CN111175492A - 一种用于检测血清中降钙素原含量的试剂盒及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了生物化学相关技术领域的一种用于检测血清中降钙素原含量的试剂盒及其使用方法,包括相互独立包装的抗试剂A、抗试剂B、磁微粒试剂、发光底物、清洗液和质控品;采用以磁微粒子作为免疫反应的固相,利用化学发光酶联免疫分析方法与化学发光类测定仪器配合,用于测定人体血清中的降钙素原含量;并且可以在全自动化学发光仪上同时测定多个样本,实现降钙素原的高通量快速化测定,准确度高,特异性强,反应时间非常快、精确度和检测效率有了较大的提高。
Description
技术领域
本发明涉及生物化学相关技术领域,特别涉及一种用于检测血清中降钙素原含量的试剂盒及其使用方法。
背景技术
降钙素原(PCT)是由116个氨基酸组成的激素原,分子量大约为12.7kD。PCT由神经内分泌细胞(包括甲状腺、肺和胰腺组织的C细胞)表达,经酶切分解为(未成熟)降钙素、羧基端肽和氨基端肽。健康人血中仅含有少量的PCT。细菌感染后PCT会明显升高。
动物模型试验显示机体发生脓毒血症时,多组织均能表达PCT。脓毒血症患者体内的PCT只含有114个氨基酸,缺少氨基末端的Ala-Pro。
作为一种新的、具有创新意义的严重细菌感染等疾病的实验指标,PCT提高了临床诊断的准确性,为重症监护、放化疗、服用免疫抑制剂或器官移植等患者合并发热时提供了极其重要的诊断、进一步的检查和治疗的临床依据。PCT可广泛应用于ICU病房、血液科、肿瘤科、儿科、早产儿及新生儿监护室、外科、内科、器官移植科、急诊科、介入诊断和治疗实验室等。
PCT水平升高见于细菌性脓毒血症,尤其是重症脓毒血症和感染性休克。PCT可作为脓毒血症的预后指标,也是急性重症胰腺炎及其主要并发症的可靠指标。对于社区获得性呼吸道感染和空调诱导性肺炎患者,PCT可作为抗生素选择以及疗效判断的指标。
所以,研发一种使用方便、检测性能高、成本低廉的检测血清中降钙素原含量的试剂盒,有种重要的技术价值与经济价值。
发明内容
针对现有技术存在的需要一种使用方便、检测性能高、成本低廉的检测血清中降钙素原含量的试剂盒的技术问题,本发明提供一种用于检测血清中降钙素原(PCT)含量的试剂盒及其使用方法(磁微粒化学发光法)。
技术原理为:异硫氰酸荧光素(FITC)标记的PCT抗体与碱性磷酸酶(AP)标记的PCT配对抗体和样本、校准品或质控品中的PCT结合形成“三明治”复合物。随后加入连有抗FITC抗体的磁微粒,通过抗FITC抗体与FITC的特异性结合使抗原抗体免疫复合物结合在磁微粒上。在外加磁场的作用下,将免疫反应形成的复合物与未结合的其他物质分离,清洗复合物后,加入酶促化学发光底物。底物在酶作用下被催化裂解,形成不稳定的激发态中间体,当激发态中间体回到基态时发出光子,形成发光反应,即可使用化学发光仪检测反应的发光强度。在检测范围内,发光强度与样本中的PCT的含量成正比,使用改良的四参数Logistic方程拟合可计算出样本中PCT浓度。
为实现上述目的,本发明的技术方案为:
一种用于检测血清中降钙素原含量的试剂盒,包括相互独立包装的抗试剂A、抗试剂B、磁微粒试剂、发光底物、清洗液和质控品;
所述抗试剂A通过包括以下步骤的操作制备而成:
Sa1:用抗试剂缓冲液将异硫氰酸荧光素配制成浓度为1.0~5.0mg/mL的异硫氰酸荧光素溶液;
