JPH0667960B2 - 結合蛋白質に結合した分析質を分離する方法及び血清中のビタミンｂ１２測定用試料準備試薬 - Google Patents
結合蛋白質に結合した分析質を分離する方法及び血清中のビタミンｂ１２測定用試料準備試薬Info
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、SH−基離脱性のチオールにより結合蛋白質を
分解することにより、結合蛋白質に結合した分析質を、
この結合蛋白質から分離する方法に関する。
分解することにより、結合蛋白質に結合した分析質を、
この結合蛋白質から分離する方法に関する。
多くの重要な分析質例えばビタミン又はステロイドは、
特異的又は非特異的に結合蛋白質例えば血清蛋白質又は
他の天然結合物質に結合している。これらを測定する前
に、これら分析質は、その結合蛋白質から又は他の結合
物質から溶離させるべきである。多くの場合に、このこ
とは、競争原理を使用することにより、例えばチオキシ
ン結合グロブリン(TBG)からT4を溶離するために、分析
質の交又反応性類縁体の過剰の添加により、又はより温
和な解離条件の保持、例えば８−アニリノ−１−ナフタ
リン−スルホン酸(ANS)の添加により達成することがで
きる。いくつかの場合に、この結合は、例えばビタミン
B12を分離するためには強力な破壊法が必要である程度
に堅固である。
特異的又は非特異的に結合蛋白質例えば血清蛋白質又は
他の天然結合物質に結合している。これらを測定する前
に、これら分析質は、その結合蛋白質から又は他の結合
物質から溶離させるべきである。多くの場合に、このこ
とは、競争原理を使用することにより、例えばチオキシ
ン結合グロブリン(TBG)からT4を溶離するために、分析
質の交又反応性類縁体の過剰の添加により、又はより温
和な解離条件の保持、例えば８−アニリノ−１−ナフタ
リン−スルホン酸(ANS)の添加により達成することがで
きる。いくつかの場合に、この結合は、例えばビタミン
B12を分離するためには強力な破壊法が必要である程度
に堅固である。
著るしく稀釈された水性溶液（例えば血清）中の分析質
例えばビタミンB12（シアノコバラミン）を測定するた
めの現在慣用されている方法は、固有のフアクター(IF)
を結合試薬として使用する放射能標識物質の使用下にお
ける方法に基づいている。これら慣用の技術は、マーカ
ーとしての57Co・B12の使用下に、遊離の分析質と標識
付き分析質とが、IFとの結合に関して競争する競争原理
の基本のもとで操作する。結合した試料と遊離試料の分
離（結合／遊離−分離）は、活性炭、固相結合IF又は磁
気分離（ここではIFが永久磁性粒子に結合している）の
使用下における方法に基づいて行なう。
例えばビタミンB12（シアノコバラミン）を測定するた
めの現在慣用されている方法は、固有のフアクター(IF)
を結合試薬として使用する放射能標識物質の使用下にお
ける方法に基づいている。これら慣用の技術は、マーカ
ーとしての57Co・B12の使用下に、遊離の分析質と標識
付き分析質とが、IFとの結合に関して競争する競争原理
の基本のもとで操作する。結合した試料と遊離試料の分
離（結合／遊離−分離）は、活性炭、固相結合IF又は磁
気分離（ここではIFが永久磁性粒子に結合している）の
使用下における方法に基づいて行なう。
血清−結合蛋白質から分析質例えばビタミンB12を分離
させるための現在慣用の方法は、通例アルカリ性領域
（pH13.5）で、SH基離脱性チオールジチオスレイトール
(DTT)の作用下に（アルカリ領域でDTTを用いて血清試料
をインキユベーシヨン）結合蛋白質を分解することに基
づくか、又は30〜60分煮沸及び引続く遠心分離すること
による。有機物質例えばアセトン、アルコールの添加に
よるか又は競争性の交又結合性物質例えばコビンアミド
の添加により、この分解は増強することができる。ビタ
ミンB12の抽出能を高め、コバラミンを同一形状の、安
定で検出可能な形即ちシアノコバラミンに変えるための
全ての慣用の試験法は、更にシアン化カリウムを含有す
る。
させるための現在慣用の方法は、通例アルカリ性領域
（pH13.5）で、SH基離脱性チオールジチオスレイトール
(DTT)の作用下に（アルカリ領域でDTTを用いて血清試料
をインキユベーシヨン）結合蛋白質を分解することに基
づくか、又は30〜60分煮沸及び引続く遠心分離すること
による。有機物質例えばアセトン、アルコールの添加に
よるか又は競争性の交又結合性物質例えばコビンアミド
の添加により、この分解は増強することができる。ビタ
ミンB12の抽出能を高め、コバラミンを同一形状の、安
定で検出可能な形即ちシアノコバラミンに変えるための
全ての慣用の試験法は、更にシアン化カリウムを含有す
る。
この双方の現在慣用の試料準備法の欠点は、殊に、DTT
の使用の際の低い溶解作用（僅かに約60〜80％）、限ら
れた安定性及び不快臭である。この加熱分解は、実験室
