CN115718195A

CN115718195A - 基于化学发光法检测edta血浆样本时提高碱性磷酸酶活性的方法及试剂盒

Info

Publication number: CN115718195A
Application number: CN202211427039.2A
Authority: CN
Inventors: 李秀丽
Original assignee: Beijing Huizhong Medical Equipment Co ltd
Current assignee: Beijing Huizhong Medical Equipment Co ltd
Priority date: 2022-11-15
Filing date: 2022-11-15
Publication date: 2023-02-28

Abstract

本申请属于免疫检测分析技术领域，提供了一种基于化学发光法检测EDTA血浆样本时提高碱性磷酸酶活性的方法及试剂盒，该方法包括：以碱性磷酸酶为标记物的化学发光免疫分析法检测含有EDTA血浆样本的步骤；以及在所述化学发光免疫分析法检测步骤中增加添加金属离子的步骤，或在所述化学发光免疫分析法的检测试剂中添加金属离子的步骤。该试剂盒设置有独立包装的金属离子反应液。本申请通过将样本中含有的抗凝剂EDTA优先与添加的金属离子络合，从而减小甚至消除EDTA对碱性磷酸酶活性的影响，提高了以碱性磷酸酶为标记物的系统中检测EDTA血浆样本的准确度。

Description

基于化学发光法检测EDTA血浆样本时提高碱性磷酸酶活性的方法及试剂盒

技术领域

本申请属于免疫检测分析技术领域，特别涉及一种基于化学发光法检测EDTA血浆样本时提高碱性磷酸酶活性的方法及试剂盒。

背景技术

化学发光免疫分析(chemiluminescence immunoassay,CLIA)，是将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测分析技术。1977年，Halman等将化学发光与抗原抗体免疫反应相结合，创建了化学发光免疫分析方法，相较于传统免疫技术(放射免疫技术、酶免疫技术、荧光免疫技术等)，CLIA既具有放射免疫分析技术的高灵敏度，又具有酶联免疫分析技术的操作简便、快速的特点，且检测过程中不使用对人体和环境有毒有害的试剂，试剂稳定，效期长，便于实现全自动化和不对环境产生污染。

CLIA根据标记物的不同可分为三大类，即直接化学发光免疫分析、酶促化学发光免疫分析和电化学发光免疫分析。其中酶促化学发光免疫分析(CLELA)是以酶标记抗原或抗体进行免疫反应，免疫反应复合物上的酶作用于发光底物，在信号试剂作用下发光用发光信号测定仪进行发光测定，酶的浓度决定了化学发光的强度。目前常用的标记酶有辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、葡萄糖氧化酶、黄嘌呤氧化酶等，它们有各自的发光底物。其中碱性磷酸酶是一种同二聚体金属酶，其空间结构的维持与酶活力的表现都需要金属离子的存在，它的两个单体结合成具有两个活性中心的对称的活性酶，每个活性中心包含3个金属原子，即两个Zn²⁺和一个Mg²⁺，其中Zn²⁺是酶活性所必需的，位于酶活性中心，是酶活性必需基团之一，参与催化作用；Mg²⁺的结合位点是在酶活性中心附近，仅起调节作用。在临床医学样本的检测过程中，含EDTA抗凝剂的采集管采集的样本是临床免疫检测反应中较常用的，在使用含EDTA抗凝剂的采集管采集样本后，采集管中仍会存在大量的EDTA，在碱性磷酸酶促化学发光免疫分析法的检测过程中，当加入碱性磷酸酶的酶标抗原或抗体时，由于EDTA与金属离子具有较强的螯合作用，这部分EDTA会优先螯合维持碱性磷酸酶活性必须的镁离子和锌离子，导致碱性磷酸酶的活性降低甚至失活，进而影响检测结果的准确性，出现假阳性或假阴性的结果。

发明内容

针对现有技术在碱性磷酸酶促化学发光法检测EDTA血浆样本的反应体系中，EDTA会致使碱性磷酸酶活性降低甚至失活的缺陷，本申请的目的在于减小化学发光反应中EDTA血浆样本对碱性磷酸酶活性的干扰，以增加碱性磷酸酶系统可以检测样本的类型，提高以碱性磷酸酶为标记物的系统中检测EDTA血浆样本的准确度。

