PL208129B1

PL208129B1 - Sposób wykrywania i określania ilościowego zawartości przeciwciała IgE swoistego w stosunku do ligandu w postaci alergenu w próbce płynu biologicznego oraz zastosowanie tego sposobu do monitorowania stanu immunologicznego osobnika

Info

Publication number: PL208129B1
Application number: PL351672A
Authority: PL
Inventors: Neerven R.J.J. Van
Original assignee: Alk Abello As
Priority date: 1998-12-22
Filing date: 1999-12-22
Publication date: 2011-03-31
Also published as: DE69928125D1; ATE308752T1; PL351672A1; KR20010081091A; KR100676583B1; US20010055778A1; JP2002533678A; JP4472877B2; ES2249049T3; DE69928125T2; AU1774100A; DK1141710T3; EP1141710B1; US7759133B2; CA2355294C; CA2355294A1; AU752028B2; EP1141710A2; HUP0104712A3; WO2000037941A3

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób wykrywania i określania ilościowego zawartości przeciwciała IgE swoistego w stosunku do ligandu w postaci alergenu, w próbce płynu biologicznego oraz zastosowanie tego sposobu do monitorowania stanu immunologicznego osobnika.

Publikacja WO 94/11734 opisuje dwustronny test immunologiczny dla przeciwciała przy zastosowaniu znakowania chemiluminescencyjnego i ligandu związanego z biotyną, gdzie wymieniony sposób obejmuje następujące etapy, zgodnie z którymi: a) miesza się płynną próbkę z ligandem w postaci antygenu, przeciwciał a lub haptenu zwią zanym z biotyną lub jej funkcjonaln ą pochodną , przeciwciało skierowane przeciwko wykrywanemu przeciwciału związane z cząstkami paramagnetycznymi i chemiluminescencyjny związek akrydynowy związany z awidyną, streptawidyną lub ich funkcjonalną pochodną dla utworzenia kompleksu związanego z fazą stałą, b) magnetycznie oddziela się fazę stałą od fazy płynnej, c) zapoczątkowuje się reakcję chemiluminescencyjną, która jeśli zachodzi, to w oddzielonej fazie stałej i d) poddaje się analizie oddzieloną fazę stałą na obecność fazy chemiluminescencyjnej, która jest wskaźnikiem obecności tego przeciwciała w próbce.

Sposób znany ze stanu techniki jest szczególnie odpowiedni do mierzenia stężenia swoistych immunoglobulin w płynach ustrojowych, takich jak swoista immunoglobulina wybrana z grupy IgA, IgD, IgE, IgG, IgM i ich podklas.

Sposób według stanu techniki jest również odpowiedni do wykrywania i analizy ilościowej całkowitej zawartości immunoglobulin w klasach lub podklasach, takich jak IgA, IgD, IgE, IgG, IgM i ich podklasach.

Publikacja WO 98/23964 ujawnia sposób wykrywania psich, kocich i końskich IgE. Jeden z przykładów realizacji sposobu obejmuje etapy, zgodnie z którymi: a) wiąże się ludzki receptor Fcε (FcεRI) z substratem, b) doprowadza się do kontaktu związanego z substratem FcεRI z kompozycją zawierającą IgE dla utworzenia kompleksu substrat - FcεRI - IgE, c) usuwa się nadmiar niezwiązanego materiału, d) dodaje się cząsteczkę wskaźnikową, na przykład, w postaci antygenu, który może wybiórczo wiązać się z IgE kompleksu, w którym ta cząsteczka wskaźnikowa może być sprzężona z wykrywalnym znacznikiem, na przykład, ze znacznikiem fluorescencyjnym lub ligandem, takim jak biotyną, e) usuwa się nadmiar cząsteczki wskaźnikowej i f) mierzy się poziom znakowania utworzonego kompleksu znakowanego.

W dokumencie tym jest ogólne stwierdzenie, że substratem mogą być cząstki stałe, zawierające cząstki magnetyczne, lub komórki rekombinowane produkujące FcεRI. Jest również ogólnie wspomniane, że wykrywalnym znacznikiem może być znacznik chemiluminescencyjny.

Test według stanu techniki ujawniony w publikacji WO 98/23964 wykorzystuje nadmiar, związanego z substratem, receptora FcεRI i stąd mierzy całkowitą zawartość swoistej IgE, która jest wykrywana, jak również inne immunoglobuliny, na przykład, IgG, które mogą wiązać się z użytym FcεRI. Test ten przeprowadza się w ścisłych warunkach in vitro obejmujących etapy płukania po dodaniu surowicy do związanego z podłożem receptora FcεRI, jak również po dodaniu antygenu.

Artykuł „Regulation and targeting of T-cell immune responses by IgE and IgG antibodies, Bheekha Escura i inni, Immunology, Vol. 86, 343-350, 1995, ujawnia sposób obejmujący etapy, zgodnie z którymi: a) inkubuje się chimeryczną mysio/ludzką monoklonalną IgE swoistą dla NIP (5-jodo-4-hydroksyl-3-nitrofenacetyl) z kompleksem alergen-NIP dla utworzenia kompleksu, b) inkubuje się tenże kompleks z komórkami B, c) usuwa się nadmiar kompleksów poprzez płukanie i d) inkubuje się tak otrzymane komórki ze znakowanym fluorescencyjnie przeciwciałem skierowanym przeciwko przeciwciału swoistemu dla NIP oraz e) wykrywa się fluorescencję.

Publikacja WO 99/51988, która była opublikowana po dacie pierwszeństwa niniejszego zgłoszenia, ujawnia sposób wykrywania biologicznie aktywnej, specyficznej dla alergenu immunoglobuliny przy użyciu cząsteczki Fc epsilon receptora I, obejmujący tworzenie kompleksu FcεRI-immunoglobulina-alergen i wykrywanie tego utworzonego kompleksu. Dokument ten ujawnia korzystne przykłady wykonania, w których styka się alergen związany z plastyczną kuleczkową cząstką i próbka zawierająca immunoglobulinę dla umożliwienia utworzenia związanego z substratem kompleksu immunoglobulina-alergen, i w którym opisany kompleks ulega kontaktowi z receptorem FcεRI.

Zgodnie z wynalazkiem, sposób wykrywania i określania ilościowego zawartości przeciwciała IgE swoistego w stosunku do ligandu w postaci alergenu w próbce płynu biologicznego, charakteryzuje się tym, że obejmuje etapy, zgodnie z którymi

PL 208 129 B1 (a) doprowadza się do kontaktu (i) próbki płynu biologicznego z (ii) wolnym rozpuszczonym ligandem w postaci alergenu dla utworzenia mieszaniny I zawierającej kompleksy IgE-ligand, (b) miesza się mieszaninę I z nośnikiem, z którym związany jest (iii) receptor IgE, który to receptor IgE jest receptorem CD23 (FcεRII) i/lub receptorem FcεRI, dla utworzenia mieszaniny II zawierającej związane z nośnikiem kompleksy IgE-ligand, (c) oddziela się związane z nośnikiem kompleksy IgE-ligand od mieszaniny II, oraz (d) określa się ilość utworzonych kompleksów IgE-ligand związanych z nośnikiem.

Korzystnie, w sposobie tym ligand jest znakowany.

Korzystnie ligand zastosowany w etapie a) jest związany ze (iv) związkiem znakującym.

Korzystnie, (iv) związek znakujący dodaje się w etapie (a) w dodatku do (i) próbki i (ii) ligandu.

Korzystnie, związek znakujący dodaje się do związanych z nośnikiem kompleksów IgE-ligand otrzymanych w etapie (b).

Korzystnie, (iv) związek znakujący dodaje się do związanych z nośnikiem kompleksów IgEligand otrzymanych w wyniku etapu rozdziału (c) dla utworzenia mieszaniny II'.

Korzystnie, znakowane i związane z nośnikiem kompleksy IgE-ligand oddziela się od mieszaniny II' i płucze się przed etapem (d).

Korzystnie, (iv) związek znakujący jest związkiem chemiluminescencyjnym kowalentnie związanym z awidyną, streptawidyną lub ich funkcjonalną pochodną.

