JP4472877B2 - 液体サンプル中の特異的ＩｇＥ抗体の検出および／または定量方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
本発明は液体サンプル中の抗原、抗体またはハプテンの形態のリガンドに特異的なＩｇＥ抗体の検出および／または定量方法に関する。
【０００２】
ＷＯ９４／１１７３４は化学ルミネセンス標識およびビオチン結合リガンドを用いる抗体の２部位イムノアッセイに関して記載し、該方法は（ａ）液体サンプルをビオチンまたはその機能的な誘導体に結合したリガンド抗原、抗体またはハプテン、常磁性粒子に結合した検出される抗体に対する抗体およびアビジン、ストレプトアビジンまたはその機能的誘導体に結合した化学ルミネセンスアクリジニウム化合物を混合し、固相混合物を形成する工程；（ｂ）液体相から固相を磁性的に分離する工程；（ｃ）あるとすれば、分離された固相中の化学ルミネセンス反応を開始する工程；並びに（ｄ）サンプル中の該抗体の存在を示す化学ルミネセンス相の存在に関して分離された固相を分析する工程からなる。
【０００３】
先行技術は体液中の特定免疫グロブリン、例えばＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭおよびそのサブクラスからなる群から選択する特定免疫グロブリンの濃度測定にとりわけ適している。
【０００４】
また先行技術はＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭおよびそのサブクラスのごときクラスまたはサブクラスの免疫グロブリンの検出および全含量の定量に適している。
【０００５】
ＷＯ９８／２３９６４ではイヌ、ネコおよびウマＩｇＥの検出法について開示している。方法の一つの実施形態は、ａ）ヒトＦｃεレセプター（ＦｃεＲＩ）を基質に結合させる工程、ｂ）この基質−ＦｃεＲＩとＩｇＥ含有組成物とを接触させて、基質−ＦｃεＲＩ−ＩｇＥの複合体を形成する工程、ｃ）過剰の非結合物質を除去する工程、ｄ）この複合体のＩｇＥに選択的に結合できる例えば抗原の形態のインジケーター分子を加える工程、該インジケーター分子は検出可能なマーカー、例えば蛍光標識またはリガンド例えばビオチンと結合できるものである、ｅ）過剰のインジケーター分子を除去する工程、およびｆ）形成した標識複合体を測定する工程からなる。
【０００６】
この文書はほかに、基質が磁性粒子またはＦｃεＲＩを発現する組換え細胞などの粒子状物質でよいことを一般的に記載している。また検出可能なマーカーは化学ルミネセンス標識であることが一般的に述べられている。
【０００７】
ＷＯ９８／２３９６４中開示された先行技術アッセイでは、過剰の基質−ＦｃεＲＩを用い、従って、使用したＦｃεＲＩに結合できる、検出される特定ＩｇＥおよびその他の免疫グロブリン例えばＩｇＧの全含量を測定する。このアッセイは、血清を基質−ＦｃεＲＩに添加した後および抗原を添加した後の洗浄工程などの厳密にインビトロ条件下で実施される。
【０００８】
「ＩｇＥおよびＩｇＧ抗体によるＴセル免疫応答の制御および標的化」、Ｂｈｅｅｋｈａ Ｅｓｃｕｒａら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８６：３３４−３５０（１９９５）ではａ）ＮＩＰ（５−ヨード−４−ヒドロキシル−３−ニトロフェンアセチル）に特異的なマウス／ヒトキメラモノクローナルＩｇＥをアレルゲン−ＮＩＰと共にインキュベートして複合体を形成する工程、ｂ）この複合体をＢセルとインキュベートする工程、ｃ）洗浄により過剰の複合体を除去する工程、およびｄ）得られた細胞を蛍光標識した、ＮＩＰ特異的抗体に対する抗体と共にインキュベートする工程、およびｅ）蛍光を検出する工程からなる方法について開示している。
【０００９】
本出願の優先期間の後に公開されたＷＯ９９／５１９８８は、ＦｃεＲＩ−免疫グロブリン−アレルゲンの複合体を形成し、形成した複合体を検出することからなる、ＦｃエプシロンレセプターＩ分子を用いる生物学的に活性なアレルゲン特異的免疫グロブリンの検出法について開示している。開示された好ましい実施形態では、プラスチックビーズ粒子に結合したアレルゲンと免疫グロブリン含有サンプルを接触させて基質結合免疫グロブリンアレルゲン複合体を形成させ、該複合体をＦｃεＲＩと接触させる。