为了减弱添加有EDTA抗凝剂的血浆样本在免疫反应检测中对碱性磷酸酶活性的影响，本申请通过在检测反应过程中单独添加含有金属离子的溶液，使得样本中含有的EDTA优先与添加的金属离子络合，从而减小甚至消除EDTA对碱性磷酸酶活性的影响。其原理在于EDTA分子中含有配位能力很强的氨氮和羧氧，具有广泛的配位性能，与金属离子形成的络合物的配位比一般为1:1，几乎能与所有的金属离子络合形成螯合物。

为了达到本申请的技术目的，本申请具体通过以下技术方案实现：

作为本申请的一个实施方案，本申请提供了一种基于化学发光法检测EDTA血浆样本时提高碱性磷酸酶活性的方法，包括以下步骤：

以碱性磷酸酶为标记物的化学发光免疫分析法检测含有EDTA血浆样本的步骤；以及

在所述化学发光免疫分析法检测步骤中增加添加金属离子的步骤；或在所述化学发光免疫分析法的检测试剂中添加金属离子的步骤。

在本实施方案中，所述化学发光免疫分析法可以是双抗体夹心法、双位点一步法、间接法测抗体、竞争法以及捕获法中的任一种，但并不局限于以上方法，任何基于如下a)、b)和c)原理的方法均适用于本申请：

a)将碱性磷酸酶分子与抗体或抗原相结合，这种结合不会改变抗体和抗原的免疫学特性，又保留了酶的活性；

b)用碱性磷酸酶标记的抗体或抗原与固相载体上的已知抗原或抗体发生特异性的结合；

c)清洗去除未参与反应的标记后抗体或抗原后，加入底物溶液，使其发生化学反应。

其中，双抗体夹心法、双位点一步法、间接法测抗体、竞争法以及捕获法为本领域技术人员的所熟知的常规方法，同时还可以为基于双抗体夹心法、双位点一步法、间接法测抗体、竞争法以及捕获法的常规方法，在符合如上a)、b)和c)原理的所做出改进的方法。优选的，在本实施方案中采用双抗体夹心法。

在本实施方案中，在所述化学发光免疫分析法检测步骤中增加添加金属离子的步骤，是指在所述化学发光免疫分析法的任一检测步骤之前增加添加金属离子的步骤。

为了将受检含有EDTA的血浆样本对碱性磷酸酶活性的影响因子减小到最小，优选的，在添加碱性磷酸酶标记的抗体或抗原之前实施添加金属离子的步骤，使得受检样本中的EDTA在与碱性磷酸酶中的钙镁离子络合之前优先与添加的金属离子结合。

在本实施方案中，在所述化学发光免疫分析法的检测试剂中添加金属离子的步骤中，所述检测试剂是指化学发光免疫分析法所必须的试剂，具体的可以是免疫吸附剂溶液、标记物溶液、固相载体和酶的底物溶液中的任一种或几种，也可以是检测过程中的其它溶液或试剂，例如受检样本溶液、标本稀释液、缓冲液、洗涤液等。

为了将受检含有EDTA的血浆样本对碱性磷酸酶活性的影响因子减小到最小，优选的，所述金属离子添加在免疫吸附剂溶液、标记物溶液、固相载体、受检样本溶液、缓冲液、洗涤液中任一种或几种，使得受检样本中的EDTA在与碱性磷酸酶中的钙镁离子络合之前优先与添加的金属离子结合。

在本实施方案中，所述的金属离子为金属元素化合物在水中形成的金属元素离子，所述金属元素可以是类金属元素，例如锗、锑、钋；所述金属元素还可以是碱金属，例如锂、钠、钾、铷、铯、钫；所述金属元素还可以是碱土金属，例如铍、镁、钙、锶、钡、镭；所述金属元素还可以是镧系元素，例如镧、铈、镨、钕、钷、钐、铕、钆、铽、镝、钬、铒、铥、镱、镥；所述金属元素还可以是锕系元素，例如锕、钍、镤、铀、镎、钚、镅、锔、锫、锎、锿、镄、钔、锘、铹；所述金属元素还可以是过渡金属，例如钪、钛、钒、铬、锰、铁、钴、镍、铜、锌、钇、锆、铌、钼、锝、钌、铑、钯、银、镉、铪、钽、钨、铼、锇、铱、铂、金、鈩等；所述金属元素还可以是其它金属，例如铝、铟、镓、锡、铊、铅、铋等。