中で、煮沸のための必要な技術的経費及び時間により、
かつ遠心分離により、実用不可能である。
の使用の際の低い溶解作用（僅かに約60〜80％）、限ら
れた安定性及び不快臭である。この加熱分解は、実験室
中で、煮沸のための必要な技術的経費及び時間により、
かつ遠心分離により、実用不可能である。
従つて、本発明の課題は、前記の従来慣用の試料準備法
の欠点を克服することのできる試料調製法を提供するこ
とであつた。
の欠点を克服することのできる試料調製法を提供するこ
とであつた。
この課題は、本発明により解決される。
本発明の目的は、結合蛋白質に結合した分析質を、アル
カリ性領域内でSH−基離脱性チオールによるり結合蛋白
質を分解することにより分離させる方法であり、これ
は、SH−基離脱性チオールとして、式(I)： 〔式中ｎは１〜８の整数有利に３〜５である〕の1,2−
ジチオラン−３−カルボン酸を使用することより成る。
カリ性領域内でSH−基離脱性チオールによるり結合蛋白
質を分解することにより分離させる方法であり、これ
は、SH−基離脱性チオールとして、式(I)： 〔式中ｎは１〜８の整数有利に３〜５である〕の1,2−
ジチオラン−３−カルボン酸を使用することより成る。
Ｉ式の酸としては、有利に、リポン酸（Liponsaeure）
が使用される。アルカリ性媒体としては、水酸化アルカ
リ溶液、殊に、NaOH−又はKOH−溶液を使用するのが有
利である。この際、アルカリの濃度は、有利に0.05〜１
モル／ｌの範囲内にある。Ｉ式のカルボン酸の有利な濃
度は、１〜20mg／ml特に４〜10mg／ml（ｎ＝４を有する
リポン酸に対して計算）である。
が使用される。アルカリ性媒体としては、水酸化アルカ
リ溶液、殊に、NaOH−又はKOH−溶液を使用するのが有
利である。この際、アルカリの濃度は、有利に0.05〜１
モル／ｌの範囲内にある。Ｉ式のカルボン酸の有利な濃
度は、１〜20mg／ml特に４〜10mg／ml（ｎ＝４を有する
リポン酸に対して計算）である。
本発明の方法は、原則的に、特異的結合蛋白質に結合し
て存在する分析質の分離のため、殊にビタミン、甲状腺
ホルモン又はステロイドの分離のために好適である。分
析質としてのビタミンB12を遊離させるために、本発明
の方法は特に好適であることが判明した。
て存在する分析質の分離のため、殊にビタミン、甲状腺
ホルモン又はステロイドの分離のために好適である。分
析質としてのビタミンB12を遊離させるために、本発明
の方法は特に好適であることが判明した。
本発明の有利な実施形によれば、この方法を、KCNの存
在で実施する。KCNの濃度は、１〜10mg／mlの間が有利
であるが、より高い又はより低い濃度が分離を更に改良
することもできる。
在で実施する。KCNの濃度は、１〜10mg／mlの間が有利
であるが、より高い又はより低い濃度が分離を更に改良
することもできる。
(I)式中でｎは特に３〜５、殊に４（リポン酸）であ
る。
る。
アルカリ性媒体としては、有利に、水酸化アルカリ殊に
NaOH又はKOHが使用される。この際、アルカリ濃度は、
0.05〜１モル／ｌ特に0.2〜0.7モル／ｌの範囲にあるの
が有利である。この媒体のpH値は、最低10、一般に10〜
14特に13〜14であり、殊に13.6が有利である。
NaOH又はKOHが使用される。この際、アルカリ濃度は、
0.05〜１モル／ｌ特に0.2〜0.7モル／ｌの範囲にあるの
が有利である。この媒体のpH値は、最低10、一般に10〜
14特に13〜14であり、殊に13.6が有利である。
(I)式の1,2−ジチオール−３−カルボン酸は、（ｎ＝４
を有するリポン酸に関して計算して）、特に１〜20mg／
ml殊に４〜10mg／mlの範囲で、第１に５〜８mg／mlで使
用される。ビタミンB12を測定するために、シアン化物
例えばシアン化カリウムの存在で操作するのが有利であ
る。このシアン化物は、0.5〜５mg／ml殊に１mg／mlの
量で使用するのが有利である。
を有するリポン酸に関して計算して）、特に１〜20mg／
ml殊に４〜10mg／mlの範囲で、第１に５〜８mg／mlで使
用される。ビタミンB12を測定するために、シアン化物
例えばシアン化カリウムの存在で操作するのが有利であ
る。このシアン化物は、0.5〜５mg／ml殊に１mg／mlの
量で使用するのが有利である。
試料準備のための本発明の方法は、手による測定法に
も、自動分析装置の使用下における方法にも好適であ
る。
も、自動分析装置の使用下における方法にも好適であ
る。
本発明方法の利点は、殊に次のとおりである： 結合蛋白質の分解は非常に迅速に進行し、一般に、15分
より短かく、この方法は、80〜95％の分離で非常に有効
であり、試料準備用の試薬溶液は非常に安定（室温での
貯蔵性は８週間以上）であり、本発明による分離試薬の
使用下では不快臭が現われず、この試薬は完全に無害で
あり、この試薬は、汎用可能であり、リポン酸が、蛋白