【００１０】
発明の要旨
本発明で取扱う技術的問題は、ただサンプル中のＩｇＥの存在を測定するというよりむしろ、ＩｇＥがそのレセプターに結合することによりそのエフェクター機能を呈する能力を反映するＩｇＥ測定を提供できる、よりインビボに近い条件下で実施できる、種々反応物質間での結合反応が可能になるところの、液体サンプル中の特異的ＩｇＥ抗体を検出および／または定量する方法を提供することである。
【００１１】
本発明の方法は；
（ａ）（ｉ）サンプルを（ｉｉ）抗原、抗体またはハプテンの形態の遊離リガンドと接触させ、ＩｇＥ−含有複合体を含んでなる混合物Ｉを形成する工程；
（ｂ）混合物Ｉを（ｉｉｉ）ＩｇＥレセプターに結合するキャリヤと混合してキャリヤ結合ＩｇＥ含有複合体を含んでなる混合物ＩＩを形成する工程、該ＩｇＥレセプターはＣＤ２３（ＦｃεＲＩＩ）および／またはＦｃεＲＩである；
（ｃ）混合物ＩＩからキャリヤ結合ＩｇＥ含有複合体を分離する工程；並びに
（ｄ）形成したキャリヤ結合ＩｇＥ含有複合体の量を測定する工程；
からなることを特徴とする。
【００１２】
低親和性ＩｇＥレセプターＣＤ２３（ＦｃεＲＩＩ）は好酸球、活性化ＢおよびＴセル並びに樹状細胞の表面に見出される。ＣＤ２３は多機能レセプターであり、ＩｇＥ媒介抗原提示において重要な役割を果たすことが示されている。ＣＤ２３は、最初、ＩｇＥおよび抗原／アレルゲンの両方を含有する多成分複合体の形態で存在するＩｇＥに結合すると考えられている（１、２）。しかしながら、単量体の形態のＮＩＰ特異的モノクローナルＩｇＥがＣＤ２３に結合できるということが報告されている（３）。しかしながら、精製されたモノクローナルＩｇＥ抗体の凝集が生じることは無視できない。ＣＤ２３はα鎖からなり、単量体、二量体または三量体として存在できる。
【００１３】
高親和性ＩｇＥレセプターＦｃεＲＩは、肥満細胞および好塩基球の表面に、並びにランゲルハンス細胞、単球および樹状細胞にも、見出される。ＦｃεＲＩもまたＩｇＥ媒介抗原／アレルゲン提示において重要な役割を果たすことが示されている（４）。ＩｇＥは、単量体ＩｇＥの形態でＦｃεＲＩに、ＩｇＥ−抗原／アレルゲンに、並びにＩｇＥおよび抗原／アレルゲンの両方を含有する多成分複合体に結合できる。肥満細胞および好塩基球のＦｃεＲＩはα鎖、β鎖およびγ鎖からなり、ランゲルハンス細胞、単球および樹状細胞のＦｃεＲＩはα鎖およびγ鎖からなる。
【００１４】
本発明は、ＣＤ２３への結合の前または少なくとも同時にＩｇＥ含有サンプルを抗原／アレルゲンと反応させるならば、抗体検出アッセイにおいてＣＤ２３を使用できるという認識に基づいている。
【００１５】
本発明はさらに、一般に第１工程でＩｇＥ含有液体サンプルを溶解した状態の抗原／アレルゲンと反応させ、反応を完了して得られた混合物をキャリヤ−ＩｇＥレセプターと接触させるアッセイ過程は、インビボで同一の反応が生じる条件によく似ているという認識に基づいている。
【００１６】
とりわけ本発明のアッセイは、ＩｇＥおよび抗原／アレルゲン含有多成分複合体の形成中に、並びにＩｇＥ−抗原／アレルゲンの形成中に生じるかもしれない、サンプル中に存在するその他の免疫グロブリンおよびいずれかのその他の干渉する可能性を有する成分からの干渉をまねしている。また、一方はキャリヤ−ＩｇＥレセプターと、および単量体ＩｇＥ、ＩｇＥ−抗原／アレルゲン、およびＩｇＥおよび抗原／アレルゲンを含有する多成分複合体との間の結合において、得られた混合物のその他の成分からの干渉もまた生じる可能性がある。
【００１７】
このように、本発明のアッセイによりインビボ条件下でＣＤ２３および／またはＦｃεＲＩレセプターに結合でき、それによりその生物学的機能を呈する特定ＩｇＥのレベル、以下ではＩｇＥの適切インビボレベルという、を測定することが可能になる。本発明は、サンプルを採取した対象の免疫学的状態を決定するのは、ＩｇＥの全レベルよりむしろ存在するＩｇＥのＩｇＥレセプターへの結合能力であるので、ＩｇＥの適切インビボレベルのかかる測定は該対象についての貴重な情報を有しているという認識により達成されている。このように本発明のアッセイは先行技術のアッセイよりもより正確に対象の免疫学的状態を決定できる可能性を提供している。
【００１８】
