JPH01153962A - 甲状腺ホルモンのアッセイ法およびそれに用いる試薬システム - Google Patents
甲状腺ホルモンのアッセイ法およびそれに用いる試薬システムInfo
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- JPH01153962A JPH01153962A JP63266999A JP26699988A JPH01153962A JP H01153962 A JPH01153962 A JP H01153962A JP 63266999 A JP63266999 A JP 63266999A JP 26699988 A JP26699988 A JP 26699988A JP H01153962 A JPH01153962 A JP H01153962A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は、チロキシン（Ｔ４）やトリヨードサイロニン
（Ｔ３）のような甲状腺ホルモンの測定方法、および該
方法に用いる試薬システムに関する。本発明の方法はフ
ロセミド［４−クロロ−Ｎ−（２−フリルメチル）−５
−スルファモイルアントラニル酸］またはその類似化合
物を用い、甲状腺ホルモンを適当なアッセイ試薬で測定
することができるように、結合タンパク質から甲状腺ホ
ルモンをフロセミドで置換する（ｄｉｓｐｌａｃｅ）こ
とを特徴とする。フロセミドは抗体との交差反応性が非
常に低いので、アッセイに用いた抗体に甲状腺ホルモン
またはトレーサーが結合するのを抑制しないという利点
を有する。
（Ｔ３）のような甲状腺ホルモンの測定方法、および該
方法に用いる試薬システムに関する。本発明の方法はフ
ロセミド［４−クロロ−Ｎ−（２−フリルメチル）−５
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物を用い、甲状腺ホルモンを適当なアッセイ試薬で測定
することができるように、結合タンパク質から甲状腺ホ
ルモンをフロセミドで置換する（ｄｉｓｐｌａｃｅ）こ
とを特徴とする。フロセミドは抗体との交差反応性が非
常に低いので、アッセイに用いた抗体に甲状腺ホルモン
またはトレーサーが結合するのを抑制しないという利点
を有する。
（従来の技術および発明が解決しようとする課題）血漿
や血清などの生物学的試料中のＴ、およびＴ、の濃度を
測定することは、種々の疾患や生理状態の診断および治
療に非常に有用である。正常なヒト血清では、存在する
Ｔ４の約９９．９７％、Ｔつの約９９７％が、チロキシ
ン結合グロブリン（ＴＢＧ）、チロキシン結合プレアル
ブミン（ＴＢＰＡ）およびアルブミンなどのタンパク質
に結合しており、残るＴ４の０６０３％およびＴ３の０
．３％は未結合の（透析し得る、すなわち遊離の）ホル
モンとして存在する。甲状腺ホルモンの濃度はまた、甲
状腺分泌および分解などの他の因子と一緒になってＴＢ
Ｇの血清濃度に依存する。しかしながら、この場合、他
の結合タンパク質はＴＢＧに比べると甲状腺ホルモンに
対する結合親和性がはるかに小さいので相対的に重要度
が低い。ＴＢＧの？ＩＪ度は妊娠、卵胞ホルモン治療ま
たは遺伝的異常などの状態で上昇し、これらの状況下で
血清中のＴ４およびＴ、の全量は増大する。逆にアンド
ロゲン治療のあいだ、またはＴＢＧの遺伝的欠損により
一血清ＴＢＧ濃度は減少する。このことは甲状腺ホルモ
ンの濃度が減少することと関連している。
や血清などの生物学的試料中のＴ、およびＴ、の濃度を
測定することは、種々の疾患や生理状態の診断および治
療に非常に有用である。正常なヒト血清では、存在する
Ｔ４の約９９．９７％、Ｔつの約９９７％が、チロキシ
ン結合グロブリン（ＴＢＧ）、チロキシン結合プレアル
ブミン（ＴＢＰＡ）およびアルブミンなどのタンパク質
に結合しており、残るＴ４の０６０３％およびＴ３の０
．３％は未結合の（透析し得る、すなわち遊離の）ホル
モンとして存在する。甲状腺ホルモンの濃度はまた、甲
状腺分泌および分解などの他の因子と一緒になってＴＢ
Ｇの血清濃度に依存する。しかしながら、この場合、他
の結合タンパク質はＴＢＧに比べると甲状腺ホルモンに
対する結合親和性がはるかに小さいので相対的に重要度
が低い。ＴＢＧの？ＩＪ度は妊娠、卵胞ホルモン治療ま