Korzystnie, związek chemiluminescencyjny jest związkiem akrydynowym.

Korzystnie, ligand jest związany z biotyną lub jej funkcjonalną pochodną.

Korzystnie, próbkę zawierającą IgE łączy się z ligandem w postaci alergenu i pozostawia się do inkubacji dla utworzenia mieszaniny I (etap (a)) przed doprowadzeniem do połączenia się mieszaniny I z receptorem IgE związanym z nośnikiem (etap (b)).

Korzystnie, etapy (a) i (b) przeprowadza się jednocześnie w jednej operacji.

Korzystnie, nośnikiem są cząstki stałe albo cząsteczki paramagnetyczne.

Korzystnie, IgE, która ma być wykrywana, analizuje się ilościowo przy użyciu zarówno samego receptora CD23 dla uzyskania pierwszego pomiaru jak i przy użyciu samego receptora FcεRI dla uzyskania drugiego pomiaru.

Korzystnie, ilość cząsteczek ligandu wynosi od 100% do 200% ilości cząsteczek IgE, która ma być wykrywana.

Korzystnie, stosuje się system wykrywający w postaci związku znakującego sprzężonego z przeciwciałem dla IgE, która ma być wykrywana.

Korzystnie, związek znakujący łączy się z przeciwciałem poprzez biotynę.

Korzystnie, system wykrywający dodaje się do związanych z nośnikiem kompleksów utworzonych w etapie (c).

Korzystnie, w sposobie takim przeprowadza się etapy, zgodnie z którymi (a) doprowadza się do kontaktu (i) próbki płynu biologicznego z (ii) wolnym rozpuszczonym ligandem w postaci alergenu dla utworzenia mieszaniny I zawierającej kompleksy IgE-ligand, w których ligand jest związany z biotyną lub jej funkcjonalną pochodną, (b) miesza się mieszaninę I z nośnikiem, z którym związany jest (iii) receptor IgE, który to receptor IgE jest receptorem CD23 (FcεRII) i/lub receptorem FcεRI, dla utworzenia mieszaniny II zawierającej związane z nośnikiem kompleksy IgE-ligand, (b') oddziela się związane z nośnikiem kompleksy IgE-ligand od mieszaniny II i płucze się te kompleksy, (b) dodaje się do wypłukanych związanych z nośnikiem kompleksów IgE-ligand roztwór (iv) związku chemiluminescencyjnego kowalentnie związanego z awidyną, streptawidyną lub ich funkcjonalną pochodną dla utworzenia mieszaniny II', (c) oddziela się związane z nośnikiem kompleksy IgE-ligand od mieszaniny II' i płucze się te kompleksy, (d) zapoczątkowuje się reakcję chemiluminescencyjną w otrzymanych kompleksach IgE-ligand i wykrywa/mierzy się otrzymaną chemiluminescencję, jeśli występuje.

Zgodnie z wynalazkiem, sposób określony powyżej znajduje zastosowanie do monitorowania stanu immunologicznego osobnika, pod względem ilości przeciwciała IgE swoistego w stosunku do ligandu.

PL 208 129 B1

Zgodnie z wynalazkiem też, sposób określony powyżej znajduje ponadto zastosowanie do monitorowania stanu immunologicznego osobnika otrzymującego swoiste szczepienie przeciw alergii (SAV), pod względem ilości przeciwciała IgE swoistego w stosunku do ligandu.

Receptor CD23 o niskim powinowactwie wiązania IgE znaleziono na powierzchni eozynofili, aktywowanych komórek B i T i komórek dendrytycznych. CD23 jest wielofunkcyjnym receptorem, który, jak wykazano, pełni doniosłą rolę w prezentacji antygenu za pośrednictwem IgE. Uważa się, że CD23 początkowo wiąże IgE obecną pod postacią wieloskładnikowych kompleksów zawierających zarówno IgE jak i antygen/alergen (1,2). Jednak donoszono, że swoista dla NIP monoklonalna IgE w postaci monomeru może wiązać się z CD23 (3). Jednak nie można wykluczyć, że dochodzi do agregacji oczyszczonego monoklonalnego przeciwciała IgE. CD23 składa się z łańcucha α, i może występować jako monomer, dimer lub trimer.

Receptor FcεRI o wysokim powinowactwie wiązania IgE znaleziono na powierzchni komórek tucznych i bazofili, i również na komórkach Langerhans'a, monocytach i komórkach dendrytycznych. Wykazano również rolę receptora FcεRI w prezentacji antygenu/alergenu za pośrednictwem IgE (4). IgE może wiązać się z FcεRI w postaci monomerycznej IgE, kompleksami IgE-antygen/alergen oraz wieloskładnikowymi kompleksami zawierającymi zarówno IgE jak i antygen/alergen. FcεRI występujący na komórkach tucznych i bazofilach zbudowany jest z łańcuchów: α, β i γ, a FcεRI zlokalizowany na komórkach Langerhans'a, monocytach i komórkach dendrytycznych składa się z łańcuchów α i γ.

Niniejszy wynalazek opiera się na rozpoznaniu, że możliwe jest użycie CD23 w teście wykrywania przeciwciała zapewniającym to, że próbka zawierająca IgE może reagować z antygenem/alergenem przed, lub najpóźniej jednocześnie wraz z wiązaniem się z CD23.

Wynalazek ponadto opiera się na rozpoznaniu, że ogólna procedura testu, w którym zawierająca IgE płynna próbka może reagować z antygenem/alergenem w stanie rozpuszczonym w pierwszym etapie, i w którym całość otrzymanej mieszaniny ulega kontaktowi z kompleksem nośnik-receptor IgE, naśladuje ściśle te warunki, w których identyczne reakcje zachodzą in vivo.

W szczególności, test według wynalazku naśladuje wszelkie interferencje z innych immunoglobulin, jak również i wszelkich innych potencjalnych zakłócających składników występujących w próbce, jakie mogą mieć miejsce podczas tworzenia wieloskładnikowych kompleksów zawierających IgE i antygen/alergen, jak również podczas tworzenia kompleksu IgE-antygen/alergen. Możliwe jest również, że interferencje pochodzące od innych składników z otrzymanej mieszaniny wystąpią także w wiązaniu pomiędzy kompleksem nośnik-receptor IgE, z jednej strony, i monomeryczną IgE, kompleksem IgE-antygen/alergen i wieloskładnikowymi kompleksami zawierającymi IgE i antygen/alergen z drugiej strony.

Zatem, test według wynalazku umożliwia mierzenie poziomu swoistej IgE, która w warunkach in vivo jest zdolna do wiązania się z receptorami CD23 i/lub FcεRI poprzez wykorzystanie jej biologicznej funkcji. Poniżej, poziom ten jest określany jako odpowiedni poziom IgE in vivo. Osiągnięciem niniejszego wynalazku jest rozpoznanie, że taki pomiar poziomu IgE odpowiedniego dla poziomu in vivo dostarcza cennych informacji o pacjencie, od którego próbka została pobrana, ponieważ są to dane o zdolności obecnej IgE do wiązania się z receptorami IgE zamiast z całkowitym poziomem IgE, który określa stan immunologiczny opisanego pacjenta. Zatem, test według wynalazku zapewnił możliwość określania stanu immunologicznego pacjenta znacznie bardziej dokładnie niż testy znane ze stanu techniki.

W szczególności, test według wynalazku jest cenny w połączeniu z monitorowaniem i ocenianiem stanu immunologicznego pacjenta leczonego swoistymi szczepieniami przeciw alergii (SAV). Tak więc, wykazano, że leczenie przy pomocy SAV prowadzi do zahamowania lub redukcji wiązania IgE z receptorami IgE, i w związku z tym właściwy odpowiedni do poziomu in vivo poziom IgE pozwala na znacznie bardziej precyzyjny pomiar ciężkich stanów chorób alergicznych niż całkowity poziom IgE tym bardziej precyzyjnie im bardziej znacząco te dwa wymienione poziomy różnią się od siebie. Dla przykładu, poziom IgE in vivo określony poprzez sposób według wynalazku przed i po leczeniu przy pomocy SAV może różnić się czterokrotnie, podczas gdy dla porównania poziom IgE mierzony przy pomocy konwencjonalnego testu dla IgE jest niezmieniony przed i po leczeniu przy pomocy SAV.