Sa2:按照降钙素原抗体:异硫氰酸荧光素溶液的质量比为1:1.1~1:1.5的比例将所述降钙素原抗体与所述异硫氰酸荧光素溶液充分混匀;
Sa3:用pH为8~9的碳酸盐缓冲液将Sa2制得的产物调节平衡;
Sa4:将Sa3制得的产物用凝胶层析分离纯化制得异硫氰酸荧光素标记的降钙素原包被抗体;
所述抗试剂B通过包括以下步骤的操作制备而成:
Sb1:用抗试剂缓冲液将碱性磷酸酶配制成浓度为1.0~5.0mg/mL的碱性磷酸酶溶液;
Sb2:将所述降钙素原抗体和碱性磷酸酶的反应基团分别活化后,按照所述碱性磷酸酶与所述降钙素原抗体的摩尔比为1:1~1:3的比例,在催化剂的催化下充分混匀进行充分的偶联反应;
Sb3:用pH为8~9的Tris缓冲液平衡将Sb2制得的产物调节平衡;
Sb4:将Sb3制得的产物用凝胶柱进行不同分子大小片度的分离纯化,制得碱性磷酸酶标记的降钙素原标记抗体;
所述磁微粒试剂通过包括以下步骤的操作制得:
Sc1:将羧基磁珠浓缩液充分混匀置于磁场中15~20min,待羧基磁珠全部沉降后吸去上清;
Sc2:向Sc1制得的羧基磁珠中加入所述羧基磁珠的体积2~5倍的磁微粒缓冲液,震荡清洗20~30min,再置于磁场中15~20min,待所述羧基磁珠全部沉降后吸去上清;然后重复本步操作0~3次;
Sc3:用所述磁微粒缓冲液将所述羧基磁珠定容到10~50mg/mL;
Sc4:按照所述羧基磁珠:抗异硫氰酸荧光素抗体为100:(1~2)的比例,向Sc3制得的溶液中加入所述抗异硫氰酸荧光素抗体,保持混匀状态下2~8℃反应16~20h,制得磁珠-抗体溶液;
Sc5:在磁场中将所述磁珠-抗体溶液中的溶质完全沉降后,用所述磁微粒缓冲液清洗0~3次后再用磷酸缓冲液将所述溶质定容为8~12mg/mL;
所述发光底物通过包括将ALPS溶解于所述ALPS体积4~10倍的发光底物缓冲液中的操作制备而成;
所述质控品通过包括用质控品缓冲溶液溶解降钙素原抗原的操作制备而成。
进一步的,Sa2和Sb2的操作中,至少有一处在避光条件下进行。
进一步的,Sb4后还包括Sb5:从所述碱性磷酸酶标记的降钙素原标记抗体中筛选出效果最优的分子片段进行测试。
进一步的,所述抗试剂A或者所述抗试剂B中还包括含有表面活性剂的磷酸盐缓冲液,所述表面活性剂为Tween20、TritonX-100、Bronidox中的一种或多种,所述表面活性剂占所述磷酸盐缓冲液体积的0.01~0.5%。
进一步的,所述质控品缓冲溶液通过在1L的新生牛血清中加入0.01~0.05g的四环素和0.1~0.5g的硫酸新霉素,完全溶解并经过0.22μm滤膜处理制备而成。
进一步的,所述抗试剂缓冲液为pH值为5~6的PBS体系;所述抗试剂缓冲液包括纯化水1L、Na2PO3H·12H2O10~20g、NaPO3H2·12H2O1~2g、绵羊血清1~5g、新生牛血清3~10g和马血清1~5g。
进一步的,所述清洗液通过包括以下步骤的操作制备而成:将NaCl160g、KCl4g、三羟甲基氨基甲烷24.2g和吐温201mL溶于900mL双蒸水中,调节PH至7.4,再用双蒸水定容至1000mL并稀释15倍。
进一步的,所述磁微粒缓冲液为1L纯化水中溶解有以下组分:Tris12.12~15.26mg、NaCl5.82~8.58mg和甲基纤维醚50~60g。
