CN110726834A - 总甲状腺素检测试剂盒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种总甲状腺素检测试剂盒及其应用，涉及生物技术领域。所述总甲状腺素检测试剂盒包括校准品、质控品、抗试剂、磁微粒试剂和发光底物，其中，所述抗试剂的制备步骤为：将总甲状腺素抗原与异硫氰酸荧光素偶联，总甲状腺素抗体与碱性磷酸酯酶偶联，分别获得异硫氰酸荧光素标记的总甲状腺素包被抗原和碱性磷酸酶标记的总甲状腺素包被抗体，将异硫氰酸荧光素标记的总甲状腺素包被抗原和碱性磷酸酶标记的总甲状腺素标记抗体加入抗试剂缓冲液中，充分搅拌；所述磁微粒试剂的制备步骤为：清洗羧基磁珠，将异硫氰酸荧光素抗体与羧基磁珠偶联，清洗并保存。本发明既能提高检测灵敏度及可靠性，又能降低成本。

Description

总甲状腺素检测试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种总甲状腺素检测试剂盒及其应用。
背景技术
四碘甲腺原氨酸(Tetraiodothyronine，T4)是甲状腺分泌的主要激素，分子量为777，半衰期为6-7天，是通过甲状腺球蛋白酪氨酸残基的碘化合成的，经过酶解从甲状腺球蛋白解离进入血液循环，T4的形成和释放受到促甲状腺激素(Thyroid StimulatingHormone，TSH)的调节。
血浆中大部分三碘甲状腺原氨酸(Triiodothyronine，T3)是由T4在外周组织中经5’脱碘作用代谢而来，虽然T3是比T4更具有活性的甲状腺激素，但T4在血清中循环的含量远远超过T3。T4和T3都起着调节体内的各种生化过程的作用，对正常的生理代谢和神经系统活性是必须的。
T4在体内循环中大部分与蛋白质结合，只有0.04％的T4处于游离状态，目前认为游离的T4才具有生物学活性。与蛋白质结合的T4与游离的激素保持动态平衡，保证甲状腺的正常功能。T4结合蛋白主要有甲状腺结合球蛋白(TBG)、前白蛋白及白蛋白，分别占到了大约60％、30％和10％。T4的水平会随着TBG浓度的改变而变化，例如，怀孕或服用避孕药，长期肝炎和胆硬化等会增加TBG的水平，肾病和雄激素治疗等则会降低。
血清总甲状腺素(TT4)的浓度与甲状腺功能有密切的关系，TT4的检测是评估甲状腺功能和病理状态的一个重要的临床指标，为确保甲状腺功能诊断的准确性，TT4应该同TSH、游离T4、TT3和游离T3等激素联合检测。
因此，有待开发对总甲状腺素TT4检测灵敏度高与可靠性并能降低检测成本的检测技术。
发明内容
本发明提供一种既能提高检测灵敏度及可靠性，又能降低成本的总甲状腺素检测试剂盒及应用。
为解决上述技术问题，本发明提供技术方案如下：
一种总甲状腺素检测试剂盒，包括校准品、质控品、抗试剂、磁微粒试剂和发光底物，其中，
所述抗试剂的制备步骤为：将总甲状腺素抗原与异硫氰酸荧光素偶联，总甲状腺素抗体与碱性磷酸酯酶偶联，分别获得异硫氰酸荧光素标记的总甲状腺素包被抗原和碱性磷酸酶标记的总甲状腺素标记抗体，将异硫氰酸荧光素标记的总甲状腺素包被抗原和碱性磷酸酶标记的总甲状腺素标记抗体加入抗试剂缓冲液中，充分搅拌；
所述磁微粒试剂的制备步骤为：清洗羧基磁珠，将异硫氰酸荧光素抗体与羧基磁珠偶联，清洗并保存。
进一步的，所述异硫氰酸荧光素标记的总甲状腺素包被抗原的制备步骤进一步为：
制备第一溶液，所述第一溶液的组分为吡啶、三乙基胺和纯化水；