优选的，所述金属离子为钙、镁、锰、铝、锌、铜、铁、钠、锂、钡、锶、铈、钴、铅、钇、镍、汞、铬、钍、钒或铋中之一种或多种元素的离子。

最优选的，所述金属离子为Ca²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Al³⁺、Zn²⁺、Cu²⁺、Fe²⁺、Fe³⁺、Na⁺、Li⁺、Ba²⁺、Sr²⁺、Ce³⁺、Co²⁺、Pb²⁺、Y³⁺、Ni²⁺、Hg²⁺、Cr³⁺、Th⁴⁺、V³⁺、Bi³⁺中之一种或多种。

在本实施方案中，由于EDTA常以二钠或者二钾或者三钾盐的形式用作血浆抗凝剂，作用机制在于它能够螯合血液中的钙离子从而阻止凝血发生。在一般的血浆样本中EDTA常用浓度为1.5mg/mL血液，因此申请人可以结合其与金属离子的配位比，确定所述金属离子的添加浓度，以适量过量的金属离子为最佳。

所述的适量过量的金属离子是指添加的金属离子可以完全络合血浆样本中的EDTA，避免残留有EDTA抑制碱性磷酸酶的活性，即适量过量的金属离子需要确定添加的最低浓度；同时也要确保剩余的金属离子不足以致使检测系统中的蛋白变性或影响反应体系的平衡，影响检测结果的准确性，即适量过量的金属离子还需要确定添加的最高浓度。

具体的，所述的金属离子Ca²⁺的添加浓度为3～50mM/L；

所述的金属离子Mg²⁺的浓度为5～80mM/L；

所述的金属离子Mn²⁺的浓度为3～30mM/L；

所述的金属离子Al³⁺的浓度为1.5～20mM/L；

所述的金属离子Zn²⁺的浓度为1～10mM/L；

所述的金属离子Cu²⁺的浓度为0.3～10mM/L；

所述的金属离子Fe²⁺的浓度为1.5～30mM/L；

所述的金属离子Fe³⁺的浓度为0.15～5mM/L；

所述的金属离子Na⁺、Li⁺、Ba²⁺、Sr²⁺、Ce³⁺、Co²⁺、Pb²⁺、Y³⁺、Ni²⁺、Hg²⁺、Cr³⁺、Th⁴⁺、V³⁺或Bi³⁺的添加浓度分别为0.05～100mM/L。

作为本申请的另一个实施方案，本申请还提供了一种基于碱性磷酸酶促化学发光法检测EDTA血浆的试剂盒。所述试剂盒包含化学发光免疫分析法所必须的试剂，比如结合物溶液、标记物溶液、磁性微粒溶液，同时所述试剂盒还包含独立的金属离子溶液。所述金属离子溶液可以用以络合血浆样本中的EDTA，以消除EDTA对碱性磷酸酶标记物溶液的影响，之所以将金属离子溶液单独包装，而非将金属离子加入免疫结合物溶液、标记物溶液或磁性微粒溶液中混合包装，是为了避免金属离子长时间的与反应试剂共存，影响试剂中某些蛋白的活性和稳定性，严重的会引起试剂中某些蛋白的变性，尤其是对于重金属离子，重金属阳离子可以和蛋白质中游离的羧基形成不溶性的盐，比如铜、铅、锌、铁、钴、镍、锰、镉、汞、钨、钼、金、银等，造成蛋白的变性，影响检测检测的准确性。

具体的，所述试剂盒包括包被抗原或抗体的固相载体反应液、碱性磷酸酶标记的抗原或抗体反应液和碱性磷酸酶的底物反应液，以及独立包装的金属离子反应液。

在本实施方案中，所述固相载体可以是凹孔平板、试管、珠粒等，其材质可以是聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺或纤维素等，抗原或抗体以非共价或物理吸附方式结合到此载体上；对于珠粒固相载体，还可以是磁性微粒，所述磁性微粒是指可均匀分散于一定基液中的胶态复合材料，具有超顺磁性、较高的比表面积、可修饰功能基团等特性，通过磁性微粒表面的功能基团(如氨基、羧基、巯基及环氧乙烷等)进行固定抗原/抗体，相比传统的聚苯乙烯塑料，悬浮性的磁微粒作为固相载体具有较高的比表面积，能够更为充分的与受检样品接触，有助于提高准确率。