进一步的,所述发光底物缓冲液为1L纯化水中溶解有以下组分:Tris12.12~121.14g、NaCl5.82g、光泽精0.03g;所述发光底物缓冲液的pH为9.5。
一种上述任一项所述的用于检测血清中降钙素原含量的试剂盒的使用方法,包括以下步骤:
Sd1:取二支试管,分别加入100μL所述质控品、100μL待测样本;
Sd2:向每支试管中加入60μL所述抗试剂A和60μL所述抗试剂B,用塑料薄膜覆盖试管,轻轻振荡试管30s,置于42℃下水浴5min;
Sd3:向每支试管中加入60μL所述磁微粒试剂,用塑料薄膜覆盖试管,轻轻振荡试管30s,置42℃下水浴1min;
Sd4:将试管在磁分离器上沉淀3min,缓慢地倒转试管和磁分离器,倒出上清液;把倒转的试管连同磁分离器一起,放在滤纸上,拍击磁分离器底部以除去粘在管壁上的所有液滴;
Sd5:向每支试管中加入300μL所述清洗液,用塑料薄膜覆盖试管,轻轻振荡试管30s,混匀后缓慢的倒转试管和磁分离器,倒出上清液,把倒转的试管连同磁分离器一起,放在滤纸上,用力拍击分离器底部以除去粘在管壁上的所有液滴;
Sd6:重复Sd5的操作0~3次;
Sd7:把所有试管从磁分离器上取下,向每支试管中加入200μL所述发光底物,振荡混匀3s,用化学发光仪检测发光强度。
本发明具有如下优点:
1.将化学发光技术与免疫磁微粒相结合,提供了一种接近均相的反应体系,并且采用了一步法反应模式,使得灵敏度、精密性、检测范围等检测性能大大提高;
2.即插即用,并且没有开瓶有效期,无须额外准备清洗液,发光底物液试剂,而且反应时间大大缩短,从开始加样到检测结果,时间少于15min,明显快于同类试剂盒;
3.采取FITC抗体与磁微粒偶联方法,偶联效率高,结合牢固,且工艺稳定,在提高产品性能的同时,大大降低了产品成本。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明试剂盒与现有技术降钙素原试剂盒检测结果的相关性。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是,对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明,但并不构成对本发明的限定。此外,在以下说明中,省略了对公知结构、技术及操作的描述,以避免不必要地混淆本发明的概念。另外,下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
本发明中,未特别注明单位的比例与含量,固体组分为质量比例与含量,液体组分为体积比例与含量。
实施例1
一种用于检测血清中降钙素原含量的试剂盒,包括相互独立包装的抗试剂A、抗试剂B、磁微粒试剂、发光底物、清洗液和质控品;
抗试剂A通过包括以下步骤的操作制备而成:
Sa1:用抗试剂缓冲液将异硫氰酸荧光素配制成浓度为1.0mg/mL的异硫氰酸荧光素溶液;
其中,抗试剂缓冲液为pH值为5的PBS体系;抗试剂缓冲液包括纯化水1L、Na2PO3H·12H2O10g、NaPO3H2·12H2O1g、绵羊血清1g、新生牛血清3g和马血清1g;
Sa2:在避光条件下,按照降钙素原抗体:异硫氰酸荧光素溶液的质量比为1:1.1的比例将降钙素原抗体与异硫氰酸荧光素溶液充分混匀;
Sa3:用pH为8的碳酸盐缓冲液将Sa2制得的产物调节平衡;
Sa4:将Sa3制得的产物用凝胶层析分离纯化制得异硫氰酸荧光素标记的降钙素原包被抗体;
抗试剂B通过包括以下步骤的操作制备而成:
Sb1:用抗试剂缓冲液将碱性磷酸酶配制成浓度为1.0mg/mL的碱性磷酸酶溶液;
Sb2:在避光条件下,将降钙素原抗体和碱性磷酸酶的反应基团分别活化后,按照碱性磷酸酶与降钙素原抗体的摩尔比为1:1的比例,在催化剂的催化下充分混匀进行充分的偶联反应;
Sb3:用pH为8的Tris缓冲液平衡将Sb2制得的产物调节平衡;
Sb4:将Sb3制得的产物用凝胶柱进行不同分子大小片度的分离纯化,制得碱性磷酸酶标记的降钙素原标记抗体;
Sb5:从碱性磷酸酶标记的降钙素原标记抗体中筛选出效果最优的分子片段进行测试;
抗试剂A中还包括含有表面活性剂的磷酸盐缓冲液,表面活性剂为Tween20,表面活性剂占磷酸盐缓冲液体积的0.01%
磁微粒试剂通过包括以下步骤的操作制得:
Sc1:将羧基磁珠浓缩液充分混匀置于磁场中15min,待羧基磁珠全部沉降后吸去上清;
Sc2:向Sc1制得的羧基磁珠中加入羧基磁珠的体积2倍的磁微粒缓冲液,震荡清洗20min,再置于磁场中15min,待羧基磁珠全部沉降后吸去上清;
其中,磁微粒缓冲液为1L纯化水中溶解有以下组分:Tris12.12mg、NaCl5.82mg和甲基纤维醚50g;
Sc3:用磁微粒缓冲液将羧基磁珠定容到10mg/mL;
Sc4:按照羧基磁珠:抗异硫氰酸荧光素抗体为100:1的比例,向Sc3制得的溶液中加入抗异硫氰酸荧光素抗体,保持混匀状态下2℃反应16h,制得磁珠-抗体溶液;
Sc5:在磁场中将磁珠-抗体溶液中的溶质完全沉降后,再用磷酸缓冲液将溶质定容为8mg/mL;
发光底物通过包括将ALPS溶解于ALPS体积4倍的发光底物缓冲液中的操作制备而成;
其中,发光底物缓冲液为1L纯化水中溶解有以下组分:Tris12.12g、NaCl5.82g、光泽精0.03g;发光底物缓冲液的pH为9.5;
质控品通过包括用质控品缓冲溶液溶解降钙素原抗原的操作制备而成;
质控品缓冲溶液通过在1L的新生牛血清中加入0.01g的四环素和0.1g的硫酸新霉素,完全溶解并经过0.22μm滤膜处理制备而成;
清洗液通过包括以下步骤的操作制备而成:将NaCl160g、KCl4g、三羟甲基氨基甲烷24.2g和吐温201mL溶于900mL双蒸水中,调节PH至7.4,再用双蒸水定容至1000mL并稀释15倍。
实施例2
一种用于检测血清中降钙素原含量的试剂盒,包括相互独立包装的抗试剂A、抗试剂B、磁微粒试剂、发光底物、清洗液和质控品;
抗试剂A通过包括以下步骤的操作制备而成:
Sa1:用抗试剂缓冲液将异硫氰酸荧光素配制成浓度为3.0mg/mL的异硫氰酸荧光素溶液;
其中,抗试剂缓冲液为pH值为5.5的PBS体系;抗试剂缓冲液包括纯化水1L、Na2PO3H·12H2O15g、NaPO3H2·12H2O1.5g、绵羊血清3g、新生牛血清6g和马血清3g;
Sa2:在避光条件下,按照降钙素原抗体:异硫氰酸荧光素溶液的质量比为1:1.3的比例将降钙素原抗体与异硫氰酸荧光素溶液充分混匀;
Sa3:用pH为8.5的碳酸盐缓冲液将Sa2制得的产物调节平衡;
Sa4:将Sa3制得的产物用凝胶层析分离纯化制得异硫氰酸荧光素标记的降钙素原包被抗体;
抗试剂B通过包括以下步骤的操作制备而成:
Sb1:用抗试剂缓冲液将碱性磷酸酶配制成浓度为3.0mg/mL的碱性磷酸酶溶液;
Sb2:在避光条件下,将降钙素原抗体和碱性磷酸酶的反应基团分别活化后,按照碱性磷酸酶与降钙素原抗体的摩尔比为1:2的比例,在催化剂的催化下充分混匀进行充分的偶联反应;