分别将总甲状腺素抗原和异硫氰酸荧光素加入第一溶液中，搅拌至完全溶解，分别获得总甲状腺素抗原溶液和异硫氰酸荧光素溶液；
将总甲状腺素抗原溶液和异硫氰酸荧光素溶液充分混匀，室温放置0.5～1小时，充分反应后进行纯化，最终得到异硫氰酸荧光素标记的总甲状腺素包被抗原。
进一步的，所述碱性磷酸酶标记的总甲状腺素标记抗体的制备步骤进一步为：
将碱性磷酸酶加入抗试剂缓冲液中，配置碱性磷酸酶溶液，使碱性磷酸酶溶液的最终浓度为1.0～5.0mg/mL；
将摩尔比为1:2～1:10的碱性磷酸酶溶液和总甲状腺素抗体充分混匀4～5小时，充分反应后加入PH值为8～9的碳酸氢盐缓冲液进行平衡，然后凝胶层析分离纯化，最终得到碱性磷酸酶标记的总甲状腺素标记抗体。
进一步的，所述磁微粒试剂的制备步骤进一步为：
步骤1：对羧基磁珠浓缩液进行磁场分离，待羧基磁珠沉降后弃上清；
步骤2：向所述步骤1得到的溶液中加入2～5倍于羧基磁珠体积的磁微粒缓冲液，震荡清洗20～30min；
步骤3：对所述步骤2得到的溶液进行磁场分离，待羧基磁珠沉降后弃上清，最后得到10～50mg/mL的羧基磁珠溶液；
步骤4：将质量比为100:1的羧基磁珠溶液和异硫氰酸荧光素抗体充分混匀反应18h；
步骤5：对所述步骤4得到的溶液进行磁场分离，待羧基磁珠沉降后使用磁微粒缓冲液清洗，最后得到10mg/mL的磁微粒试剂。
进一步的，所述发光底物的组分为APS-5和发光底物缓冲液，体积比为1:4～1：10，其中，
所述发光底物缓冲液的组分及含量为：Tris缓冲液12.12～121.14g/L，氯化钠5.82g/L，光泽精0.03g/L。
进一步的，所述抗试剂缓冲液的组分及含量为：
Figure BDA0002177772460000031
进一步的，所述校准品和质控品的制备步骤为：使用校准品缓冲液溶解总甲状腺素，得到0nmol/L、60nmol/L、88nmol/L、140nmol/L、200nmol/L和400nmol/L的校准品以及88nmol/L、200nmol/L的质控品，其中，
所述校准品缓冲液的组分及含量为：血清500g/L，四环素0.01～0.05g/L，硫酸新霉素0.1～0.5g/L。
进一步的，所述总甲状腺素检测试剂盒还包括清洗液，所述清洗液的组分及含量为：
Figure BDA0002177772460000041
一种上述任一所述的总甲状腺素检测试剂盒作为体外诊断试剂的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明的检测试剂盒以异硫氰酸荧光素和碱性磷酸酶为标记酶，通过化学反应标记抗体，提高了反应的灵敏度；
2、本发明的检测试剂盒以异硫氰酸荧光素抗体与羧基磁珠偶联制得磁微粒试剂，使免疫反应更容易混匀和分离，而且大大提高了反应速度；
3、本发明的检测试剂盒稳定性良好，有效期可至一年以上；
4、本发明的检测试剂盒在临床研究中与国外进口试剂的符合相关性高达99％以上，且费用仅为其1/5，大大降低了成本。
附图说明
图1为采用本发明的总甲状腺素检测试剂盒的标准曲线；
图2为采用本发明实施例1的总甲状腺素检测试剂盒的相关性曲线；
图3为采用本发明实施例2的总甲状腺素检测试剂盒的相关性曲线；
图4为采用本发明实施例3的总甲状腺素检测试剂盒的相关性曲线。
具体实施方式
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体实施例及附图进行详细描述。