とりわけ、本発明のアッセイは特異的アレルギーワクチン接種（ＳＡＶ）処置を受けている対象の免疫学的状態のモニター観察および評価に関して価値がある。このように、ＳＡＶ処置は、ＩｇＥのＩｇＥレセプターに対する結合を阻害するかまたは低減させ、従って、ＩｇＥの適切インビボレベルおよび全ＩｇＥレベルが有意に異なるかぎりにおいて、ＩｇＥの適切インビボレベルは全ＩｇＥレベルよりもアレルギー性疾患の重篤度のより正確な判断基準を与えることが示された。例えば、本発明の方法によりＳＡＶ処置前および後に決定されるインビボＩｇＥレベルは第４因子により異なるが、それに比較して慣用的なＩｇＥアッセイにより測定されるＩｇＥレベルはＳＡＶ処置前および後で変化しない。
【００１９】
本発明はさらに、アレルギー性および非アレルギー性の両方の対象を含む対象、とりわけヒト、の免疫学的状態をモニター観察および評価するための請求項１ないし１３のいずれかの方法の使用に関する。
【００２０】
とりわけ本発明は特異的アレルギーワクチン接種（ＳＡＶ）処置を受けている対象とりわけヒトの免疫学的状態をモニター観察および評価するための請求項１ないし１３のいずれかの方法の使用に関する。
【００２１】
発明の詳細な説明
本発明の実施形態ではリガンドは標識されている。
【００２２】
「標識されたリガンド」なる表現は標識された原子または部分例えば放射性原子標識を含んでなるいずれものリガンドを意味する。
【００２３】
本発明の別の実施形態では、工程ａ）で用いるリガンドは（ｉｖ）標識化合物に結合している。本発明の別の実施形態では、工程ａ）において（ｉ）サンプルおよび（ｉｉ）リガンドに加えて（ｉｖ）標識化合物を加える。また、（ｉｖ）標識化合物を工程ａ）で形成したＩｇＥ含有複合体に加えてもよい。
【００２４】
本発明の好ましい実施形態では、（ｉｖ）標識化合物を工程（ｂ）で形成したキャリヤ結合ＩｇＥ含有複合体に加える。
【００２５】
本発明のとりわけ好ましい実施形態では、（ｉｖ）標識化合物を分離工程（ｃ）から得られたキャリヤ結合ＩｇＥ含有複合体に加え、混合物ＩＩ’を形成し、この場合得られた標識およびキャリヤ結合ＩｇＥ含有複合体を混合物ＩＩ’から分離し、工程（ｄ）の前に洗浄する。
【００２６】
「標識化合物」なる表現は、ルミネセンス標識、化学ルミネセンス標識、酵素標識、放射性標識、蛍光標識および吸収標識からなるイムノアッセイで慣用的に用いられるいずれかの適当な標識系を意味する。
【００２７】
本発明の好ましい実施形態では、（ｉｖ）標識化合物はアビジン、ストレプトアビジンまたはその機能的誘導体に共有結合した化学ルミネセンス化合物である。
【００２８】
化学ルミネセンス標識はアクリジニウム化合物、例えばＮ−ヒドロキシサクシンイミド・ジメチルアクリジニウムエステル（ＮＨＳ−ＤＭＡＥ）であるのが好ましい。Ｗｅｅｋｓら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍ．２９：１４７４−１４７９（１９８３）の方法によりアビジン／ストレプトアビジンおよびＤＭＡＥを結合できる。本発明の使用に適した化学ルミネセンス化合物のその他の例としてはルミノール、ルシゲニンおよびロフィンなどがある。
【００２９】
本発明の別の好ましい実施形態では、（ｉｖ）標識化合物はアビジン、ストレプトアビジンまたはその機能的誘導体に共有結合した蛍光標識である。蛍光標識の好ましい例としてはフィゴエリスリン（ＰＥ）がある。
【００３０】
用いる標識の型に依存して、標識化合物をリガンドに直接結合できるか、またはビオチンによりリガンドに結合できる。本発明の好ましい実施形態ではリガンドをビオチンまたはその機能的誘導体に結合する。好ましくはビオチンは工程（ａ）で加えたリガンドに結合する。
【００３１】
標識化合物は、また、検出されるＩｇＥに対する抗体により、検出されるＩｇＥと結合できる。これでは、ＩｇＥに対するこの抗体は、ＩｇＥのＩｇＥレセプターに対する結合を妨害しないように、ＩｇＥに結合される。標識化合物の組合わせおよび検出抗体を工程（ｂ）または（ｃ）において形成されるキャリヤ結合ＩｇＥ含有複合体に加えるのが好ましい。別法として、標識化合物の組合わせおよび検出抗体を工程（ａ）においてサンプルおよびリガンドの前かまたは同時に加えるかまたは工程（ａ）において形成されたＩｇＥ含有複合体に加える。
【００３２】