質を分解する間に蛋白質に結合することに基づき、この
テストの影響は非常に低く、pH−値の中和の際の蛋白質
−及び分析質−錯体の逆形成の可能性は、著るしく限定
される。
より短かく、この方法は、80〜95％の分離で非常に有効
であり、試料準備用の試薬溶液は非常に安定（室温での
貯蔵性は８週間以上）であり、本発明による分離試薬の
使用下では不快臭が現われず、この試薬は完全に無害で
あり、この試薬は、汎用可能であり、リポン酸が、蛋白
質を分解する間に蛋白質に結合することに基づき、この
テストの影響は非常に低く、pH−値の中和の際の蛋白質
−及び分析質−錯体の逆形成の可能性は、著るしく限定
される。
結合蛋白質に結合した分析質をこの結合蛋白質から分離
する本発明の方法は、多くの測定法のための試料準備の
ために好適である。特に、本発明方法は、分析質例えば
ビタミン、甲状腺ホルモン及びステロイドに対して、例
えばテストステロン結合グロブリンからのテストステロ
ンの分離、チロキシン結合グロブリン(TBG)からのT3、T
4の分離のために、更に、分析質が蛋白質例えば細胞マ
トリツクス又は結合蛋白質に結合した腫瘍マーカーに結
合している他の系に対しても、殊にビタミンB12測定法
における試料準備のために好適である。
する本発明の方法は、多くの測定法のための試料準備の
ために好適である。特に、本発明方法は、分析質例えば
ビタミン、甲状腺ホルモン及びステロイドに対して、例
えばテストステロン結合グロブリンからのテストステロ
ンの分離、チロキシン結合グロブリン(TBG)からのT3、T
4の分離のために、更に、分析質が蛋白質例えば細胞マ
トリツクス又は結合蛋白質に結合した腫瘍マーカーに結
合している他の系に対しても、殊にビタミンB12測定法
における試料準備のために好適である。
このような分析質の測定法は、例えばK.リユプケ（Lueb
ke）のイムノロギツシエ・テスト・フユア・ニーダーモ
レキユラーレ・ヴイルクストツフエ（Immunologische T
este fuer niedermolekulare Wirkstoffe,Georg Thieme
Verlag,Stuttgart（1978））、Clin.Chim.Acta22（196
8）、51〜69;B.ロスフエルド（Rothfeld）ed.のニユク
レア・メデイシン・リピンコツト・フイラデルフイア
（Nuclear Medicine Lippincott,Philadelphia）69〜8
4、1974並びに殊にTestosteron in J.Endocr.100（198
4）、367〜376、J.Steroid.Biochem.19（1973）、1605
〜1610並びにJ.Steroid Biochem.22（1985）、169〜175
及び西ドイツ特許（DE−Ａ）第3545253号明細書に記載
されている。T3及びT4の測定法は、例えば、Biochem.Bi
ophys.Res.Comm.46（1972）、2107〜2113に記載されて
いる。ビタミンB12の測定法は、例えばクリニカル・ビ
オケミストリイ（Clinical Biochemistry）18（198
5）、261〜266、J.Clin.Path.20（1967）、683〜686、B
rit.Haemat.22（1972）、21〜31、Biochem.Biophys.Re
s.Comm.46（1972）2107〜2113、並びに同日出願特願
号（西ドイツ出願第P3900650.6号）明細書に
記載されている。
ke）のイムノロギツシエ・テスト・フユア・ニーダーモ
レキユラーレ・ヴイルクストツフエ（Immunologische T
este fuer niedermolekulare Wirkstoffe,Georg Thieme
Verlag,Stuttgart（1978））、Clin.Chim.Acta22（196
8）、51〜69;B.ロスフエルド（Rothfeld）ed.のニユク
レア・メデイシン・リピンコツト・フイラデルフイア
（Nuclear Medicine Lippincott,Philadelphia）69〜8
4、1974並びに殊にTestosteron in J.Endocr.100（198
4）、367〜376、J.Steroid.Biochem.19（1973）、1605
〜1610並びにJ.Steroid Biochem.22（1985）、169〜175
及び西ドイツ特許（DE−Ａ）第3545253号明細書に記載
されている。T3及びT4の測定法は、例えば、Biochem.Bi
ophys.Res.Comm.46（1972）、2107〜2113に記載されて
いる。ビタミンB12の測定法は、例えばクリニカル・ビ
オケミストリイ（Clinical Biochemistry）18（198
5）、261〜266、J.Clin.Path.20（1967）、683〜686、B