需要说明的是，实施例中所用各试剂材料均可商购获得，所用各仪器设备也是所属领域的现有仪器设备，未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照制造商所建议的条件。
实施例1
本实施例的总甲状腺素检测试剂盒的制备：
1、各缓冲液的制备
1)校准品缓冲液的制备
在1L新生牛血清中加入0.01g四环素和0.1g硫酸新霉素，充分溶解后经过0.22um滤膜处理，得到校准品缓冲液。
2)抗试剂缓冲液的制备
将12.12mg的Tris、0.01g的四环素、1g的羊血清、3g的牛血清、1g的马血清加入1L纯化水中，充分搅拌至完全溶解，得到抗试剂缓冲液。
3)Tris盐缓冲液的制备
将12.12mg的Tris、5.82mg的氯化钠加入1L纯化水中，充分搅拌至完全溶解，使用盐酸调整得到PH值为8.0的Tris盐缓冲液。
4)磁微粒缓冲液的制备
将12.12mg的Tris缓冲液、5.82mg的氯化钠、50g的甲基纤维醚加入1L纯化水中，充分搅拌至完全溶解，得到磁微粒缓冲液。
5)发光底物缓冲液的制备
将12.12g的Tris、5.82g的氯化钠、0.03g的光泽精加入1L纯化水中，充分搅拌至完全溶解，使用盐酸调整得到PH值为9.5的发光底物缓冲液。
6)清洗液的制备
将12.12g的Tris、5.82g的氯化钠、50mL的Tween-20、50mL的曲拉通-100加入1L纯化水中，充分搅拌至完全溶解，得到清洗液。
2、校准品和质控品的制备
使用校准品缓冲液溶解总甲状腺素，配置成如表1所示的目标浓度的校准品和质控品，本实施例所用的总甲状腺素采购自厂家fitzgerald公司。
表1：校准品和质控品的浓度
Figure BDA0002177772460000061
3、抗试剂的制备
1)异硫氰酸荧光素标记的总甲状腺素包被抗原的制备
首先向一个试管中加入1mL的吡啶、0.2mL的乙三基胺和0.1mL的纯化水，混匀得到第一溶液；
分别使用两个试管称量5mg的总甲状腺素抗原和5mg的异硫氰酸荧光素，之后分别向两个盛有总甲状腺素抗原和异硫氰酸荧光素的试管中加入0.3mL的第一溶液，搅拌至完全溶解；向盛有总甲状腺素抗原的试管中加入0.2mL的异硫氰酸荧光素溶液搅拌至完全溶解，室温放置30min；
使用高效液相色谱仪将上述溶液进行纯化得到异硫氰酸荧光素标记的总甲状腺素包被抗原。
2)碱性磷酸酶标记的总甲状腺素标记抗体的制备
首先用抗试剂缓冲液将碱性磷酸酶配制成浓度为2.5mg/mL的碱性磷酸酶溶液，按照碱性磷酸酶与总甲状腺素抗体的摩尔比为1:2的量将二者转移至棕色瓶中，室温下搅拌4小时，充分反应后使用pH＝8的缓冲液平衡，之后进行凝胶层析分离纯化，得到碱性磷酸酶标记的总甲状腺素标记抗体；
3)将获得的异硫氰酸荧光素标记的总甲状腺素包被抗原和碱性磷酸酶标记的总甲状腺素标记抗体分别加入含有0.1％Tween20的Tris盐缓冲液中，充分搅拌后获得抗试剂。
4、磁微粒试剂的制备
将异硫氰酸荧光素抗体与羧基磁珠偶联制得磁微粒试剂，具体如下：
1)羧基磁珠溶液的制备：取10mL充分混匀后的羧基磁珠浓缩液置于磁场15min，待羧基磁珠全部沉降后吸去上清；之后加入5倍于羧基磁珠体积的磁微粒缓冲液，震荡清洗20min；将清洗后的溶液置于磁场15min，待羧基磁珠沉降后吸去上清；重复清洗羧基磁珠3遍，最后将羧基磁珠溶液定容到10mg/mL；