検出抗体はポリクローナル抗体であるのが好ましい。
【００３３】
標識化合物に結合した検出抗体からなる検出系を使用することは、同一の系を検出されるＩｇＥから独立して用いることができるという利点を有する。また、未標識リガンドを使用できる検出系を用いることは、インビボ条件を最もよく擬似しているので有利であると考えられる。
【００３４】
用いる標識系の型に依存して、標識化合物を検出抗体に直接結合できるかまたはビオチンにより検出抗体に結合できる。本発明の好ましい実施形態では、検出抗体をビオチンまたはその機能的誘導体に結合する。ビオチンを工程（ｃ）の後に加えた検出抗体に結合するのが好ましい。
【００３５】
好ましくはＩｇＥ含有サンプルをリガンドと接触させてインキュベートし、混合物Ｉを形成させた（工程（ａ））後、混合物Ｉをキャリヤ／ＩｇＥレセプターと接触させる（工程（ｂ））。サンプルおよびリガンドのインキュベーション時間は１ないし１２０、好ましくは５ないし６０、より好ましくは１０ないし４０分間である。
【００３６】
この工程は、ＩｇＥレセプターと接触する前にリガンドおよびＩｇＥの複合体を形成させるので、および、ＣＤ２３が該複合体の形態のＩｇＥに結合するので、この工程が最もよくインビボ条件に、似ていると考えられる。
【００３７】
別法として、工程（ａ）および（ｂ）を１回の操作で同時に実施する、すなわちＩｇＥ含有サンプル、リガンドおよびキャリヤ−ＩｇＥレセプターを混合し、一緒にインキュベートする。この場合、インキュベーション時間は１ないし１２０、好ましくは５ないし６０、より好ましくは１０ないし３０分間である。
【００３８】
キャリヤは免疫学的アッセイにおいて共通に用いられるいずれかの固体物質、例えば生物学的細胞、例えばＢセル；例えばガラス、金属すなわち鉄または重合体からなる粒子状物質；常磁性粒子；および重合体からなるプレート、ウェル、皿またはチューブでよい。
【００３９】
キャリヤは好ましくは粒子、最も好ましくは常磁性粒子である。「常磁性粒子」なる用語は液体培地に分散または懸濁できるいずれかの常磁性粒子、例えばアドバンスト・マグネチックス・インコーポレーティッド（米国）により販売されている「バイオマグ」粒子（アミン末端基で被覆された酸化鉄粒子）、ダイナル・エイ・エス（ノルウェイ）により販売されている「ダイナビーズ」（重合体で覆われた酸化鉄）を意味する。
【００４０】
粒子状物質をキャリヤとして用いる場合、液体相からの固体相複合体の分離は用いる固体粒子の型に依存して、すなわち磁性分離、濾過、沈殿、遠心、クロマトグラフィー、カラムクロマトグラフィーにより実施できる。
【００４１】
本発明の好ましい実施形態では、第１の測定値を得るためにＣＤ２３単独、および第２の測定値を得るためにＦｃεＲＩ単独、の両方を用いて検出されるＩｇＥを定量する。
【００４２】
Ｂセルによる低抗原濃度でのＣＤ２３媒介抗原提示は、ＣＤ４＋Ｔセルの活性化を促進し、後期相アレルギー性応答、すなわち暴露の約６から２４時間の間に現れる応答、において重要な役割果たす。ＩｇＥの架橋結合後の、肥満細胞および好塩基球のＦｃεＲＩ引き金は、即時型アレルギー応答を誘起する。このように、ＣＤ２３およびＦｃεＲＩの生物学的機能は異なり、それ故にＩｇＥレセプターとしてＣＤ２３およびＦｃεＲＩを用いる本発明のアッセイで得られる結果は各々、ＩｇＥ含有サンプルの源である対象の免疫学的状態に関して異なる情報を有している。従って、対象の免疫学的状態をモニター観察および評価するためのより完全な基礎を提供するために、ＣＤ２３およびＦｃεＲＩの両方に関する結果を得るのが有利である。
【００４３】
本発明の別の好ましい実施形態では、ＣＤ２３およびＦｃεＲＩの組合わせを用いる。用いるキャリヤが粒子状物質である場合、ＣＤ２３およびＦｃεＲＩを別個の粒子にまたは同一の粒子に結合できる。
【００４４】
本発明の方法はサンプル中の予期されるＩｇＥレベルに比較して過剰のリガンドを用いて実施できる。多量の過剰リガンド、例えばＩｇＥに対するリガンドの比率が１００００まで、を用いることができる。
【００４５】
本発明の好ましい実施形態では、リガンド分子数は検出されるＩｇＥ分子数の１００％から１０．０００％の間、好ましくは１００％から１０００％の間、より好ましくは１００％から２００％の間、より好ましくは１００％から１５０％の間、および最も好ましくは１００％から１２０％の間である。