Sb3:用pH为8.5的Tris缓冲液平衡将Sb2制得的产物调节平衡;
Sb4:将Sb3制得的产物用凝胶柱进行不同分子大小片度的分离纯化,制得碱性磷酸酶标记的降钙素原标记抗体;
Sb5:从碱性磷酸酶标记的降钙素原标记抗体中筛选出效果最优的分子片段进行测试;
抗试剂B中还包括含有表面活性剂的磷酸盐缓冲液,表面活性剂为TritonX-100,表面活性剂占磷酸盐缓冲液体积的0.3%
磁微粒试剂通过包括以下步骤的操作制得:
Sc1:将羧基磁珠浓缩液充分混匀置于磁场中18min,待羧基磁珠全部沉降后吸去上清;
Sc2:向Sc1制得的羧基磁珠中加入羧基磁珠的体积4倍的磁微粒缓冲液,震荡清洗25min,再置于磁场中18min,待羧基磁珠全部沉降后吸去上清;然后重复本步操作1次;
其中,磁微粒缓冲液为1L纯化水中溶解有以下组分:Tris14.26mg、NaCl7.58mg和甲基纤维醚55g;
Sc3:用磁微粒缓冲液将羧基磁珠定容到30mg/mL;
Sc4:按照羧基磁珠:抗异硫氰酸荧光素抗体为100:1.5的比例,向Sc3制得的溶液中加入抗异硫氰酸荧光素抗体,保持混匀状态下4℃反应18h,制得磁珠-抗体溶液;
Sc5:在磁场中将磁珠-抗体溶液中的溶质完全沉降后,用磁微粒缓冲液清洗1次后再用磷酸缓冲液将溶质定容为10mg/mL;
发光底物通过包括将ALPS溶解于ALPS体积7倍的发光底物缓冲液中的操作制备而成;
其中,发光底物缓冲液为1L纯化水中溶解有以下组分:Tris60.14g、NaCl5.82g、光泽精0.03g;发光底物缓冲液的pH为9.5;
质控品通过包括用质控品缓冲溶液溶解降钙素原抗原的操作制备而成;
质控品缓冲溶液通过在1L的新生牛血清中加入0.03g的四环素和0.3g的硫酸新霉素,完全溶解并经过0.22μm滤膜处理制备而成;
清洗液通过包括以下步骤的操作制备而成:将NaCl160g、KCl4g、三羟甲基氨基甲烷24.2g和吐温201mL溶于900mL双蒸水中,调节PH至7.4,再用双蒸水定容至1000mL并稀释15倍。
实施例3
一种用于检测血清中降钙素原含量的试剂盒,包括相互独立包装的抗试剂A、抗试剂B、磁微粒试剂、发光底物、清洗液和质控品;
抗试剂A通过包括以下步骤的操作制备而成:
Sa1:用抗试剂缓冲液将异硫氰酸荧光素配制成浓度为5.0mg/mL的异硫氰酸荧光素溶液;
其中,抗试剂缓冲液为pH值为6的PBS体系;抗试剂缓冲液包括纯化水1L、Na2PO3H·12H2O20g、NaPO3H2·12H2O2g、绵羊血清5g、新生牛血清10g和马血清5g;
Sa2:在避光条件下,按照降钙素原抗体:异硫氰酸荧光素溶液的质量比为1:1.5的比例将降钙素原抗体与异硫氰酸荧光素溶液充分混匀;
Sa3:用pH为9的碳酸盐缓冲液将Sa2制得的产物调节平衡;
Sa4:将Sa3制得的产物用凝胶层析分离纯化制得异硫氰酸荧光素标记的降钙素原包被抗体;
抗试剂B通过包括以下步骤的操作制备而成:
Sb1:用抗试剂缓冲液将碱性磷酸酶配制成浓度为5.0mg/mL的碱性磷酸酶溶液;
Sb2:在避光条件下,将降钙素原抗体和碱性磷酸酶的反应基团分别活化后,按照碱性磷酸酶与降钙素原抗体的摩尔比为1:3的比例,在催化剂的催化下充分混匀进行充分的偶联反应;
Sb3:用pH为9的Tris缓冲液平衡将Sb2制得的产物调节平衡;