2)连接反应：按照羧基磁珠溶液与异硫氰酸荧光素抗体的质量比为100:1的比例，在羧基磁珠溶液中加入异硫氰酸荧光素抗体，在2～8℃内保持混匀状态反应18小时；
3)将步骤2)获得的溶液置于磁场15min，待羧基磁珠沉降后用磁微粒缓冲液清洗羧基磁珠3次，最后将羧基磁珠定容至10mg/mL，在2～8℃环境下保存，制得所需待用磁微粒试剂。
5、发光底物的制备
使用7倍于APS-5体积的发光底物缓冲液充分溶解APS-5，得到发光底物。
6、将上述校准品、质控品、抗试剂、磁微粒试剂、发光底物和清洗液分装并密封保存，即得到总甲状腺素检测试剂盒。
实施例2：
本实施例的总甲状腺素检测试剂盒的制备：
1、各缓冲液的制备
1)校准品缓冲液的制备
在1L新生牛血清中加入0.03g四环素和0.3g硫酸新霉素，充分溶解后经过0.22um滤膜处理，得到校准品缓冲液。
2)抗试剂缓冲液的制备
将35.62mg的Tris、0.03g的四环素、3g的羊血清、6g的牛血清、3g的马血清加入1L纯化水中，充分搅拌至完全溶解，得到抗试剂缓冲液。
3)Tris盐缓冲液、磁微粒缓冲液和清洗液浓缩液的制备同实施例1。
4)发光底物缓冲液的制备
将70.35g的Tris、5.82g的氯化钠、0.03g的光泽精加入1L纯化水中，充分搅拌至完全溶解，使用盐酸调整得到PH值为9.5的发光底物缓冲液。
2、校准品和质控品的制备
同实施例1。
3、抗试剂的制备
1)异硫氰酸荧光素标记的总甲状腺素包被抗原的制备
首先向一个试管中加入0.5mL的吡啶、0.1mL的乙三基胺和0.1mL的纯化水，混匀得到第一溶液；
分别使用两个试管称量3mg的总甲状腺素抗原和3mg的异硫氰酸荧光素，之后分别向两个盛有总甲状腺素抗原和异硫氰酸荧光素的试管中加入0.2mL的第一溶液，搅拌至完全溶解；向盛有总甲状腺素抗原的试管中加入0.1mL的异硫氰酸荧光素溶液搅拌至完全溶解，室温放置30min；
使用高效液相色谱仪将上述溶液进行纯化得到异硫氰酸荧光素标记的总甲状腺素包被抗原。
2)碱性磷酸酶标记的总甲状腺素标记抗体的制备
首先用抗试剂缓冲液将碱性磷酸酶配制成浓度为2.5mg/mL的碱性磷酸酶溶液，按照碱性磷酸酶与总甲状腺素抗体的摩尔比为1:6的量将二者转移至棕色瓶中，室温下搅拌5小时，充分反应后使用pH＝8.5的缓冲液平衡，之后进行凝胶层析分离纯化，得到碱性磷酸酶标记的总甲状腺素标记抗体；
3)将获得的异硫氰酸荧光素标记的总甲状腺素包被抗原和碱性磷酸酶标记的总甲状腺素标记抗体分别加入含有0.2％Triton X-100的Tris盐缓冲液中，充分搅拌后获得抗试剂。
4、磁微粒试剂的制备
将异硫氰酸荧光素抗体与羧基磁珠偶联制得磁微粒试剂，具体如下：
1)羧基磁珠溶液的制备：取10mL充分混匀后的羧基磁珠清洗浓缩液置于磁场15min，待羧基磁珠全部沉降后吸去上清；之后加入2倍于羧基磁珠体积的磁微粒缓冲液，震荡清洗20min；将清洗后的溶液置于磁场15min，待羧基磁珠沉降后吸去上清；重复清洗羧基磁珠3遍，最后将羧基磁珠溶液定容到10mg/mL；
2)连接反应：按照羧基磁珠溶液与异硫氰酸荧光素抗体的质量比为100:1的比例，在羧基磁珠溶液中加入异硫氰酸荧光素抗体，在2～8℃内保持混匀状态反应18小时；
3)将步骤2)获得的溶液置于磁场15min，待羧基磁珠沉降后用磁微粒缓冲液清洗羧基磁珠3次，最后将羧基磁珠定容至10mg/mL，在2～8℃环境下保存，制得所需待用磁微粒试剂。
