DE69928125T2

DE69928125T2 - EIN VERFAHREN ZUM AUFFINDEN UND/ODER QUANTIFIZIEREN EINES SPEZIFISCHEN IgE-ANTIKÖRPERS IN EINER FLÜSSIGEN PROBE

Info

Publication number: DE69928125T2
Application number: DE69928125T
Authority: DE
Inventors: R. J. J. Van Neerven
Original assignee: ALK Abello AS
Current assignee: ALK Abello AS
Priority date: 1998-12-22
Filing date: 1999-12-22
Publication date: 2006-04-20
Anticipated expiration: 2019-12-23
Also published as: CA2355294A1; PL208129B1; EP1141710B1; HUP0104712A2; HUP0104712A3; KR100676583B1; CA2355294C; WO2000037941A3; DE69928125D1; PL351672A1; JP2002533678A; US7759133B2; ES2249049T3; JP4472877B2; US20010055778A1; EP1141710A2; KR20010081091A; ATE308752T1; AU1774100A; AU752028B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Detektieren und/oder Quantifizieren eines IgE-Antikörpers, der für einen Liganden in Form eines Antigens, Antikörpers oder Haptens in einer Flüssigkeitsprobe spezifisch ist.
In WO 94/11734 ist ein Two-Site-Immunoassay für einen Antikörper unter Verwendung einer chemilumineszierenden Markierung und eines Biotin-gebundenen Liganden beschrieben, welches Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Mischen der Flüssigkeitsprobe mit einem Liganden-Antigen, -Antikörper oder -Hapten, der an Biotin oder ein funktionelles Derivat davon gebunden ist, einem Antikörper, der gegen den nachzuweisenden Antikörper gerichtet und an paramagnetische Partikel gebunden ist, und einer chemilumineszierende Acridinverbindung, die an Avidin, Streptavidin oder ein funktionelles Derivat davon gebunden ist, um einen Festphasen-Komplex zu bilden, (b) magnetisches Trennen der festen Phase von der flüssigen Phase, (c) Einleiten einer chemilumineszierenden Reaktion, sofern erforderlich, in der abgetrennten festen Phase, und (d) Analysieren der abgetrennten festen Phase auf das Vorhandensein einer chemilumineszierenden Phase, welche das Vorhandensein des Antikörpers in der Probe anzeigt.
Das Verfahren nach dem Stand der Technik ist besonders zur Messung der Konzentration spezifischer Immunglobuline in Körperflüssigkeiten geeignet, wie etwa eines spezifischen Immunglobulins, ausgewählt aus der Gruppe von IgA, IgD, IgE, IgG, IgM und Unterklassen davon.
Das Verfahren nach dem Stand der Technik ist auch zum Nachweisen und Quantifizieren der Gesamtmenge an Immunglobulinen in einer Klasse oder Unterklasse geeignet, wie etwa IgA, IgD, IgE, IgG, IgM und Unterklassen davon.
In WO 98/23964 ist ein Verfahren zum Nachweisen von Hunde-, Katzen- und Pferde-IgE beschrieben. Eine Ausführungsform des Verfahrens umfasst die folgenden Schritte:
a) Binden des humanen Fcε-Rezeptors (FcεRI) an ein Substrat, b) Kontaktieren des Substrat- FcεRI mit einer IgE-haltigen Zusammensetzung zur Bildung eines Komplexes von Substrat-FcεRI-IgE, c) Entfernen von überschüssigem nicht-gebundenem Material, d) Zugeben eines Indikatormoleküls in Form z.B. eines Antigens, welches selektiv an das IgE des Komplexes binden kann, wobei das Indikatormolekül an eine nachweisbare Markierung, z.B. eine Fluoreszenzmarkierung oder einen Liganden, z.B. Biotin, konjugiert werden kann, e) Entfernen von überschüssigem Indikatormolekül und f) Messen des markierten gebildeten Komplexes.
An anderer Stelle in jenem Dokument wird allgemein erwähnt, dass das Substrat z.B. ein partikuläres Material sein kann, einschließlich magnetischer Partikel, oder eine rekombinante Zelle, die das FcεRI exprimiert. Auch wird allgemein erwähnt, dass die nachweisbare Markierung eine Chemilumineszenzmarkierung sein kann.
Der in WO 98/23964 beschriebene Assay nach dem Stand der Technik verwendet eine Überschussmenge an Substrat-FcεRI und misst folglich den vollen Gehalt an spezifischem nachzuweisendem IgE als auch anderer Immunglobuline, z.B. IgG, welche an das verwendete FcεRI binden kann. Der Assay wird unter strengen in vitro-Bedingungen unter Einbeziehung von Waschschritten nach Zugabe des Serums zum Substrat-FcεRI als auch nach Zugabe des Antigens durchgeführt.
Der Artikel "Regulierung und Anzielung von T-Zell-Immunreaktionen durch IgE- und IgG-Antikörper", Bheeka Escura et al., Immunology, Band 86, 343-350, 1995, beschreibt ein Verfahren, das die folgenden Schritte umfasst: a) Inkubieren von chimärem monoklonalem Maus/Mensch-IgE, das für NIP (5-Iodo-4-hydroxyl-4-nitrophenacetyl) spezifisch ist, mit Allergen-NIP, um einen Komplex zu bilden, b) Inkubieren des Komplexes mit B-Zellen, c) Entfernen von überschüssigen Komplexen durch Waschen, und d) Inkubieren der resultierenden Zellen mit fluoreszenzmarkiertem Antikörper gegen den NIP-spezifischen Antikörper, und e) Nachweisen der Fluoreszenz.
In WO 99/51988, welche nach dem Prioritätsdatum der vorliegenden Anmeldung veröffentlicht wurde, ist ein Verfahren zum Nachweisen eines biologisch aktiven, Allergen-spezifischen Immunglobulins unter Verwendung eines Fc-Epsilon-Rezeptor I-Moleküls beschrieben, umfassend das Bilden eines Komplexes von FcεRI-Immunglobulin-Allergen und Nachweisen des gebildeten Komplexes. Das Dokument erwähnt bevorzugte Ausführungsformen, wobei das an einen Kunststoffkügelchen-Partikel konjugierte Allergen und die Immunglobulin-haltige Probe zusammengebracht werden, um die Bildung eines Substrat-gebundenen Immunglobulin-Allergen-Komplexes zu erlauben, und wobei der Komplex mit FcεRI kontaktiert wird.
Zusammenfassung der Erfindung
Das technische Problem, auf das sich die vorliegende Erfindung richtet, besteht in der Bereitstellung eines Verfahrens zum Nachweisen und/oder Quantifizieren eines spezifischen IgE-Antikörpers in einer Flüssigkeitsprobe, welches die Vornahme der Bindungsreaktionen zwischen den verschiedenen Reaktionspartnern unter mehr in vivo-artigen Bedingungen erlaubt, um eine IgE-Messung zu erhalten, die die Fähigkeit von IgE widerspiegelt, seine Effektorfunktionen durch Bindung an seinen Rezeptor und nicht nur durch das Messen des Vorhandenseins von IgE in einer Probe auszuüben,.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist durch die folgenden Schritte gekennzeichnet:

(a) Zusammenbringen (i) der biologischen Probe mit (ii) einem freien gelösten Liganden in Form eines Antigens, eines Antikörpers oder eines Haptens, zum Erhalt eines Gemischs I, umfassend IgE-haltige Komplexe,
(b) Mischen des Gemischs I mit einem Träger, an den (iii) IgE-Rezeptor gebunden ist, welcher IgE-Rezeptor CD23 (FcεRII) und/oder FcεRI ist, zum Erhalt eines Gemischs II, das Träger-gebundene IgE-haltige Komplexe umfasst,
(c) Trennen der Träger-gebundenen IgE-haltigen Komplexe von Gemisch II, und
(d) Bestimmen der Menge an gebildeten Träger-gebundenen IgE-haltigen Komplexen.