【００４６】
前記から明らかなように、リガンドおよびＩｇＥを対応する規模の量でまたはリガンドを少し過剰にして混合するのが好ましい。これは複合体形成に都合のよいインビボ条件に対応すると考えられるので好ましい。
【００４７】
ＩｇＥに対するリガンドの好ましい比率は、多くの因子、例えばキャリヤの型、検出されるＩｇＥの特性、並びに検出されるＩｇＥに対応するＩｇＥレセプターおよびリガンドの特性、に依存し、従って実施される特定の的アッセイに関して最適化されるべきである。しかしながら、ＩｇＥの適切インビボレベルの測定に関して前記の範囲内の比率で最もよい結果が得られるので、一般にかかる比率であるのが好ましい。これは、前記のＣＤ２３媒介抗原提示が低い抗原濃度で抗原提示を増強するメカニズムであることにより説明されると考えられる。高い抗原濃度では、ＣＤ２３による特異的捕捉がなくとも、抗原提示細胞により十分な抗原が提示されるので、該メカニズムが不適切になる。換言すれば、リガンドおよびＩｇＥの複合体は、ＣＤ２３およびＦｃεＲＩの両方に結合し、前記したＩｇＥに対するリガンドの比率で平衡がＣＤ２３に対する結合の方向にシフトすると考えられる。
【００４８】
好ましくは、本発明の方法は０℃ないし１００℃、より好ましくは０℃ないし４０℃、および最も好ましくは２０℃ないし３８℃の温度で実施される。
【００４９】
キャリヤとして生物学的細胞を用いる場合、そして標識化合物に結合した検出抗体からなる検出系を用いる場合、細胞の外表面上の、ＩｇＥレセプターに結合したＩｇＥおよびアレルゲンの複合体が、標識される前に細胞内部へ内向する（これは測定の不正確性を招く）のを避けるために、相対的に低い温度、０℃ないし１０℃、より好ましくは０℃ないし６℃でアッセイを実施するのが好ましい。
【００５０】
本発明はとりわけ：
（ａ）（ｉ）サンプルを（ｉｉ）抗原、抗体またはハプテンの形態の遊離リガンドと接触させて、ＩｇＥ含有複合体を含んでなる混合物Ｉを形成する工程、ここでリガンドはビオチンまたはその機能的誘導体に結合している；
（ｂ）混合物Ｉを（ｉｉｉ）ＩｇＥレセプターが結合しているキャリヤと混合して、キャリヤ結合ＩｇＥ含有複合体を含んでなる混合物ＩＩを形成する工程、該ＩｇＥレセプターはＣＤ２３（ＦｃεＲＩＩ）および／またはＦｃεＲＩである；
（ｂ’）混合物ＩＩからキャリヤ結合ＩｇＥ含有複合体を分離し、該複合体を洗浄する工程；
（ｂ’’）洗浄したキャリヤ結合ＩｇＥ含有複合体にアビジン、ストレプトアビジンまたはその機能的誘導体に共有結合した（ｉｖ）化学ルミネセンス化合物の溶液を加え、混合物ＩＩ’を形成する工程；
（ｃ）混合物ＩＩ’からキャリヤ結合ＩｇＥ含有複合体を分離し、該複合体を洗浄する工程；
（ｄ）得られたＩｇＥ含有複合体において化学ルミネセンス反応を開始し、あるとすれば、得られた化学ルミネセンスを検出／測定する工程；
からなる液体サンプル中の特定ＩｇＥ抗体を検出および／または定量する方法に関する。
【００５１】
定義
本発明において「特定ＩｇＥ抗体」なる表現は、ＩｇＥレセプターＣＤ２３および／またはＦｃεＲＩに親和性を有するＩｇＥアイソタイプのいずれかの特定免疫グロブリンおよびいずれかのその他の免疫グロブリンを意味する。
【００５２】
「生物学的サンプル」なる用語は、生物学的有機体内で排出、分泌または輸送されるいずれかの生物学的流体、例えば血液、血漿、血清、尿、唾液およびいずれかのその他の流体を意味する。
【００５３】
「抗原、抗体、またはハプテンの形態のリガンド」なる表現はいずれかの免疫学的に活性な物質であり得る。「抗原」はアレルゲン例えば樹木、草、雑草等の花粉、カビアレルゲン、ダニ（コナダニ）および動物例えばネコ、イヌ、ウマ、ウシおよびトリからのアレルゲン、有刺昆虫のアレルゲンおよび昆虫の吸入アレルゲン、および食物アレルゲンなどであり得；「抗体」は組換えおよびフラグメント化抗体などのモノクローナルまたはポリクローナル抗体であり得；並びに「ハプテン」はその炭水化物部分またはフラグメント、酵素インヒビターまたは薬物例えばペニシリンまたはその誘導体であり得る。
【００５４】