5、发光底物的制备
使用4倍于APS-5体积的发光底物缓冲液充分溶解APS-5，得到发光底物。
6、将上述校准品、质控品、抗试剂、磁微粒试剂、发光底物和清洗液分装并密封保存，即得到总甲状腺素检测试剂盒。
实施例3
1、各缓冲液的制备
1)校准品缓冲液的制备
在1L新生牛血清中加入0.05g四环素和0.5g硫酸新霉素，充分溶解后经过0.22um滤膜处理，得到校准品缓冲液。
2)抗试剂缓冲液的制备
将60.57mg的Tris、0.05g的四环素、5g的羊血清、10g的牛血清、5g的马血清加入1L纯化水中，充分搅拌至完全溶解，得到抗试剂缓冲液。
3)Tris盐缓冲液、磁微粒缓冲液和清洗液浓缩液的制备同实施例1。
4)发光底物缓冲液的制备
将70.35g的Tris、5.82g的氯化钠、0.03g的光泽精加入1L纯化水中，充分搅拌至完全溶解，使用盐酸调整得到PH值为9.5的发光底物缓冲液。
2、校准品和质控品的制备
同实施例1。
3、抗试剂的制备
1)异硫氰酸荧光素标记的总甲状腺素包被抗原的制备
同实施例1。
2)碱性磷酸酶标记的总甲状腺素标记抗体的制备
首先用抗试剂缓冲液将碱性磷酸酶配制成浓度为5mg/mL的碱性磷酸酶溶液，按照碱性磷酸酶与总甲状腺素抗体的摩尔比为1:10的量将二者转移至棕色瓶中，室温下搅拌5小时，充分反应后使用pH＝9的缓冲液平衡，之后进行凝胶层析分离纯化，得到碱性磷酸酶标记的总甲状腺素标记抗体；
3)将获得的异硫氰酸荧光素标记的总甲状腺素包被抗原和碱性磷酸酶标记的总甲状腺素标记抗体分别加入含有0.5％Bronidox的Tris盐缓冲液中，充分搅拌后获得抗试剂。
4、磁微粒试剂的制备
将异硫氰酸荧光素抗体与羧基磁珠偶联制得磁微粒试剂，具体如下：
1)羧基磁珠溶液的制备：取10mL充分混匀后的羧基磁珠清洗浓缩液置于磁场15min，待羧基磁珠全部沉降后吸去上清；之后加入4倍于羧基磁珠体积的磁微粒缓冲液，震荡清洗30min；将清洗后的溶液置于磁场15min，待羧基磁珠沉降后吸去上清；重复清洗羧基磁珠3遍，最后将羧基磁珠溶液定容到30mg/mL；
2)连接反应：按照羧基磁珠溶液与异硫氰酸荧光素抗体的质量比为100:1的比例，在羧基磁珠溶液中加入异硫氰酸荧光素抗体，在2～8℃内保持混匀状态反应18小时；
3)将步骤2)获得的溶液置于磁场15min，待羧基磁珠沉降后用磁微粒缓冲液清洗羧基磁珠3次，最后将羧基磁珠定容至10mg/mL，在2～8℃环境下保存，制得所需待用磁微粒试剂。
5、发光底物的制备
使用10倍于APS-5体积的发光底物缓冲液充分溶解APS-5，得到发光底物。
6、将上述校准品、质控品、抗试剂、磁微粒试剂、发光底物和清洗液分装并密封保存，即得到总甲状腺素检测试剂盒。
数据的处理：
通过四参数非线性拟合校准品的浓度值和发光值获得标准曲线的四参数Logistic log方程：
Y＝520887.5715+(-490773.5000)/(1+EXP(-(-4.3919+1.3069*ln(X))
标准曲线如图1所示，其中，横轴代表校准品的浓度值，纵轴代表发光值。
临床数据：
1、本发明的总甲状腺素检测试剂盒稳定性等数据检测
为了评价实施例1-3的总甲状腺素检测试剂盒的稳定性、准确性和变异性，每隔一段时间对实施例1-3的试剂盒进行性能测试，测试结果如表1-3所示。
表1实施例1的总甲状腺素检测试剂盒测试结果
Figure BDA0002177772460000111