rit.Haemat.22（1972）、21〜31、Biochem.Biophys.Re
s.Comm.46（1972）2107〜2113、並びに同日出願特願
号（西ドイツ出願第P3900650.6号）明細書に
記載されている。
本発明のもう１つの目的物は、血清中のビタミンB12を
測定するための試料準備用の、pH10〜14でリポン酸１〜
20mg／ml及びシアン化アルカリ１〜10mg／mlを含有する
試薬である。
測定するための試料準備用の、pH10〜14でリポン酸１〜
20mg／ml及びシアン化アルカリ１〜10mg／mlを含有する
試薬である。
試料準備用のこの試薬を、試料に加え、これを、有利に
10〜20殊に15分間室温でインキユベートする。引続き、
pH値を７〜９に低下させる。このことは、殊に、適当な
緩衝液の使用下に２工程でゆつくり実施するのが有利で
ある。さもないと沈殿が生じうる。
10〜20殊に15分間室温でインキユベートする。引続き、
pH値を７〜９に低下させる。このことは、殊に、適当な
緩衝液の使用下に２工程でゆつくり実施するのが有利で
ある。さもないと沈殿が生じうる。
この試料準備は、本発明方法により、殊に、リポン酸
（Ｉ式でｎ＝４）の使用下に行なう。KCN（特にKCN１〜
10mg／ml、殊に１〜５mg／mlの濃度で）の存在で操作す
るのが有利である。このインキユベーシヨンは、有利
に、室温で、アルカリ性領域で有利に15分間実施し、工
程c)の実施の前に中和する。KCNの代りに、NaCN又は他
の易解離性のシアン化物も、この方法に影響しない陽イ
オンと共に使用できる。
（Ｉ式でｎ＝４）の使用下に行なう。KCN（特にKCN１〜
10mg／ml、殊に１〜５mg／mlの濃度で）の存在で操作す
るのが有利である。このインキユベーシヨンは、有利
に、室温で、アルカリ性領域で有利に15分間実施し、工
程c)の実施の前に中和する。KCNの代りに、NaCN又は他
の易解離性のシアン化物も、この方法に影響しない陽イ
オンと共に使用できる。
工程d)における競争性標識B12（マーカー）としては、
例えば57Co・B12を使用することができる。この放射能
マーカーに付随する欠点をさけるために、(II)式： B12-CO-NHNH-R-CO-NHｘＮ＝GP （II） 〔式中B12は、シアノコバラミン（ビタミンB12）から、
-CONH2-基の離脱により形成された残基を表わし、Ｒ
は、結合基（スペーサー）を表わし、ｘは０又は１であ
り、GPは、１個のグリコシル基を介して-NH-N＝基に結
合しているグリコシル基含有マーカー酵素の残基を表わ
す〕のB12−複合体を使用するのが有利である。（II）
式中で-CONH-基は、有利にB12−残基のｄ−位に存在
し、第一に、B12-d-CO-NH-N＝GP殊に、B12-d-CO-NH-NH-
CO-CH2O-CH2-CH2 ３-O-CH2-CO-NH-N＝GP（ここでGP
はベルオキシダーゼ基(POD)である）が使用される。
例えば57Co・B12を使用することができる。この放射能
マーカーに付随する欠点をさけるために、(II)式： B12-CO-NHNH-R-CO-NHｘＮ＝GP （II） 〔式中B12は、シアノコバラミン（ビタミンB12）から、
-CONH2-基の離脱により形成された残基を表わし、Ｒ
は、結合基（スペーサー）を表わし、ｘは０又は１であ
り、GPは、１個のグリコシル基を介して-NH-N＝基に結
合しているグリコシル基含有マーカー酵素の残基を表わ
す〕のB12−複合体を使用するのが有利である。（II）
式中で-CONH-基は、有利にB12−残基のｄ−位に存在
し、第一に、B12-d-CO-NH-N＝GP殊に、B12-d-CO-NH-NH-
CO-CH2O-CH2-CH2 ３-O-CH2-CO-NH-N＝GP（ここでGP
はベルオキシダーゼ基(POD)である）が使用される。
(II)式のB12−複合体は、西ドイツ特許出願第3900648.4
号（発明の名称：新規コバラミン−酸ヒドラジド及びこ
れから誘導されたコバラミン−複合体）の目的物であ
る。これは、式： B12-CO-NH-NHR-CO-NH-NHｘＨ （式中B12、Ｒ及びｘは前記のものを表わす）のコバラ
ミン−酸ヒドラジドとグリコ蛋白質のグリコシル基のOH
−基との結合により、その酸化及びヒドラゾン基-NH-N
＝CH-グリコプロテインの形成後に、自体公知の条件下
で製造することができる。
号（発明の名称：新規コバラミン−酸ヒドラジド及びこ
れから誘導されたコバラミン−複合体）の目的物であ
る。これは、式： B12-CO-NH-NHR-CO-NH-NHｘＨ （式中B12、Ｒ及びｘは前記のものを表わす）のコバラ
ミン−酸ヒドラジドとグリコ蛋白質のグリコシル基のOH
−基との結合により、その酸化及びヒドラゾン基-NH-N
＝CH-グリコプロテインの形成後に、自体公知の条件下
で製造することができる。
標識分析質として殊に、 B12-d-CO-NH-NH-CO-CH2O-CH2-CH2 ３O-CH2-CO-NH-N