たは遺伝的異常などの状態で上昇し、これらの状況下で
血清中のＴ４およびＴ、の全量は増大する。逆にアンド
ロゲン治療のあいだ、またはＴＢＧの遺伝的欠損により
一血清ＴＢＧ濃度は減少する。このことは甲状腺ホルモ
ンの濃度が減少することと関連している。
しかしながら、上記のごと（ＴＢＧ濃度の変化したいず
れの状況においても、患者の甲状腺機能は正常であり、
遊離のＴ４およびＴ３濃度ならびにＴＢＧ異−常の補正
をした全Ｔ４およびＴ、濃度は正常の範囲内にある。
れの状況においても、患者の甲状腺機能は正常であり、
遊離のＴ４およびＴ３濃度ならびにＴＢＧ異−常の補正
をした全Ｔ４およびＴ、濃度は正常の範囲内にある。
米国特許第３．９１１．０９６号明細書には、ヒト血清
試料中のＴ３またはＴ４濃度を測定するためのラジオイ
ムノアッセイ法が開示されている。この方法では、血清
試料をバルビツールまたは他のバッファーとともにイン
キユベートしてＴ３またはＴ４を「ブロッキング剤」、
放射性標識Ｔ３またはＴ ４、およびＴ、またはＴ４に
特異的な抗体で置換する。ついて結合した放射性Ｔ３ま
たはＴ４を測定し、標準曲線に対してホルモン濃度を決
定する。「ブロッキング作目としては、８−アニリノ−
１−ナフタレンスルホン酸（ＡＮＳ）、３−（４−アニ
リノ−１−ナフチルアゾ）２，７−ナフタレンジスルホ
ン酸（Ａ Ｎ Ｎ Ｄ Ｓ ）、２，４．６−）リニト
ロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）、ナフタレンスルホ
ン酸、チメロサール、５．５−ジフェニル２−チオヒダ
ントイン、ドクサビンＨＣＩ、ジアゼパム、サリチル酸
ナトリウム、プロクロルペラジン、ハロフェナート（Ｍ
Ｋ−１８５）［メルク・シャープ・アンド・ドーム（Ｍ
ｅｒｃｋ ５ｈａｒｐ ａｎｄ Ｄｏｈｍｅ）］が挙げ
られる。
試料中のＴ３またはＴ４濃度を測定するためのラジオイ
ムノアッセイ法が開示されている。この方法では、血清
試料をバルビツールまたは他のバッファーとともにイン
キユベートしてＴ３またはＴ４を「ブロッキング剤」、
放射性標識Ｔ３またはＴ ４、およびＴ、またはＴ４に
特異的な抗体で置換する。ついて結合した放射性Ｔ３ま
たはＴ４を測定し、標準曲線に対してホルモン濃度を決
定する。「ブロッキング作目としては、８−アニリノ−
１−ナフタレンスルホン酸（ＡＮＳ）、３−（４−アニ
リノ−１−ナフチルアゾ）２，７−ナフタレンジスルホ
ン酸（Ａ Ｎ Ｎ Ｄ Ｓ ）、２，４．６−）リニト
ロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）、ナフタレンスルホ
ン酸、チメロサール、５．５−ジフェニル２−チオヒダ
ントイン、ドクサビンＨＣＩ、ジアゼパム、サリチル酸
ナトリウム、プロクロルペラジン、ハロフェナート（Ｍ
Ｋ−１８５）［メルク・シャープ・アンド・ドーム（Ｍ
ｅｒｃｋ ５ｈａｒｐ ａｎｄ Ｄｏｈｍｅ）］が挙げ
られる。
より最近の方法ではバルビツールまたはバッファーを用
いず、その代わり上記米国特許第３．９１１．０９６号
明細書に記載しであるようなＡＮＳなどのいわゆる「ブ
ロッキング剤」のみを用いている。ＡＮＳの不利な点は
それが光感受性であることであり、そのため吸収測定を
妨害し得る。
いず、その代わり上記米国特許第３．９１１．０９６号
明細書に記載しであるようなＡＮＳなどのいわゆる「ブ
ロッキング剤」のみを用いている。ＡＮＳの不利な点は
それが光感受性であることであり、そのため吸収測定を
妨害し得る。
それより以前の方法では溶媒抽出、試料の酵素分解、ま
たはＴ３またはＴ４ホルモンを抽出するための他の試薬
を用いていた。これらの方法は煩わしく、また処理工程
で甲状腺ホルモン濃度の正確な測定が妨害されることが
わかった。それゆえ、Ｔ３およびＴ４ホルモンの測定の
ための改良した方法が望まれている。
たはＴ３またはＴ４ホルモンを抽出するための他の試薬
を用いていた。これらの方法は煩わしく、また処理工程
で甲状腺ホルモン濃度の正確な測定が妨害されることが
わかった。それゆえ、Ｔ３およびＴ４ホルモンの測定の
ための改良した方法が望まれている。
（課題を解決するための手段）
本発明は、試料中のチロキシン（Ｔ４）およびトリヨー
ドサイロニン（Ｔ３）よりなる群から選ばれた甲状腺ホ
ルモンの濃度の測定方法であって、試料をフロセミドで
