CN113671170A - 样本稀释液及其制备方法和消除新鲜样本检测异常的免疫分析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及体外诊断技术领域，特别涉及样本稀释液及其制备方法和消除新鲜样本检测异常的免疫分析方法。该样本稀释液包括组分A、组分B和生物缓冲液；组分A为硫辛酸或二氢硫辛酸；组分B为硫酸葡聚糖或其盐。本发明将硫辛酸和硫酸葡聚糖组合，并将其应用于免疫临床检测中，避免因样本新鲜程度不同所导致的检测结果的异常。本稀释液可以有效防止新鲜样本中的干扰，能够消除样本中含有的补体及纤维蛋白等主要干扰物质。本稀释液能降低免疫分析中的非特异性反应，从而提高试剂的准确度及精密性。本稀释液制备方法简单，具备安全性和环境友好性。

Description

样本稀释液及其制备方法和消除新鲜样本检测异常的免疫分 析方法
技术领域
本发明涉及体外诊断技术领域，特别涉及样本稀释液及其制备方法和消除新鲜样本检测异常的免疫分析方法。
背景技术
免疫反应中常见的干扰包含内源性及外源性干扰，常见的内源性干扰因素包括补体、类风湿因子RF、自身抗体、嗜异性抗体等；外源性干扰因素主要有脂血、细菌感染、溶血、高胆红素、纤维蛋白等。
补体是存在于人或脊椎动物血清与组织液中的一组具有酶活性的蛋白质。因其是抗体发挥溶细胞作用的必要补充条件，故被称为补体。补体系统各固有成分分别由巨噬细胞、肝细胞、小肠上皮细胞、脾细胞等产生。补体的激活会引起不必要的免疫反应进而带来异常的干扰结果。
纤维蛋白由纤维蛋白原转化而来，其不溶于水。血清纤维蛋白的干扰通常是血液凝固不全导致的，分离出的血清中仍残留部分纤维蛋白原，在放置或检测时生成纤维蛋白，干扰抗原抗体反应，从而使检测结果发生异常。
目前，已有多种方法可减少补体和纤维蛋白所带来的干扰。如：申请号CN110849981A公开了一种维生素D定量检测的样本前处理溶液，包括生理盐水、硫酸葡聚糖钠盐与β-异嗜性阻断剂，其使用的硫酸葡聚糖钠盐和β-异嗜性抗体主要用于25-羟基维生素D与结合蛋白的分离。申请号201911044431.7公开了一种消除纤维蛋白原干扰的化学发光法试剂盒配方，其化学发光法样品稀释液中含有含有纤溶酶。申请号202010522371.1涉及一种分离血清中高密度脂蛋白的装置，所述的低密度脂蛋白阻断试剂为硫酸葡聚糖及其盐、磷钨酸镁、聚乙二醇20000中的一种或多种。
但采用上述样品稀释液对样品的前处理后的抗干扰作用有限。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了样本稀释液及其制备方法和消除新鲜样本检测异常的免疫分析方法。该样本稀释液解决了现有免疫技术存在的新鲜样本检测结果异常的缺陷，本发明稀释液操作简单，抗干扰效果显著，稳定性较好，适用于常规检测人血清及血浆样本。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种样本稀释液，样本稀释液包括组分A、组分B和生物缓冲液；组分A为硫辛酸或二氢硫辛酸；组分B为硫酸葡聚糖或其盐。
本发明提供了一种消除新旧样本检测差异的稀释液所包含的组合物能够充分避免补体被激活进而消除补体的干扰作用。本发明的消除新鲜样本检测异常的稀释液及应用，其特点在于将硫辛酸与硫酸葡聚糖组合物同时引入到稀释液中，目的在于消除新鲜样本中的异常干扰，通过充分的研究表明，本发明稀释液中所包含的硫辛酸和硫酸葡聚糖能够共同消除新鲜样本补体的干扰，并能够共同促进样本中纤维蛋白的降解。本发明稀释液能够消除因新鲜样本中补体含量过高及纤维蛋白所导致的异常结果，避免因补体及纤维蛋白影响人血清及血浆内标志物的测定，有利于进行化学发光反应及磁微粒的洗涤，从而保证了免疫测量结果的准确性。