Niniejszy wynalazek ponadto dotyczy zastosowania wyniku uzyskanego sposobem według wynalazku, do monitorowania i oceniania stanu immunologicznego osobników leczonych, a w szczególności ludzi, w tym zarówno osobników alergicznych jak i nie alergicznych.

PL 208 129 B1

W szczególności przedmiotem niniejszego wynalazku jest też zastosowanie wyniku uzyskanego sposobem według wynalazku do monitorowania i oceniania stanu immunologicznego osobników, a w szczególności ludzi, leczonych przy pomocy SAV.

Szczegółowy opis wynalazku.

W przykł adzie wykonania według wynalazku ligand jest znakowany.

Wyrażenie „znakowany ligand oznacza każdy ligand obejmujący znakowany atom lub część, na przykład, atom znakowany promieniotwórczo.

W innym przykł adzie wykonania wedł ug wynalazku ligand u ż yty w etapie a) jest wią zany ze (iv) związkiem znakującym. W dalszym przykładzie wykonania według wynalazku, (iv) związek znakujący dodawany jest w etapie a) w uzupełnieniu do (i) próbki i (ii) ligandu. Również (iv) związek znakujący może być dodawany do kompleksów zawierających IgE utworzonych w etapie (a).

W korzystnym przykł adzie wykonania wedł ug wynalazku (iv) zwią zek znakują cy dodawany jest do związanych z nośnikiem kompleksów zawierających IgE utworzonych w etapie (b).

W szczególnie korzystnym przykł adzie wykonania wedł ug wynalazku (iv) zwi ą zek znakują cy dodawany jest do związanego z nośnikiem kompleksu zawierającego IgE otrzymanego w wyniku zajścia etapu oddzielenia (c) dla utworzenia mieszaniny II', w którym to przypadku otrzymane znakowane i związane z nośnikiem kompleksy zawierające IgE oddzielane są od mieszaniny II' i wypłukiwane przed etapem (d).

Wyrażenie „związek znakujący oznacza każdy odpowiedni konwencjonalny system znakujący użyty w testach immunologicznych obejmujący znaczniki luminescencyjne, znaczniki chemiluminescencyjne, znaczniki enzymatyczne, znaczniki promieniotwórcze, znaczniki fluorescencyjne i znaczniki absorpcyjne.

W korzystnym przykładzie wykonania według wynalazku (iv) związek znakujący jest związkiem chemiluminescencyjnym kowalentnie związanym z awidyną, streptawidyną lub ich funkcjonalną pochodną.

Korzystnie jest, gdy znacznik chemiluminescencyjny jest związkiem akrydynowym, takim jak ester dwumetyloakrydynowy N-hydroksysukcynimidu (NHS-DMAE). Awidyna/streptawidyna i DMAE mogą być łączone według sposobu Weeks'a i współpracowników, zgodnie z publikacją Clinical Chem., Vol. 29, 1474-1479 (1983). Innymi przykładami związków chemiluminescencyjnych odpowiednich do użycia w niniejszym wynalazku są luminol, lucigenina i lofina.

W innym korzystnym przykł adzie wykonania wedł ug wynalazku (iv) zwią zkiem znakują cym jest znacznik fluorescencyjny kowalentnie związany z awidyną, streptawidyną lub ich funkcjonalną pochodną. Korzystnym przykładem znacznika fluorescencyjnego jest figoerytryna (PE).

Zależnie od typu użytego systemu znakowania, związek znakujący może być związany bezpośrednio z ligandem lub może być połączony z ligandem za pomocą biotyny. W korzystnym przykładzie wykonania wynalazku ligand jest związany z biotyną lub jej funkcjonalną pochodną. Biotyną jest korzystnie związana z ligandem dodanym w etapie (a).

Związek znakujący może również być połączony z IgE, która ma być wykrywana za pomocą przeciwciała dla IgE, przy czym przeciwciało dla IgE jest łączone z IgE w taki sposób, że wiązanie IgE z receptorem IgE nie jest utrudnione. Mieszanina zawierająca kombinację związku znakującego i przeciwciał a wykrywającego korzystnie dodawana jest do zwią zanych z noś nikiem kompleksów zawierających IgE utworzonych w etapie (b) lub (c). Ewentualnie kombinacja związku znakującego i przeciwciała wykrywającego jest dodawana przed albo równocześnie z próbką i ligandem w etapie (a) lub też jest dodawana do kompleksów zawierających IgE tworzonych w etapie (a).

Korzystnie jest, gdy przeciwciało wykrywające jest przeciwciałem poliklonalnym.

Użycie systemu wykrywania obejmującego przeciwciało wykrywające połączonego ze związkiem znakującym ma tę zaletę, że ten sam system może być wykorzystany niezależnie od IgE, która ma być wykrywana. Również, uważa się, że korzystne jest użycie systemu wykrywania, który pozwala na zastosowanie nieznakowanego ligandu, ponieważ ten najlepiej przypomina warunki in vivo.

Zależnie od typu użytego systemu znakowania, związek znakujący może być związany bezpośrednio do przeciwciała wykrywającego lub może być łączony z wykrywającym przeciwciałem za pomocą biotyny. W korzystnym przykładzie wykonania wynalazku przeciwciało wykrywające jest związane z biotyną lub z jej funkcjonalną pochodną. Biotyną jest korzystnie związana z wykrywającym przeciwciałem dodanym po etapie (c).

Korzystnie jest, gdy próbka zawierająca IgE stykana jest z ligandem i umożliwiona jest inkubacja dla utworzenia mieszaniny I (etap (a)) zanim dojdzie do kontaktu mieszaniny I z kompleksem no6

PL 208 129 B1 śnik/receptor IgE (etap (b)). Czas trwania inkubacji próbki z ligandem może wynosić od 1 do 120 minut, korzystnie od 5 do 60 minut, a najkorzystniej od 10 do 40 minut.

Uważa się, że ta procedura najlepiej naśladuje warunki panujące in vivo, ponieważ umożliwia tworzenie kompleksów ligandu i IgE zanim dojdzie do kontaktu z receptorem IgE, i ponieważ CD23 wiąże IgE pod postacią opisanego kompleksu.

Alternatywnie, etap (a) i (b) przeprowadzane są jednocześnie w jednej operacji, to jest próbka zawierająca IgE, ligand i związany z nośnikiem receptor IgE są mieszane i inkubowane razem. W tym przypadku czas trwania inkubacji może wynosić od 1 do 120 minut, korzystnie od 5 do 60 minut, a najkorzystniej od 10 do 30 minut.

Nośnikiem może być każdy stały materiał powszechnie używany w testach immunologicznych, taki jak komórka biologiczna, na przykład komórka B; cząstki stałe składające się, na przykład, ze szkła, metalu, w tym żelaza, lub polimeru; cząstki paramagnetycznej; jak też płytki, ścianki, szalki lub rurki z polimeru.

Korzystnie, nośnik jest cząstką, a korzystnej cząstką paramagnetyczną. Termin „cząstka paramagnetyczna oznacza każdą cząstkę paramagnetyczną, która może być rozproszona lub zawieszona w środowisku płynnym, na przykład, cząstki „Biomag (cząstki tlenku żelaza pokryte grupami zakończonymi aminami) sprzedawane przez Advanced Magnetics Inc., USA, i „Dynabeads (tlenek żelaza pokryty polimerem) sprzedawany przez Dynal A.S., Norwegia.

Gdy cząstki stałe są użyte jako nośnik, to oddzielenie kompleksu od fazy płynnej może, zależnie od typu użytej cząstki stałej, być przeprowadzane przez między innymi, oddzielanie magnetyczne, filtrowanie, sedymentację, wirowanie, chromatografię, chromatografię kolumnową.

W korzystnym przykł adzie wykonania wedł ug wynalazku, wykrywana IgE jest analizowana ilościowo przy użyciu zarówno samego CD23 dla uzyskania pierwszego pomiaru i przy użyciu samego FcεRI dla uzyskania drugiego pomiaru.