Der niederaffine IgE-Rezeptor CD23 (FcεRII) ist auf der Oberfläche von Eosinophilen, aktivierten B- und T-Zellen und dendritischen zu finden. CD23 ist ein multifunktioneller Rezeptor, von dem gezeigt wurde, dass es eine wichtige Rolle in der IgE-vermittelten Antigenpräsentation spielt. Es wird angenommen, dass CD23 primär an IgE bindet, das in Form von vielkomponentigen Komplexen vorliegt, die sowohl IgE als auch Antigen/Allergen enthalten (1,2). Es ist jedoch berichtet worden, dass NIP-spezifisches monoklonales IgE in monomerer Form an CD23 binden kann (3). Es kann jedoch nicht ausgeschlossen werden, dass eine Aggregation des gereinigten monoklonalen IgE-Antikörpers stattfindet. Cd23 besteht aus einer α-Kette und kann als ein Monomer, ein Dimer oder ein Trimer vorliegen.
Der hochaffine IgE-Rezeptor FcεRI ist auf der Oberfläche von Mastzellen und Basophilen zu finden, ebenso wie auf Langerhans-Zellen. Monozyten und dendritischen Zellen. Von FcεRI ist außerdem gezeigt worden, dass es eine Rolle in der IgE-vermittelten Antigen/Allergen-Präsentierung spielt (4). IgE kann an FcεRI in Form von monomerem IgE, IgE-Antigen/Allergen und multikomponentigen Komplexen binden, die sowohl IgE als auch Antigen/Allergen enthalten. FcεRI auf Mastzellen und Basophilen besteht aus einer α-Kette, einer β-Kette und einer γ-Kette, und FcεRI auf Langerhans-Zellen, Monozyten und dendritischen Zellen besteht aus einer α-Kette und einer γ-Kette.
Die vorliegende Erfindung basiert auf der Erkenntnis, dass die Verwendung von CD23 in einem Antikörper-Nachweisassay möglich ist, vorausgesetzt, dass die IgE-haltige Probe mit dem Antigen/Allergen vor oder spätestens gleichzeitig mit der Bindung an CD23 reagieren darf.
Die vorliegende Erfindung basiert ferner auf der Erkenntnis, dass ganz generell ein Assay-Verfahren, bei dem die IgE-haltige Flüssigkeitsprobe mit dem Antigen/Allergen in gelöstem Zustand bei einem ersten Schritt reagieren darf, und bei dem das komplette resultierende Gemisch mit dem Träger-IgE-Rezeptor kontaktiert wird, nahe die Bedingungen simuliert, bei denen die identischen Reaktionen in vivo stattfinden.
Insbesondere simuliert der Assay der Erfindung jegliche Interferenz anderer Immunglobuline als auch jeglicher weiterer potenziell interferierender Komponenten, die in der Probe vorhanden sind, was während der Bildung der vielkomponenten Komplexe erfolgen kann, die IgE und Antigen/Allergen enthalten, als auch während der Bildung von IgE-Antigen/Allergen. Es ist auch möglich, dass eine Interferenz von anderen Inhaltsstoffen des resultierenden Gemischs bei der Bindung zwischen einerseits dem Träger-IgE-Rezeptor und andererseits dem monomeren IgE, IgE-Antigen/Allergen und den vielkomponentigen Komplexen, die IgE und Antigen/Allergen enthalten, erfolgt.
Daher macht der Assay der Erfindung die Messung der Menge an spezifischem IgE möglich, die bei in vivo-Bedingungen zur Bindung an die CD23- und/oder FcεRI-Rezeptoren fähig ist und damit ihre biologische Funktion ausübt. Im Folgenden wird dies als die relevante in vivo-Menge an IgE bezeichnet. Eine Errungenschaft der vorliegenden Erfindung besteht in der Erkenntnis, dass solch eine Messung der relevanten in vivo-Menge an IgE wertvolle Informationen über das Lebewesen erbringt, von dem die Probe entnommen ist, da es sich eher um die Bindungsfähigkeit des vorhandenen IgE an die IgE-Rezeptoren als um die Gesamtmenge an IgE handelt, die den immunologischen Status des Lebewesens bestimmt. Daher wird mit dem Assay der vorliegenden Erfindung eine Möglichkeit bereitgestellt, den immunologischen Status des Lebewesens viel exakter als mit den Assays nach dem Stand der Technik zu bestimmen.
Insbesondere ist der Assay der Erfindung in Zusammenhang mit der Überwachung und Auswertung des immunologischen Status von Lebewesen wertvoll, die eine Spezifische Allergie-Vakzinations-(SAV)-Behandlung erhalten. Es ist nämlich gezeigt worden, dass die SAV-Behandlung zur Hemmung oder Verminderung der Bindung von IgE an IgE-Rezeptoren führt, weshalb die relevante in vivo-Menge an IgE ein viel präziseres Maß des Schweregrads der allergischen Erkrankung ergibt als die IgE-Gesamtmenge, zumal diese beiden Mengen signifikant abweichen können. Zum Beispiel kann die in vivo-Menge an IgE, wie mittels des Verfahrens der Erfindung vor und nach der SAV-Behandlung bestimmt, um den Faktor vier abweichen, wohingegen die IgE-Menge, die durch einen herkömmlichen IgE-Assay gemessen wird, vor und nach der SAV-Behandlung vergleichsweise unverändert ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Anwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1–13 zur Überwachung und Auswertung des immunologischen Status von Lebewesen, insbesondere Menschen, einschließlich sowohl allergischer als auch nicht-allergischer Lebewesen.
Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Anwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1–13 zur Überwachung und Auswertung des immunologischen Status von Lebewesen, insbesondere Menschen, die eine Spezifische Allergie-Vakzinations-(SAV)-Behandlung erhalten.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Bei einer Ausführungsform der Erfindung ist der Ligand markiert.
Der Ausdruck "markierter Ligang" meint jeglichen Liganden, der ein markiertes Atom oder ein Teil davon, z.B. eine radioaktive Atom-Markierung, umfasst.
Bei einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird der in Schritt a) verwendete Ligand an (iv) eine markierende Verbindung gebunden. Bei einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird (iv) eine markierende Verbindung in Schritt a) zusätzlich zur (i) Probe und (ii) dem Liganden zugegeben. Auch kann eine (iv) markierende Verbindung den in Schritt a) gebildeten IgE-haltigen Komplexen zugegeben werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird (iv) eine markierende Verbindung zu den Träger-gebundenen IgE-haltigen Komplexen in Schritt (b) zugegeben.
Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird (iv) eine markierende Verbindung den Träger-gebundenen IgE-haltigen Komplexen zugegeben, die aus dem Trennschritt (c) zum Erhalt eines Gemischs II' resultieren, in welchem Fall die resultierenden markierten und Träger-gebundenen IgE-haltigen Komplexe aus Gemisch II' abgetrennt und vor Schritt (d) gewaschen werden.
Der Ausdruck "markierte Verbindung" meint jegliches geeignete Markierungssystem, das herkömmlicherweise in Immunoassays verwendet wird, umfassend Lumineszenzmarkierungen, Chemilumineszenzmarkierungen, Enzymmarkierungen, radioaktive Markierungen, Fluoreszenzmarkierungen und Absorbanzmarkierungen.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die (iv) markierende Verbindung eine chemilumineszierende Verbindung, die kovalent an Avidin, Streptavidin oder ein funktionelles Derivat davon gebunden ist.