＝PODが使用される。
＝PODが使用される。
PODの測定は、自体公知の方法で行なうことができる。P
ODの測定を色原体としての2,2′−アジノジ−（３−エ
チルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）(ABTS)を用い
るPODの着色を介して行なうのが有利である。
ODの測定を色原体としての2,2′−アジノジ−（３−エ
チルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）(ABTS)を用い
るPODの着色を介して行なうのが有利である。
試料の前処理（ｂ工程）は、外部で又は、自動的B12−
測定プログラムの範囲でも、例えば前記の自動分析装置
を用いて行なうこともできる。溶液中で、濃縮物として
又は凍結乾燥された形でも使用することのできるB12−
複合体の量は、殊に、試料の種類及びその中で予期され
るB12−含分に依り決まる。最適量は、特定の予期され
るB12−含分に対して予め測定するのが有利である。
測定プログラムの範囲でも、例えば前記の自動分析装置
を用いて行なうこともできる。溶液中で、濃縮物として
又は凍結乾燥された形でも使用することのできるB12−
複合体の量は、殊に、試料の種類及びその中で予期され
るB12−含分に依り決まる。最適量は、特定の予期され
るB12−含分に対して予め測定するのが有利である。
殊に、前記の抗体をビタミンB12の結合試薬として同時
に使用して、本発明の試料準備法を用いてビタミンB12
を測定する方法により、従来慣用の試料準備の使用の際
に放射能標識B12と結びついて生じた問題が避けられる
テスト系が提供される。この本発明による系は、健康上
の害がなく、この試薬は、従来慣用のテスト系の場合よ
りも著るしく大きい保存性を有する。使用試薬の取扱い
容易性及び無害性及びこのテストの実施容易性により、
この系は、全体的に非常に使用し易い。使用モノクロー
ナル抗体は、従来使用されたIFを結合又は遮断すること
のできる血清抗体によつて影響されない。本発明による
分離法（試料準備）の使用は、試験正確性を改良し、テ
ストの多大の認容性に寄与する。ビタミンB12−分離の
良好な再現性及び多大な効果が得られる。
に使用して、本発明の試料準備法を用いてビタミンB12
を測定する方法により、従来慣用の試料準備の使用の際
に放射能標識B12と結びついて生じた問題が避けられる
テスト系が提供される。この本発明による系は、健康上
の害がなく、この試薬は、従来慣用のテスト系の場合よ
りも著るしく大きい保存性を有する。使用試薬の取扱い
容易性及び無害性及びこのテストの実施容易性により、
この系は、全体的に非常に使用し易い。使用モノクロー
ナル抗体は、従来使用されたIFを結合又は遮断すること
のできる血清抗体によつて影響されない。本発明による
分離法（試料準備）の使用は、試験正確性を改良し、テ
ストの多大の認容性に寄与する。ビタミンB12−分離の
良好な再現性及び多大な効果が得られる。
次の実施例及び添付図面につき、本発明を詳述するが、
これらは本発明を限定するものではない。室温(RT)と
は、25℃±２℃である。「％」は「重量％」である。
これらは本発明を限定するものではない。室温(RT)と
は、25℃±２℃である。「％」は「重量％」である。
第１図は、例３による、添加物なし（曲線１）、リポン
酸10mg／ml添加（曲線２）、DTT10mg／ml添加（曲線
３）の際のビタミンB12測定用の標準曲線である。
酸10mg／ml添加（曲線２）、DTT10mg／ml添加（曲線
３）の際のビタミンB12測定用の標準曲線である。
例１ リポン酸での試料前処理 ヒト血清250μｌに分離試薬（NaOH0.5モル／ｌ中に溶か
されたリポン酸８mg／ml、シアン化カリウム１mg／mlよ
り成る）125μｌと混合し、室温で15分間インキユベー
トする。引続き200mモル／ｌ燐酸塩緩衝液（pH4.1）125
μｌを加える。200mモル／ｌ燐酸塩緩衝液（pH4.1）の
代りに、燐酸（H3PO4、1.5Ｎ）25μｌも使用できる。こ
のことは、この際に、試料の稀釈が減少される利点を有
する。
されたリポン酸８mg／ml、シアン化カリウム１mg／mlよ
り成る）125μｌと混合し、室温で15分間インキユベー
トする。引続き200mモル／ｌ燐酸塩緩衝液（pH4.1）125
μｌを加える。200mモル／ｌ燐酸塩緩衝液（pH4.1）の
代りに、燐酸（H3PO4、1.5Ｎ）25μｌも使用できる。こ
のことは、この際に、試料の稀釈が減少される利点を有
する。
もう１つの変法で、中和のために燐酸塩緩衝液（200mモ
ル／ｌ、pH7.2）800μｌを加えることができる。
ル／ｌ、pH7.2）800μｌを加えることができる。
例２ DTTでの試料前処理（比較） ヒト血清250μｌにDTT−分離試薬（0.5モル／ｌNaOH中