在本实施方案中，所述抗原或抗体的固相载体反应液、碱性磷酸酶标记的抗原或抗体反应液和碱性磷酸酶的底物反应液为将抗原或抗体的固相载体、碱性磷酸酶标记的抗原或抗体、碱性磷酸酶的底物分别与缓冲液混合得到，所述金属离子反应液为金属化合物溶于缓冲液中得到。所述缓冲液为本领域通用的缓冲液，比如弱酸及其盐的混合溶液，弱碱及其盐的混合溶液。为了提高试剂的稳定性，优选的，所述缓冲液中还包括防腐剂、蛋白稳定剂和表面活性剂。

优选的，所述金属离子选自钙、镁、锰、铝、锌、铜、铁、钠、锂、钡、锶、铈、钴、铅、钇、镍、汞、铬、钍、钒或铋中之一种或多种元素的离子。

本申请的有益效果为：

本申请通过在以碱性磷酸酶为标记物的化学发光检测系统中独立的添加适量的金属离子，利用EDTA血浆样本中的EDTA可以螯合金属离子的原理，使样本采集管中剩余的EDTA不会螯合碱性磷酸酶酶活性所必需的金属离子，从而消除EDTA抗凝血浆样本对化学发光反应中碱性磷酸酶活性干扰，使碱性磷酸酶保持原有的活性，经试验证明本申请方法与罗氏样本测试结果的线性回归的相关系数均大于0.99，一致性均较好，实现提高了碱性磷酸酶为标记物的系统中检测EDTA血浆样本的准确度的效果。

附图说明

图1是本申请实施例1中PCT项目检测结果；

图2是本申请实施例2中T3项目检测结果；

图3是本申请实施例3中C-P项目检测结果；

图4是本申请实施例4金属离子独立包装的PCT项目测试结果；

图5是本申请实施例5金属离子在加入碱性磷酸酶标抗体/抗原之前和之后的PCT项目测试结果。

具体实施方式

下面将结合本申请具体的实施例，对本申请技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

本申请提供了一种基于化学发光法检测EDTA血浆样本时提高碱性磷酸酶活性的方法，包括以下步骤：

在所述化学发光免疫分析法检测步骤中增加添加金属离子的步骤。

其中，以碱性磷酸酶为标记物的化学发光免疫分析法优选为双抗体夹心法，则检测含有EDTA血浆样本的步骤具体为：

①将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体，洗涤除去未结合的抗体及杂质。

②加EDTA血浆样本使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物，洗涤除去其它未结合的物质。

③加碱性磷酸酶标记的抗体使固相免疫复合物上的抗原与碱性磷酸酶标记的抗体结合，彻底洗涤未结合的碱性磷酸酶标记的抗体，此时固相载体上带有的碱性磷酸酶量与标本中受检物质的量成正相关。

④加发光底物，夹心式复合物中的碱性磷酸酶量催化底物成为有色产物，根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。

进一步的，在所述化学发光免疫分析法检测步骤中增加添加金属离子的步骤，是指在上述①～④操作过程中任一两个连续的步骤之间增加添加金属离子的步骤，具体的可以是将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体，洗涤除去未结合的抗体及杂质后，在固相抗体中添加金属离子溶液；也可以是EDTA血浆样本与固相抗体接触反应形成固相抗原复合物后，添加金属离子溶液；还可以是在形成固相抗原复合物，洗涤除去其它未结合的物质后添加金属离子溶液。通过在碱性磷酸酶标记的抗体与EDTA血浆样本接触之前添加金属离子溶液，使得EDTA血浆样本中的EDTA与金属离子提前络合，消耗了后续检测步骤中EDTA，在后续检测过程碱性磷酸酶活性中心的金属离子得到了保护，保证了催化发光反应中碱性磷酸酶的活性，从而以提高检测结果的准确度。