Die chemilumineszierende Markierung ist vorzugsweise eine Acridin-Verbindung, wie etwa N-Hydroxysuccinimid-Dimethylacridiniumester (NHS-DMAE). Avidin/Streptavidin und DMAE können gemäß der Methoden von Weeks et al., Clinical Chem., Band 29, 1474–1479 (1983) gekoppelt werden. Weitere Beispiele für chemilumeszierende Verbindungen, die zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung geeignet sind, sind Luminol, Lucigenin und Lophin.
Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die (iv) markierende Verbindung eine Fluoreszenzmarkierung, die kovalent an Avidin, Streptavidin oder ein funktionelles Derivat davon gebunden ist. Ein bevorzugtes Beispiel einer Fluoreszenzmarkierung ist Phygoerythrin (PE).
In Abhängigkeit von der Art des verwendeten Markierungssystems kann die markierende Verbindung direkt an den Liganden gebunden werden oder kann an den Liganden mittels Biotin gekoppelt werden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird der Ligand an Biotin oder ein funktionelles Derivat davon gebunden. Biotin wird vorzugsweise an den in Schritt (a) zugegebenen Liganden gebunden.
Die markierende Verbindung kann auch an das IgE, das mittels eines Antikörpers zum IgE nachgewiesen werden soll, gekoppelt werden, wobei der Antikörper zum IgE an IgE in solcher Weise gekoppelt wird, dass die Bindung des IgE an den IgE-Rezeptor nicht behindert ist. Die Kombination aus der markierenden Verbindung und dem Nachweisantikörper wird vorzugsweise den Träger-gebundenen IgE-haltigen Komplexen, die in Schritt (b) oder (c) gebildet wurden, zugegeben. Alternativ wird die Kombination aus der markierenden Verbindung und dem Nachweisantikörper vorab entweder gleichzeitig mit der Probe und dem Liganden in Schritt (a) zugegeben oder wird den in Schritt (a) gebildeten IgE-haltigen Komplexen zugegeben.
Der Nachweisantikörper ist vorzugsweise ein polyklonaler Antikörper.
Die Verwendung eines Nachweissystems, bestehend aus einem Nachweisantikörper in Kopplung an eine markierende Verbindung, weist den Vorteil auf, dass dasselbe System unabhängig vom nachzuweisenden IgE verwendet werden kann. Auch wird davon ausgegangen, dass die Verwendung eines Nachweissystems, welches die Verwendung eines nicht-markierten Liganden erlaubt, von Vorteil ist, da dies den in vivo-Bedingungen am meisten ähnelt.
In Abhängigkeit von der Art des verwendeten Markierungssystems kann die markierende Verbindung direkt an den Nachweisantikörper gebunden werden oder kann an den Nachweisantikörper mittels Biotin gekoppelt werden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der Nachweisantikörper an Biotin oder ein funktionelles Derivat davon gebunden. Biotin wird vorzugsweise an den nach Schritt (c) zugegebenen Nachweisantikörper gebunden.
Vorzugsweise wird die IgE-haltige Probe mit dem Liganden kontaktiert und zum Erhalt eines Gemischs I inkubiert (Schritt (a)), bevor das Gemisch I mit dem Träger/IgE-Rezeptor kontaktiert wird (Schritt (b)). Die Dauer der Inkubation von Probe und Liganden kann von 1 bis 120, vorzugsweise 5 bis 60, bevorzugter 10 bis 40 Minuten betragen.
Es wird davon ausgegangen, dass dieses Verfahren die in vivo-Bedingungen am besten simuliert, da es die Bildung von Komplexen aus Ligand und IgE vor dem Kontaktieren mit dem IgE-Rezeptor erlaubt und da CD23 das IgE in der Form dieser Komplexe bindet.
Alternativ werden Schritt (a) und (b) gleichzeitig bei einem Vorgang vorgenommen, d.h. die IgE-haltige Probe, der Ligand und der Träger-IgE-Rezeptor werden gemischt und gemeinsam inkubiert. In diesem Fall kann die Dauer der Inkubation 1 bis 120, bevorzugt 5 bis 60, bevorzugter 10 bis 30 Minuten betragen.
Der Träger kann jegliches feste Material sein, das üblicherweise in immunologischen Assays verwendet, wie etwa eine biologische Zelle, z.B. eine B-Zelle; ein partikuläres Material, das sich z.B. aus Glas, einem Metall, u.a. Eisen, oder einem Polymer zusammensetzt, ein paramagnetischer Partikel; und eine Platte, ein Well, eine Schale oder ein Röhrchen, das sich aus einem Polymer zusammensetzt.
Der Träger ist vorzugsweise ein Partikel, am bevorzugtesten ein paramagnetischer Partikel. Der Begriff "paramagnetischer Partikel" meint jeglichen paramagnetischen Partikel, der in einem flüssigen Medium dispergiert oder suspendiert werden kann, z.B. "Biomag"-Partikel (Eisenoxidpartikel, beschichtet mit aminterminierten Gruppen), wie vertrieben von Advanced Magnetics Inc., USA, und "Dynabeads" (Eisenoxid, beschichtet mit einem Polymer), wie vertrieben von Dynal A.S., Norwegen.
Wird eine partikuläres Material als ein Träger verwendet, so kann die Trennung des festphasigen Komplexes von der flüssigen Phase in Abhängigkeit von der Art des verwendeten feststofflichen Partikels unter anderem durch magnetische Trennung, Filtration, Sedimentation, Zentrifugation, Chromatographie, Säulenchromatographie, durchgeführt werden.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das nachzuweisende IgE sowohl unter Verwendung von CD23 alleine zum Erhalt einer ersten Messung als auch unter Verwendung von FcεRI alleine zum Erhalt einer zweiten Messung quantifiziert.
Die CD23-vermittelte Antigenpräsentation bei geringen Antigenkonzentrationen über B-Zellen erleichtert die Aktivierung von CD4⁺-T-Zellen, welche eine wichtige Rolle in der späten Phase von allergischen Reaktionen spielen, d.h. bei Reaktionen, die etwa 6 bis 24 Stunden nach Exposition auftreten. Das FcεRI-Triggering bei Mastzellen und Basophilen nach Vernetzung von IgE bewirkt die sofortigen allergischen Reaktionen. Daher sind die biologischen Funktionen von CD23 und FcεRI verschieden, weshalb die mit dem Assay der Erfindung unter Verwendung, als IgE-Rezeptor, von DCD23 bzw.
FcεRI, erhaltenen Ergebnisse unterschiedliche Informationen über den immunologischen Status des Lebewesens, von dem die IgE-haltigen Proben stammen, liefern. Es ist daher von Vorteil, Ergebnisse sowohl für CD23 als auch FcεRI zu erhalten, um eine vollständigere Grundlage für die Überwachung und Auswertung des immunologischen Status des Lebewesens zu schaffen.
Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird eine Kombination von CD23 und FcεRI angewendet. In dem Fall, in dem der verwendete Träger ein partikuläres Material ist, können CD23 und FcεRI an separate Partikel oder an dieselben Partikel gebunden werden.
Das Verfahren der Erfindung kann unter Verwendung einer Überschussmenge an Ligand im Vergleich zur erwarteten IgE-Menge in der Probe durchgeführt werden. Die Anwendung einer großen Überschussmenge an Ligand, z.B. ein Verhältnis von Ligand zu IgE von bis zu 10000, ist möglich.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung beträgt die Anzahl der Ligandmoleküle zwischen 100 % und 10.000 %, vorzugsweise zwischen 100 % und 1000 %, bevorzugter zwischen 100 % und 200 %, noch bevorzugter zwischen 100 % und 150 %, und am bevorzugtesten zwischen 100 % und 120 %, der Zahl der nachzuweisenden IgE-Moleküle.