Prezentacja antygenu za pośrednictwem CD23 przy niskim stężeniu antygenu poprzez komórki B ułatwia aktywację CD4⁺ komórek T, które pełnią ważną rolę w odpowiedziach alergicznych późnej fazy, to jest w odpowiedziach pojawiających się w czasie około 6 do 24 godzin po ekspozycji. Wywołanie reakcji za pośrednictwem receptora FcεRI po usieciowaniu IgE w komórkach tucznych i bazofilach wywołuje natychmiastową odpowiedź alergiczną. Zatem, biologiczne funkcje CD23 i FcεRI są różne, i w związku z tym wyniki uzyskane z testów według wynalazku przy użyciu jako receptora IgE odpowiednio CD23 i FcεRI, niosą różną informację o stanie immunologicznym leczonego osobnika, od którego pochodzą próbki zawierające IgE. Jest zatem korzystne uzyskanie wyników dla obydwu receptorów CD23 i FcεRI w celu zapewnienia bardziej kompletnej podstawy dla monitorowania i określenia stanu immunologicznego leczonego osobnika.

W innym korzystnym przykładzie wykonania według wynalazku użyta jest kombinacja receptorów CD23 i FcεRI. W tym przypadku użytym nośnikiem są cząstki stałe, CD23 i FcεRI mogą być związane z oddzielnymi cząstkami lub z tymi samymi cząstkami.

Sposób według wynalazku może być zrealizowany przy użyciu nadmiaru ligandu w porównaniu do oczekiwanego poziomu IgE w próbce. Możliwe jest użycie znacznego nadmiaru ligandu, na przykład, przy stosunku ligandu do IgE wynoszącym do 10000.

W dalszym korzystnym przykładzie wykonania według wynalazku, liczba cząsteczek ligandu wynosi od 100% do 10000%, korzystnie od 100% do 1000%, bardziej korzystnie od 100% do 200%, jeszcze korzystniej od 100% do 150%, a najkorzystniej od 100% do 120%, liczby cząsteczek IgE, która ma być wykrywana.

Jak z powyższego wynika korzystne jest, że ligand i IgE są mieszane w ilościach odpowiadających sobie lub z umiarkowanym nadmiarem ligandu. Jest to korzystne ponieważ uważa się, że odpowiada to warunkom in vivo, sprzyjającym dla utworzenia kompleksu.

Korzystny stosunek ligandu do IgE zależy od licznych czynników, takich jak rodzaj użytego nośnika, cech charakterystycznych IgE, która ma być wykrywana oraz cech charakterystycznych receptora IgE i ligandu odpowiadających IgE, która ma być wykrywana, i dlatego stosunek ten powinien być optymalizowany dla każdego swoistego testu, który ma być przeprowadzany. Jednak, jest ogólnie korzystne, aby stosunek ten mieścił się w granicach opisanych powyżej, ponieważ najlepsze wyniki z uwzględnieniem pomiaru odpowiedniego poziomu IgE in vivo osiągane są przy takim właśnie stosunku. Uważa się, że wyjaśnieniem dla tego zjawiska jest to, że opisana powyżej prezentacja antygenu za pośrednictwem CD23 jest mechanizmem, który wzmaga prezentację antygenu przy niskim stężeniu antygenu. Przy wysokim stężeniu antygenu opisany mechanizm ten nie ma znaczenia, poniePL 208 129 B1 waż wystarczająca ilość antygenu prezentowana jest przez komórki prezentujące antygen, nawet bez swoistego łączenia go przez CD23. Innymi słowy, uważa się, że kompleksy ligandu i IgE wiążą się zarówno z CD23 jak i z FcεRI, i że równowaga reakcji przesuwana jest w stronę wiązania z CD23 w stosunkach ligandu do IgE opisanych powyżej.

Korzystnie jest, gdy sposób według wynalazku prowadzony jest w temperaturze od 0°C do 100°C, bardziej korzystnie od 0°C do 40°C, a najkorzystniej od 20°C do 38°C.

Jeśli jako nośnik użyte są komórki biologiczne, i jeśli użyty jest system wykrywania składający się z przeciwciała wykrywającego połączonego ze związkiem znakującym, to wtedy test ten jest korzystnie przeprowadzany w stosunkowo niskiej temperaturze wynoszącej od 0°C do 10°C, a korzystniej od 0°C do 6°C, w celu uniknięcia sytuacji, w której kompleksy IgE i alergenu związane z receptorami IgE na zewnętrznej powierzchni komórki są wchłaniane do wnętrza komórki zanim dojdzie do znakowania, która to sytuacja może prowadzić do nieprawidłowych pomiarów.

W szczególności przedmiotem niniejszego wynalazku jest sposób wykrywania i określania ilościowego zawartości swoistego przeciwciała IgE w płynnej próbce, obejmujący etapy, zgodnie z którymi:

(a) doprowadza się do kontaktu (i) próbki z (ii) wolnym ligandem w postaci antygenu, przeciwciała lub haptenu dla utworzenia mieszaniny I złożonej z kompleksów zawierających IgE, w których ligand jest związany z biotyną lub jej funkcjonalną pochodną, (b) miesza się mieszaninę I z nośnikiem, z którym związany jest (iii) receptor IgE, przy czym receptor jest receptorem CD23 (FcεRII) i/lub receptorem FcεeRI, dla utworzenia mieszaniny II złożonej ze związanych z nośnikiem kompleksów zawierających IgE, (b') oddziela się związane z nośnikiem kompleksy zawierające IgE od mieszaniny II i płucze się opisane kompleksy, (b) dodaje się do wypłukanych związanych z nośnikiem kompleksów zawierających IgE roztwór (iv) związku chemiluminescencyjnego kowalentnie związanego z awidyną, streptawidyną lub ich funkcjonalną pochodną dla utworzenia mieszaniny II', (c) oddziela się związane z nośnikiem kompleksy zawierające IgE od mieszaniny II' i płucze się te kompleksy, (d) zapoczątkowuje się reakcję chemiluminescencyjną w otrzymanych kompleksach zawierających IgE i wykrywa/mierzy się otrzymaną chemiluminescencję, jeśli występuje.

Definicje

W niniejszym wynalazku wyrażenie „swoiste przeciwciało IgE oznacza każdą swoistą immunoglobulinę z izotypu IgE tak jak i każdą inną immunoglobulinę, która wykazuje powinowactwo do receptorów IgE tj. CD23 i/lub FcεRI.

Termin „płynna próbka oznacza każdy płyn biologiczny taki jak krew, osocze, surowica, mocz, ślina i każdy inny płyn, który jest wydalany, wydzielany i transportowany wewnątrz organizmu.

Wyrażenie „ligand w postaci antygenu, przeciwciała lub haptenu może odnosić się do każdej aktywnej immunologicznie substancji. „Antygenem może być alergen, na przykład, pyłki drzew, traw, chwastów itd., alergeny pleśni, alergeny roztoczy i zwierząt, takich jak kot, pies, koń, bydło i ptaki, alergeny jadów żądlących owadów i owadzie alergeny wziewne, oraz alergeny pokarmowe; „przeciwciałem może być monoklonalne lub poliklonalne przeciwciało, w tym przeciwciała rekombinowane lub fragmentowane; a „haptenem mogą być części węglowodanów lub ich fragmenty, inhibitory enzymów lub leki, na przykład penicylina, lub ich funkcjonalne pochodne.

W niniejszym wynalazku termin „receptor IgE oznacza receptor CD23 (FcεRII) i/lub FcεRI. Termin „CD23 oznacza każdą postać tego receptora i każdą jego część, wliczając w to CD23 w postaci czystej lub w mieszaninie, roztworze lub wyciągu, syntetyczny lub rekombinowany CD23, CD23 pochodzący ze źródeł naturalnych oraz CD23 w całości i jego części. Łańcuch α receptora CD23 może być użyty jako trimer, dimer lub monomer, ale tylko łańcuch α lub jego rozpuszczalna część, na przykład, część wychodząca z zewnętrznej powierzchni błony komórkowej lub fragment rozpuszczalnej części łańcucha α może być użyty jako CD23. „FcεRI oznacza każdą postać tego receptora i każdą jego część, wliczając w to FcεRI w postaci czystej lub w mieszaninie, roztworze lub wyciągu, syntetyczny lub rekombinowany FcεRI, FcεRI pochodzący ze źródeł naturalnych oraz FcεRI w całości i jego części. W szczególności, tylko łańcuch α, który jest początkowo odpowiedzialny za wiązanie IgE, lub jego rozpuszczalna część, to jest część wychodząca z zewnętrznej powierzchni błony komórkowej, lub fragment rozpuszczalnej części łańcucha α może być użyty jako FcεRI.