本発明に関して「ＩｇＥレセプター」なる用語は、ＣＤ２３（ＦｃεＲＩＩ）および／またはＦｃεＲＩを意味する。「ＣＤ２３」なる用語は、純粋な形態のまたは混合物、溶液もしくは抽出物中のＣＤ２３；合成または組換えＣＤ２３；天然の供給源に由来するＣＤ２３；並びにＣＤ２３全体およびその部分などの、いずれかのその調合物およびいずれかのその部分を意味する。ＣＤ２３のα鎖を三量体、二量体または単量体として用いることができ、α鎖またはその可溶性部分のみ、すなわち細胞膜の外表面から伸びている部分またはα鎖の可溶性部分の切片をＣＤ２３として用いることができる。「ＦｃεＲＩ」は純粋な形態のまたは混合物、溶液または抽出物中のＦｃεＲＩ；合成または組換えＦｃεＲＩ；天然の供給源に由来するＦｃεＲＩ；並びにＦｃεＲＩ全体およびその部分などのそのいずれかの、調合物およびそのいずれかの部分を意味する。とりわけ最初にＩｇＥの結合に寄与するα鎖のみ、またはその可溶性部分すなわち細胞膜の外表面から伸びている部分またはα鎖の可溶性部分の切片をＦｃεＲＩとして用いることができる。
【００５５】
「遊離の溶解したリガンド」なる表現は、妨害されずに自由にＩｇＥと複合体を形成するリガンドを意味し、この表現は溶液中のリガンドおよび溶液中の物質に結合したリガンドを含む。
【００５６】
本発明を以下の図面に関してより詳細に記載する。
【００５７】
図１ａは（ｉ）血清不含、アレルゲン不含、（ｉｉ）対照血清およびアレルゲン、並びに（ｉｉｉ）アレルギー性患者の血清およびアレルゲンを用いて本発明のアッセイにおいて測定された蛍光レベルを示す。
【００５８】
図１ｂは（ｉ）対照血清およびアレルゲン、（ｉｉ）アレルギー性患者の血清およびアレルゲン、並びに（ｉｉｉ）アレルギー性患者の血清、ＣＤ１９およびアレルゲンに対する抗体、並びに（ｉｖ）アレルギー性患者の血清、ＣＤ２３およびアレルゲンに対する抗体を用いて本発明のアッセイにおいて測定された蛍光レベルを示す。
【００５９】
図１ｃは（ｉ）血清不含、アレルゲン不含、（ｉｉ）アレルギー性患者の血清およびアレルゲン不含、（ｉｉｉ）アレルギー性患者の血清およびアレルゲン、（ｉｖ）アレルギー性患者の血清、アレルゲンおよびＩｇＧに対する抗体、並びに（ｖ）アレルギー性患者の血清、アレルゲンおよびＩｇＥに対する抗体を用いて本発明のアッセイにおいて測定された蛍光レベルを示す。
【００６０】
図２ａは（ｉ）アレルギー性患者の血清およびアレルゲン不含、（ｉｉ）アレルギー性患者の血清およびアレルゲン、（ｉｉｉ）アレルギー性患者の血清、ＳＡＶ処置したアレルギー性患者の血清およびアレルゲン、並びに（ｉｖ）ＳＡＶ処置したアレルギー性患者の血清およびアレルゲンを用いて本発明のアッセイにおいて測定された蛍光レベルを示す。
【００６１】
図２ｂは参考全ＩｇＥアッセイにおけるアレルギー性患者の血清およびＳＡＶ処置したアレルギー性患者血清のＩｇＥレベルの測定値を基にして算出した図２ａの（ｉ）ないし（ｉｖ）の設定でのＩｇＥレベルを示す。
【００６２】
図３は本発明の一つの好ましい実施形態を示す図である。
【００６３】
図４は本発明の第２の好ましい実施形態を示す図である。
【００６４】
図５は本発明の第３の好ましい実施形態を示す図である。
【００６５】
図６は（ｉ）アレルギー性患者の血清、アレルゲンおよびＣＤ２３のＩｇＥ結合部分に対する抗体（１）、（ｉｉ）アレルギー性患者の血清、アレルゲンおよびＣＤ２３のＩｇＥ結合部分に対する抗体（２）、（ｉｉｉ）アレルギー性患者の血清、アレルゲンおよびＣＤ２３の非ＩｇＥ結合部分に対する抗体、並びに（ｉｖ）アレルギー性患者の血清、アレルゲンおよびＣＤ１４に対する抗体を用いて本発明のアッセイにおいて測定された蛍光レベルを示す。
【００６６】
図７ａはアレルギー性患者の血清および漸増量の草アレルゲンを用いて本発明のアッセイにおいて測定された蛍光レベルを示す。
【００６７】
図７ｂはアレルギー性患者の血清および漸増量の精製され、組換えにより発現されたカバ主要アレルゲンを用いて本発明のアッセイにおいて測定された蛍光レベルを示す。
【００６８】
図８ａは（ｉ）カバアレルギー性患者の血清および非アレルギー性対照血清、（ｉｉ）アレルギー性患者の血清およびＳＡＶ処置したカバアレルギー性患者の血清（Ａ）、（ｉｉｉ）カバアレルギー性患者の血清およびＳＡＶ処置したカバアレルギー性患者の血清（Ｂ）、並びに（ｉｖ）カバアレルギー性患者の血清およびＳＡＶ処置した草アレルギー性患者の血清を用いて本発明のアッセイにおいて測定された蛍光レベルを示す。