表2实施例2的总甲状腺素检测试剂盒测试结果
Figure BDA0002177772460000112
Figure BDA0002177772460000121
表3实施例3的总甲状腺素检测试剂盒测试结果
Figure BDA0002177772460000122
由表1-3可以看出：实施例1-3的总甲状腺素检测试剂盒与发光值的线性相关性连续15个月均保持在0.99以上，最低检出限均小于5.5nmol/L，变异系数均小于6％，符合国家标准。
2、实施例1的总甲状腺素检测试剂盒与进口总甲状腺素检测试剂盒(罗氏公司购得)检测效果的比较
选取240份血清样本，将血清样本中的低、中、高值分离后，对低、中、高值样本进行单独的线性回归分析，得到了线性回归方程y＝0.9938X+1.0471，R2＝0.9860。该回归曲线方程如图2所示，其中，横轴代表进口总甲状腺素检测试剂盒的检测结果，纵轴代表实施例1的总甲状腺素检测试剂盒的检测结果。
3、实施例2的总甲状腺素检测试剂盒与进口总甲状腺素检测试剂盒(罗氏公司购得)的检测效果的比较
选取240份血清样本，将血清样本中的低、中、高值分离后，对低、中、高值样本进行单独的线性回归分析，得到了线性回归方程y＝1.0012X-0.3979，R2＝0.9869。该回归曲线方程如图3所示，其中，横轴代表进口总甲状腺素检测试剂盒的检测结果，纵轴代表实施例2的总甲状腺素检测试剂盒的检测结果。
4、实施例3的总甲状腺素检测试剂盒与进口总甲状腺素检测试剂盒(罗氏公司购得)的检测效果的比较
选取240份血清样本，将血清样本中的低、中、高值分离后，对低、中、高值样本进行单独的线性回归分析，得到了线性回归方程y＝1.005X+0.7766，R2＝0.9874。该回归曲线方程如图4所示，其中，横轴代表进口总甲状腺素检测试剂盒的检测结果，纵轴代表实施例3总甲状腺素检测试剂盒的检测结果。
由图2-4可以看出，本发明的总甲状腺素检测试剂盒的有较好的稳定性和准确性。
5、本发明的总甲状腺素检测试剂盒的参考区间用正常人样本检测值的双侧95百分位数作为参考值。
使用实施例1-3的总甲状腺素检测试剂盒分别对400份人样本血清内总甲状腺素进行检验，用SPSS22.0for windows软件对正常人样本的测定结果进行正态性检验，数据整体分布基本属于非正态分布。
表4本发明的总甲状腺素检测试剂盒ROC曲线检测结果表
P值(一致性)
实施例1 0.00
实施例2 0.00
实施例3 0.00
6、本发明的总甲状腺素检测试剂盒的正常值范围
使用实施例1-3的总甲状腺素检测试剂盒分别对550份正常人样本血清内总甲状腺素进行检验，其中95％的样本血清中，总甲状腺素的含量最低值为72.2nmol/L，最高值为154.8nmol/L，如表5所示。因此，采用本发明的总甲状腺素检测试剂盒检测时，建议总甲状腺素的正常参考值范围定为72.2～154.8nmol/L。
表5正常人总甲状腺素临床参考值范围表
综上所述，本发明的总甲状腺素检测试剂盒性能可靠，灵敏度高，线性范围宽，可配合全自动仪器使用。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种总甲状腺素检测试剂盒，其特征在于，包括校准品、质控品、抗试剂、磁微粒试剂和发光底物，其中，