PL 208 129 B1

Wyrażenie „wolny rozpuszczony ligand oznacza ligand, który jest uwolniony dla niepowstrzymanego tworzenia kompleksów z IgE, przy czym wyrażenie to obejmuje ligandy w roztworze i ligandy przyłączone do substancji w roztworze.

Niniejszy wynalazek opisany jest w dalszych szczegółach w odniesieniu do rysunku, na którym fig. 1a przedstawia poziom fluorescencji mierzony w teście według wynalazku przy użyciu (i) bez dodania surowicy i bez dodania alergenu, (ii) kontrolnej surowicy i alergenu, i (iii) surowicy alergicznego pacjenta i alergenu, fig. 1b przedstawia poziom fluorescencji mierzony w teście według wynalazku przy użyciu (i) kontrolnej surowicy i alergenu, (ii) surowicy alergicznego pacjenta i alergenu, (iii) surowicy alergicznego pacjenta, przeciwciała dla CD19 i alergenu, oraz (iv) surowicy alergicznego pacjenta, przeciwciała dla CD23 i alergenu, fig. 1c przedstawia poziom fluorescencji mierzony w teście według wynalazku przy użyciu (i) bez dodania surowicy i bez dodania alergenu, (ii) surowicy alergicznego pacjenta i bez dodania alergenu, (iii) surowicy alergicznego pacjenta i alergenu, (iv) surowicy alergicznego pacjenta, alergenu i przeciwciała dla IgG, i (v) surowicy alergicznego pacjenta, alergenu i przeciwciała dla IgE, fig. 2a przedstawia poziom fluorescencji mierzony w teście według wynalazku przy użyciu (i) surowicy alergicznego pacjenta i bez dodania alergenu, (ii) surowicy alergicznego pacjenta i alergenu, (iii) surowicy alergicznego pacjenta, surowicy alergicznego pacjenta leczonego przy pomocy SAV i alergenu, i (iv) surowicy alergicznego pacjenta leczonego przy pomocy SAV i alergenu, fig. 2b przedstawia poziom IgE w sytuacjach (i)-(iv) przedstawionych w fig. 2a obliczony na podstawie pomiarów poziomu IgE w surowicy pacjenta alergicznego i w surowicy pacjenta alergicznego leczonego przy pomocy SAV w odniesieniu do testu wykrywającego całkowitą IgE, fig. 3 jest schematycznym przedstawieniem jednego korzystnego przykładu wykonania według wynalazku, fig. 4 jest schematycznym przedstawieniem drugiego korzystnego przykładu wykonania według wynalazku, fig. 5 jest schematycznym przedstawieniem trzeciego korzystnego przykładu wykonania według wynalazku, fig. 6 przedstawia poziom fluorescencji mierzony w teście według wynalazku przy użyciu (i) surowicy alergicznego pacjenta, alergenu i przeciwciała (1) skierowanego przeciwko części wiążącej IgE receptora CD23, (ii) surowicy alergicznego pacjenta, alergenu i przeciwciała (2) skierowanego przeciwko części wiążącej IgE receptora CD23, (iii) surowicy alergicznego pacjenta, alergenu i przeciwciała skierowanego przeciwko części niewiążącej IgE receptora CD23, oraz (iv) surowicy alergicznego pacjenta, alergenu i przeciwciała skierowanego przeciwko CD14, fig. 7a przedstawia poziom fluorescencji mierzony w teście według wynalazku przy użyciu surowicy alergicznego pacjenta i wzrastających dawek alergenów, fig. 7b przedstawia poziom fluorescencji mierzony w teście według wynalazku przy użyciu surowicy alergicznego pacjenta i wzrastających dawek oczyszczonego, otrzymanego w wyniku rekombinacji głównego alergenu brzozy, fig. 8a przedstawia poziom fluorescencji mierzony w teście według wynalazku przy użyciu wzrastających dawek alergenów brzozy i (i) surowicy pacjenta uczulonego na brzozę i kontrolnej surowicy pacjenta nie alergicznego, (ii) surowicy alergicznego pacjenta i surowicy pochodzącej od alergicznego pacjenta uczulonego na brzozę leczonego przy pomocy SAV (A), (iii) surowicy alergicznego pacjenta uczulonego na brzozę i surowicy pochodzącej od alergicznego pacjenta uczulonego na brzozę leczonego przy pomocy SAV (B), i (iv) surowicy alergicznego pacjenta uczulonego na brzozę i surowicy pochodzącej od alergicznego pacjenta uczulonego na trawy leczonego przy pomocy SAV, a fig. 8b przedstawia poziom fluorescencji mierzony w teście według wynalazku przy użyciu wzrastających dawek oczyszczonego, otrzymanego w wyniku rekombinacji głównego alergenu brzozy, i (i) surowicy pacjenta uczulonego na brzozę i kontrolnej surowicy pacjenta nie alergicznego, (ii) surowicy alergicznego pacjenta i surowicy pochodzącej od alergicznego pacjenta uczulonego na brzozę leczonego przy pomocy SAV (A), (iii) surowicy alergicznego pacjenta uczulonego na brzozę i surowicy pochodzącej od alergicznego pacjenta uczulonego na brzozę leczonego przy pomocy SAV (B), i (iv) surowicy alergicznego pacjenta uczulonego na brzozę i surowicy pochodzącej od alergicznego pacjenta uczulonego na trawy leczonego przy pomocy SAV.

Fig. 3 przedstawia etapy korzystnego przykładu wykonania testu według wynalazku w szczegółach. W pierwszym etapie biotynylowany alergen i próbka zawierająca IgE swoistą dla alergenu (oznaczona na rysunku jako „IgE) są mieszane i inkubowane dla utworzenia mieszaniny I zawierającej kompleksy zawierające pewną liczbę cząsteczek IgE i pewną liczbę cząsteczek alergenu, mieszanina I zawiera również nadmiar IgE i alergenu. W drugim etapie dodawany jest stały nośnik cząstek stałych, z którym związane są pewne ilości cząsteczek receptora CD23 (i/lub receptora FcεRI), i opisane kompleksy są związane z nośnikiem poprzez CD23 dla utworzenia mieszaniny II. Możliwe jest, że niewielka ilość IgE może wiązać się z CD23 w postaci monomerycznej. W trzecim etapie, związane z nośnikiem kompleksy są oddzielane od mieszaniny II i płukane jeden lub więcej razy dla

PL 208 129 B1 usunięcia nie związanych reagentów. Płukanie usuwa również wszelkie nie związane kompleksy, które mogą być obecne w mieszaninie, ponieważ jak podano wcześniej możliwe są ich zakłócające reakcję interferencje zachodzące w niniejszym teście, które spowodują zahamowanie wiązania się kompleksów z receptorem IgE. Oddzielanie kompleksów od mieszaniny II może być przeprowadzane, na przykład, przez oddzielanie magnetyczne, jeśli jako nośnik użyte są cząstki paramagnetyczne. Znacznik chemiluminescencyjny, korzystnie reagent estru streptawidynowo-akrydynowego, inkubowany jest ze związanymi z nośnikiem kompleksami dla związania znacznika ze związaną z kompleksem biotyną. Po inkubacji związane z nośnikiem znakowane kompleksy są oddzielane i płukane dla usunięcia cząstek znakujących, które nie weszły w reakcję, i zapoczątkowywana jest reakcja chemiluminescencyjną przez użycie odpowiedniego odczynnika, na przykład, wodorotlenku sodu, po czym mierzona jest chemiluminescencja związanych z nośnikiem znakowanych kompleksów.