另外，添加金属离子的步骤还可以是在碱性磷酸酶标记的抗体使固相免疫复合物上的抗原与在碱性磷酸酶标记的抗体结合后添加金属离子溶液，或彻底洗涤未结合的在碱性磷酸酶标记的抗体后加金属离子溶液。通过在碱性磷酸酶标记的抗体与EDTA血浆样本接触之后添加金属离子溶液，虽然EDTA血浆样本中的EDTA与碱性磷酸酶活性中心的金属离子会优先络合，致使部分碱性磷酸酶失活，但是由于检测过程的连续性，各步骤的操作时间较短，因此时间间隔较小，同样也能起到保护碱性磷酸酶活性中心的金属离子的作用，只是效果不如在碱性磷酸酶标记的抗体与EDTA血浆样本接触之前添加。但是如果添加的金属离子为Zn²⁺和Mg²⁺时，添加的金属离子与失去镁离子和锌离子的碱性磷酸酶接触，重新进入酶活性中心达到激活碱性磷酸酶的作用，克服了EDTA对碱性磷酸酶活性的影响，从而以提高检测结果的准确度。

本申请还提供了另一种基于化学发光法检测EDTA血浆样本时提高碱性磷酸酶活性的方法，包括以下步骤：

在所述化学发光免疫分析法的检测试剂中添加金属离子的步骤。

进一步的，在所述化学发光免疫分析法检测试剂中添加金属离子的步骤是指在上述①～④操作过程中使用的任一试剂中添加金属离子的步骤，具体的可以是含有包被抗原或抗体的固相载体、在碱性磷酸酶标记的抗体、碱性磷酸酶的底物、EDTA血浆样本的溶液，以及标本稀释液、缓冲液、洗涤液、终止反应液等。优选的，所述金属离子添加在包被抗原或抗体的固相载体溶液、碱性磷酸酶标记的抗体溶液、DTA血浆样本、标本稀释液中。

在以上两种基于碱性磷酸酶促化学发光法检测EDTA血浆的方法中：

进一步的，所述固相载体为磁性微粒，包括但不限于包被链霉亲和素的磁性微粒、包被羊抗FITC的磁性微粒、羧基化的磁性微粒、甲苯磺酰基磁性微粒、醛基磁性微粒、包被抗原或抗体的磁性微粒。

进一步的，所述金属离子选自钙、镁、锰、铝、锌、铜、铁、钠、锂、钡、锶、铈、钴、铅、钇、镍、汞、铬、钍、钒或铋中之一种或多种元素的离子。优选的，所述金属离子为Ca²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Al³⁺、Zn²⁺、Cu²⁺、Fe²⁺、Fe³⁺、Na⁺、Li⁺、Ba²⁺、Sr²⁺、Ce³⁺、Co²⁺、Pb²⁺、Y³⁺、Ni²⁺、Hg²⁺、Cr³⁺、Th⁴⁺、V³ ⁺、Bi³⁺中之一种或多种。

进一步的，所述的金属离子为Ca²⁺，浓度为3～50mM/L；

所述的金属离子为Mg²⁺，浓度为5～80mM/L；

所述的金属离子为Mn²⁺，浓度为3～30mM/L；

所述的金属离子为Al³⁺，浓度为1.5～20mM/L；

所述的金属离子为Zn²⁺，浓度为1～10mM/L；

所述的金属离子为Cu²⁺，浓度为0.3～10mM/L；

所述的金属离子为Fe²⁺，浓度为1.5～30mM/L；

所述的金属离子为Fe³⁺，浓度为0.15～5mM/L；

所述的金属离子为Na⁺、Li⁺、Ba²⁺、Sr²⁺、Ce³⁺、Co²⁺、Pb²⁺、Y³⁺、Ni²⁺、Hg²⁺、Cr³⁺、Th⁴⁺、V³⁺、Bi³⁺，浓度分别为0.05～100mM/L。

下面结合具体的实施例对本申请技术方案做进一步的证明。如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。

实施例1EDTA抗凝血浆样本对添加金属离子后的PCT项目测试结果的影响

采用北京惠中医疗器械有限公司生产的降钙素原(PCT)测定试剂盒(磁微粒化学发光免疫分析法)，注册证编号：京械注准20162400196。

试剂盒构成如下：

检测方法：

①向反应杯中按顺序加入固定量的PCT抗试剂1、样本(或校准品或质控品)、金属离子反应液、PCT抗试剂2。

②37℃孵育后，加入固定量的磁分离试剂。

③37℃孵育后，清洗去除未参与反应的试剂及样本后，加入底物溶液，使其发生化学反应，读取测试结果。

实验内容：

设置5组实验，共选取5盒试剂盒，第1盒作为对照组，按正常未添加金属离子反应液操作过程检测，记为对照组1；在第2盒试剂测试时，向测试反应体系中加入含Ca²⁺的溶液，使反应体系中Ca²⁺浓度为3mM/L，记为实验组1-1；在第3盒试剂测试时，向测试反应体系中加入含Ca²⁺的溶液，使反应体系中Ca²⁺浓度为50mM/L，记为实验组1-2；在第4盒试剂测试时，向测试反应体系中加入含Mg²⁺的溶液，使反应体系中Mg²⁺浓度为5mM/L，记为实验组1-3；在第5盒试剂测试时，向测试反应体系中加入含Mg²⁺的溶液，使反应体系中Mg²⁺浓度为80mM/L，记为实验组1-4。

使用以上方法同时测试PCT项目的32例样本来自北京航天总医院，测试的样本使用EDTA抗凝管采集，并将测试结果与罗氏测值进行比较，结果见表1。

表1夹心法PCT项目在添加单一金属离子后对EDTA抗凝血浆样本检测结果的影响

如表1和图1，结果显示，PCT项目的临床正常值范围是≤0.05ng/ml。对照组检测的样本结果受抗凝管中的EDTA影响较大，样本测值整体呈降低趋势，部分样本造成假阴性结果。而4个实验组的试剂盒样本测试结果与罗氏样本测试结果一致性均较好,证实4个实验组中所述浓度的金属离子可以消除抗凝管中EDTA对碱性磷酸酶活性的影响。

实施例2EDTA抗凝血浆样本对添加2种及以上金属离子后的T3项目测试结果的影响

使用北京惠中医疗器械有限公司生产的总三碘甲状腺原氨酸(T3)测定试剂盒(磁微粒化学发光免疫分析法)，注册证编号：京械注准20152400279。试剂盒构成如下：

组成	主要成分
		T3抗试剂1	FITC标记的鼠抗人T3单抗，0.05％吐温-20，0.2％防腐剂等
T3抗试剂2	ALP标记的T3抗原，0.05％吐温-20，0.2％防腐剂等
		磁分离试剂	羊抗FITC多抗，磁性微粒等
T3校准品(选配)	T3纯品，混合血清(热灭活牛、马、羊血清)，0.2％防腐剂
		T3质控品(选配)	T3纯品，混合血清(热灭活牛、马、羊血清)，0.2％防腐剂

检测方法：

①向反应杯中按顺序加入固定量的T3抗试剂1、样本(或校准品或质控品)、金属离子反应液。

②37℃孵育后，加入固定量的磁分离试剂。

③37℃孵育后，加入固定量的T3抗试剂2。

④37℃孵育后，清洗去除未参与反应的试剂及样本后，加入底物溶液，使其发生化学反应，读取测试结果。

实验内容：

设置3组实验，共选取3盒试剂盒，第1盒作为对照组，按正常操作过程检测不做金属离子的添加步骤，记为对照组2；在第2盒试剂测试时，向测试反应体系中加入含Mg²⁺、Zn²⁺的溶液，使反应体系中Mg²⁺浓度为5mM/L、Zn²⁺浓度为1mM/L，记为实验组2-1；在第3盒试剂测试时，向测试反应体系中加入含Mg²⁺、Zn²⁺的溶液，使反应体系中Mg²⁺浓度为80mM/L、Zn²⁺浓度为10mM/L，记为实验组2-2。

测试的33例样本来自北京航天总医院，将测试结果与罗氏测值进行比较，结果见表2。

表2竞争法T3项目在添加2种及以上金属离子后对EDTA抗凝血浆检测结果的影响

如表2和图2，结果显示，T3项目的临床正常值范围在0.5～1.6ng/ml之间。对照组检测的样本结果受抗凝管中的EDTA影响较大，样本测值整体呈升高趋势，低值部分样本造成假阴性结果，部分正常值样本造成假阳性结果。而2个实验组的试剂盒样本测试结果与罗氏样本测试结果一致性均较好，证实2个实验组中所述浓度的金属离子可以消除抗凝管中EDTA对碱性磷酸酶活性的影响。

实施例3EDTA抗凝血浆样本对在反应过程中添加重金属离子时的C-P项目测试结果的影响

使用北京惠中医疗器械有限公司生产的C肽(C-P)测定试剂盒(磁微粒化学发光免疫分析法)，注册证编号：京械注准20152400280。试剂盒构成如下：

检测方法：

①向反应杯中按顺序加入固定量的C-P抗试剂1、样本(或校准品或质控品)、金属离子反应液、C-P抗试剂2。

②37℃孵育后，加入固定量的磁分离试剂。

实验内容：

设置2组实验，共选取2盒试剂盒，第1盒作为对照组，按正常操作过程检测，记为对照组3；在第2盒试剂测试时，向测试反应体系中加入含Pb²⁺的溶液，使反应体系中Pb²⁺浓度为1mM/L，记为实验组3-1。

测试的36例样本来自北京航天总医院，将测试结果与罗氏测值进行比较，结果见表3。

表3夹心法C-P项目在反应过程中添加重金属离子时对EDTA抗凝血浆样本检测结果的影响

如表3和图3，结果显示，项目的临床正常值范围在1.06～4.15ng/ml之间。对照组检测的样本结果受抗凝管中的EDTA影响较大，样本测值整体呈降低趋势，部分高值样本造成假阴性结果，部分正常值样本造成假阳性结果。而实验组的试剂盒样本测试结果与罗氏样本测试结果一致性均较好，证实实验组中所述浓度的金属离子可以消除抗凝管中EDTA对碱性磷酸酶活性的影响。

实施例4金属离子独立包装时对PCT项目测试结果的影响

采用北京惠中医疗器械有限公司生产的降钙素原(PCT)测定试剂盒(磁微粒化学发光免疫分析法)，注册证编号：京械注准20162400196，试剂盒构成如下：

检测方法：

①向反应杯中按顺序加入固定量的PCT抗试剂1、样本(或校准品或质控品)、PCT抗试剂2。

②37℃孵育后，加入固定量的磁分离试剂。

实验内容：

设置2组实验，共选取2盒试剂盒，在第1盒试剂测试时，在测试操作过程中，在加入PCT抗试剂2之前向测试反应体系中加入含Ca²⁺的溶液，使反应体系中Ca²⁺浓度为3mM/L，记为实验组4-1；在第2盒的抗试剂溶液中加入Ca²⁺，使反应体系中Ca²⁺浓度为3mM/L，在适宜环境下保存1个月，利用该试剂盒按正常操作过程测试样本，记为实验组4-2。

测试的样本同实施例1，并将测试结果与罗氏测值进行比较，结果见表4。

表4夹心法PCT项目在金属离子未独立包装与独立包装时的测试结果

如表4和图4，结果显示，PCT项目的临床正常值范围是≤0.05ng/ml。金属离子未独立包装时检测的样本结果仍会受抗凝管中的EDTA影响，样本测值整体呈降低趋势，部分样本造成假阴性结果。而金属离子独立包装时试剂盒样本测试结果与罗氏样本测试结果一致性均较好，证实金属离子独立包装时所述浓度的金属离子可以更好的消除抗凝管中EDTA对碱性磷酸酶活性的影响。

实施例5金属离子在加入碱性磷酸酶标抗体/抗原之前和之后的PCT项目测试结果的影响

检测方法：

②37℃孵育后，加入固定量的磁分离试剂。

实验内容：

设置3组实验，共选取3盒试剂盒，向测试反应体系中加入含Ca²⁺的溶液，使反应体系中Ca²⁺浓度为3mM/L；第1盒试剂检测操作时，检测方法步骤①的添加顺序为：固定量的PCT抗试剂1、金属离子反应液、样本(或校准品或质控品)、PCT抗试剂2，记为实验组5-1。第2盒试剂检测操作时，检测方法步骤①的添加顺序为：固定量的PCT抗试剂1、样本(或校准品或质控品)、金属离子反应液、PCT抗试剂2，记为实验组5-2。第3盒试剂检测操作时，检测方法步骤①的添加顺序为：固定量的PCT抗试剂1、样本(或校准品或质控品)、PCT抗试剂2、金属离子反应液，记为实验组5-3。

测试的样本同实施例1，并将测试结果与罗氏测值进行比较，结果见表5。

表5夹心法PCT项目在碱性磷酸酶标抗体之前和之后添加金属离子的测试结果

如表5和图5，结果显示，PCT项目的临床正常值范围是≤0.05ng/ml。在碱性磷酸酶标抗体之后添加金属离子检测的样本结果仍会受抗凝管中的EDTA影响，样本测值整体呈降低趋势，部分样本造成假阴性结果。而在碱性磷酸酶标抗体之前任一步骤时添加金属离子检测的样本结果与罗氏样本测试结果一致性均较好，证实金属离子在碱性磷酸酶标抗体之前添加可以更好的消除抗凝管中EDTA对碱性磷酸酶活性的影响。