に溶かしたDTT10mg／ml、シアン化カリウム１mg／ml）1
25μｌと混合し、室温で15分間インキユベートする。引
続き、燐酸塩緩衝液（200mモル／ｌ、pH4.1）125μｌを
加える。
に溶かしたDTT10mg／ml、シアン化カリウム１mg／ml）1
25μｌと混合し、室温で15分間インキユベートする。引
続き、燐酸塩緩衝液（200mモル／ｌ、pH4.1）125μｌを
加える。
例３ ビタミンB12の測定 a)試薬類： サーモ（Thermo）−RSAストレプトアビジンで塗被され
たポリスチロール管（欧州特許第0269092号により製
造） 試薬１ ビタミンB12に対するビチオン化されたMAK（ECACC88101
302）95ng／ml（ビチオン化はJACS（1978）3585〜3590
による） 40mモル／ｌ燐酸塩緩衝液（pH7.2） 試薬２ B12-d-CO-NH-NH-CO-CH2-(O-CH2-CH2 ３O-CH2-CO-NH-N
＝POD（活性約60mU／ml） 40mモル／ｌ燐酸塩緩衝液（pH7.2） 試薬３ 燐酸塩−クエン酸塩緩衝液（pH4.4） 100mモル／ｌ ABTS （2,2′−アジノ−ジ〔３−エチ ル−ベンズチアゾリン−スルホネート〕）1.9ｍモル／
ｌ 過硼酸ナトリウム 3.2ｍモル／
ｌ b)測定の実施 この測定の実施のために、例１又は例２により前処理さ
れた試料200μｌを試薬１ 800μｌと共にストレプトア
ビジン管中に入れ、室温で60分間インキユベートする。
引続き、洗浄溶液（塩化ナトリウム250mg／ml、硫酸銅
１mg／100ml）で洗浄し、試薬２ 1000μｌを加え、室
温で30分間インキユベートする。洗浄溶液（塩化ナトリ
ウム250mg／ml、硫酸銅１mg／100ml）で洗浄し、試薬３
を加え、室温で30分間インキユベートし、生じる色をビ
タミンB12の尺度として420nmで測定する。
たポリスチロール管（欧州特許第0269092号により製
造） 試薬１ ビタミンB12に対するビチオン化されたMAK（ECACC88101
302）95ng／ml（ビチオン化はJACS（1978）3585〜3590
による） 40mモル／ｌ燐酸塩緩衝液（pH7.2） 試薬２ B12-d-CO-NH-NH-CO-CH2-(O-CH2-CH2 ３O-CH2-CO-NH-N
＝POD（活性約60mU／ml） 40mモル／ｌ燐酸塩緩衝液（pH7.2） 試薬３ 燐酸塩−クエン酸塩緩衝液（pH4.4） 100mモル／ｌ ABTS （2,2′−アジノ−ジ〔３−エチ ル−ベンズチアゾリン−スルホネート〕）1.9ｍモル／
ｌ 過硼酸ナトリウム 3.2ｍモル／
ｌ b)測定の実施 この測定の実施のために、例１又は例２により前処理さ
れた試料200μｌを試薬１ 800μｌと共にストレプトア
ビジン管中に入れ、室温で60分間インキユベートする。
引続き、洗浄溶液（塩化ナトリウム250mg／ml、硫酸銅
１mg／100ml）で洗浄し、試薬２ 1000μｌを加え、室
温で30分間インキユベートする。洗浄溶液（塩化ナトリ
ウム250mg／ml、硫酸銅１mg／100ml）で洗浄し、試薬３
を加え、室温で30分間インキユベートし、生じる色をビ
タミンB12の尺度として420nmで測定する。
第１表は、例３によるテストにおける分離試薬としての
リポン酸もしくはDTTの使用下での種々のヒト血清に関
する結果の比較を示す。
リポン酸もしくはDTTの使用下での種々のヒト血清に関
する結果の比較を示す。
第１表 B12濃度（pg／ml） リポン酸 DTT 10mg/ml 10mg/mｌ 376 94 452 174 418 252 513 152 3939 458 これから、リポン酸の使用の際に高い測定値が得られ、
従つて良好な分離が達成されることが判る。
従つて良好な分離が達成されることが判る。
第１図は、シアノコバラミン−標準（塩化ナトリウム0.
9％、クロテインＣ0.9％及びシアン化カリウム0.1％を
有する40mモル／ｌ燐酸緩衝液（pH7.0）中のシアノコバ
ラミン）の使用の際の較正曲線に対するDTT（10mg／m
l）もしくはリポン酸（10mg／ml）の影響を示してい
る。これによれば、較正曲線はリポン酸により非常に僅
かにのみ影響される。
9％、クロテインＣ0.9％及びシアン化カリウム0.1％を
有する40mモル／ｌ燐酸緩衝液（pH7.0）中のシアノコバ
ラミン）の使用の際の較正曲線に対するDTT（10mg／m
l）もしくはリポン酸（10mg／ml）の影響を示してい
る。これによれば、較正曲線はリポン酸により非常に僅
かにのみ影響される。
B12に対するHAKとしてセルラインECACC88101301からのH
AKを使用する際にも同様な結果が得られる。
AKを使用する際にも同様な結果が得られる。
例４ テストステロン−測定 試薬類： 試験緩衝液： テストステロンに対するモノクローナル抗体（ECACC851
21701）35ng／ml、40mモル／ｌ燐酸ナトリウム（pH6.