【００６９】
図８ｂは漸増量の精製され、組換えにより発現されたカバ主要アレルゲン、並びに（ｉ）カバアレルギー性患者の血清および非アレルギー性対照血清、（ｉｉ）アレルギー性患者の血清およびＳＡＶ処置したカバアレルギー性患者の血清（Ａ）、（ｉｉｉ）カバアレルギー性患者の血清およびＳＡＶ処置したカバアレルギー性患者の血清（Ｂ）、並びに（ｉｖ）カバアレルギー性患者の血清およびＳＡＶ処置した草アレルギー性患者の血清を用いて本発明のアッセイにおいて測定された蛍光レベルを示す。
【００７０】
図３は原理的に本発明のアッセイの好ましい実施形態の工程を示す。第１の工程ではビオチン化アレルゲンと、およびアレルゲンに特異的なＩｇＥを含有するサンプル（図では「ＩｇＥ」で表す）とを混合し、インキュベートして多くのＩｇＥ分子および多くのアレルゲン分子を含む複合体を含有する混合物Ｉを形成する。この混合物Ｉはさらに過剰のＩｇＥおよびアレルゲンを含んでいる。第２の工程では多くのＣＤ２３分子（および／または多くのＦｃεＲＩ分子）が結合した粒子状キャリヤを加え、該複合体はＣＤ２３を介してキャリヤに結合し、混合物ＩＩを形成する。恐らく少量のＩｇＥは単量体形態でＣＤ２３に結合するであろう。第３の工程ではキャリヤ結合複合体を混合物ＩＩから分離し、１または２回洗浄して非結合反応物質を除去する。また、前記したように、本アッセイで生じる干渉はＩｇＥレセプターに対する複合体の結合の阻害の結果による可能性があるので、洗浄により、存在し得るいずれかの非結合複合体をも除去する。混合物ＩＩからの複合体の分離は例えばキャリヤとして常磁性粒子を用いた場合、磁性分離により実施できる。化学ルミネセンス標識、好ましくはストレプトアビジン・アクリジニウム・エステル試薬をキャリヤ結合複合体と共にインキュベートして複合体結合ビオチンに標識を結合させる。インキュベーションの後、キャリヤ結合標識複合体を分離し、洗浄して未反応標識分子を除去し、適当な試薬例えば水酸化ナトリウムを用いて化学ルミネセンス反応を開始し、キャリヤ結合標識複合体の化学ルミネセンスを測定する。
【００７１】
図４は原理的に本発明のアッセイの好ましい実施形態の工程を示す。第１の工程ではビオチン化アレルゲンおよびアレルゲンに特異的なＩｇＥを含有するサンプル（図では「ＩｇＥ」で表す）および多くのＣＤ２３分子（および／または多くのＦｃεＲＩ分子）が結合した粒子状キャリヤを混合し、インキュベートして多くのＩｇＥ分子および多くのアレルゲン分子を含むキャリヤ結合複合体を含有する混合物ＩＩを形成する。混合物ＩＩはさらに過剰のＩｇＥおよびアレルゲン並びに非結合複合体を含んでなる。次いでキャリヤ結合複合体を混合物ＩＩから分離し、１または２回洗浄する。
【００７２】
続いて化学ルミネセンス標識、好ましくはストレプトアビジン・アクリジニウム・エステル試薬、をキャリヤ結合複合体と共にインキュベートして、複合体結合ビオチンにこの標識を結合させる。インキュベーションの後、キャリヤ結合標識複合体を分離し、洗浄して未反応標識分子を除去し、適当な試薬例えば水酸化ナトリウムを用いて化学ルミネセンス反応を開始し、キャリヤ結合標識複合体の化学ルミネセンスを測定する。
【００７３】
図５は本発明の別の好ましい実施形態の工程を示す。第１のインキュベーション工程ではアレルゲンおよびアレルゲンに特異的なＩｇＥを含有するサンプル（図では「ＩｇＥ」で表す）を混合し、インキュベートして多くのＩｇＥ分子および多くのアレルゲン分子を含む複合体を含有する混合物Ａを形成する。混合物Ａはさらに過剰のＩｇＥおよびアレルゲンを含んでなる。第２のインキュベーション工程では多くのＣＤ２３分子（および／または多くのＦｃεＲＩ分子）が結合した粒子状キャリヤを加える。該複合体はＣＤ２３を介してキャリヤに結合して混合物Ｂを形成する。恐らく少量のＩｇＥは単量体形態でＣＤ２３に結合するであろう。続いてキャリヤ結合複合体を混合物Ｂから分離し、１または２回洗浄して非結合反応物質を除去する。また、前記するように本アッセイで生じる干渉はＩｇＥレセプターに対する複合体の結合の阻害の結果による可能性があるので、洗浄により存在し得るいずれもの非結合複合体をも除去する。混合物Ｂからの複合体の分離は、例えばキャリヤとして常磁性粒子を用いた場合、磁性分離により実施できる。