所述抗试剂的制备步骤为：将总甲状腺素抗原与异硫氰酸荧光素偶联，总甲状腺素抗体与碱性磷酸酯酶偶联，分别获得异硫氰酸荧光素标记的总甲状腺素包被抗原和碱性磷酸酶标记的总甲状腺素标记抗体，将异硫氰酸荧光素标记的总甲状腺素包被抗原和碱性磷酸酶标记的总甲状腺素标记抗体加入抗试剂缓冲液中，充分搅拌；
所述磁微粒试剂的制备步骤为：清洗羧基磁珠，将异硫氰酸荧光素抗体与羧基磁珠偶联，清洗并保存。
2.根据权利要求1所述的总甲状腺素检测试剂盒，其特征在于，所述异硫氰酸荧光素标记的总甲状腺素包被抗原的制备步骤进一步为：
制备第一溶液，所述第一溶液的组分为吡啶、三乙基胺和纯化水；
分别将总甲状腺素抗原和异硫氰酸荧光素加入第一溶液中，搅拌至完全溶解，分别获得总甲状腺素抗原溶液和异硫氰酸荧光素溶液；
将总甲状腺素抗原溶液和异硫氰酸荧光素溶液充分混匀，室温放置0.5～1小时，充分反应后进行纯化，最终得到异硫氰酸荧光素标记的总甲状腺素包被抗原。
3.根据权利要求1所述的总甲状腺素检测试剂盒，其特征在于，所述碱性磷酸酶标记的总甲状腺素标记抗体的制备步骤进一步为：
将碱性磷酸酶加入抗试剂缓冲液中，配置碱性磷酸酶溶液，使碱性磷酸酶溶液的最终浓度为1.0～5.0mg/mL；
将摩尔比为1:2～1:10的碱性磷酸酶溶液和总甲状腺素抗体充分混匀4～5小时，充分反应后加入PH值为8～9的碳酸氢盐缓冲液进行平衡，然后凝胶层析分离纯化，最终得到碱性磷酸酶标记的总甲状腺素标记抗体。
4.根据权利要求1所述的总甲状腺素检测试剂盒，其特征在于，所述磁微粒试剂的制备步骤进一步为：
步骤1：对羧基磁珠浓缩液进行磁场分离，待羧基磁珠沉降后弃上清；
步骤2：向所述步骤1得到的溶液中加入2～5倍于羧基磁珠体积的磁微粒缓冲液，震荡清洗20～30min；
步骤3：对所述步骤2得到的溶液进行磁场分离，待羧基磁珠沉降后弃上清，最后得到10～50mg/mL的羧基磁珠溶液；
步骤4：将质量比为100:1的羧基磁珠溶液和异硫氰酸荧光素抗体充分混匀反应18h；
步骤5：对所述步骤4得到的溶液进行磁场分离，待羧基磁珠沉降后使用磁微粒缓冲液清洗，最后得到10mg/mL的磁微粒试剂。
5.根据权利要求1至4中任一所述的总甲状腺素检测试剂盒，其特征在于，所述发光底物的组分为APS-5和发光底物缓冲液，体积比为1:4～1：10，其中，
所述发光底物缓冲液的组分及含量为：Tris缓冲液12.12～121.14g/L，氯化钠5.82g/L，光泽精0.03g/L。
6.根据权利要求1至4中任一所述的总甲状腺素检测试剂盒，其特征在于，所述抗试剂缓冲液的组分及含量为：
Figure FDA0002177772450000021
7.权利要求1至4中任一所述的总甲状腺素检测试剂盒，其特征在于，所述校准品和质控品的制备步骤为：使用校准品缓冲液溶解总甲状腺素，得到0nmol/L、60nmol/L、88nmol/L、140nmol/L、200nmol/L和400nmol/L的校准品以及88nmol/L、200nmol/L的质控品，其中，
所述校准品缓冲液的组分及含量为：血清500g/L，四环素0.01～0.05g/L，硫酸新霉素0.1～0.5g/L。
8.权利要求1-4中任一所述的总甲状腺素检测试剂盒，其特征在于，所述总甲状腺素检测试剂盒还包括清洗液，所述清洗液的组分及含量为：
9.一种如权利要求1至8中任一所述的总甲状腺素检测试剂盒作为体外诊断试剂的应用。
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