8） 処理溶液： マウスFc−γに対するポリクローナル羊−抗体(IgG) 10μg/ml 炭酸ナトリウム緩衝液（pH9.6） 20ｍモル／ｌ 洗浄液： 塩化ナトリウム 250mg/100ml 硫酸銅 １mg/100ml 基質溶液： ABTS （2,2″−アジノ−ジ〔３−エチル−ベンズチア
ゾリン−スルホン酸(6)〕−ジアンモニウム塩 1.9ｍモル／ｌ 燐酸塩−クエン酸塩緩衝液（pH4.4）100ｍモル／ｌ 過硼酸ナトリウム 3.2ｍモル／ｌ 試料： 例１によりリポン酸で前処理したか又は例２によりDTT
で前処理したヒト血清。
21701）35ng／ml、40mモル／ｌ燐酸ナトリウム（pH6.
8） 処理溶液： マウスFc−γに対するポリクローナル羊−抗体(IgG) 10μg/ml 炭酸ナトリウム緩衝液（pH9.6） 20ｍモル／ｌ 洗浄液： 塩化ナトリウム 250mg/100ml 硫酸銅 １mg/100ml 基質溶液： ABTS （2,2″−アジノ−ジ〔３−エチル−ベンズチア
ゾリン−スルホン酸(6)〕−ジアンモニウム塩 1.9ｍモル／ｌ 燐酸塩−クエン酸塩緩衝液（pH4.4）100ｍモル／ｌ 過硼酸ナトリウム 3.2ｍモル／ｌ 試料： 例１によりリポン酸で前処理したか又は例２によりDTT
で前処理したヒト血清。
この測定実施のために、処理溶液１mlを室温でルラン管
中で30分間インキユベートした。引続き、洗浄溶液で２
回洗浄した。試験緩衝液１mlを加え、室温で30分間イン
キユベートし、洗浄液で２回洗浄した。試料100μｌ及
びテストステロン３−cmo−POD−複合体（西ドイツ特許
第3833149号により製造、80mU/mｌ）１mlに、40mモル／
ｌ燐酸ナトリウム緩衝液（pH6.8）中で、プルロニツクF
68 0.2％を添加し、室温で30分間インキユベートし、
洗浄液で２回洗浄した。その後、基質溶液１mlを加え、
室温で30分間インキユベートし、405nmでの吸光度を測
定した。
中で30分間インキユベートした。引続き、洗浄溶液で２
回洗浄した。試験緩衝液１mlを加え、室温で30分間イン
キユベートし、洗浄液で２回洗浄した。試料100μｌ及
びテストステロン３−cmo−POD−複合体（西ドイツ特許
第3833149号により製造、80mU/mｌ）１mlに、40mモル／
ｌ燐酸ナトリウム緩衝液（pH6.8）中で、プルロニツクF
68 0.2％を添加し、室温で30分間インキユベートし、
洗浄液で２回洗浄した。その後、基質溶液１mlを加え、
室温で30分間インキユベートし、405nmでの吸光度を測
定した。
第１図は、シアノコバラミン標準の使用下におけるDTT
及びリポン酸による較正曲線に対する影響を示す曲線図
である。
及びリポン酸による較正曲線に対する影響を示す曲線図
である。
Claims (2)
- 【請求項１】アルカリ性領域内でのSH基離脱性チオール
による結合蛋白質の分解により結合蛋白質に結合した分
析質を分離する方法において、SH基離脱性チオールとし
て、式(I)： 〔式中ｎは１〜８の整数を表わす〕の1,2−ジチオラン
−３−カルボン酸を使用することを特徴とする、結合蛋
白質に結合した分析質を分離する方法。 - 【請求項２】pH10〜14で、 リポン酸 １〜20mg／ml シアン化アルカリ １〜10mg／ml を含有する、血清中のビタミンB12測定用試料準備試薬
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3900649A DE3900649A1 (de) | 1989-01-11 | 1989-01-11 | Verfahren zur abloesung eines analyten von seinem bindeprotein |
| DE3900649.2 | 1989-01-11 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02233700A JPH02233700A (ja) | 1990-09-17 |
| JPH0667960B2 true JPH0667960B2 (ja) | 1994-08-31 |
Family
ID=6371887
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002637A Expired - Lifetime JPH0667960B2 (ja) | 1989-01-11 | 1990-01-11 | 結合蛋白質に結合した分析質を分離する方法及び血清中のビタミンｂ１２測定用試料準備試薬 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5332678A (ja) |
| EP (1) | EP0378204B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0667960B2 (ja) |
| AT (1) | ATE123149T1 (ja) |
| CA (1) | CA2007337A1 (ja) |
| DE (2) | DE3900649A1 (ja) |
| ES (1) | ES2072923T3 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3900650A1 (de) * | 1989-01-11 | 1990-07-12 | Boehringer Mannheim Gmbh | Vitamin-b12-bestimmung |
| US5187107A (en) * | 1991-06-27 | 1993-02-16 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | B12 enzyme imunoassay and sample pretreatment |
| GB9122180D0 (en) | 1991-10-18 | 1991-11-27 | Marconi Gec Ltd | Separation and analysis |
| DE4239815A1 (de) * | 1992-11-26 | 1994-06-01 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verbesserte B¶1¶¶2¶-Konjugate |
| US5968477A (en) * | 1994-01-24 | 1999-10-19 | Neorx Corporation | Radiolabeled annexin conjugates with hexose and a chelator |
| WO2000007021A1 (fr) | 1998-07-31 | 2000-02-10 | Mitsubishi Chemical Corporation | Procede d'analyse d'un composant physiologiquement actif |
| MXPA01004152A (es) | 1998-10-26 | 2002-06-04 | Univ New York State Res Found | Derivados de acido lipoico y su uso en el tratamiento de enfermedades. |
| CN102798726B (zh) * | 2012-07-26 | 2015-09-23 | 博奥赛斯（天津）生物科技有限公司 | 维生素b12化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法 |
| CN103575914B (zh) * | 2012-08-02 | 2016-08-03 | 北京勤邦生物技术有限公司 | 检测维生素b12的酶联免疫试剂盒及其应用 |
| CN107219373B (zh) * | 2016-03-22 | 2020-07-07 | 深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司 | 维生素b12检测试剂盒和方法及其样本前处理方法 |
| JP6946926B2 (ja) * | 2017-10-23 | 2021-10-13 | 東ソー株式会社 | ビタミン類の遊離に使用する凍結乾燥試薬 |
| CN113671170A (zh) * | 2021-09-09 | 2021-11-19 | 郑州安图生物工程股份有限公司 | 样本稀释液及其制备方法和消除新鲜样本检测异常的免疫分析方法 |
| CN114011111B (zh) * | 2022-01-05 | 2022-04-01 | 广州科方生物技术股份有限公司 | 用于结合蛋白中萃取维生素的萃取液及其制备方法和应用 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4100150A (en) * | 1975-11-04 | 1978-07-11 | G. D. Searle & Co. | Stabilization of interferon against mechanical stress using thioctic acid |
| GB2084320B (en) * | 1980-09-22 | 1983-12-21 | Amersham Int Ltd | Assay of vitamin b12 |
| US4451571A (en) * | 1981-04-06 | 1984-05-29 | University Patents, Inc. | Preparation of samples for vitamin B12 and/or folate assay and assay |
| US4429008B1 (en) * | 1981-12-10 | 1995-05-16 | Univ California | Thiol reactive liposomes |
| JPS60136520A (ja) * | 1983-12-23 | 1985-07-20 | Otsuka Pharmaceut Co Ltd | フイブリン吸着性ウロキナ−ゼ複合体 |
| EP0150067A3 (en) * | 1984-01-23 | 1986-12-30 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Stable composition of gamma-interferon |
| EP0158487B1 (en) * | 1984-04-09 | 1991-08-28 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Stable composition of interleukin-2 |
| JPS6197229A (ja) * | 1984-10-18 | 1986-05-15 | Chugai Pharmaceut Co Ltd | 安定なエリトロポエチン製剤 |
| DE3507571A1 (de) * | 1985-03-04 | 1986-09-04 | Fa. Carl Zeiss, 7920 Heidenheim | Beleuchtungseinheit fuer die photographische dokumentation mit einer standardspaltlampe |
| US4780281A (en) * | 1985-06-14 | 1988-10-25 | Wayne State University | Method for assay of peroxidase enzyme or reducing substrate activity |
| US4784804A (en) * | 1985-07-29 | 1988-11-15 | New York University | N,N'-bis(4-azidobenzoyl)cystine |
| US4902495A (en) * | 1986-07-22 | 1990-02-20 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | IgE Fc directed delivery system |
| US4981979A (en) * | 1987-09-10 | 1991-01-01 | Neorx Corporation | Immunoconjugates joined by thioether bonds having reduced toxicity and improved selectivity |
| US4950612A (en) * | 1987-12-16 | 1990-08-21 | Microgenics Corporation | Peroxy acid pretreatment in vitamin B12 assay |
| US4978613A (en) * | 1989-01-17 | 1990-12-18 | Abbott Laboratories | Beta-lactamase assay employing chromogenic precipitating substrates |
-
1989
- 1989-01-11 DE DE3900649A patent/DE3900649A1/de not_active Withdrawn
-
1990
- 1990-01-08 CA CA002007337A patent/CA2007337A1/en not_active Abandoned
- 1990-01-10 US US07/463,188 patent/US5332678A/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-01-10 EP EP90100463A patent/EP0378204B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-01-10 DE DE59009106T patent/DE59009106D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-01-10 ES ES90100463T patent/ES2072923T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-01-10 AT AT90100463T patent/ATE123149T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-01-11 JP JP2002637A patent/JPH0667960B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
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|---|---|
| DE59009106D1 (de) | 1995-06-29 |
| EP0378204A3 (de) | 1992-07-08 |
| EP0378204B1 (de) | 1995-05-24 |
| ES2072923T3 (es) | 1995-08-01 |
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| AU4768590A (en) | 1990-07-19 |
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| AU625700B2 (en) | 1992-07-16 |
| DE3900649A1 (de) | 1990-07-12 |
| US5332678A (en) | 1994-07-26 |
| ATE123149T1 (de) | 1995-06-15 |
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