Fig. 4 przedstawia etapy korzystnego przykładu wykonania testu według wynalazku w szczegółach. W pierwszym etapie biotynylowany alergen, próbka zawierająca IgE swoistą dla alergenu (oznaczona na rysunku jako „IgE) i nośnik cząstek stałych, z którym związana jest pewna ilość cząsteczki receptora CD23 (i/lub receptora FcεRI) są mieszane i inkubowane dla utworzenia mieszaniny II zawierającej związane z nośnikiem kompleksy zawierające pewną liczbę cząsteczek IgE i pewną liczbę cząsteczek alergenu, mieszanina II zawiera również nadmiar IgE i alergenu jak również nie związanych kompleksów. Wtedy związane z nośnikiem kompleksy są oddzielane od mieszaniny II i płukane jeden lub kilka razy.

Następnie znacznik chemiluminescencyjny, korzystnie reagent estru streptawidynowo-akrydynowego, inkubowany jest ze związanymi z nośnikiem kompleksami dla związania znacznika ze związaną z kompleksem biotyną. Po inkubacji związane z nośnikiem znakowane kompleksy są oddzielane i płukane dla usunięcia cząstek znakujących, które nie weszły w reakcję, i zapoczątkowywana jest reakcja chemiluminescencyjna przez użycie odpowiedniego odczynnika, na przykład, wodorotlenku sodu, po czym mierzona jest chemiluminescencja związanych z nośnikiem znakowanych kompleksów.

Fig. 5 przedstawia etapy innego korzystnego przykładu wykonania według wynalazku. W pierwszym etapie inkubacyjnym alergen i próbka zawierająca IgE swoistą dla alergenu (oznaczona na rysunku jako „IgE) są mieszane i inkubowane dla utworzenia mieszaniny A zawierającej kompleksy zawierające pewną liczbę cząsteczek IgE i pewną liczbę cząsteczek alergenu, mieszanina A zawiera również nadmiar IgE i alergenu. W drugim etapie inkubacyjnym dodawany jest nośnik cząstek stałych, z którym związana jest pewna ilość cząsteczek receptora CD23 (i/lub receptora FcεRI), i opisane kompleksy są związane z nośnikiem poprzez CD23 dla utworzenia mieszaniny B. Możliwe jest, że niewielka ilość IgE może wiązać się z CD23 w postaci monomerycznej. Później związane z nośnikiem kompleksy oddzielane są od mieszaniny B i płukane jeden lub kilka razy dla usunięcia nie związanych reagentów. Płukanie usuwa również wszelkie nie związane kompleksy, które mogą być obecne w mieszaninie, ponieważ jak opisano wcześniej możliwe są ich zakłócające reakcję interferencje zachodzące w niniejszym teście, które powodują zahamowanie wiązania się kompleksów z receptorem IgE. Oddzielanie kompleksów od mieszaniny B może być przeprowadzane, na przykład, przez oddzielanie magnetyczne, jeśli jako nośnik użyte są cząstki paramagnetyczne. W trzecim etapie inkubacyjnym dodawane jest biotynylowane przeciwciało skierowane przeciwko IgE (przeciwciało wykrywające) dla utworzenia mieszaniny C. Przeciwciało wykrywające jest przeciwciałem poliklonalnym i wiąże się ze wszystkimi immunoglobulinami E niezależnie od swoistości IgE. Otrzymane związane z nośnikiem kompleksy oddzielane są od mieszaniny C, po czym kompleksy te są płukane. W czwartym etapie inkubacyjnym znacznik chemiluminescencyjny, korzystnie reagent estru streptawidynowo-akrydynowego, jest inkubowany ze związanymi z nośnikiem kompleksami dla związania znacznika ze związaną z kompleksem biotyną. Po inkubacji związane z nośnikiem znakowane kompleksy są oddzielane i płukane dla usunięcia cząstek znakujących, które nie weszły w reakcję, i zapoczątkowywana jest reakcja chemiluminescencyjna przez użycie odpowiedniego odczynnika, na przykład, wodorotlenku sodu, po czym mierzona jest chemiluminescencja związanych z nośnikiem znakowanych kompleksów.

Poniżej wynalazek opisany jest w dalszych szczegółach w odniesieniu do przykładów.

P r z y k ł a d y

W przykładach zostały użyte następujące skróty:

FITC: izotiocjanian fluoresceiny

EBV: wirus Epstein'a - Barr'a

SU: jednostki znormalizowane

SAV: swoiste szczepienie przeciw alergii.

PL 208 129 B1

P r z y k ł a d 1

Wykrywanie swoistej dla alergenu brzozy IgE związanej z receptorem CD23 ulegającego ekspresji w transformowanych wirusem EBV komórkach B przez analizę w cytometrze przepływowym.

Znakowany FITC wyciąg Betula verrucosa (Bet v) (1 μg/ml) był inkubowany z kontrolną surowicą 734 (niewykrywalna IgE w teście odniesienia mierzącym całkowitą zawartość IgE (MagicLite®, ALK-ABELLÓ, Hoersholm, Dania)), lub z surowicą pacjenta uczulonego na brzozę 1464 (>800 SU/ml swoistej dla brzozy IgE w teście MagicLite®) do końcowego stężenia surowicy wynoszącego 60%. Transformowane EBV komórki B pochodzące od alergicznego pacjenta były dodawane do roztworu hodowlanego w końcowym stężeniu komórek wynoszącym 4x10⁶/ml i były inkubowane przez 1 godzinę w 37°C, a następnie przez dwukrotne płukanie usuwano nadmiar alergenu. Po płukaniu wiązanie znakowanego FITC alergenu Bet v (Bet v*) było analizowane przez pomiar fluorescencji przy użyciu cytometru przepływowego FASCalibur.

Wyniki przedstawiono na fig. 1a, na której jest wykazane średnie natężenie fluorescencji (MFI) dla próbek: (i) bez surowicy i bez Bet v (tło) oznaczonej „Tylko medium, (ii) s734 i Bet v, oraz (iii) s1464 i Bet v. Wyniki wskazują, że wiązanie ekstraktu znakowanego FITC alergenu brzozy z limfocytami B, które produkują receptor CD23 może być wykazane bezpośrednio.

W doświadczeniach blokujących z użyciem przeciwciała skierowanego przeciwko CD23 i, dla porównania, przeciwciała skierowanego przeciwko CD19, EBV komórki B były inkubowane przez 1 godzinę w 4°C z tymi przeciwciałami przed dodaniem tych komórek do mieszanin zawierających Bet v i surowicę. Fig. 1b przedstawia średnie natężenie fluorescencji (MFI) dla próbek: (i) surowicy s734, (ii) s1464, (iii) s1464 i przeciwciała skierowanego przeciw CD19, oraz (iv) s1464 i przeciwciała skierowanego przeciw CD23. Jak wynika z fig. 1b preinkubacja komórek B z przeciwciałem skierowanym przeciw CD23 hamuje wiązanie znakowanego FITC wyciągu brzozy do komórek B, podczas gdy preinkubacja z przeciwciałem skierowanym przeciwko nie mającemu znaczenia dla badanego zagadnienia antygenowi CD19 na powierzchni komórek B, nie hamuje tego wiązania. Wskazuje to, że znakowany FITC wyciągu brzozy wiąże się do CD23, receptora IgE o niskim powinowactwie.

Przeprowadzano również inne eksperymenty, w których przeciwciała poliklonalne anty-IgG lub anty-IgE były preinkubowane z surowicą alergicznego pacjenta (s1464) przez 1 godzinę w 37°C przed dodaniem Bet v. Fig. 1c przedstawia średnie natężenie fluorescencji (MFI) dla (i) tła, oraz próbek: (ii) s1464 i bez Bet v, (iii) s1464 i Bet v, (iv) s1464 i przeciwciała skierowanego przeciwko IgG i Bet v, (v) s1464, przeciwciała skierowanego przeciwko IgE i Bet v. Jak wynika z flg. 1c IgE, ale nie IgG, jest odpowiedzialna za wiązanie znakowanego FITC wyciągu brzozy z limfocytami B.