Claims

1.一种基于化学发光法检测EDTA血浆样本时提高碱性磷酸酶活性的方法，其特征在于，包括：

在所述化学发光免疫分析法的步骤中增加添加金属离子的步骤，或在所述化学发光免疫分析法的检测试剂中添加金属离子的步骤。

2.根据权利要求1所述的一种基于化学发光法检测EDTA血浆样本时提高碱性磷酸酶活性的方法，其特征在于，所述添加金属离子的步骤在所述化学发光免疫分析法的任一步骤之前实施。

3.根据权利要求2所述的一种基于化学发光法检测EDTA血浆样本时提高碱性磷酸酶活性的方法，其特征在于，在添加碱性磷酸酶标记的抗体或抗原的步骤之前实施添加金属离子的步骤。

4.根据权利要求1所述的一种基于化学发光法检测EDTA血浆样本时提高碱性磷酸酶活性的方法，其特征在于，所述检测试剂为免疫吸附剂溶液、结合物溶液、固相载体和酶的底物溶液、受检样本溶液、标本稀释液、缓冲液、清洗液中任一种或几种。

5.根据权利要求4所述的一种基于化学发光法检测EDTA血浆样本时提高碱性磷酸酶活性的方法，其特征在于，所述检测试剂为免疫吸附剂、固相载体、标本稀释液、受检样本溶液、缓冲液中任一种或几种。

6.根据权利要求1～5中任一项所述的一种基于化学发光法检测EDTA血浆样本时提高碱性磷酸酶活性的方法，其特征在于，所述金属离子为钙、镁、锰、铝、锌、铜、铁、钠、锂、钡、锶、铈、钴、铅、钇、镍、汞、铬、钍、钒或铋中之一种或多种元素的离子。

7.根据权利要求6所述的一种基于化学发光法检测EDTA血浆样本时提高碱性磷酸酶活性的方法，其特征在于，所述金属离子为Ca²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Al³⁺、Zn²⁺、Cu²⁺、Fe²⁺、Fe³⁺、Na⁺、Li⁺、Ba²⁺、Sr²⁺、Ce³⁺、Co²⁺、Pb²⁺、Y³⁺、Ni²⁺、Hg²⁺、Cr³⁺、Th⁴⁺、V³⁺、Bi³⁺中之一种或多种。

8.根据权利要求7所述的一种基于化学发光法检测EDTA血浆样本时提高碱性磷酸酶活性的方法，其特征在于，

所述的金属离子Ca²⁺的浓度为3～50mM/L；

所述的金属离子Mg²⁺的浓度为5～80mM/L；

所述的金属离子Mn²⁺的浓度为3～30mM/L；

所述的金属离子Al³⁺的浓度为1.5～20mM/L；

所述的金属离子Zn²⁺的浓度为1～10mM/L；

所述的金属离子Cu²⁺的浓度为0.3～10mM/L；

所述的金属离子Fe²⁺的浓度为1.5～30mM/L；

所述的金属离子Fe³⁺的浓度为0.15～5mM/L；

所述的金属离子Na⁺、Li⁺、Ba²⁺、Sr²⁺、Ce³⁺、Co²⁺、Pb²⁺、Y³⁺、Ni²⁺、Hg²⁺、Cr³⁺、Th⁴⁺、V³⁺或Bi³⁺的浓度为0.05～100mM/L。

9.基于碱性磷酸酶促化学发光法检测EDTA血浆的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括包被抗原或抗体的固相载体反应液、碱性磷酸酶标记的抗原或抗体反应液、固相载体，以及独立包装的金属离子反应液，独立包装的碱性磷酸酶的底物反应液。

10.根据权利要求9所述的基于碱性磷酸酶促化学发光法检测EDTA血浆的试剂盒，其特征在于，所述金属离子为Ca²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Al³⁺、Zn²⁺、Cu²⁺、Fe²⁺、Fe³⁺、Na⁺、Li⁺、Ba²⁺、Sr²⁺、Ce³⁺、Co²⁺、Pb²⁺、Y³⁺、Ni²⁺、Hg²⁺、Cr³⁺、Th⁴⁺、V³⁺、Bi³⁺中之一种或多种。