Sb4:将Sb3制得的产物用凝胶柱进行不同分子大小片度的分离纯化,制得碱性磷酸酶标记的降钙素原标记抗体;
Sb5:从碱性磷酸酶标记的降钙素原标记抗体中筛选出效果最优的分子片段进行测试;
抗试剂A中还包括含有表面活性剂的磷酸盐缓冲液,表面活性剂为Bronidox,表面活性剂占磷酸盐缓冲液体积的0.5%
磁微粒试剂通过包括以下步骤的操作制得:
Sc1:将羧基磁珠浓缩液充分混匀置于磁场中20min,待羧基磁珠全部沉降后吸去上清;
Sc2:向Sc1制得的羧基磁珠中加入羧基磁珠的体积5倍的磁微粒缓冲液,震荡清洗30min,再置于磁场中20min,待羧基磁珠全部沉降后吸去上清;然后重复本步操作3次;
其中,磁微粒缓冲液为1L纯化水中溶解有以下组分:Tris15.26mg、NaCl8.58mg和甲基纤维醚60g;
Sc3:用磁微粒缓冲液将羧基磁珠定容到50mg/mL;
Sc4:按照羧基磁珠:抗异硫氰酸荧光素抗体为100:2的比例,向Sc3制得的溶液中加入抗异硫氰酸荧光素抗体,保持混匀状态下8℃反应20h,制得磁珠-抗体溶液;
Sc5:在磁场中将磁珠-抗体溶液中的溶质完全沉降后,用磁微粒缓冲液清洗3次后再用磷酸缓冲液将溶质定容为12mg/mL;
发光底物通过包括将ALPS溶解于ALPS体积10倍的发光底物缓冲液中的操作制备而成;
其中,发光底物缓冲液为1L纯化水中溶解有以下组分:Tris121.14g、NaCl5.82g、光泽精0.03g;发光底物缓冲液的pH为9.5;
质控品通过包括用质控品缓冲溶液溶解降钙素原抗原的操作制备而成;
质控品缓冲溶液通过在1L的新生牛血清中加入0.05g的四环素和0.5g的硫酸新霉素,完全溶解并经过0.22μm滤膜处理制备而成;
清洗液通过包括以下步骤的操作制备而成:将NaCl160g、KCl4g、三羟甲基氨基甲烷24.2g和吐温201mL溶于900mL双蒸水中,调节PH至7.4,再用双蒸水定容至1000mL并稀释15倍。
实施例4
实施例1~3任一项的用于检测血清中降钙素原含量的试剂盒的使用方法,均包括以下步骤,本实施例中采用实施例2制备的用于检测血清中降钙素原含量的试剂盒,对样本进行检测,操作过程如下:
样本采集:
采用正确医用技术收集血清(严重溶血或脂血的样本不能用于测定),收集后的样本在室温放置不可超过8小时;如果不在8小时内检测需将样本放置于2-8℃的冰箱中;若需72小时以上保存或运输,则应冻存于-20℃以下,避免反复冻融。使用前回复到室温,轻轻摇动混匀。
实验前准备
Sd1:取二支平底试管,编号,分别加入100μL质控品、100μL待测样本;
Sd2:向每支试管中加入60μL抗试剂A和60μL抗试剂B,用塑料薄膜覆盖试管,轻轻振荡试管30s,置于42℃下水浴5min;
Sd3:向每支试管中加入60μL磁微粒试剂,用塑料薄膜覆盖试管,轻轻振荡试管30s,置42℃下水浴1min;
Sd4:将试管在磁分离器上沉淀3min,缓慢地倒转试管和磁分离器,倒出上清液;把倒转的试管连同磁分离器一起,放在滤纸上,拍击磁分离器底部以除去粘在管壁上的所有液滴;
Sd5:向每支试管中加入300μL清洗液,用塑料薄膜覆盖试管,轻轻振荡试管30s,混匀后缓慢的倒转试管和磁分离器,倒出上清液,把倒转的试管连同磁分离器一起,放在滤纸上,用力拍击分离器底部以除去粘在管壁上的所有液滴;
Sd6:重复Sd5的操作3次;
Sd7:把所有试管从磁分离器上取下,向每支试管中加入200μL发光底物,振荡混匀3s,用化学发光仪检测发光强度。
采用四参数拟合方式,以校准品浓度值为X轴,以校准品发光强度值为Y轴,建立定标曲线。根据待测样本的发光强度值回算相应的浓度值。
将本发明试剂盒按照方法学鉴定,可达到如下指标:
标准曲线线性:R>0.9900;
最低检测限:≤0.02ng/mL;
准确度:添加回收率85%-115%;
重复性:变异系数CV≤8%;
批间差:变异系数≤15%;
线性稀释:R大于0.9900。
将71份血清样本测值与市售降钙素原检测试剂盒对比,比较本发明试剂盒与现有技术的降钙素原试剂盒检测结果的相关性,如图1所示。
以上结合附图对本发明的实施方式作了详细说明,但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言,在不脱离本发明原理和精神的情况下,在没有做出创造性劳动前提下,对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型,仍落入本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种用于检测血清中降钙素原含量的试剂盒,其特征在于:包括相互独立包装的抗试剂A、抗试剂B、磁微粒试剂、发光底物、清洗液和质控品;
所述抗试剂A通过包括以下步骤的操作制备而成:
Sa1:用抗试剂缓冲液将异硫氰酸荧光素配制成浓度为1.0~5.0mg/mL的异硫氰酸荧光素溶液;
Sa2:按照降钙素原抗体:异硫氰酸荧光素溶液的质量比为1:1.1~1:1.5的比例将所述降钙素原抗体与所述异硫氰酸荧光素溶液充分混匀;
Sa3:用pH为8~9的碳酸盐缓冲液将Sa2制得的产物调节平衡;
Sa4:将Sa3制得的产物用凝胶层析分离纯化制得异硫氰酸荧光素标记的降钙素原包被抗体;
所述抗试剂B通过包括以下步骤的操作制备而成:
Sb1:用抗试剂缓冲液将碱性磷酸酶配制成浓度为1.0~5.0mg/mL的碱性磷酸酶溶液;
Sb2:将所述降钙素原抗体和碱性磷酸酶的反应基团分别活化后,按照所述碱性磷酸酶与所述降钙素原抗体的摩尔比为1:1~1:3的比例,在催化剂的催化下充分混匀进行充分的偶联反应;
Sb3:用pH为8~9的Tris缓冲液平衡将Sb2制得的产物调节平衡;
Sb4:将Sb3制得的产物用凝胶柱进行不同分子大小片度的分离纯化,制得碱性磷酸酶标记的降钙素原标记抗体;
所述磁微粒试剂通过包括以下步骤的操作制得:
Sc1:将羧基磁珠浓缩液充分混匀置于磁场中15~20min,待羧基磁珠全部沉降后吸去上清;
Sc2:向Sc1制得的羧基磁珠中加入所述羧基磁珠的体积2~5倍的磁微粒缓冲液,震荡清洗20~30min,再置于磁场中15~20min,待所述羧基磁珠全部沉降后吸去上清;然后重复本步操作0~3次;
Sc3:用所述磁微粒缓冲液将所述羧基磁珠定容到10~50mg/mL;
Sc4:按照所述羧基磁珠:抗异硫氰酸荧光素抗体为100:(1~2)的比例,向Sc3制得的溶液中加入所述抗异硫氰酸荧光素抗体,保持混匀状态下2~8℃反应16~20h,制得磁珠-抗体溶液;
Sc5:在磁场中将所述磁珠-抗体溶液中的溶质完全沉降后,用所述磁微粒缓冲液清洗0~3次后再用磷酸缓冲液将所述溶质定容为8~12mg/mL;
所述发光底物通过包括将ALPS溶解于所述ALPS体积4~10倍的发光底物缓冲液中的操作制备而成;
所述质控品通过包括用质控品缓冲溶液溶解降钙素原抗原的操作制备而成。
2.根据权利要求1所述的用于检测血清中降钙素原含量的试剂盒,其特征在于:Sa2和Sb2的操作中,至少有一处在避光条件下进行。
3.根据权利要求1所述的用于检测血清中降钙素原含量的试剂盒,其特征在于:Sb4后还包括Sb5:从所述碱性磷酸酶标记的降钙素原标记抗体中筛选出效果最优的分子片段进行测试。
4.根据权利要求1所述的用于检测血清中降钙素原含量的试剂盒,其特征在于:所述抗试剂A或者所述抗试剂B中还包括含有表面活性剂的磷酸盐缓冲液,所述表面活性剂为Tween20、TritonX-100、Bronidox中的一种或多种,所述表面活性剂占所述磷酸盐缓冲液体积的0.01~0.5%。
5.根据权利要求1所述的用于检测血清中降钙素原含量的试剂盒,其特征在于:所述质控品缓冲溶液通过在1L的新生牛血清中加入0.01~0.05g的四环素和0.1~0.5g的硫酸新霉素,完全溶解并经过0.22μm滤膜处理制备而成。
6.根据权利要求1所述的用于检测血清中降钙素原含量的试剂盒,其特征在于:所述抗试剂缓冲液为pH值为5~6的PBS体系;所述抗试剂缓冲液包括纯化水1L、Na2PO3H·12H2O10~20g、NaPO3H2·12H2O1~2g、绵羊血清1~5g、新生牛血清3~10g和马血清1~5g。
7.根据权利要求1所述的用于检测血清中降钙素原含量的试剂盒,其特征在于:所述清洗液通过包括以下步骤的操作制备而成:将NaCl160g、KCl4g、三羟甲基氨基甲烷24.2g和吐温201mL溶于900mL双蒸水中,调节PH至7.4,再用双蒸水定容至1000mL并稀释15倍。
8.根据权利要求1所述的用于检测血清中降钙素原含量的试剂盒,其特征在于:所述磁微粒缓冲液为1L纯化水中溶解有以下组分:Tris12.12~15.26mg、NaCl5.82~8.58mg和甲基纤维醚50~60g。
9.根据权利要求1所述的用于检测血清中降钙素原含量的试剂盒,其特征在于:所述发光底物缓冲液为1L纯化水中溶解有以下组分:Tris12.12~121.14g、NaCl5.82g、光泽精0.03g;所述发光底物缓冲液的pH为9.5。
10.一种如权利要求1~9任一项所述的用于检测血清中降钙素原含量的试剂盒的使用方法,其特征在于:包括以下步骤:
Sd1:取二支试管,分别加入100μL所述质控品、100μL待测样本;
Sd2:向每支试管中加入60μL所述抗试剂A和60μL所述抗试剂B,用塑料薄膜覆盖试管,轻轻振荡试管30s,置于42℃下水浴5min;
Sd3:向每支试管中加入60μL所述磁微粒试剂,用塑料薄膜覆盖试管,轻轻振荡试管30s,置42℃下水浴1min;
Sd4:将试管在磁分离器上沉淀3min,缓慢地倒转试管和磁分离器,倒出上清液;把倒转的试管连同磁分离器一起,放在滤纸上,拍击磁分离器底部以除去粘在管壁上的所有液滴;
Sd5:向每支试管中加入300μL所述清洗液,用塑料薄膜覆盖试管,轻轻振荡试管30s,混匀后缓慢的倒转试管和磁分离器,倒出上清液,把倒转的试管连同磁分离器一起,放在滤纸上,用力拍击分离器底部以除去粘在管壁上的所有液滴;
Sd6:重复Sd5的操作0~3次;
Sd7:把所有试管从磁分离器上取下,向每支试管中加入200μL所述发光底物,振荡混匀3s,用化学发光仪检测发光强度。
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