其中，本发明稀释液中组合物的主要成分硫酸葡聚糖，其能够增强C1抑制物的作用能力，抑制C3、C4，从而抑制补体活化的经典途径；还能通过促进并加强H因子与C3b的结合，使旁路途径C3转化酶不能顺利组装，进而从旁路途径抑制补体的激活；另外，还能影响补体的凝集素激活途径，从多方面影响补体激活的效果，起到一定的消除补体对新鲜样本检测的异常干扰能力。本发明稀释液中所含的组合物的硫辛酸成分，其能够充分络合补体激活途径的金属离子，将经典激活途径中涉及的钙离子，MBL激活途径及旁路途径中涉及的镁离子充分螯合，起到强有力的补体消除能力，并与稀释液中的硫酸葡聚糖起到互补共进的特殊作用，共同消除补体带来的样本异常检测结果，硫辛酸的引入提升了稀释液中硫酸葡聚糖对补体抑制率，从而使免疫试剂能够更精准的检测新鲜样本，避免出现因补体带来的新鲜样本检测结果的异常。
本发明稀释液中的硫酸葡聚糖通过诱导人血浆内源性纤维蛋白溶解，能够增强纤溶酶原激活物的活性，从而提高纤溶酶的作用，降低纤维蛋白所带来的异常干扰现象；硫辛酸能够促使纤溶酶原激活物水平均显著升高，与硫酸葡聚糖起到协同互补的作用，共同促进消除新鲜样本中纤维蛋白干扰的影响，从而避免出现新鲜样本检测结果的异常。
作为优选，组分A在样本稀释液中的质量百分浓度为0.05％～5％，组分B在样本稀释液中的质量百分浓度为0.01％～5％。
优选地，组分A在样本稀释液中的质量百分浓度为0.05％～2.0％，组分B在样本稀释液中的质量百分浓度为0.1％～3.0％。
更优选地，组分A在样本稀释液中的质量百分浓度为0.05％～0.5％，组分B在样本稀释液中的质量百分浓度为0.1％～2.5％。
在本发明中，生物缓冲液选自但不限于磷酸盐缓冲液、HEPES缓冲液、MOPS缓冲液、Tris-HCl缓冲液、MES缓冲液中的一种或多种。
作为优选，生物缓冲液的浓度为0.01～1.0mol/L。
作为优选，样本稀释液的pH值为6～10。
优选地，样本稀释液的pH值为7.5～9.0。
作为优选，硫酸葡聚糖或其盐的分子量为3～1000kDa。
本发明还提供了该样本稀释液的制备方法，将组分A、组分B溶解于生物缓冲液，调节pH值。
本发明还提供了一种消除新鲜样本检测异常的免疫分析方法，在基于抗原抗体结合的免疫分析方法中，采用上述样本稀释液对待测样本进行处理。
在本发明中，待检样本为血清或血浆。本发明稀释液可用于检测血清及血浆样品中的各种临床标志物。
本发明提供了样本稀释液及其制备方法和消除新鲜样本检测异常的免疫分析方法。该样本稀释液包括组分A、组分B和生物缓冲液；组分A为硫辛酸或二氢硫辛酸；组分B为硫酸葡聚糖或其盐。本发明具有的技术效果为：
本发明将硫辛酸和硫酸葡聚糖组合，并将其应用于免疫临床检测中，避免因样本新鲜程度不同所导致的检测结果的异常。本稀释液可以有效防止新鲜样本中的干扰，能够消除样本中含有的补体及纤维蛋白等主要干扰物质。本稀释液能降低免疫分析中的非特异性反应，从而提高试剂的准确度及精密性。本稀释液制备方法简单，具备安全性和环境友好性；
本发明稀释液中的硫辛酸能够充分络合补体激活途径的各种金属离子，协助稀释液中的硫酸葡聚糖进行补体系统的抑制及消除，从而避免因补体干扰所导致的新鲜样本检测结果的异常；硫酸葡聚糖和硫辛酸共同促进纤溶酶系统的激活，从而提高纤维蛋白的清除能力，避免因纤维蛋白干扰所导致的新鲜样本检测结果的异常，保障检测结果的真实性和可靠性。
具体实施方式
本发明公开了样本稀释液及其制备方法和消除新鲜样本检测异常的免疫分析方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明中所用试剂或仪器均可由市场购得。其中，硫辛酸购自西格玛公司；硫酸葡聚糖及其盐购自西格玛公司，分子量为3～1000kDa。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