第３のインキュベーション工程では、ＩｇＥに対するビオチン化抗体（検出抗体）を加えて混合物Ｃを形成する。検出抗体はポリクローナルであり、ＩｇＥの特異性にかかわらず全てのＩｇＥに結合する。得られたキャリヤ結合複合体を混合物Ｃから分離し、該複合体を洗浄する。第４のインキュベーション工程では、化学ルミネセンス標識、好ましくはストレプトアビジン・アクリジニウム・エステル試薬、をキャリヤ結合複合体と共にインキュベートして複合体結合ビオチンに標識を結合させる。インキュベーションの後、キャリヤ結合標識複合体を分離し、洗浄して未反応標識分子を除去し、適当な試薬例えば水酸化ナトリウムを用いて化学ルミネセンス反応を開始し、キャリヤ結合標識複合体の化学ルミネセンスを測定する。
【００７４】
以下では実施例に関して本発明をさらに詳細に記載する。
【００７５】
実施例
実施例において以下の略語を用いる：
ＦＩＴＣ：フルオレセイン・イソチオシアネート
ＥＢＶ：エプスタイン・バー・ウイルス
ＳＵ：標準単位
ＳＡＶ：特異的アレルギーワクチン接種
実施例１
フローサイトメトリー分析によるＥＢＶ形質転換したＢセルにより発現されたＣＤ２３に対するカバアレルゲン特異的ＩｇＥの結合の検出
ＦＩＴＣ標識ベツラ・ベルコーサ（Ｂｅｔｕｌａ ｖｅｒｒｕｃｏｓａ：Ｂｅｔ ｖ）抽出物（１μｇ／ｍｌ）を対照血清７３４（ＩｇＥ全含量を測定する参考アッセイ（マジックライト（登録商標）、アルク・アベロ、ヘルスホルム、デンマーク））では検出できないＩｇＥと共に、またはカバアレルギー性患者血清１４６４（マジックライト（登録商標）アッセイにおいてカバ特異的ＩｇＥ＞８００ＳＵ／ｍｌ）と共に最終血清濃度６０％でインキュベートした。培養培地中アレルギー性患者からのＥＢＶ形質転換したＢセルを最終濃度４ｘ１０６／ｍｌで加え、３７℃で１時間インキュベートし、続いて２回洗浄して過剰のアレルゲンを除去した。細胞を洗浄した後、Ｂセルに対するＦＩＴＳ標識Ｂｅｔ ｖ（Ｂｅｔ ｖ＊）の結合をＦＡＣＳカリビュア・フローサイトメーターを用いる蛍光測定により分析した。
【００７６】
結果を図１ａに示す。（ｉ）図１ａにおいて「培地のみ」と表する血清不含、Ｂｅｔ ｖ不含（バックグラウンド）（ｉｉ）ｓ７３４およびＢｅｔ ｖ、並びに（ｉｉｉ）ｓ１４６４およびＢｅｔ ｖについての平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。結果はＣＤ２３を発現するＢリンパ球に対するＦＩＴＣ標識カバアレルゲン抽出物の結合が直接的に表されることを表している。
【００７７】
ＣＤ２３に対する抗体および参考としてＣＤ１９に対する抗体を用いる遮断実験では、ＥＢＶ−Ｂセルをこれらの抗体と共に４℃で１時間インキュベートし、その後Ｂｅｔ ｖおよび血清の混合物に細胞を加える。図１ｂは（ｉ）ｓ７３４血清、（ｉｉ）ｓ１４６４、（ｉｉｉ）ｓ１４６４およびＣＤ１９に対する抗体、並びに（ｉｖ）ｓ１４６４およびＣＤ２３に対する抗体に関する平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。図１ｂから明らかであるように、ＢセルとＣＤ２３に対する抗体とのプレインキュベーションは、ＦＩＴＣ標識カバ抽出物のＢセルに対する結合を阻害し、一方無関係なＢセル表面抗原ＣＤ１９に対する抗体とのプレインキュベーションは、結合を阻害しない。これはＦＩＴＣ標識カバ抽出物は低親和性ＩｇＥレセプターであるＣＤ２３と結合することを表している。
【００７８】
さらなる実験では、ポリクローナル抗ＩｇＧまたは抗ＩｇＥ抗体をアレルギー性患者血清（ｓ１４６４）と共に３７℃で１時間プレインキュベートし、その後Ｂｅｔ ｖを添加した。図１ｃは（ｉ）バックグラウンド、（ｉｉ）ｓ１４６４およびＢｅｔ ｖ不含、（ｉｉｉ）ｓ１４６４およびＢｅｔ ｖ、（ｉｖ）ｓ１４６４、ＩｇＧおよびＢｅｔ ｖに対する抗体、（ｖ）ｓ１４６４、ＩｇＥおよびＢｅｔ ｖに対する抗体についての平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。図１ｃより明らかであるように、ＩｇＧではなくＩｇＥがＦＩＴＣ標識カバ抽出物のＢリンパ球に対する結合に寄与する。
【００７９】
結論として、図１ａないしｃで示される実験では、固体キャリヤ上でのＣＤ２３に対する標識アレルