylchlorid,
Methacryloylchlorid, Acrylsäure und Methacrylsäure zu nennen.
Bevorzugt werden eines oder mehrere dieser Monomere (in Gegenwart von magnetisch anziehbarem festem Material)
derart polymerisiert, daß unmittelbar ein festes Polymerisat erzeugt wird, das nach geeigneter Abtrennung von dem
Umsetzungsgemisch und notwendigem Auswaschen fein zerkleinert
werden kann, damit die Teilchen gemäß der Erfindung erhalten werden. Eine derartige Polymerisation kann normalerweise
in Abwesenheit eines Lösungsmittels (d.h. als Substanzpolymerisation) unter Verwendung eines Katalysators
bzw. Initiators durchgeführt werden. Beispielsweise wird im Falle von Acrolein das monomere Acrolein mit
Ν,Ν,Ν1,N'-tetramethylendiamin vermischt, und es tritt rasch
eine Polymerisation unter Ausbildung eines festen Produktes ein. Im Falle von Acrylnitril wird außerdem Ammoniumpersulphat
zugesetzt, um die Reaktion zu beschleunigen.
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Weiterhin ist es bevorzugt, die Polymerisatmatrix durch Radikalpolymerisation von Acrolein in Gegenwart von
N»Ns,N«sN"-tetramethylendiamin herzustellen. Wenn auf diese
Weise Acrolein in Gegenwart von Fe-^O^ polymerisiert wirds
bildet sich leicht eine homogene Masse aus Substanzpolymerisat und Fe^O.. Diese Masse kann leicht zu kleinen
Teilchen vermählen werden.
Die Polymerisatmatrix und insbesondere die freien reaktionsfähigen Gruppen in ihr werden je nachdem ausgewähltj,
was für ein Reagenz an sie gekuppelt werden soll» Im allgemeinen enthält das Reagenz freie Amino- oder Sulphhydrylgruppen*
weshalb in diesen Fällen eine Aldehydgruppen enthaltende Polymerisatmatrix verwendet wird» Reagenzien,
die freie Aminogruppen enthalten^ sind beispielsweise Proteine,, wie beispielsweise Antikörper und Enzyme,
sowie bestimmte Antigene, Haptene, Arzneimittel und Antibiotika»
Beispiele für derartige Substanzen sind die Thyroidhormone T, und T^ (Thyroxin und Triizothyronin)',
die tricyclischen Antidepressiva (Nortriptylin9 Desipramin
und Protriptylin), die Aminoglycosid-Antibiotika
(Gentamicin Sisomycins Netilmicin, Amikacinj, Neomycin^
Streptomycins, Kanamycin und Tobramycin) „ Absorbentien mit
verschiedener Affinität für die Isolierung oder die Bestimmung von Antikörpern und anderen bindenden Proteinen^
sowie Zwischenprodukte bei der Herstellung von ersten Antikörpern in fester Phase, die zur Bestimmung des paarweise
verbundenen Haptens (conjugate hapten) verwendet werden.- sollene
Ein großer Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht
darin«, daß das Reagenz an die Teilchen gemäß der Erfindung durch ein ia wesentlichen einstufiges Verfahren
gebunden werden kann„ So kann das Reagenz beispielsweise einfach in einem Medium von geeignetem pH-Wert mit den
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Teilchen in Berührung gebracht werden. Polymerisatmatrices,
die freie Aldehydgruppen, enthalten, sind gegenüber freien Aminogruppen "selbstreagierend", und das Reagenz
wird somit mit der Matrix umgesetzt und unmittelbar an diese gebunden. Die auf diese Weise gebildeten Reagenzteilchen
gemäß der Erfindung sind anschließend gebrauchsfertig. Die Selbstreaktivität der Teilchen gemäß der Erfindung
ist ein sehr großer Vorteil, da sich durch sie die Notwendigkeit der Verwendung von Brückengruppen (beim
Stand der Technik) erübrigt; sie ist außerdem insgesamt ein einfacherer, schnellerer und wirksamerer Vorgang.
Die Teilchen gemäß der Erfindung und die Reagenzteilchen gemäß der Erfindung können eine beliebige Größe
besitzen, im allgemeinen ist es jedoch zweckmäßig, daß sie 1 bis 20 λχ groß sind. Insbesondere im Falle der Verwendung
in Verfahren mit kontinuierlichem Durchfluß sollte das spezifische Gewicht der Teilchen vorzugsweise etwa
1,4 bis 3,2 betragen, um ein übermäßiges Aufschwimmen oder Absetzen der Teilchen in dem strömenden flüssigen Reaktionsgemisch
zu vermeiden.
Die Teilchen gemäß der Erfindung (d.h. in dem Zustand, bevor das Reagenz an sie gebunden ist) können vor
ihrer Verwendung aufbewahrt werden. Wie dem Fachmann klar ist, müssen die Teilchen während der Aufbewahrungsdauer
von Substanzen ferngehalten werden, mit denen sie reagieren könnten. Alternativ kann die feste Masse aus selbstreagierender
Polymerisatmatrix, die die magnetischen Teilchen enthält, aufbewahrt werden, und wenn Teilchen benötigt
werden, können Teile der Masse zerkleinert werden, damit sie mit einem Reagenz umgesetzt werden können. So
können die Reagenzteilchen gemäß der Erfindung einfach und frisch unmittelbar vor ihrer Verwendung hergestellt
werden.
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Die Reagenzteilchen gemäß der Erfindung sind: be-
wenngleich nicht ausschließlich nützlich in Bestimmungen, (Assays) eines interessierenden Bestandteils
von Flüssigkeiten von Nutzen* Sie können auf diese Weise bei manuellen oder automatischen Bestimmungen mit kontinuierlichem
Durchfluß verwendet werden? wie sie beispielsweise in der US-PS 2 797 149 beschrieben sindo Sie können
dort verwendet werden«, wie beispielsweise in der BE-PS
852 327 beschrieben*
Gegenstand der Erfindung ist somit weiterhin ein ■
Verfahren zur Bestimmung eines Bestandteiles einer biologischen Flüssigkeitsprobe 9 das dadurch gekennzeichnet
ist, daß man die Probe mit Reagenzteilchen gemäß der Erfindung in Berührung bringt und die Teilchen magnetisch
abtrennt„
Gegenstand der Erfindung ist schließlich ein Analyseverfahrens
das dadurch gekennzeichnet ist,, daß man entlang einer Leitung ein Umsetzungsgesisch strömen läßt,
das aus einer flüssigen Phase mit einer einen zu bestimmenden Bestandteil enthaltenden flüssigen Probe und einer
festen Phase aus Reagenzteilchen gemäß der Erfindung besteht«, daß man in dem Gemisch eine Umsetzung ablaufen
läßt, xfofoei ein Bestandteil des Umsetzungsgemisches mit
der festen Phase reagiert oder selektiv an sie adsorbiert daß man die Teilchen in der Leitung magnetisch eins,
um sie gegen die Strömung zu halten und auf diese Weise die feste Phase von der strömenden flüssigen Phase
zu trennen«, und daß man stromabwärts davon die zu bestimmende Komponente in der Probe durch Analyse der abgetrennten
festen oder flüssigen Phase bestimmt«,
Eine bevorzugte Ausführungsform einer Analysevorrichtung zur Durchführung dieser Methode ist in der BE-PS
852 527 beschrieben.
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Die genaue Art und Weise, auf die die Reagenzteilchen bei biologischen Bestimmungen, wie Immunoassays,
wirken, hängt von der Art des Reagenzes ab, wie dem Fachmann klar ist. Beispielsweise kann in einem Immunoassay
auf ein Antigen unter Verwendung eines markierten Antigens und eines Antikörpers oder anderen bindenden Proteins
der Antikörper das Reagenz auf den Reagenzteilchen sein. Unter diesen Umständen bildet das Reagenz sowohl mit
markiertem als auch mit unmarkiertem Antigen Komplexe und kann nach Entfernung aus dem Reaktionsgemisch aufgrund der
Markierung bestimmt werden, oder das zurückbleibende Umsetzungsgemisch kann auf die Markierung hin bestimmt werden.
In einer bevorzugten Durchführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens enthält das Umsetzungsgemisch
(als zweites Reagenz) eine bestimmte Menge einer markierten Substanz, die mit der zu bestimmenden Komponente unter
Ausbildung eines Komplexes mit ihr reagiert, und das Reagenz auf den Reagenzteilchen gemäß der Erfindung bindet
sich an den Überschuß aus dem zweiten Reagenz, wonach das abgetrennte Gemisch analysiert wird, um die zu bestimmende
Komponente in der Probe zu bestimmen. Bei diesem Verfahren wird die Analyse entweder auf den Komplex oder auf den
nicht umgesetzten Überschuß des zweiten Reagenzes durchgeführt, wie es zweckmäßig ist. Die vorstehenden Beispiele
dienen lediglich der Erläuterung, und die vielseitige Einsetzbarkeit der Reagenzteilchen gemäß der Erfindung bei
verschiedenen unterschiedlichen Bestimmungsverfahren sind dem Fachmann klar.
Die folgenden weiteren Beispiele dienen ebenfalls der Erläuterung der Erfindung.
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Herstellung von Teilchen gemäß der Erfindung mit einem Gehalt an Polyacrolein
2 g Acrolein und 2 g magnetisierbares Eisen (II, Hl)-OxId
(Fe^O,) wurden bei Raumtemperatur kräftig miteinander vermischt
und das Gemisch mit 100/Ul ϊί,Ν,Ν',Ν'-tetramethylendiamin
versetzt und das Rühren etwa 6 bis 7 min fortgeführt, wonach Polymerisation eintrat und ein homogenes
festes Produkt erhalten wurde. Dieses Produkt wurde in einer elektrischen Kaffeemühle (Braun) zu feinem Granulat
vermählen« Weiteres Vermählen in einer Feinstmahlvorrichtung
(McCrone) während 250 min ergab ein stabiles selbstreagierendes
Produkt mit geeigneter Teilchengröße.
Herstellung von Teilchen gemäß der Erfindung
ml Acrylnitril und 2 g magnetisch anziehbares Eisen , III)-Oxid wurden bei Raumtemperatur kräftig miteinander
vermischt und das Ganze mit 100 /ul Ν,Η,ΙΡ, -N'-tet-ramethylendiamin
versetzt. Danach wurde 1 ml einer 33%igen (Gewicht/Volumen) AmmoniumpersulphatlSsung zugefügt* Nach
etwa 7 min trat Polymerisation ein* und man erhielt ein
homogenes festes Produkte Dieses Produkt wurde auf eine Teilchengröße von unter 1 mm zerstoßen und 72 h bei Raumtemperatur
an der Luft getrocknetβ Das Produkt mirde weiter
in einer Peinstmahlvorrichtung (McCrone) vermählen, wonach
man stabile, selbstreagierende Teilchen gemäß der Erfindung
erhielt.
3 5/0591
Kupplung von Anti-T^-Serum (T-Globulinf raktion)
an Teilchen gemäß der Erfindung.
1 g der Polyacrolein/Fe^O^-Teilchen gemäß Beispiel 1
■wurde viermal mit je 20 ml Wasser und anschließend zweimal
mit 0,1 m Natriumcarbonat/Bicarbonat-Puffer vom pH 9,0
gewaschen. Eine Suspension der Teilchen in dem Puffer wurde auf ein Volumen von 14 ml gebracht. Die Kupplung wurde
durchgeführt, indem man 1 ml Anti-T^-Serum (T -Globulinfraktion)
der Teilchensuspension zusetzte und das Ganze 24 h bei 4 0C leicht vermischte. Die Teilchen wurden anschließend
auf einem mehrpoligen Ferritmagneten absetzen gelassen und die überstehende Flüssigkeit entfernt. Die
auf diese Weise hergestellten Reagenzteilchen wurden dreimal mit dem Bicarbonat/Carbonat-Puffer und anschließend
zweimal mit 0,05 m Phosphatpuffer vom pH 7,4 gewaschen. Schließlich wurde das Volumen der Suspension mit
Phosphatpuffer auf 20 ml gebracht.
Kupplung von Antidigoxin-Serum ( T -Globulinfraktion)
Es wurde das gleiche Verfahren, wie in Beispiel 3 beschrie ben, durchgeführt mit der Abweichung, daß anstelle von
Anti-T^-Serum 1 ml. Antidigoxin-Serum (T-Globulinfraktion)
verwendet wurde.
Kupplung von Anti-HPL (lactogenes Hormon der menschlichen Placenta)-Serum (f-Globulinfraktion) an Teilchen gemäß
Es wurde, wie in Beispiel 3 beschrieben, gearbeitet mit der Abweichung, daß anstelle des Anti-T^-Serums 1 ml Anti-HPL-Serum
(Tf-Globulinfraktion) verwendet wurde.
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Kupplung von Antidigoxinserum (%* ~Globulinfraktion)
1 g der Teilchen gemäß Beispiel 2 wurde viermal mit ^e
20 ml Wasser und danach zweimal mit 0,1 m Natriumcarbonat/ Bicarbonat-Puffer vom pH 9,0 gewaschen. Die Suspension der
Teilchen in der Pufferlösung wurde auf ein Volumen von 14 ml gebracht. Die Kupplung wurde durchgeführt, indem
man 1 ml Aiitidigoxinserum (ΐΓ-Globulinfraktion) zu der
Teilchensuspension hinzufügte und das Ganze 24 h bei 4 0C
leicht vermischte. Die Reagenzteilchen, die auf diese
Weise hergestellt wurden, wurden danach auf einem mehrpoligen Ferritmagneten absitzen gelassen, wonach die
überstehende Flüssigkeit entfernt wurde. Die Teilchen wurden dreimal mit dem Bicarbonat/Carbonat-Puffer und anschließend
zweimal mit 0,05 m Phosphatpuffer vom pH 7,4 gewaschen» Schließlich wurde das Volumen der Suspension
mit Phosphatpuffer auf 20 ml ergänzt.
Manueller Radioimmunoassay von Ta unter Verwendung
der inti-TA-Polyacrolein/Fe-zO^-Reagenzteilchen
Intikörperverdünnungskurven: Das Verdünnungsmittel für
sämtliche Assays war 0,05 m Phosphatpuffer vom pH 7,4. Es wurde eine Verdünnungsreihe aus der Suspension der
Reagenzteilchen hergestellts 5, 2,5, 1,25, 0,625,
Qf312„ 0156 g Matrix je 100 ml Suspension. Danach wurde
121S
eine T^- I-Indikatorlösung hergestellt, so daß 500 cps in 50/Ul erzielt wurden. Der Indikatorlösung wurde in einem Verhältnis von 8/Ug/ml Serumprobe 8-Anilin-1-naphthalinsulphonsäure zugesetzt» Die Verdünnungskurven wurden durch Vermischen der Reagenzien in der folgenden Reihenfolge und in den folgenden Mengen aufgestellt.
eine T^- I-Indikatorlösung hergestellt, so daß 500 cps in 50/Ul erzielt wurden. Der Indikatorlösung wurde in einem Verhältnis von 8/Ug/ml Serumprobe 8-Anilin-1-naphthalinsulphonsäure zugesetzt» Die Verdünnungskurven wurden durch Vermischen der Reagenzien in der folgenden Reihenfolge und in den folgenden Mengen aufgestellt.
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Kurve für die maximale Bindung:
(I) Serum T^ frei 50/
(II) T^- -5I-Indikatorlösung (im Verdünnungsmittel
für den Assay) 50/
(III) Anti-Tjjj-Reagenzteilchensuspension
(Beispiel 3) bei den oben aufgeführten
Verdünnungen . 50 All
Kurve für die obere Standardbindung (top standard binding
curve):
(I) Oberer Standard im T^-freien Serum
(400 nMol/1) 50 ,ul
(II)·T4-125I-Indikatorlösung 50/
(III) Anti-ΪΛ-Reagenzteilchensuspension
(Beispiel 3) 50 /
Kurve für die unspezifische Bindung (non-specific binding curve):
(I) 2Ofache Konzentration des oberen Standards
(8 /uMol/1) in T^-freiem Serum 50/
(II) T4-125I-Indikator-Lösung 50/
(III) Anti-T^-Reagenzteilchensuspension
(Beispiel 3) 50/
Die Röhrchen wurden bei Raumtemperatur über Nacht bebrütet. Die Teilchen aus fester Phase wurden auf einem
Ferritmagneten absitzen gelassen und die überstehende Lösung verworfen. Die Teilchen wurden dreimal mit dem
für den Assay bestimmten Verdünnungsmittel gewaschen und schließlich mit einer Wilj-Apparatur gezählt. Die Ergebnisse
sind in Fig. 1 dargestellt.
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Manueller Radioimmunoassay von Digoxin unter Verwendung
der Antidigoxin-Polyacrolein/Fe^O^-Reagenzteilchen
Antikörperverdünnungskurven: Eine Verdünnungsreihe wurde
mit der Antikörper-Reagenzteilchen-Suspension wie folgt hergestelltσ 5, 2,5, 1,25, 0,625, 0,312, 0,156,
0,078 g Teilchen je 100 ml Suspension» Ferner wurde eine
125
Digoxin- I-Indikatorlösung hergestellt, so daß in 50/ul 500 cps erzielt wurden» Die Verdünnungskurven wurden hergestellt, indem man die Reagenzien in der folgenden Reihenfolge und in den folgenden Mengen miteinander vermischte.
Digoxin- I-Indikatorlösung hergestellt, so daß in 50/ul 500 cps erzielt wurden» Die Verdünnungskurven wurden hergestellt, indem man die Reagenzien in der folgenden Reihenfolge und in den folgenden Mengen miteinander vermischte.
(I) Plasma 200/ul
Kurve der maximalen Bindung:
(I) Plasma
(I) Plasma
(II) Digoxin-125I-Indikatorlösung 50/
(III) Antidigoxinreagenzteilchensuspension
(Beispiel 4) . 50 ,ul
Kurve der oberen Standardbindung:
(I) Oberer Standard 8 nMol/1 in Plasma 200 au.
(II) Digoxin-125I-Indikatorlösung 50,ul
(III) Antidigoxin-Reagenzteilchensuspension
(Beispiel 4) 50 ,ul
Kurve der nichtspezifischen Bindungs
(I) 2Ofache obere Standardkonzentration (160 nMol/l)
in Plasma 200/ul
(II) Digoxin»125I-Indikatorlösung 50/ul
(III) Antidigoxinreagenzteilchensuspension
(Beispiel 4) 50/ul
Die Röhrchen xrarden bei Raumtemperatur über Macht bebrütet»
Die Festphasenteilchen wurden auf einem Ferrit— magneten absitzen gelassen und die überstehende Flüssigkeit
verworfen. Die Teilchen wurden dreimal mit dem für den Assay verwendeten Verdünnungsmittel gewaschen und
schließlich mit Hilfe eines Wilj-Apparates gezählt» Die
Ergebnisse sind in F^e. 2
Manueller Radioimniunoassay von HPL (lactogenes Hormon der
menschlichen Placenta) unter Verwendung der Anti-HPL-Polyacrolein/Fe.,0.-Reagenzteilchen
Antikörperverdünnungskurven: Eine Verdünnungsreihe wurde aus der Antikörper-Reagenzteilchensuspension wie folgt
hergestellt: 5, 2,5, 1,25, 0,625, 0,313 g Teilchen je
125
100 ml Suspension. HPL- I-Indikatorlösung wurde hergestellt,
so daß 500 cps in 50 /Ul erzielt wurden. Die Verdün
nungskurven wurden aufgestellt, indem man die Reagenzien in der folgenden Reihenfolge und in den folgenden Mengen
miteinander vermischte:
Kurve der maximalen Bindung;
(I) Männer-Serum 50 /
(II) HPL-125I-Indikatorlösung 50 /
(III) Anti-HPL-Reagenzteilchensuspension bei den
oben angegebenen Verdünnungen . 50/
Kurve der oberen Standardbindung:
(I) Oberer Standard (12/ug/ml) 50/
(II) HPL-125I-Indikatorlösung 50/
(III) Anti-HPL-Reagenzteilchensuspension 50/
Kurve der unspezifischen Bindung:
(I) 2Ofache obere Standardkonzentration
(240/ug/ml) 50/
(II) HPL-125I-Lösung 50
/ (III) Anti-HPL-Reagenzteilchensuspension 50/Ul
Die Röhrchen wurden bei Raumtemperatur über Nacht bebrütet. Die Festphasenteilchen wurden auf einem Ferritmagneten absitzen
gelassen und die überstehende Lösung verworfen. Die Teilchen wurden dreimal mit dem für den Assay verwendeten
Verdünnungsmittel gewaschen und schließlich mit einem WiIj-Gerät
gezählt. Die Ergebnisse sind in Fig. 3 dargestellt. Die Antikörperverdünnungskurven der Fig. 1 bis 3 zeigen,
daß die Antiseren gegenüber T^, HPL und Digoxin ihre Immun-
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reaktivität beibehalten, wezin sie kovalent an das PoIyacroleln
gebunden worden sind.
Beispiel 10 . "
Automatischer Radioiiainunoassay von HPL (lactogenes Hormon
der menschlichen Placenta) unter Verwendung der" Anti-HPL-Polyacrolein/Fe^O^-Reagenzteilchen
Die in Beispiel 9 angegebenen Reagenzien wurden in einem automatischen Gerät mit kontinuierlichem Durchfluß
(BE-PS 852 327) verwendet, wobei eine on-line-Bebrütung
des strömenden diskreten Assaygemisches während 10 lain und
anschließend eine magnetische Abtrennung der Reagenzteilchen von dem Gemisch angewandt wurden. Die abgetrennten
Teilchen;, die nunmehr die an die Antikörper gebundene Fraktion
des lactogenen Hormons der menschlichen Placenta trugen«, wurden anschließend durch einen Gammazähler strömen
gelassen, wonach die Zählungen aufgezeichnet warden., Diese Daten wurden dazu verwendet, um eine Standardkurve herzustellen,
aus der die unbekannten Konzentrationen an HPI, in den zu untersuchenden Proben durch Interpolation gefunden
wurden.
yerdünnungsmittel-Püffer
O1,05m Phosphatpuffer vom pH 7,4 mit einem Gehalt an 0,25%
Tween 20, 0,1% Natrlumazid und O5 25% Rinderserumalbumin.
HPL-Standards (50 #ul
!formales Männer serum · wurde mit reinem lactogenen. Hormon
der menschlichen Placenta versetzt (spiked), so daß Konzentrationen von 0, 1, 2/4, 6, 8, 10f 12/ug/ml erhalten wurden,
HPL-125I-Indikator (50/ul)
Die hergestellte Indikatorvorratslösung wurde mit Pufferlösung verdünnt, so daß eine Gesamtzählung von 1700 cps
je 50/Ul erzielt wurde.
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Anti-HPL-Polyacrolein/Fe^O^-Teilchensuspension ( 50/Ul)
Diese Suspension wurde in einer Konzentration von 0,625 mg je 50/Ul Pufferverdiinnung verwendet. Die Standardkurve,
die durch Auftragen der Zählungen in Form von C./C % gegen den Logarithmus der Konzentrationen der Standards
erhalten wurde, ist in Fig. 4 dargestellt. Unbekannte Werte wurden in der üblichen Weise aus der Standardkurve
abgelesen.
Es bedeuten: CQ = Anzahl der Zählungen, wenn keine
Bindung eintritt, d.h. die maximal erzielbare Zählung,
C^ = Anzahl der Zählungen bei Verwendung
des Standards i.
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Claims (16)
- TECHNICON INSTRUMENTS CORPORATION» Tarrytowiip' N.Y., VStAPatentansprüche1 ο Verfahren zur Herstellung eines selbstreagierendeSr, magnetisch anziehbaren MaterialsP
dadurch geken n.z eiciinetj, daß man eines oder mehrere Monomere in Gegenwart magnetisch anziehbarer Feststoffe unter unmittelbarer Ausbildung einer synthetischen^ wasserunlöslichen Polymer!satmatrix, in der die Festkörper gleichmäßig eingebettet sind» polymerisierts xfobei das Monomere bzw. die Monomere derart ausgewählt wird bzw. werden, daß die gebildete Matrix eine oder mehrere Aldehyd-, Keton-, Cyanat-S Isocyanatej, Thiocyanate Isothiocyanat-f halogen^nitro-aromatische, s-Triazin-, aromatische SulphonylChlorid-f Isoxazol™, Aziridin-, Imin-, Imid-, Carboxyl, Epoxid- und Säureanhydrid-Gruppen enthält bzw« enthalten,, die frei sind, so daß sie unmittelbar mit einem Reagenz kuppeln können, das mit ihnen zu reagieren vermag, so daß das Reagenz an das Material gebunden wird» - 2. Verfahren gemäß Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, daß man als das bzw. jedes Monomere ein ethylenisch ungesättigtes Monomeres verwendet, das eine oder mehrere der genannten Gruppen enthält und daß man die Polymerisation über die ethylen!sehe Doppelbindung bewirkt und die Gruppen als solche in der auf diese Weise gebildeten Polymerisatmatrix erhalten bleiben.909835/0593 - 3. Verfahren gemäß Anspruch 2,
dadurch gekennzeichnet, daß man als das oder jedes Monomere Acrolein, Methacrolein, Methacrylnitril, Acrylnitril, Dimethylketen, Acryloylchlorid, Methacryloylchlorxd, Acrylsäure oder Methacrylsäure verwendet. - 4. Verfahren gemäß Anspruch 29
dadurch gekennzeichnet, daß man die Polymerisation als Substanzpolymerisation in Gegenwart eines Katalysators und bzw. oder Initiators durchführt. - 5. Verfahren gemäß Anspruch 4,
dadurch gekennzeichnet, daß man Acrolein oder Acrylnitril in Gegenwart von NjNjN'jN'-tetramethylendiamin in Masse polymerisiert. - 6. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man nach der Polymerisation die gebildete Polymerisatmatrix zu Teilchen zerkleinert.
- 7. Verfahren gemäß Anspruch 6,
dadurch gekennzeichnet, daß man die Zerkleinerung zu Teilchen von einer Größe von 1 bis 20/U und von einem spezifischen Gewicht von 1,4 bis 3,2 vornimmt. - 8. Selbstreagierendes, magnetisch anziehbares Material, hergestellt nach dem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5.
- 9. Teilchenförmiges, selbstreagierendes, magnetisch anziehbares Material, hergestellt nach dem Verfahren gemäß Anspruch 6 oder 7.90983 5/0 5 93
- 10» Verfahren zur Herstellung eines teilchenförmigen, magnetisch anziehbaren Reagenzes zur Verwendung bei Immunoassays,dadurch gekennzeichnet,, daß man teilchenförmiges Material gemäß Anspruch 9 mit einem Reagenz in Berührung bringt«, das unmittelbar mit den freien Gruppen in der Polymerisatmatrix der Teilchen reagiertj, und diese Umsetzung ablaufen läßts um das Reagenz unmittelbar an die Polymerisatmatrix zu binden»
- 11. Verfahren gemäß Anspruch 1Oj,
dadurch gekennzeichnet^ daß man als teilchenförmiges Material gemäß Anspruch 9 solches verwendet^ das freie Aldehydgruppen enthält, und daß man als Reagenz ein solches verwendet, das freie Amino- oder Sulphhydrylgruppen enthält und ein Protein, Antigen,, Hapten oder Enzym ist„ - 12. Teilchenförmigesj, magnetisch anziehbares Reagenz, hergestellt nach dem Verfahren gemäß Anspruch 10 oder
- 13. Reagenz gemäß Anspruch 12j,
dadurch gekennzeichnet, daß es in einer wäßrigen Flüssigkeit suspendiert ist. - 14. Verfahren zur Bestimmung eines Bestandteiles in einer Flüssigkeit,dadurch gekennzeichnet, daß man die Flüssigkeit mit einem teilchenförmigen Reagenz gemäß Anspruch 12 oder 13 in Berührung bringt und anschließend das teilchenförmige Reagenz aus der Flüssigkeit magnetisch abtrennt.9 0 9 S 3 5/0593
- 15. Verfahren zur Bestimmung eines Bestandteils einer Flüssigkeit,dadurch gekennzeichnet, daß man ein Umsetzungsgemisch aus einer flüssigen Phase, die eine Probe der Flüssigkeit enthält, und einer festen Phase, die teilchenförmiges Reagenz gemäß Anspruch 12 enthält, eine Leitung entlangströmen läßt, wobei in dem Gemisch zwischen dem Reagenz und einem oder mehreren anderen Bestandteilen des Gemisches eine Umsetzung stattfindet, wodurch die Komponente selektiv an die Teilchen gebunden wird, daß man die Teilchen in der Leitung' magnetisch einfängt, um sie gegen die Strömung festzuhalten und auf diese Weise die feste Phase von der strömenden flüssigen Phase zu trennen,und daß man stromabwärts davon den zu bestimmenden Bestandteil in der Probe durch Analyse der abgetrennten festen Phase oder flüssigen Phase bestimmt.
- 16. Verfahren gemäß Anspruch 14,
dadurch gekennzeichnet, daß man das Verfahren diskontinuierlich manuell (on a discrete manual basis) durchführt.90983 5/0 593
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