Wie aus obigem erkennbar wird, ist es bevorzugt, dass der Ligand und das IgE in Mengen einer entsprechenden Größenordnung oder bei einem mäßigen Überschuss des Liganden gemischt werden. Dies ist bevorzugt, da davon ausgegangen wird, dass dies den in vivo-Bedingungen, bei denen die Komplexbildung begünstigt ist, entspricht.
Das bevorzugte Verhältnis von Ligand zu IgE hängt von einer Reihe von Faktoren ab, wie etwa der Art des Trägers, den Eigenschaften des nachzuweisenden IgE und den Eigenschaften von IgE-Rezeptor und Ligand entsprechend dem nachzuweisenden IgE, weshalb dieses für den spezifisch durchzuführenden Assay optimiert werden sollte. Allerdings ist es generell bevorzugt, dass sich das Verhältnis innerhalb der oben genannten Grenzen bewegt, da die besten Ergebnisse bezüglich der Messung der relevanten in vivo-Menge an IgE bei diesem Verhältnis erzielt werden. Es wird davon ausgegangen, dass die Erklärung hierfür ist, dass es sich bei oben erwähnter CD23-vermittelter Antigenpräsentation um einen Mechanismus handelt, der die Antigenpräsentation bei niedrigen Antigenkonzentrationen erhöht. Bei hohen Antigenkonzentrationen wird dieser Mechanismus irrelevant, da ausreichend Antigen durch Antigen-präsentierende Zellen selbst ohne spezifischen Einfang durch CD23 präsentiert werden wird. In anderen Worten wird angenommen, dass die Komplexe aus Ligand und IgE sowohl an CD23 als auch an FcεRI binden und dass das Gleichgewicht bei den oben genannten Verhältnissen von Ligand zu IgE zu einer Bindung an CD23 hin verschoben wird.
Vorzugsweise wird das Verfahren der Erfindung bei einer Temperatur von 0°C bis 100°C, bevorzugter 0°C bis 40°C, und am bevorzugtesten 20°C bis 38°C durchgeführt.
Werden biologische Zellen als Träger verwendet und wird ein Detektionssystem, bestehend aus einem Nachweisantikörper in Kopplung an eine markierende Verbindung verwendet, so wird der Assay vorzugsweise bei einer relativ niedrigen Temperatur von 0°C bis 10°C, bevorzugter 0°C bis 6°C, vorgenommen, um zu vermeiden, dass Komplexe von IgE und Allergen, das an IgE-Rezeptoren an der äußeren Oberfläche der Zelle gebunden ist, in das Zellinnere internalisiert werden, bevor die Markierung stattgefunden hat, was zu inkorrekten Messungen führen würde.
Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zum Detektieren und/oder Quantifizieren eines spezifischen IgE-Antikörpers in einer Flüssigkeitsprobe, umfassend die folgenden Schritte:

(a) Kontaktieren (i) der Probe mit (ii) einem freien Liganden in Form eines Antigens, eines Antikörpers oder eine Haptens, zum Erhalt eines Gemischs I, das IgE-haltige Komplexe umfasst, wobei der Ligand an Biotin oder ein funktionelles Derivat davon gebunden ist,
(b) Mischen des Gemischs I mit einem Träger, an den (iii) IgE-Rezeptor gebunden ist, welcher IgE-Rezeptor CD23 (FcεRII) und/oder FcεRI ist, zum Erhalt eines Gemischs II, das Träger-gebundene IgE-haltige Komplexe umfasst,
(b') Trennen der Träger-gebundenen IgE-haltigen Komplexe von Gemisch II und Waschen der Komplexe,
(b'') Hinzufügen der gewaschenen Träger-gebundenen IgE-haltigen Komplexe einer Lösung von (iv) einer chemilumineszierenden Verbindung, die kovalent an Avidin, Streptavidin oder ein funktionelles Derivat davon gebunden ist, zum Erhalt eines Gemischs II',
(c) Trennen der Träger-gebundenen IgE-haltigen Komplexe von Gemisch II' und Waschen dieser Komplexe,
(d) Einleiten einer chemilumineszierenden Reaktion in den resultierenden IgE-haltigen Komplexen und Nachweisen/Messen der resultierenden Chemilumineszenz, sofern vorhanden.

Definitionen
Bei der vorliegenden Erfindung meint der Ausdruck "spezifischer IgE-Antikörper" jegliches spezifisches Immungolublin des IgE-Isotyps als auch jegliches andere Immunglobulin, das eine Affinität für die IgE-Rezeptoren CD23 und/oder FcεRI aufweist.
Der Begriff "biologische Flüssigkeitsprobe" meint jegliche biologische Flüssigkeit, z.B. Blut, Plasma, Serum, Urin, Speichel oder jegliche andere Flüssigkeit, die innerhalb eines biologischen Organismus exkretiert, sekretiert oder transportiert wird.
Der Ausdruck "Ligand in Form eines Antigens, eines Antikörpers oder eines Haptens" kann jegliche immunologisch aktive Substanz sein. "Antigen" kann ein Allergen sein, z.B. Pollen von Bäumen, Gras, Unkraut etc., Stauballergene, Allergene von Acariden (Milben) und Tieren wie Katzen, Hunden, Pferden, Rindern und Vögeln, Allergene von Stechmücken und inhalierte Allergene von Insekten, und Nahrungsmittel-Allergene, "Antikörper" kann ein monoklonaler oder polyklonaler Antikörper sein, einschließlich rekombinanter und fragmentierter Antikörper; und "Hapten" kann eine Kohlehydrat- Komponente oder Fragmente davon, Enzymhemmer oder Arzneimittel, z.B. Penicillin oder ein Derivat davon, sein.
In Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung meint der Begriff "IgE-Rezeptor" CD23 (FcεRII) und/oder FcεRI. Der Begriff "CD23" meint jegliche Formulierung davon und jeglichen Teil davon, einschließlich CD23 in reiner Form oder in einem Gemisch, einer Lösung oder einem Extrakt; synthetisches oder rekombinantes CD23; CD23, das aus natürlichen Quellen stammt; und Voll-CD23 und Teile davon. Die α-Kette von CD23 kann als einem Trimer, einem Dimer oder einem Monomer verwendet werden, und lediglich als der α-Kette oder dem löslichen Teil davon, d.h. dem Teil, der sich von der äußeren Oberfläche der Zellmembran erstreckt, oder es kann ein Abschnitt des löslichen Teils der α-Kette als CD23 verwendet werden. "FcεRI" meint jegliche Formulierung davon und jeglichen Teil davon, einschließlich FcεRI in reiner Form oder in einem Gemisch, einer Lösung oder einem Extrakt; synthetisches oder rekombinantes FcεRI; FcεRI, das aus natürlichen Quellen stammt; und Voll-FcεRI und Teile davon. Insbesondere kann lediglich die α-Kette, die primär für die Bindung von IgE verantwortlich ist, oder der lösliche Teil davon, d.h. der Teil, der sich von der äußeren Oberfläche der Zellmembran erstreckt, oder ein Abschnitt des löslichen Teils der α-Kette, als FcεRI verwendet werden.
Der Ausdruck "freier gelöster Ligand" meint einen Liganden, der frei zur ungehinderten Bildung von Komplexen mit IgE ist, und der Ausdruck umfasst Liganden in Lösung und Liganden, die an eine Substanz in Lösung gekoppelt sind.
Die vorliegende Erfindung wird in weiterer Ausführlichkeit unter Bezugnahme auf die Zeichnungen beschrieben, worin
1a die Fluoreszenzmenge zeigt, die in einem Assay der Erfindung unter Verwendung von (i) keinem Serum und keinem Allergen, (ii) einem Kontrollserum und Allergen, und (iii) Allergiepatientenserum und Allergen, gemessen wurde.
1b zeigt die Fluoreszenzmenge, die in einem Assay der Erfindung unter Verwendung von (i) einem Kontrollserum und Allergen, (ii) Allergiepatientenserum und Allergen, (iii) Allergiepatientenserum, Antikörper zu CD19 und Allergen, und (iv) Allergiepatientenserum, Antikörper zu CD23 und Allergen, gemessen wurde.
1c zeigt die Fluoreszenzmenge, die in einem Assay der Erfindung unter Verwendung von (i) keinem Serum und keinem Allergen, (ii) Allergiepatientenserum und keinem Allergen, (iii) Allergiepatientenserum und Allergen, (iv) Allergiepatientenserum, Allergen und Antikörper zu IgE, und (v) Allergiepatientenserum, Allergen und Antikörper zu IgE, gemessen wurde.
2a zeigt die Fluoreszenzmenge, die in einem Assay der Erfindung unter Verwendung von (i) Allergiepatientenserum und keinem Allergen, (ii) Allergiepatientenserum und Allergen, (iii) Allergiepatientenserum, SAV-behandeltem Allergiepatientenserum und Allergen, und (iv) SAV-behandeltem Allergiepatientenserum und Allergen, gemessen wurde.
2b zeigt die IgE-Menge bei den Situationen (i)–(iv) der 2a, die auf der Grundlage der Messungen der IgE-Menge in Allergiepatientenserum und SAV-behandeltem Allergiepatientenserum in einem Gesamt-IgE-Referenzassay berechnet wurde.
3 zeigt eine diagrammatische Darstellung einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung
4 zeigt eine diagrammatische Darstellung einer zweiten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung
5 zeigt eine diagrammatische Darstellung einer dritten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung
6 zeigt die Fluoreszenzmenge, die in einem Assay der Erfindung unter Verwendung von (i) Allergiepatientenserum, Allergen und Antikörper, (1) gerichtet auf die IgE-Bindungskomponente von CD23, (ii) Allergiepatientenserum, Allergen und Antikörper, (2) gerichtet auf die IgE-Bindungskomponente von CD23, (iii) Allergiepatientenserum, Allergen und Antikörper, gerichtet auf die Nicht-IgE-Bindungskomponente von CD23, und (iv) Allergiepatientenserum, Allergen und Antikörper zu CD14, gemessen wurde
7a zeigt die Fluoreszenzmenge, die in einem Assay der Erfindung unter Verwendung von Allergiepatientenserum und zunehmenden Dosen von Grasallergenen gemessen wurde
7b zeigt die Fluoreszenzmenge, die in einem Assay der Erfindung unter Verwendung von Allergiepatientenserum und zunehmenden Dosen eines gereinigten, rekombinant exprimierten Birken-Hauptallergens gemessen wurde
8a zeigt die Fluoreszenzmenge, die in einem Assay der Erfindung unter Verwendung steigender Dosen an Birkenallergenen und (i) Birkenallergie-Patientenserum und nicht-allergischem Kontrollserum, (ii) Allergiepatientenserum und Serum von einem SAV-behandelten Birkenallergiepatienten (A), (iii) Birkenallergie-Patientenserum und Serum von einem SAV-behandelten Birkenallergiepatienten (B), und (iv) Birkenallergie-Patientenserum und Serum von einem SAV-behandelten Gräserallergiepatienten gemessen wurde
8b zeigt die Fluoreszenzmenge, die in einem Assay der Erfindung unter Verwendung steigender Dosen eines gereinigten, rekombinant exprimierten Birken-Hauptallergens, und (i) Birkenallergie-Patientenserum und nicht-allergischem Kontrollserum, (ii) Allergiepatientenserum und Serum von einem SAV-behandelten Birkenallergiepatienten (A), (iii) Birkenallergie-Patientenserum und Serum von einem SAV-behandelten Birkenallergiepatienten (B), und (iv) Birkenallergie-Patientenserum und Serum von einem SAV-behandelten Gräserallergiepatienten gemessen wurde.
In 3 sind die Schritte einer bevorzugten Ausführungsform des Assays der Erfindung im Prinzip gezeigt. In einem ersten Schritt wird ein biotinyliertes Allergen und eine Probe, die für das Allergen spezifisches IgE enthält (bezeichnet als "IgE" in der Figur) gemischt und zum Erhalt eines Gemischs I inkubiert, das die Komplexe einschließlich einer Reihe von IgE-Molekülen und einer Anzahl von Allergen-Molekülen enthält, wobei das Gemisch I außerdem überschüssiges IgE und Allergen umfasst. In einem zweiten Schritt wird ein partikulärer Träger, an den eine Anzahl von CD23-Molekülen (und/oder eine Anzahl von FcεRI-Molekülen) gebunden sind, zugegeben, und diese Komplexe werden an den Träger über CD23 zum Erhalt eines Gemischs II gebunden. Möglicherweise kann eine geringere Menge an IgE an CD23 in monomerer Form binden. In einem dritten Schritt werden die Träger-gebundenen Komplexe aus Gemisch II abgetrennt und ein- oder mehrmals zur Entfernung von nicht-gebundenen Reaktanden gewaschen. Außerdem werden durch den Waschvorgang jegliche nicht-gebundene Komplexe entfernt, die vorhanden sein können, da, wie oben erwähnt, es möglich ist, dass die beim vorliegenden Assay stattfindende Interferenz das Ergebnis einer Hemmung der Bindung der Komplexe an den IgE-Rezeptor ist. Die Trennung der Komplexe aus Gemisch II kann z.B. durch magnetische Trennung vorgenommen werden, wenn paramagnetische Partikel als Träger verwendet werden. Eine chemilumineszierende Markierung, vorzugsweise ein Streptavidin-Acridinester-Reagenz, wird mit den Trägergebundenen Komplexen inkubiert, um die Markierung an das Komplex-gebundene Biotin zu binden. Im Anschluss an die Inkubation werden die Träger-gebundenen markierten Komplexe abgetrennt und gewaschen, um nicht-umgesetzte Markierungsmoleküle zu entfernen, und wird die chemilumineszierende Reaktion durch Verwendung eines geeigneten Reagenz, z.B. Natriumhydroxid, eingeleitet und die Chemilumineszenz der Träger-gebundenen markierten Komplexe gemessen.
In 4 sind die Schritte einer bevorzugten Ausführungsform des Assays der Erfindung im Prinzip gezeigt. In einem ersten Schritt werden ein biotinyliertes Allergen, eine Probe, die ein zu dem Allergen spezifisches IgE enthält (bezeichnet als "IgE" in der Figur) und ein partikulärer Träger, an den eine Anzahl von CD23-Molekülen (und/oder eine Anzahl von FcεRI-Molekülen) gebunden ist, gemischt und zum Erhalt eines Gemischs II inkubiert, das Träger-gebundene Komplexe enthält, einschließlich einer Anzahl von IgE-Molekülen und einer Anzahl von Allergen-Molekülen, wobei das Gemisch II außerdem überschüssiges IgE und Allergen, ebenso wie nicht-gebundene Komplexe, umfasst. Dann werden die Träger-gebundenen Komplexe aus Gemisch II abgetrennt und ein- oder mehrmals gewaschen.
Anschließend wird eine chemilumineszierende Markierung, vorzugsweise ein Streptavidin-Acridinester-Reagenz, mit den Träger-gebundenen Komplexen inkubiert, um die Markierung am das Komplex-gebundene Biotin zu binden. Nach der Inkubation werden die Träger-gebundenen markierten Komplexe abgetrennt und gewaschen, um nicht-umgesetzte Markierungsmoleküle zu entfernen, und wird die chemilumineszierende Reaktion durch Verwendung eines geeigneten Reagenz, z.B. Natriumhydroxid, eingeleitet und die Chemilumineszenz der Träger-gebundenen markierten Komplexe gemessen.
In 5 sind die Schritte einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung gezeigt. In einem ersten Inkubationsschritt werden ein Allergen und eine Probe, die für das Allergen spezifischen IgE enthält (bezeichnet als "IgE" in der Figur) gemischt und zum Erhalt eines Gemischs A inkubiert, das Komplexe einschließlich einer Anzahl von IgE-Molekülen und einer Anzahl von Allergen-Molekülen enthält, wobei das Gemisch A außerdem überschüssiges IgE und Allergen enthält. In einem zweiten Inkubationsschritt wird ein partikulärer Träger, an den eine Anzahl von CD23-Molekülen (und/oder eine Anzahl von FcεRI-Molekülen) gebunden ist, zugegeben, und werden diese Komplexe an den Träger über CD23 zum Erhalt eines Gemischs B gebunden. Möglicherweise kann eine geringere Menge an IgE an CD23 in monomerer Form binden. Anschließend werden die Träger-gebundenen Komplexe aus Gemisch B abgetrennt und ein- oder mehrmals zur Entfernung von nicht-gebundenen Reaktanden gewaschen. Auch werden durch das Waschen jegliche nicht-gebundenen Komplexe entfernt, die vorhanden sein können, da es, wie oben erwähnt, möglich ist, dass die beim vorliegenden Assay stattfindende Interferenz das Ergebnis einer Hemmung der Bindung der Komplexe an den IgE-Rezeptor ist. Die Abtrennung der Komplexe aus dem Gemisch B kann z.B. durch magnetische Trennung vorgenommen werden, wenn paramagnetische Partikel als dem Träger verwendet werden. In einem dritten Inkubationsschritt wird biotinylierter Antikörper zum IgE (Nachweisantikörper) zum Erhalt eines Gemisches C zugegeben. Der Nachweisantikörper ist polyklonal und wird an alle IgEs unabhängig von der Spezifität des IgE binden. Die resultierenden Träger-gebundenen Komplexe werden aus dem Gemisch C abgetrennt und diese Komplexe gewaschen. In einem vierten Inkubationsschritt wird eine chemilumineszierende Markierung, vorzugsweise ein Streptavidin-Acridinester-Reagenz, mit den Träger-gebundenen Komplexen zur Bindung der Markierung an das Komplex-gebundene Biotin inkubiert. Nach der Inkubation werden die Trägergebundenen markierten Komplexe abgetrennt und zur Entfernung von nichtumgesetzten Markierungsmolekülen gewaschen, und wird die chemilumineszierende Reaktion unter Verwendung eines geeigneten Reagenz, z.B. Natriumhydroxid, eingeleitet und die Chemilumineszenz der Träger-gebundenen markierten Komplexe gemessen.
Im Folgenden wird die Erfindung unter Bezugnahme auf die Beispiele ausführlicher beschrieben.
Beispiele
In den Beispielen werden die folgenden Abkürzungen verwendet:

FITC: Fluoresceinisothiocyanat
EBV: Epstein-Barr-Virus
SE: Standardeinheiten
SAV: Spezifische Allergie-Vakzination

Beispiel 1
Nachweis der Bindung von Birkenallergen-spezifischem IgE an CD23, exprimiert durch EBV-transformierte B-Zellen, mittels flusszytometrische Anlayse.
FITC-markierter Betula verrucosa-(Bet v)-Extrakt (1 μg/ml) wurde mit Kontrollserum 734 inkubiert (kein nachweisbares IgE in einem Referenzassay, der den Gesamtgehalt an IgE misst (MagicLite^®, ALK-ABELLÒ, Hoersholm, Dänemark)), oder mit Birken-Allergiepatientenserum 1474 (> 800 SE/ml Birken-spezifisches IgE im MagicLite^®-Assay) bei einer Serum-Endkonzentration von 60 %. EBV-transformierte B-Zellen von einem allergischen Patienten in Kulturmedium wurden zu einer Endkonzentration von 4 × 10⁶/ml zugegeben und für 1 Stunde bei 37°C inkubiert, gefolgt von zwei Waschgängen zur Entfernung von überschüssigem Allergen. Nach dem Waschen der Zellen wurde die Bindung von FITC-markiertem Bet v (Bet v*) an die B-Zellen durch Messen der Fluoreszenz unter Verwendung eines FACSCalibur-Flusszytometers analysiert.
Die Ergebnisse sind in 1a gezeigt, worin die Mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) angegeben ist für (i) kein Serum und kein Bet v (Hintergrund), bezeichnet als "nur Medium" in 1a, (ii) s734 und Bet v, und (iii) s1464 und Bet v. Die Ergebnisse zeigen, dass die Bindung von FITC-markiertem Birkenallergenextrakt an B-Lymphozyten, die CD23 exprimieren, direkt nachgewiesen werden kann.
In Blockierungsexperimenten mit Antikörper zu CD23 und Antikörper zu CD19 als Referenz wurden EBV-B-Zellen 1 Stunde lang bei 4°C mit diesen Antikörpern inkubiert, bevor die Zellen den Gemischen von Bet v und Serum zugegeben wurden. 1b zeigt die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) für (i) s734-Serum, (ii) s1464, (iii) s1464 und Antikörper zu CD19, und (iv) s1464 und Antikörper zu CD23. Wie aus 1b hervorgeht, hemmt die Vorinkubation der B-Zellen mit Antikörper zu CD23 die Bindung von FITC-markiertem Birkenextrakt an die B-Zellen, wohingegen die Vorinkubation mit einem Antikörper zu einem irrelevanten B-Zell-Oberflächenantigen, CD19, die Bindung nicht hemmt. Dies zeigt, dass FITC-markierter Birkenextrakt an CD23, den niederaffinen IgE-Rezeptor, bindet.
Zusätzliche Experimente, bei denen polyklonale Anti-IgG- oder Anti-IgE-Antikörper mit dem allergischen Patientenserum (s1464) für 1 Stunde bei 37°C vor Zugabe von Bet v vorinkubiert wurden, wurden vorgenommen. 1c zeigt die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) für (i) Hintergrund, (ii) s1464 und kein Bet v, (iii) s1464 und Bet v, (iv) s1464, Antikörper zu IgG und Bet v, (v) s1464, Antikörper zu IgE und Bet v. Wie aus 1c ersichtlich wird, ist IgE, doch nicht IgG, für die Bindung von FITC-markiertem Birkenextrakt an die B-Lymphozyten verantwortlich.
Schlussfolgernd zeigen die in 1a–c gezeigten Experimente, dass die Bindung eines markierten Allergens an CD23 auf einem festen Träger über IgE vermittelt ist und ohne weiteres nachgewiesen werden kann.
Beispiel 2
Die Bindung von Birkenallergen-spezifischem IgE an CD23 wird durch Immuntherapie-Seren gehemmt, obschon die kumulativen Birkenallergen-spezifischen IgE-Mengen, wie mittels MagicLite^®-Assay gemessen, erhöht sind.
FITC-markierter Betula verrucosa-(Bet v)-Extrakt (1 μg/ml) wurde mit Birken-Allergiepatientenserum 894 (> 800 SE/ml Birken-spezifisches IgE im MagicLite^®-Assay) bei einer Serum-Endkonzentration von 40 % in Abwesenheit oder Gegenwart eines Serums (ebenfalls 40 %) von einem Patienten inkubiert, der eine Birken-SAV für > 4 Jahre (Serum 1490, 88 SE/ml Birken-spezifisches IgE im MagicLite^®-Assay) erhält. EBV-transformierte B-Zellen von einem allergischen Patienten in Kulturmedium wurden zu einer Endkonzentration von 4 × 10⁶/ml zugegeben und für 1 Stunde bei 37°C inku biert, gefolgt von zwei Waschgängen zur Entfernung von überschüssigem Allergen. Nach dem Waschen der Zellen wurde die Bindung von FITC-markiertem Bet v (Bet v*) an die B-Zellen durch Messen der Fluoreszenz unter Verwendung eines FACSCalibur-Flusszytometers analysiert.
2a zeigt die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) für (i) s894 und kein Bet v, (ii) s894-Serum und Bet v, (iii) sowohl s894 als auch s1490 und Bet v, und (iv) s1490 und Bet v. Wie aus 2a erkennbar sein wird, reduziert die Zugabe von s1490 die Bindung von IgE und FITC-markiertem Birkenallergen an CD23 auf Hintergrundmengen. Dies zeigt das Vorhandensein eines Faktors an, der in die IgE-vermittelte Bindung von FITC-markiertem Birkenallergen an CD23 eingreift.
Zu Vergleichszwecken zeigt 2b die errechnete Gesamtmenge an Birkenallergenspezifischem IgE für die gleichen Reaktand-Situationen (i)–(iv) wie in 2a, wobei die Mengen auf der Grundlage separater Messungen der Gesamtmenge an IgE in s894 und s1490 erreicht wurden, wie mittels MagicLIte^®-Assay gemessen.
Aus 2a–b kann auch gefolgert werden, dass der Assay der Erfindung unter Verwendung von CD23 als Fangagens recht unterschiedliche Ergebnisse gegenüber dem Gesamt-IgE-Assay MagicLite^® nach dem Stand der Technik unter Verwendung von Antikörper zu IgE als Fangagens erbringt. Weiterhin muss angenommen werden, dass die mittels des Assays der Erfindung erzielten Ergebnisse den Status des untersuchten Lebewesens besser ausdrücken, da die in vivo-Antigenpräsentation durch CD23 erleichtert wird.
Beispiel 3
Komplexe zwischen Allergen und spezifischem IgE binden an CD23 durch Wechselwirkung mit der IgE-bindenden Komponente des Rezeptors und können durch einen Antikörper zu IgE nachgewiesen werden.
Blockierungsexperimente wurden mit drei verschiedenen monoklonalen Antikörpern zu CD23, d.h. zwei Antikörper zu CD23, die spezifisch an die IgE-bindende Komponente von CD23 binden (ML 233 von Pharmingen, vertrieben durch Becton-Dickinson, Dänemark, und MHM6 von DAKO A/S, Dänemark) und einem Antikörper, der spezifisch an eine Region von CD23 bindet, die nicht an der IgE-Bindung beteiligt ist (EBV CS5 von Becton-Dickinson, Dänemark), vorgenommen. Schließlich wurde ein Antikörper zu einem irrelevanten Oberflächenmolekül (CD14) als einer Referenz einbezogen (von DAKO A/S, Dänemark). EBV-transformierte B-Zellen wurden mit 10 μg/ml jedes Antikörpers für 1 Stunde bei 4°C vorinkubiert, und zur Entfernung des ungebundenen Antikörpers vor der Inkubation mit Komplexen gewaschen. Die Komplexe wurden durch Kontaktieren von Serum s1464 von einem Spender mit Birkenpollenallergie (> 800 SE/ml Birken-spezifisches IgE im MagicLite^®-Assay) bei einer Serum-Endkonzentration von 80 % mit 1 μg/ml Bet v für 1 Stunde bei 37°C erzeugt. Die Komplexe durften die Antikörperbehandelten EBV-Zellen für 1 Stunde bei 4°C kontaktieren. Anschließend wurden die Zellen gewaschen und gebundene Komplexe durch Inkubieren mit einem biotinylierten Antikörper, der Human-IgE erkennt (PU PED0048 von ALK-Abello) gefärbt, gefolgt von Waschen und Inkubieren mit einem Streptavidin-Phycoerythrin-Konjugat (Southern Biotechnology Associates, vertrieben von KEBO, Dänemark). Nach dem letzten Waschgang wurde die Bindung der IgE-Allergen-Komplexe an die EBV-Zellen durch Messen der Fluoreszenz unter Verwendung eines FACSCalibur-Flusszytometers analysiert.
Aus 6 kann geschlossen werden, dass die Bindung von Allergen an CD23 durch eine Wechselwirkung mit der IgE-bindenden Komponente von CD23 und nicht durch eine nicht-spezifische Wechselwirkung vermittelt ist. Außerdem kann die Bindung unmarkierter Komplexe durch einen Antikörper zu IgE ohne weiteres nachgewiesen werden.
Beispiel 4
Die Erfindung erlaubt den Nachweis von spezifischem IgE in Seren von Patienten mit Allergie, unabhängig von dem erkannten Allergen.
Komplexe wurden durch Kontaktieren von Seren von zwei verschiedenen Spendern mit einer Allergie gegenüber Gräserpollen-(Phleum p)-Allergene (s1043: 582 SE/ml, und s1524: 658 SE/ml Phleum p-spezifisches IgE im MagicLite^®-Assay) bei zunehmenden Dosen eines Extrakts der Gräserallergene erzeugt. Die Reaktion durfte 1 Stunde lang bei 37°C ablaufen. Anschließend wurden EBV-transformierte B-Zellen der Reaktion für 1 Stunde bei 4°C zugegeben. Die Zellen wurden gewaschen, und gebundene Komplexe wurden sichtbar gemacht und wie in Beispiel 3 beschrieben analysiert. 7a zeigt das geometrische Mittel der Fluoreszenzintensität für (i) s1043 und (ii) s1524. Jede Probe wurde im Duplikat vorgenommen und der Mittelwert errechnet.
In 7b wurde s1464 (beschrieben in Beispiel 3) mit zunehmenden Dosen an gereinigtem, rekombinantem Bet v 1, einem der Hauptallergene von Birkenpollen, kontaktiert. Das Experiment wurde wie in 7a beschrieben vorgenommen.
7a und b zeigen, dass bei einer Ausführungsform der Erfindung unter Verwendung desselben Antikörpers zu IgE für den Nachweis die Messung von IgEs, die für unterschiedliche Allergene spezifisch sind, möglich ist. Der Assay kann zur Messung von für Vollallergenextrakt, als auch für einzelne, gereinigte Allergene spezifische IgEs verwendet werden. 7a und b zeigen auch, dass individuelle Allergene bei unterschiedlichen Dosen erforderlich sind, um ein optimales Signal zu erhalten.
Beispiel 5
Die Bindung von Birkenallergen-spezifischem IgE an CD23 wird durch Seren von Patienten gehemmt, die einer Spezifischen Allergie-Vakzination (SAV) für Birkenpollen-Allergie unterzogen wurden, wohingegen die Bindung durch Seren von einem nicht-allergischen Spender oder einem Patienten, der eine SAV für eine nicht-verwandte Allergie erhalten hat, nicht gehemmt ist.