処理して結合タンパク質からＴ３およびＴ４を置換し、
ついで置換したＴ３およびＴ４の量を測定することを特
徴とする。置換したＴ、ｌおよびＴ４の量は、種々の知
られた甲状腺ホルモンアッセイ試薬および方法のいずれ
を用いても測定することができる。好ましくはフロセミ
ドを、他の置換試薬すなわち「ポツパー（ｐｏｐｐｅｒ
）Ｊおよび従来の試薬システムおよび方法に用いていた
置換工程の代わりに用いる。
ドサイロニン（Ｔ３）よりなる群から選ばれた甲状腺ホ
ルモンの濃度の測定方法であって、試料をフロセミドで
処理して結合タンパク質からＴ３およびＴ４を置換し、
ついで置換したＴ３およびＴ４の量を測定することを特
徴とする。置換したＴ、ｌおよびＴ４の量は、種々の知
られた甲状腺ホルモンアッセイ試薬および方法のいずれ
を用いても測定することができる。好ましくはフロセミ
ドを、他の置換試薬すなわち「ポツパー（ｐｏｐｐｅｒ
）Ｊおよび従来の試薬システムおよび方法に用いていた
置換工程の代わりに用いる。
用いるフロセミドの世は、実質的にすべてのＴ。
およびＴ、を置換しうるように、試料の大きさの関数と
して計算する。検出方法としては、蛍光、吸収、蛍光偏
光、化学ルミネッセンスまたは放射性手段のいずれも用
いることができる。
して計算する。検出方法としては、蛍光、吸収、蛍光偏
光、化学ルミネッセンスまたは放射性手段のいずれも用
いることができる。
他の態様において、本発明は試料中のチロキシン（Ｔ４
）およびトリヨードサイロニン（Ｔ３）よりなる群から
選ばれた甲状腺ホルモンのａ度を測定すべ（設計された
試薬システムに関し、これは試料中の結合タンパク質に
結合した実質的にすべてのＴ３およびＴ４を置換するに
充分な量のフロセミドからなる。
）およびトリヨードサイロニン（Ｔ３）よりなる群から
選ばれた甲状腺ホルモンのａ度を測定すべ（設計された
試薬システムに関し、これは試料中の結合タンパク質に
結合した実質的にすべてのＴ３およびＴ４を置換するに
充分な量のフロセミドからなる。
試薬システムの残る部分については、種々の甲状腺ホル
モン試薬システムのいずれを用いることもできる。好ま
しくはフロセミドを、他の置換試薬すなわち「ポツパー
」およびそのような甲状腺ホルモン試薬システムに一般
に用いていた置換工程の代わりに用いる。試薬システム
および方法論として幾つかを挙げれば、蛍光酵素イムノ
アッセイ、蛍光（（Ｗ 先イムノアッセイ、化学ルミネ
ッセンスイムノアッセイ、ラジオイムノアッセイおよび
比色酵素イムノアッセイなどが挙げられる。
モン試薬システムのいずれを用いることもできる。好ま
しくはフロセミドを、他の置換試薬すなわち「ポツパー
」およびそのような甲状腺ホルモン試薬システムに一般
に用いていた置換工程の代わりに用いる。試薬システム
および方法論として幾つかを挙げれば、蛍光酵素イムノ
アッセイ、蛍光（（Ｗ 先イムノアッセイ、化学ルミネ
ッセンスイムノアッセイ、ラジオイムノアッセイおよび
比色酵素イムノアッセイなどが挙げられる。
（発明の構成および効果）
本発明は、全血、血清および血漿などの生物学的試料中
のチロキシン（Ｔ４）およびトリヨードサイロニン（Ｔ
３）を決定する方法に関するものである。本発明の方法
では、甲状腺ホルモンのイムノアッセイにおいて置換試
薬としてフロセミドを用いる。フロセミドは、チロキシ
ン結合グロブリン（ＴＢＧ）、アルブミンおよびプレア
ルブミンなどの結合性タンパク質から該ホルモンを置換
し、適当な抗体を用いて血清または血漿中のこれらのホ
ルモンを直接的に測定することができるようにする。
のチロキシン（Ｔ４）およびトリヨードサイロニン（Ｔ
３）を決定する方法に関するものである。本発明の方法
では、甲状腺ホルモンのイムノアッセイにおいて置換試
薬としてフロセミドを用いる。フロセミドは、チロキシ
ン結合グロブリン（ＴＢＧ）、アルブミンおよびプレア
ルブミンなどの結合性タンパク質から該ホルモンを置換
し、適当な抗体を用いて血清または血漿中のこれらのホ
ルモンを直接的に測定することができるようにする。
フロセミドは、分析対象物であるＴ１、Ｔ４またはトレ
ーサー（すなわち酵素標識、酵素インヒビター標識、蛍
光標識または放射性標識などのＴ３またはＴ４誘導体）
が抗体に結合するのを妨害しないため、置換試薬として
特に有利である。このことは、８−アニリノ−１−ナフ
タレンスルホン酸（ＡＮＳ）やサリチル酸塩のような他
の古典的な置換試薬に比べて有利な点である。さらにフ
ロセミドは、アッセイ試薬システム中において溶解性を
保持しているので取り扱い性能が向上している。
ーサー（すなわち酵素標識、酵素インヒビター標識、蛍
光標識または放射性標識などのＴ３またはＴ４誘導体）
が抗体に結合するのを妨害しないため、置換試薬として
特に有利である。このことは、８−アニリノ−１−ナフ
タレンスルホン酸（ＡＮＳ）やサリチル酸塩のような他
の古典的な置換試薬に比べて有利な点である。さらにフ
ロセミドは、アッセイ試薬システム中において溶解性を
保持しているので取り扱い性能が向上している。
フロセミドは、遊離の甲状腺ホルモンを同定するために
用いる試薬とともに試料に直接加える。
用いる試薬とともに試料に直接加える。
フロセミドは、蛍光、吸収、化学ルミネッセンスまたは
ラジオイムノアッセイ用に設計されたものなどのすべて
の甲状腺ホルモン試薬システムに用いることができる。
ラジオイムノアッセイ用に設計されたものなどのすべて
の甲状腺ホルモン試薬システムに用いることができる。
それゆえ、フロセミドは、置換試薬すなわち「ポツパー
」として甲状腺ホルモンアッセイ試薬システムに都合の
よい添加剤である。
」として甲状腺ホルモンアッセイ試薬システムに都合の
よい添加剤である。
さらに、フロセミドを用いることによって、他の点では
従来通りの甲状腺ホルモンアッセイ試薬システムおよび
方法において以前用いられていた池の置換試薬またはホ
ルモン置換工程をすべて完全に排除してしまえることが
一層好ましい。用いるフロセミドの量は、特定のアッセ
イ条件下で結合タンパク質からホルモンを置換するのに
必要な量に依存する。このことは、甲状腺ホルモンアッ
セイの技術分野における当業者により、入手可能な試験
用サンプルの関数として容易に決定することができる。
従来通りの甲状腺ホルモンアッセイ試薬システムおよび
方法において以前用いられていた池の置換試薬またはホ
ルモン置換工程をすべて完全に排除してしまえることが
一層好ましい。用いるフロセミドの量は、特定のアッセ
イ条件下で結合タンパク質からホルモンを置換するのに
必要な量に依存する。このことは、甲状腺ホルモンアッ
セイの技術分野における当業者により、入手可能な試験
用サンプルの関数として容易に決定することができる。
フロセミド［４−クロロ−Ｎ−（２−フリルメチル）−
５−スルファモイルアントラニル酸］は下記構造式で表
すことができる。
５−スルファモイルアントラニル酸］は下記構造式で表
すことができる。
フロセミドの類似化合物または誘導体は、甲状腺ホルモ
ン試薬システムにおいて置換試薬として同様の結果を得
ることができ、それゆえ本発明の範囲に含まれる。
ン試薬システムにおいて置換試薬として同様の結果を得
ることができ、それゆえ本発明の範囲に含まれる。
本発明の方法に従って、甲状腺ホルモンの置換試薬とし
てフロセミドを種々の甲状腺ホルモン試薬システムのい
ずれにも用いることができる。フロセミドは、実質的に
すべて、好ましくはすべての利用できる結合甲状腺ホル
モン（Ｔ、およびＴ３）を置換するに充分な量で試料に
加える。放出された甲状腺ホルモンを定量すべく選んだ
試薬システムを加える前に試料をフロセミドで処理する
こともできるし、試料を試薬システムと同時に加えるこ
ともできる。
てフロセミドを種々の甲状腺ホルモン試薬システムのい
ずれにも用いることができる。フロセミドは、実質的に
すべて、好ましくはすべての利用できる結合甲状腺ホル
モン（Ｔ、およびＴ３）を置換するに充分な量で試料に
加える。放出された甲状腺ホルモンを定量すべく選んだ
試薬システムを加える前に試料をフロセミドで処理する
こともできるし、試料を試薬システムと同時に加えるこ
ともできる。
置換試薬のフロセミドは、置換した甲状腺ホルモンを競
合アッセイ法かまたは非競合アッセイ法により定量する
ために種々の甲状腺ホルモン試薬システムのいずれにも
用いることができる。フロセミド付加試薬システムもま
た蛍光、吸収、蛍光偏光、化学ルミネッセンスまたはラ
ジオイムノアッセイのような種々の検出法のいずれにも
用いることができる。甲状腺ホルモンアッセイに用いら
れフロセミドと両立し得る典型的な標識としては、蛍光
酵素標識、化学ルミネッセンス標識、比色標識、ルミネ
ッセンス標識物質、放射性標識および金属または非金属
標識が挙げられる。
合アッセイ法かまたは非競合アッセイ法により定量する
ために種々の甲状腺ホルモン試薬システムのいずれにも
用いることができる。フロセミド付加試薬システムもま
た蛍光、吸収、蛍光偏光、化学ルミネッセンスまたはラ
ジオイムノアッセイのような種々の検出法のいずれにも
用いることができる。甲状腺ホルモンアッセイに用いら
れフロセミドと両立し得る典型的な標識としては、蛍光
酵素標識、化学ルミネッセンス標識、比色標識、ルミネ
ッセンス標識物質、放射性標識および金属または非金属
標識が挙げられる。
つぎに実施例に基づいて本発明をさらに詳しく説明する
が、本発明はこれらに限られるものではない。
が、本発明はこれらに限られるものではない。
実施例１
本実施例では、甲状腺ホルモンの測定に置換試薬として
フロセミドを用い、標準曲線を作成して未知のＴ４濃度
と標準曲線との正確な相関が得られるようにする。
フロセミドを用い、標準曲線を作成して未知のＴ４濃度
と標準曲線との正確な相関が得られるようにする。
本実施例の酵素インヒビターイムノアッセイに用いた試
薬は、アセチルコリンエステラーゼ、フロセミド、およ
びウシチログロブリン結合チロキシンでヒツジを免疫す
ることにより得られたＴ。
薬は、アセチルコリンエステラーゼ、フロセミド、およ
びウシチログロブリン結合チロキシンでヒツジを免疫す
ることにより得られたＴ。
結合抗血清またはＴ４抗体であった。Ｔ４抗体は、最終
希釈１：（３ｏ、０００で用いた。酵素インヒビターイ
ムノアッセイ手順は以下のようにして行った。
希釈１：（３ｏ、０００で用いた。酵素インヒビターイ
ムノアッセイ手順は以下のようにして行った。
第一の水性試薬は、タンパク安定他剤添加（０゜６モル
／（ｌ硫酸リチウム）Ｈｅｐｅｓバッファー中のヒツジ
抗チロキシン抗血清（１６，６μｍ２／１２）、アセチ
・ルフリンエステラーゼ（３４Ｕ／のおよびフロセミド
（０，７ｍＭ／１２）からなっていた。
／（ｌ硫酸リチウム）Ｈｅｐｅｓバッファー中のヒツジ
抗チロキシン抗血清（１６，６μｍ２／１２）、アセチ
・ルフリンエステラーゼ（３４Ｕ／のおよびフロセミド
（０，７ｍＭ／１２）からなっていた。
第二の水性試薬は、クエン酸バッフ１−中のチロキシン
−インヒビター結合体（８ｎＭ／１２）、５゜５′−ジ
チオビス−（２−二トロ安息香酸）（Ｄ Ｔ ＮＢ０２
ｍＭ／４）およびヨウ化Ｓ−アセチル−Ｂ−（メチルチ
オ）コリン（３，８５＋ａＭ／１２）からなっていた。
−インヒビター結合体（８ｎＭ／１２）、５゜５′−ジ
チオビス−（２−二トロ安息香酸）（Ｄ Ｔ ＮＢ０２
ｍＭ／４）およびヨウ化Ｓ−アセチル−Ｂ−（メチルチ
オ）コリン（３，８５＋ａＭ／１２）からなっていた。
第一の試薬溶液（１６８μのを血漿（３，６μのに加え
混合した。この混合物を約５分間インキュベートした。
混合した。この混合物を約５分間インキュベートした。
ついで第二の試薬溶液（８５μρ）を加え、所定の時間
間隔で４１５ｎｍおよび５００ｎｍ波長での吸収読み取
りを行った。この甲状腺ホルモンアッセイにおいて、試
料のチロキシンは、チロキシンと似た構造を有する酵素
インヒビター（Ｔ４−結合体）と特異的抗体上の結合部
位において競合する。遊離の結合体の量は、酵素活性の
失われた割合を測定することにより決定する。Ｔ、−結
合体および試料中のチロキシンは、溶液中のそれぞれの
濃度に比例して結合する。フロセミドは、血清結合タン
パク質からチロキシンを遊離させ、引き続く結合を防ぐ
ために用いる。
間隔で４１５ｎｍおよび５００ｎｍ波長での吸収読み取
りを行った。この甲状腺ホルモンアッセイにおいて、試
料のチロキシンは、チロキシンと似た構造を有する酵素
インヒビター（Ｔ４−結合体）と特異的抗体上の結合部
位において競合する。遊離の結合体の量は、酵素活性の
失われた割合を測定することにより決定する。Ｔ、−結
合体および試料中のチロキシンは、溶液中のそれぞれの
濃度に比例して結合する。フロセミドは、血清結合タン
パク質からチロキシンを遊離させ、引き続く結合を防ぐ
ために用いる。
本実施例の試験では、０．３．６．１２および２４μ９
／ｄｆｆの濃度のわずかな量のチロキシンによる５つの
カリブレーク−を用いた。酵素活性の消失に関する時間
定数は、４パラメ一タ一対数曲線に対応させ検定曲線を
作成した。チロキシンカリブレーク−の濃度範囲（０〜
２４μｇ／ｄ９）は、たいていの患者試料のチロキシン
濃度を正確に決定するのに充分である。最も濃度の高い
カリブレーク−（２４μｇ／ｄのよりも高い濃度のチロ
キシンを含有する試料の場合には、試料をカリブレーク
−で希釈し再アッセイすることにより正確に決定す・る
ことかできる。試料のチロキシン値は、希釈試料から得
られた結果に希釈係数を掛けることにより計算する。
／ｄｆｆの濃度のわずかな量のチロキシンによる５つの
カリブレーク−を用いた。酵素活性の消失に関する時間
定数は、４パラメ一タ一対数曲線に対応させ検定曲線を
作成した。チロキシンカリブレーク−の濃度範囲（０〜
２４μｇ／ｄ９）は、たいていの患者試料のチロキシン
濃度を正確に決定するのに充分である。最も濃度の高い
カリブレーク−（２４μｇ／ｄのよりも高い濃度のチロ
キシンを含有する試料の場合には、試料をカリブレーク
−で希釈し再アッセイすることにより正確に決定す・る
ことかできる。試料のチロキシン値は、希釈試料から得
られた結果に希釈係数を掛けることにより計算する。
実施例２
本実施例では、酵素イムノアッセイにおける甲状１１１
ホルモンの測定に置換試薬としてフロセミドを用いる。
ホルモンの測定に置換試薬としてフロセミドを用いる。
用いた試薬は以下の通りであった。すなわち、Ｔ、とウ
シチログロブリンとの共有結合体で免疫したヤギから得
た、ポリスチレン粒子に結合させたＴ３結合抗血清。抗
体コーティング粒子は、アッセイにおいて適当な用量作
用が得られるように希釈する。フロセミドはこの試薬中
に０゜０１２５％（ｗ／ ｖ）の濃度で含まれる。
シチログロブリンとの共有結合体で免疫したヤギから得
た、ポリスチレン粒子に結合させたＴ３結合抗血清。抗
体コーティング粒子は、アッセイにおいて適当な用量作
用が得られるように希釈する。フロセミドはこの試薬中
に０゜０１２５％（ｗ／ ｖ）の濃度で含まれる。
Ｔ、−アルカリホスファターゼ結合体を調製し、タンパ
ク安定化剤を含有するバッファー中に希釈した。
ク安定化剤を含有するバッファー中に希釈した。
試薬グレードＮａ Ｌ Ｔｓを、最終濃度が０．０
．５、■、２．４および８ｎ９／ｘ１２となるようにＴ
、遊離ヒト血清に重量測定により加えた。これらはカリ
ブレーターとして用いた。
．５、■、２．４および８ｎ９／ｘ１２となるようにＴ
、遊離ヒト血清に重量測定により加えた。これらはカリ
ブレーターとして用いた。
基質は４−メチルランベリフェロイルホスフェートの水
性バッファー溶液からなっていた。ア、。
性バッファー溶液からなっていた。ア、。
セイ希釈液は、トリス（５０ｍＭ）、ＮａＣＩ（０，３
Ｍ）（ｐＨ７，５）からなっていた。
Ｍ）（ｐＨ７，５）からなっていた。
本ア、セイを行うために以下の工程を行った。
カリブレーク−（５０μのまたは試料（５０μＱ）をポ
リスチレン反応ウェルに加えた。これに粒子試！（５０
μＱ）、ついでアッセイ希釈液（１５０μのを加えた。
リスチレン反応ウェルに加えた。これに粒子試！（５０
μＱ）、ついでアッセイ希釈液（１５０μのを加えた。
この混合物を混合し、３４．５℃で約１０分間インキュ
ベートした。粒子試薬中のフロセミドは、結合タンパク
質からＴ３を有効に置換した。
ベートした。粒子試薬中のフロセミドは、結合タンパク
質からＴ３を有効に置換した。
混合物１７５μＱ容をガラスファイバーマトリックスに
移し、アッセイ希釈液の７５μＱアリコートで２回洗浄
した。放出Ｔ３の結合した粒子は、マトリックスに不可
逆的に結合した。
移し、アッセイ希釈液の７５μＱアリコートで２回洗浄
した。放出Ｔ３の結合した粒子は、マトリックスに不可
逆的に結合した。
Ｔ３アルカリホスファターゼ結合体試薬をマトリックス
に加え、４分間のインキュベーションの後、未反応結合
体をアッセイ希釈液の７５μｅアリコ一ト２回で洗い落
とした。
に加え、４分間のインキュベーションの後、未反応結合
体をアッセイ希釈液の７５μｅアリコ一ト２回で洗い落
とした。
ついで基質をマトリックスに加え、生成物であるメチル
ウンベリフェロンの生成速度を蛍光放出により決定した
。
ウンベリフェロンの生成速度を蛍光放出により決定した
。
第１図は、結合Ｔ３の量（ｎｇ／ｘＱ）に対して速度（
ＣＴＳ／秒／秒）をプロットした典型的な標準曲線を示
している。５０％切片は２ 、０ ｎ９／ ｊＩＱであ
り、アッセイの感度は、 ０．１３ｎ９／ｍｆｆにて９
５％の信頼で０から試料を区別する能力により測定した
。
ＣＴＳ／秒／秒）をプロットした典型的な標準曲線を示
している。５０％切片は２ 、０ ｎ９／ ｊＩＱであ
り、アッセイの感度は、 ０．１３ｎ９／ｍｆｆにて９
５％の信頼で０から試料を区別する能力により測定した
。
該プロットは、フロセミドを含有する甲状腺試薬システ
ムで優れた結果が得られたことを示している。
ムで優れた結果が得られたことを示している。
下記に示す第１表は、本実施例のアッセイ（ＥＩＡ）で
得られたＴ、値を、脱ブロッキング剤として８−アニリ
ノ−１−ナフタレンスルホン１（ＡＮＳ）を用いた典型
的なラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）と比較して示した
ものである。
得られたＴ、値を、脱ブロッキング剤として８−アニリ
ノ−１−ナフタレンスルホン１（ＡＮＳ）を用いた典型
的なラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）と比較して示した
ものである。
寒土清
上記表の結果は、置換試薬としてフロセミドを用いるこ
とにより確かな試料の値が得られ、低いＴ３試料、正常
のＴ３試料および高いＴ３試料をアッセイで区別できる
こと、すなわちＴ、をその結合タンパク質から置換する
上において古典的な方法と同等に有効であることを示し
ている。
とにより確かな試料の値が得られ、低いＴ３試料、正常
のＴ３試料および高いＴ３試料をアッセイで区別できる
こと、すなわちＴ、をその結合タンパク質から置換する
上において古典的な方法と同等に有効であることを示し
ている。
【図面の簡単な説明】
第１図は、結合Ｔ、の量に対して酵素分解生成物の生成
速度をプロットした標準曲線を示すグラフである。
速度をプロットした標準曲線を示すグラフである。
Claims (9)
- （１）試料中のチロキシン（Ｔ＿４）およびトリヨード
サイロニン（Ｔ＿３）よりなる群から選ばれた甲状腺ホ
ルモンの濃度の測定方法であって、 （ａ）試料をフロセミドで処理して結合タンパク質から
Ｔ＿３およびＴ＿４を置換し、ついで （ｂ）置換したＴ＿３およびＴ＿４の量を測定すること
を特徴とする方法。 - （２）試料の大きさの関数として実質的にすべてのＴ＿
３およびＴ＿４を置換するためのフロセミドの量を計算
する特許請求の範囲第（１）項記載の方法。 - （３）上記工程（ｂ）を蛍光、吸収、蛍光偏光、化学ル
ミネッセンスまたは放射性手段により行う特許請求の範
囲第（１）項記載の方法。 - （４）試料が血漿または血清試料である特許請求の範囲
第（１）項記載の方法。 - （５）試料中のチロキシン（Ｔ＿４）およびトリヨード
サイロニン（Ｔ＿３）よりなる群から選ばれた甲状腺ホ
ルモンの濃度を測定すべく設計された試薬システムであ
って、試料中の結合タンパク質に結合した実質的にすべ
てのＴ＿３およびＴ＿４を置換するに充分な量のプロア
ミドからなることを特徴とする試薬システム。 - （６）蛍光酵素イムノアッセイを行うためのものである
特許請求の範囲第（５）項記載の試薬システム。 - （７）化学ルミネッセンスイムノアッセイを行うための
ものである特許請求の範囲第（５）項記載の試薬システ
ム。 - （８）ラジオイム／アッセイを行うためのものである特
許請求の範囲第（５）項記載の試薬システム。 - （９）比色酵素イムノアッセイを行うためのものである
特許請求の範囲第（５）項記載の試薬システム。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US11174887A | 1987-10-21 | 1987-10-21 | |
| US111748 | 1987-10-21 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01153962A true JPH01153962A (ja) | 1989-06-16 |
Family
ID=22340241
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63266999A Pending JPH01153962A (ja) | 1987-10-21 | 1988-10-20 | 甲状腺ホルモンのアッセイ法およびそれに用いる試薬システム |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
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| JP (1) | JPH01153962A (ja) |
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| AU (1) | AU2400188A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02302667A (ja) * | 1989-05-17 | 1990-12-14 | Sanyo Chem Ind Ltd | ハプテンの免疫測定法 |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5660991A (en) * | 1994-10-28 | 1997-08-26 | Lakowicz; Joseph R. | Long lifetime anisotropy (polarization) probes for clinical chemistry, immunoassays, affinity assays and biomedical research |
| US7745142B2 (en) | 1997-09-15 | 2010-06-29 | Molecular Devices Corporation | Molecular modification assays |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| US4468469A (en) * | 1981-11-04 | 1984-08-28 | Miles Laboratories, Inc. | Substituted phenylacetic acids and salts as TBP blocking agents in iodothyronine immunoassays |
| US4622293A (en) * | 1983-07-05 | 1986-11-11 | Miles Laboratories, Inc. | Iodothyronine immunoassays employing HMS as TBP blocking agent |
| GB8404843D0 (en) * | 1984-02-24 | 1984-03-28 | Amersham Int Plc | Free analyte assay |
-
1988
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- 1988-10-19 KR KR1019880013596A patent/KR890007075A/ko not_active Application Discontinuation
- 1988-10-19 AU AU24001/88A patent/AU2400188A/en not_active Abandoned
- 1988-10-20 JP JP63266999A patent/JPH01153962A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02302667A (ja) * | 1989-05-17 | 1990-12-14 | Sanyo Chem Ind Ltd | ハプテンの免疫測定法 |
| JPH081433B2 (ja) * | 1989-05-17 | 1996-01-10 | 三洋化成工業株式会社 | ハプテンの免疫測定法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR890007075A (ko) | 1989-06-17 |
| AU2400188A (en) | 1989-05-04 |
| EP0312897A1 (en) | 1989-04-26 |
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