Stąd, eksperymenty przedstawione na flg. 1a-c wykazują, że wiązanie znakowanego alergenu z receptorem CD23 znajdującym się na stałym nośniku odbywa się za pośrednictwem IgE, i może być łatwo wykrywane.

P r z y k ł a d 2

Wiązanie IgE swoistej dla alergenu brzozy do receptora CD23 jest hamowane przez immunoterapeutyczne surowice nawet przy skumulowanych poziomach IgE swoistej dla alergenu, które wzrastają jak wykazują pomiary za pomocą testu MagicLite®,.

Znakowany FITC wyciąg Betula verrucosa (Bet v) (1 μg/ml) był inkubowany z surowicą pacjenta uczulonego na brzozę 894 (>800 SU/ml swoistej dla brzozy IgE w teście MagicLite®) w końcowym stężeniu surowicy wynoszącym 40% przy nieobecności lub obecności surowicy (końcowe stężenie również 40%) pacjenta otrzymującego SAV na brzozę przez więcej niż 4 lata (surowica 1490, 88 SU/ml swoistej dla brzozy IgE w teście MagicLite®). Transformowane EBV komórki B pochodzące od alergicznego pacjenta były dodawane do roztworu hodowlanego w końcowym stężeniu komórek wynoszącym 4x10⁶/ml i były inkubowane przez 1 godzinę w 37°C, a następnie przez dwukrotne płukanie usuwano nadmiar alergenu. Po płukaniu komórek, wiązanie znakowanego FITC alergenu Bet v (Bet v*) z komórkami B było analizowane przez pomiar fluorescencji przy użyciu cytometru przepływowego FASCalibur.

Fig. 2a przedstawia średnie natężenie fluorescencji (MFI) dla próbek: (i) surowicy s894 i bez Bet v, (ii) surowicy s894 i Bet v, (iii) obu surowic s894 i s1490 i Bet v, oraz (iv) s1490 i Bet v. Jak wynika z fig. 2a dodanie s1490 redukuje do poziomu tła wiązanie IgE i znakowanego FITC alergenu brzozy z receptorem CD23. Wskazuje to na obecność w próbce czynnika, który zakłóca wiązanie, za pośrednictwem IgE, znakowanego FITC alergenu brzozy z receptorem CD23.

Dla porównania, fig. 2b pokazuje skalkulowany poziom całkowitej IgE swoistej dla alergenu brzozy dla tych samych substratów reakcji, jak w sytuacjach (i)-(iv) jak na fig. 2a, poziomy te zostały

PL 208 129 B1 skalkulowane na podstawie oddzielnych pomiarów poziomu całkowitej IgE w surowicy s894 i s1490 mierzonych przy pomocy testu MagicLite®.

Z fig. 2a-b można wywnioskować, że test według wynalazku wykorzystujący receptor CD23 jako czynnik wychwytujący wytwarza nieznacznie różne wyniki niż znany ze stanu techniki test MagicLite® dla całkowitej IgE, wykorzystujący jako czynnik wychwytujący IgE przeciwciało skierowane przeciwko IgE. Jednakże, musi zostać przyjęte, że wyniki otrzymane w teście według wynalazku lepiej wyrażają stan badanego pacjenta, ponieważ prezentacja antygenu in vivo jest ułatwiana przez CD23.

P r z y k ł a d 3

Kompleksy utworzone pomiędzy alergenem i swoistą IgE wiążą się z receptorem CD23 w wyniku oddziaływania z częścią wiążącą IgE tego receptora i mogą być wykrywane przez przeciwciało skierowane przeciwko IgE.

Eksperymenty blokujące przeprowadzano z trzema różnymi monoklonalnymi przeciwciałami skierowanymi przeciwko CD23, w tym dwoma przeciwciałami dla CD23, które wiążą się specyficznie z częściami receptora CD23 wiążącymi IgE (ML 233 firmy Pharmingen, sprzedawanego przez Becton-Dickinson, Dania, oraz MHM6 z firmy DAKO A/S, Dania), i jednym przeciwciałem, które swoiście wiąże się z regionem CD23 nie biorącym udziału w wiązaniu IgE (EBV CS5 z firmy Becton-Dickinson, Dania). A w końcu w teście jako odniesienie wykorzystywano również przeciwciało przeciwko nieistotnej dla badanej reakcji cząsteczce powierzchniowej (CD14) (z firmy DAKO A/S, Dania). Transformowane EBV komórki B były preinkubowane z 10 μg/ml każdego z wymienionych przeciwciał, przez 1 godzinę w 4°C, płukane dla usunięcia niezwiązanego przeciwciała, co poprzedzało inkubację z kompleksami. Kompleksy były generowane przez łączenie surowicy s1464, od dawcy z alergią na pyłki brzozy (>800 SU/ml swoistej dla brzozy IgE w teście MagicLite®) przy końcowym stężeniu surowicy wynoszącym 80%, z 1 μg/ml Bet v, przez 1 godzinę w 37°C. Kompleksy następnie łączono z traktowanymi przeciwciałami komórkami EBV, przez 1 godzinę w 4°C. Później komórki były płukane, i związane kompleksy były znakowane przez inkubację z biotynylowanym przeciwciałem rozpoznającym ludzką IgE (PU PED0048 z ALK-Abello), a następnie płukane i inkubowane z koniugatem streptawidynowofikoreytrynowym (Southern Biotechnology Associates, sprzedawanym przez KEBO, Dania). Po końcowym płukaniu, wiązanie kompleksów IgE-alergen z komórkami EBV było analizowane przez pomiar fluorescencji przy użyciu cytometru przepływowego FACSCalibur.

Z fig. 6 można wywnioskować, że wiązanie alergenu z receptorem CD23 odbywa się przez oddziaływania z cząstką receptora CD23 wiążącą IgE, a nie przez inne niespecyficzne oddziaływania. W dodatku, wiązanie nie znakowanego kompleksu może być łatwo wykrywane przez przeciwciało dla IgE.

P r z y k ł a d 4

Wynalazek umożliwia wykrywanie swoistej IgE w surowicach pozyskanych od pacjentów z alergią, niezależnie od rozpoznawanego alergenu.

Kompleksy były generowane przez łączenie surowic od dwóch konkretnych dawców mających alergię na alergeny pyłków traw (Phleum p), (s1043: 582 SU/ml, i s1524: 658 SU/ml swoistej Phleum p IgE mierzonej w teście MagicLite®), ze wzrastającymi dawkami wyciągu alergenów traw. Reakcja była przeprowadzana przez 1 godzinę w 37°C. Później transformowane EBV komórki B były dodawane do reakcji, na 1 godzinę w 4°C. Komórki były płukane, a związane kompleksy były uwidaczniane i analizowane jak opisano w przykładzie 3.

Fig. 7a przedstawia średnią geometryczną natężenia fluorescencji dla: (i) s1043 i (ii) s1524. Każda próbka była przeprowadzana dwukrotnie i była obliczana średnia z wyników.

Fig. 7b przedstawia s1464 (opisaną w przykładzie 3), która była łączona ze wzrastającymi dawkami oczyszczonego, rekombinowanego Bet v, jednego z głównych alergenów pyłku brzozy. Doświadczenie było przeprowadzane jak opisano w Fig. 7a.

Fig. 7a i b wykazują, że w jednym przykładzie wykonania według wynalazku, przy użyciu tego samego przeciwciała dla wykrywania IgE, możliwe jest mierzenie poziomu różnych immunoglobulin E swoistych dla różnych alergenów. Test ten może być użyty do mierzenia poziomu IgE swoistej dla całego wyciągu alergenu, tak jak i dla pojedynczych, oczyszczonych alergenów. Fig. 7a i b przedstawiają również, że dla osiągnięcia optymalnego sygnału wymagana jest obecność poszczególnych alergenów w różnych dawkach.

P r z y k ł a d 5

Wiązanie swoistej dla alergenu brzozy IgE z receptorem CD23 jest hamowane przez surowice pochodzące od pacjentów, których poddano leczeniu przy pomocy swoistych szczepień przeciwaler12

PL 208 129 B1 gicznych skierowanych przeciw alergii na pyłek brzozy, podczas gdy wiązanie to nie jest zahamowane przez surowice otrzymane od niealergicznego dawcy, lub pacjenta, który był leczony przy pomocy SAV dla nieodpowiedniej alergii.