一、稀释液配方及其制备方法
首先制备本发明稀释液，其中包含质量比0.05％的硫辛酸及0.1％的硫酸葡聚糖及PBS缓冲液。制备方法：先将上述比例的硫辛酸和硫酸葡聚糖充分溶解于0.1mol/L的PBS溶液中，充分混合均匀，之后用调节pH至7.5用于实验研究。
对照稀释液1为仅含0.05％的硫辛酸及PBS缓冲液；对照稀释液2为仅含0.1％的硫酸葡聚糖及PBS缓冲液。对照稀释液1和对照稀释液2同上述配制方法。
二、检测方法
使用本发明配制的稀释液检测人血清或血浆样品中25羟基维生素D含量的方法，具体包括如下步骤：
1.制备包被抗25羟基维生素D抗体的磁微粒混悬液；
2.配制含25羟基维生素D抗原的梯度校准品；
3.制备辣根过氧化物酶标记的25羟基维生素D；
4.实验组稀释液及对照组稀释液按本实施例步骤一方法配制；
5.选择20份按照正确医用技术采集处理的当日新鲜临床样本，进行25羟基维生素D含量的检测；
6.将一定量的待测样本、校准品分别添加于反应杯中；添加一定量混匀的磁微粒混悬液；添加一定量的实验组稀释液或对照组稀释液；加入适量的酶结合物混匀后于37℃温育；采用磁分离设备使磁珠分离并洗涤；将磁珠震荡混匀后添加发光底物避光反应；
7.使用化学发光免疫分析仪检测发光强度。
三、临床比对研究
20份当日新鲜采集的临床样本化学发光法与液相串联质谱同时进行实验检测25羟基维生素D，如表1所示，采用含质量比0.05％的硫辛酸及0.1％的硫酸葡聚糖稀释液的实验组与质谱相比没有出现样本之间浓度偏差超过10％的异常结果；
对照稀释液1小组的检测结果表明，20份新鲜样本与质谱浓度相比整体偏高98.7％；
对照稀释液2小组的检测结果表明，20份新鲜样本与质谱浓度相比整体偏高96.3％。
表1
Figure BDA0003254143820000051
Figure BDA0003254143820000061
实施例2
一、稀释液配方及其制备方法
首先制备本发明缓冲液，其中包含质量比0.5％的硫辛酸及2.5％的硫酸葡聚糖及MOPS缓冲液。制备方法：先将上述比例的硫辛酸与硫酸葡聚糖充分溶解于0.5mol/L的MOPS缓冲溶液中，充分混合均匀，之后用调节pH至9.0用于实验研究。
对照稀释液1为仅含0.5％的硫辛酸及MOPS缓冲液；对照稀释液2为仅含2.5％的硫酸葡聚糖及MOPS缓冲液。对照稀释液1和对照稀释液2同上述配制方法。
二、检测方法
使用本发明配制的稀释液检测人血清或血浆样品中反三碘甲状腺原氨酸含量的方法，具体包括如下步骤：
1.制备包被反三碘甲状腺原氨酸抗原的磁微粒混悬液；
2.配制含反三碘甲状腺原氨酸抗原的梯度校准品；
3.制备辣根过氧化物酶标记的抗反三碘甲状腺原氨酸抗体；
4.实验组稀释液及对照组稀释液按本实施例步骤一方法配制；
5.选择20份按照正确医用技术采集处理的当日新鲜临床样本,进行反三碘甲状腺原氨酸含量的检测；
6.将一定量的待测样本、校准品分别添加于反应杯中；添加一定量的实验组稀释液或对照组稀释液；添加一定量混匀的磁微粒混悬液；加入适量的酶结合物混匀后于37℃温育；采用磁分离设备使磁珠分离并洗涤；将磁珠震荡混匀后添加发光底物避光反应；
7.使用化学发光免疫分析仪检测发光强度。
三、临床比对研究
20份当日新鲜采集的临床样本化学发光法与液相串联质谱同时进行实验检测反三碘甲状腺原氨酸，如表2所示，采用含质量比0.5％的硫辛酸及2.5％的硫酸葡聚糖稀释液的实验组与质谱相比没有出现样本之间浓度偏差超过10％的异常结果；
对照稀释液1小组的检测结果表明，20份新鲜样本与质谱浓度相比整体平均偏高68.1％；
对照稀释液2小组的检测结果表明，20份新鲜样本与质谱浓度相比整体平均偏高75.8％。
表2
Figure BDA0003254143820000071
实施例3