Serum von einem gegen Birkenpollen allergischen Spender, s1464, wurde mit den folgenden Seren gemischt (1:1): (i) Serum von einem nicht-allergischen Spender s745 (0 SE/ml), (ii), (iii) Spender, die eine SAV für Birkenpollen erhalten haben (s1490 und s1598; 88 und 57 SE/ml Birken-spezifisches IgE im Magiclite^®-Assay), und (iv) Spender mit Gräserpollenallergie (s808954; 137 SE/ml Gräser-spezifisches und 4 SE/ml Birken-spezifisches IgE im Magiclite^®-Assay). Nach der Inkubation mit entweder einem Extrakt der Birkenpollen-Allergene (Bet V, 8a) oder einem gereinigten rekombinanten Allergen von Birkenpollen (Bet v 1, 8b) bei einer Endkonzentration von 40 jedes Serums wurden EBV-transformierte B-Zellen für eine Stunde bei 4°C zugegeben, die Zellen gewaschen und gebundene Komplexe wie oben beschrieben nachgewiesen.
8a und b stellen die Ergebnisse als dem geometrischen Mittelwert der Fluoreszenzintensität dar. Durch Vergleich der Gesamtmengen an IgE (gemessen in Magiclite^®-Assays) in jeder Probe (i–iv) zum Signal, das unter Verwendung von CD23 als einem Fangagens erhalten wurde, kann gefolgert werden, dass der Assay der Erfindung einen unterschiedlichen "Typ" des Komplex-bildenden, CD23-bindenden IgE misst. Wie oben erörtert wird davon ausgegangen, dass die Mengen dieses "Typs" von IgE den Status des untersuchten Lebewesens besser widerspiegeln als die mittels herkömmlicher Methoden zu gemessenen IgE-Mengen.
Literaturliste

(1) "Serum-IgE-Facilitated Allergen Presentation in Atopic Disease", van der Heijden et al., The Journal of Immunology, Bd. 150, 3643-3650, 1993.
(2) "IgE-antigen complexes enhance FcεR and Ia expression by murine B lymphocytes", Richards et al., J. Exp. Med., Bd. 168, 571, 1998.
(3) Santamaria et al., Hum. Immunol., Bd. 37, 23-30, 1993.
(4) "The High Affinity IgE Recpetor (FcεRI) Mediates IgE-Dependant Allergen Presentation", Maurer et al., The Journal of Immunology, Bd. 154, 6285-6290, 1995.

Claims

Verfahren zum Detektieren und/oder Quantifizieren eines IgE-Antikörpers, der für einen Liganden in Form eines Antigens, Antikörpers oder Haptens spezifisch ist, in einer biologischen Flüssigkeitsprobe, hinsichtlich der Fähigkeit des IgE-Antikörpers, an einen IgE-Rezeptor zu binden, umfassend die folgenden Schritte: (a) Kontaktieren (i) der Probe mit (ii) einem freien gelösten Liganden in Form eines Antigens, eines Antikörpers oder eines Haptens, zum Erhalt eines Gemischs I, das IgE-haltige Komplexe umfasst, (b) Mischen des Gemischs I mit einem Träger, an den (iii) IgE-Rezeptor gebunden ist, wobei der IgE-Rezeptor CD23 (FcεRII) und/oder FcεRI ist, zum Erhalt eines Gemischs II, umfassend Träger-gebundene IgE-haltige Komplexe, (c) Abtrennen der Träger-gebundenen IgE-haltigen Komplexe aus Gemisch II, und (d) Bestimmen der Menge der entstandenen Träger-gebundenen IgE-haltigen Komplexe.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Ligand markiert ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der in Schritt a) verwendete Ligand an (iv) eine markierende Verbindung gebunden ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei (iv) eine markierende Verbindung in Schritt a) zusätzlich zu (i) der Probe und (ii) dem Liganden zugegeben wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei eine markierende Verbindung den in Schritt (b) entstandenen Träger-gebundenen IgE-haltigen Komplexen zugegeben wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei (iv) eine markierende Verbindung den Trägergebundenen IgE-haltigen Komplexen, die aus dem Abtrennschritt (c) resultieren, zugegeben wird, zum Erhalt eines Gemischs II'.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei die markierten und Träger-gebundenen IgE-haltigen Komplexe aus Gemisch II' abgetrennt und vor Schritt (d) gewaschen werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 3-7, wobei (iv) die markierende Verbindung eine chemilumineszierende Verbindung ist, die kovalent an Avidin, Streptavidin oder ein funktionelles Derivat davon gebunden ist.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die chemilumineszierende Verbindung eine Acridinverbindung ist.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der Ligand an Biotin oder ein funktionelles Derivat davon gebunden ist.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die IgE-haltige Probe mit dem Liganden kontaktiert wird und inkubieren darf, zum Erhalt eines Gemischs I (Schritt (a)), bevor Gemisch I mit dem Träger/IgE-Rezeptor kontaktiert wird (Schritt (b)).
Verfahren nach einem der Ansprüche 1-10, wobei Schritt (a) und (b) gleichzeitig in einem Vorgang ausgeführt werden.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der Träger ein partikuläres Material ist.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei der Träger ein paramagnetisches partikuläres Material ist.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das nachzuweisende IgE unter Verwendung sowohl von CD23 alleine zum Erhalt einer ersten Messung und von FcεRI alleine zum Erhalt einer zweiten Messung quantifiziert wird.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Zahl der Liganden-Moleküle zwischen 100 % und 200 % der Zahl der nachzuweisenden IgE-Moleküle liegt.
Verfahren nach Anspruch 1, umfassend die Verwendung eines Detektionssystems in Form einer markierenden Verbindung, die an einen Antikörper zu dem nachzuweisenden IgE gekoppelt ist.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei die markierende Verbindung an den Antikörper über Biotin gekoppelt ist.
Verfahren nach Anspruch 17 oder 18, wobei das Detektionssystem den in Schritt c) entstandenen Träger-gebundenen Komplexen zugegeben wird.
Verfahren zum Detektieren und/oder Quantifizieren eines spezifischen IgE-Antikörpers in einer biologischen Flüssigkeitsprobe, hinsichtlich der Fähigkeit des IgE-Antikörpers, an einen IgE-Rezeptor zu binden, umfassend die folgenden Schritte: (a) Kontaktieren (i) der Probe mit (ii) einem freien Liganden in Form eines Antigens, eines Antikörpers oder eines Haptens, zum Erhalt eines Gemischs I das IgE-haltige Komplexe umfasst, wobei der Ligand an Biotin oder ein funktionelles Derivat davon gebunden ist, (b) Mischen des Gemischs I mit einem Träger, an den (iii) IgE-Rezeptor gebunden ist, wobei der IgE-Rezeptor CD23 (FcεRII) und/oder FcεRI ist, zum Erhalt eines Gemischs II, das Träger-gebundene IgE-haltige Komplexe umfasst, (b') Abtrennen der Träger-gebundenen IgE-haltigen Komplexe aus Gemisch II und Waschen der Komplexe, (b'') Zugeben zu den gewaschenen Träger-gebundenen IgE-haltigen Komplexen einer Lösung von (iv) einer chemilumineszierenden Verbindung, die kovalent an Avidin, Streptavidin oder ein funktionelles Derivat davon gebunden ist, zum Erhalt eines Gemischs II', (c) Abtrennen der Träger-gebundenen IgE-haltigen Komplexe aus Gemisch II' und Waschen der Komplexe, (d) Einleiten einer Chemilumineszenzreaktion in den resultierenden IgE-haltigen Komplexen und Nachweisen/Messen der resultierenden Chemilumineszenz, sofern vorhanden.
Anwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1-17, zur Überwachung und Auswertung des immunologischen Zustands einer Person.
Anwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1-17, zur Überwachung und Auswertung des immunologischen Zustands einer Person, die eine spezifische Allergie-Vakzinations-(SAV)-Behandlung erhält.