Surowica pozyskana od dawcy uczulonego na pyłek brzozy, s1464, była mieszana (w stosunku 1:1) z następującymi surowicami: (i) surowicą od niealergicznego dawcy s745 (0 SU/ml), (ii), (iii) dawców, którzy otrzymali SAV dla pyłku brzozy (s1490 i s1598; odpowiednio 88 i 57 SU/ml swoistej dla brzozy IgE w teście MagicLite®), i (iv) dawców z alergią na pyłki traw (s808954; 137 SU/ml swoistej dla traw IgE, i 4 SU/ml swoistej dla brzozy IgE w teście MagicLite®). Po inkubacji: albo z wyciągiem alergenów pyłku brzozy (Bet v, fig. 8a), albo z oczyszczonym rekombinowanym alergenem z pyłku brzozy (Bet v 1, fig. 8b), w końcowym stężeniu wynoszącym 40% dla każdej surowicy, dodawane były transformowane EBV komórki B na 1 godzinę w 4°C, później komórki były płukane, a związane kompleksy były wykrywane jak to opisano powyżej.

Fig. 8a i b przedstawia wyniki jako geometryczną średnią natężenia fluorescencji. Przez porównanie całkowitego poziomu IgE mierzonego w teście MagicLite®) w każdej próbce (i-iv), do sygnału otrzymanego przy wykorzystaniu receptora CD23 jako czynnika wychwytującego, można wywnioskować, że test według wynalazku mierzy różne „typy IgE tworzące kompleks związane z receptorem CD23. Jak wyjaśniono powyżej, to właśnie poziomy tych poszczególnych „typów IgE, uważa się za informacje lepiej odzwierciedlające stan badanego pacjenta, niż poziomy IgE mierzone w sposób konwencjonalny.

Wykaz literatury (1) „Serum-IgE-Facilitated Allergen Presentation in Atopic Disease, van der Heijden et al., The Journal of Immunology, Vol. 150, 3643-3650, 1993.

(2) „IgE-antigen complexes enhance FcεR and la expression by murine B lymphocytes, Richards et al., J. Exp. Med., Vol. 168, 571, 1998.

(3) Santamaria et al., Hum. Immunol., Vol. 37, 23-30, 1993.

(4) „The High Affinity IgE Receptor (FcεRI) Mediates IgE-Dependent Allergen Presentation, Mauer et al., The Journal of Immunology, Vol. 154, 6285-6290, 1995.

Claims

1. Sposób wykrywania i określania ilościowego zawartości przeciwciała IgE swoistego w stosunku do ligandu w postaci alergenu w próbce płynu biologicznego, znamienny tym, że obejmuje etapy, zgodnie z którymi:

(a) doprowadza się do kontaktu (i) próbki płynu biologicznego z (ii) wolnym rozpuszczonym ligandem w postaci alergenu dla utworzenia mieszaniny I zawierającej kompleksy IgE-ligand, (b) miesza się mieszaninę I z nośnikiem, z którym związany jest (iii) receptor IgE, który to receptor IgE jest receptorem CD23 (FcεRII) i/lub receptorem FcεRI, dla utworzenia mieszaniny II zawierającej związane z nośnikiem kompleksy IgE-ligand, (c) oddziela się związane z nośnikiem kompleksy IgE-ligand od mieszaniny II, oraz (d) określa się ilość utworzonych kompleksów IgE-ligand związanych z nośnikiem.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że ligand jest znakowany.

3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że ligand zastosowany w etapie a) jest związany ze (iv) związkiem znakującym.

4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że (iv) związek znakujący dodaje się w etapie (a) w dodatku do (i) próbki i (ii) ligandu.

5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że związek znakujący dodaje się do związanych z nośnikiem kompleksów IgE-ligand otrzymanych w etapie (b).

6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że (iv) związek znakujący dodaje się do związanych z nośnikiem kompleksów IgE-ligand otrzymanych w wyniku etapu rozdziału (c) dla utworzenia mieszaniny II'.

7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że znakowane i związane z nośnikiem kompleksy IgE-ligand oddziela się od mieszaniny II' i płucze się je przed etapem (d).

8. Sposób według zastrz. 3 albo 4, albo 5, albo 6, albo 7, znamienny tym, że (iv) związek znakujący jest związkiem chemiluminescencyjnym kowalentnie związanym z awidyną, streptawidyną lub ich funkcjonalną pochodną.

PL 208 129 B1

9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że związek chemiluminescencyjny jest związkiem akrydynowym.

10. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, znamienny tym, że ligand jest związany z biotyną lub jej funkcjonalną pochodną.

11. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że próbkę zawierającą IgE doprowadza się do kontaktu z ligandem w postaci alergenu i pozostawia się do inkubacji dla utworzenia mieszaniny I (etap (a)) przed doprowadzeniem do połączenia się mieszaniny I z receptorem IgE związanym z nośnikiem (etap (b)).

12. Sposób według zastrz. 1 albo 4, albo 5, albo 9, znamienny tym, że etapy (a) i (b) przeprowadza się jednocześnie w jednej operacji.

13. Sposób według zastrz. 1 albo 5, albo 6, albo 7, albo 11, znamienny tym, że nośnikiem są cząstki stałe.

14. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że nośnikiem są cząsteczki paramagnetyczne.

15. Sposób według zastrz. 1 albo 5, albo 6, albo 7, albo 11, znamienny tym, że IgE, która ma być wykrywana, analizuje się ilościowo przy użyciu zarówno samego receptora CD23 dla uzyskania pierwszego pomiaru jak i przy użyciu samego receptora FcεRI dla uzyskania drugiego pomiaru.

16. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że ilość cząsteczek ligandu wynosi od 100% do 200% ilości cząsteczek IgE, która ma być wykrywana.

17. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się system wykrywający w postaci związku znakującego sprzężonego z przeciwciałem dla IgE, która ma być wykrywana.

18. Sposób według zastrz. 17, znamienny tym, że związek znakujący łączy się z przeciwciałem poprzez biotynę.

19. Sposób według zastrz. 17 albo 18, znamienny tym, że system wykrywający dodaje się do związanych z nośnikiem kompleksów utworzonych w etapie (c).

20. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że obejmuje etapy, zgodnie z którymi:

(a) doprowadza się do kontaktu (i) próbki płynu biologicznego z (ii) wolnym rozpuszczonym ligandem w postaci alergenu dla utworzenia mieszaniny I zawierającej kompleksy IgE-ligand, w których ligand jest związany z biotyną lub jej funkcjonalną pochodną, (b) miesza się mieszaninę I z nośnikiem, z którym związany jest (iii) receptor IgE, który to receptor IgE jest receptorem CD23 (FcεRII) i/lub receptorem FcεRI, dla utworzenia mieszaniny II zawierającej związane z nośnikiem kompleksy IgE-ligand, (b') oddziela się związane z nośnikiem kompleksy IgE-ligand od mieszaniny II i płucze się te kompleksy, (b) dodaje się do wypłukanych związanych z nośnikiem kompleksów IgE-ligand roztwór (iv) związku chemiluminescencyjnego kowalentnie związanego z awidyną, streptawidyną lub ich funkcjonalną pochodną dla utworzenia mieszaniny II', (c) oddziela się związane z nośnikiem kompleksy IgE-ligand od mieszaniny II' i płucze się te kompleksy, (d) zapoczątkowuje się reakcję chemiluminescencyjną w otrzymanych kompleksach IgE-ligand i wykrywa/mierzy się otrzymaną chemiluminescencję, jeśli występuje.

21. Zastosowanie sposobu określonego w zastrz. 1-20, do monitorowania stanu immunologicznego osobnika, pod względem ilości przeciwciała IgE swoistego w stosunku do ligandu.

22. Zastosowanie sposobu określonego w zastrz. 1-20, do monitorowania stanu immunologicznego osobnika otrzymującego swoiste szczepienie przeciw alergii (SAV), pod względem ilości przeciwciała IgE swoistego w stosunku do ligandu.