一、稀释液配方及其制备方法
首先制备本发明缓冲液，其中包含质量比0.25％的硫辛酸及0.75％的硫酸葡聚糖及Tris-HCl缓冲液。制备方法：先将上述比例的硫辛酸与硫酸葡聚糖充分溶解于0.1mol/L的Tris-HCl缓冲溶液中，充分混合均匀，之后用调节pH至8.5用于实验研究。
对照稀释液1为仅含0.25％的硫辛酸及Tris-HCl缓冲液；对照稀释液2为仅含0.75％的硫酸葡聚糖及Tris-HCl缓冲液。对照稀释液1和对照稀释液2同上述配制方法。
二、检测方法
使用本发明配制的稀释液检测人血清或血浆样品中骨钙素含量的方法，具体包括如下步骤：
1.制备包被抗骨钙素抗体磁微粒混悬液；
2.配制含骨钙素的梯度校准品；
3.制备辣根过氧化物酶标记的抗骨钙素抗体；
4.实验组稀释液及对照组稀释液按本实施例步骤一方法配制；
5.选择20份按照正确医用技术采集处理的当日新鲜临床样本，进行骨钙素含量的检测；
6.将一定量的待测样本、校准品分别添加于反应杯中；添加一定量的实验组稀释液或对照组稀释液；添加一定量混匀的磁微粒混悬液；加入适量的酶结合物混匀后于37℃温育；采用磁分离设备使磁珠分离并洗涤；将磁珠震荡混匀后添加发光底物避光反应；
7.使用化学发光免疫分析仪检测发光强度。
三、临床比对研究
将20份当日新鲜采集的临床样本与罗氏电化学发光法同时检测骨钙素。如表3所示，在这20份样本的检测中，含质量比0.25％的硫辛酸及0.75％的硫酸葡聚糖稀释液的实验组，其检测结果与罗氏测量结果浓度偏差均未超过10％；
对照稀释液1小组的检测结果表明，20份新鲜样本与与罗氏测量结果相比相比，浓度偏差整体超过72.5％；
而对照稀释液2小组的检测结果表明，20份新鲜样本与与罗氏测量结果相比相比，浓度偏差整体超过59.2％。
表3
Figure BDA0003254143820000091
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种样本稀释液，其特征在于，所述样本稀释液包括组分A、组分B和生物缓冲液；所述组分A为硫辛酸或二氢硫辛酸；所述组分B为硫酸葡聚糖或其盐。
2.根据权利要求1所述的样本稀释液，其特征在于，所述组分A在样本稀释液中的质量百分浓度为0.05％～5％，所述组分B在样本稀释液中的质量百分浓度为0.01％～5％。
3.根据权利要求1所述的样本稀释液，其特征在于，所述组分A在样本稀释液中的质量百分浓度为0.05％～2.0％，所述组分B在样本稀释液中的质量百分浓度为0.1％～3.0％。
4.根据权利要求1所述的样本稀释液，其特征在于，所述组分A在样本稀释液中的质量百分浓度为0.05％～0.5％，所述组分B在样本稀释液中的质量百分浓度为0.1％～2.5％。
5.根据权利要求1所述的样本稀释液，其特征在于，所述生物缓冲液选自磷酸盐缓冲液、HEPES缓冲液、MOPS缓冲液、Tris-HCl缓冲液、MES缓冲液中的一种或多种。
6.根据权利要求1所述的样本稀释液，其特征在于，所述生物缓冲液的浓度为0.01～1.0mol/L。
7.根据权利要求1所述的样本稀释液，其特征在于，所述样本稀释液的pH值为6～10。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的样本稀释液，其特征在于，所述硫酸葡聚糖或其盐的分子量为3～1000kDa。
9.权利要求1至8中任一项所述样本稀释液的制备方法，其特征在于，将组分A、组分B溶解于生物缓冲液，调节pH值。
10.一种消除新鲜样本检测异常的免疫分析方法，其特征在于，在基于抗原抗体结合的免疫分析方法中，采用权利要求1至8中任一项所述样本稀释液对待测样本进行处理。
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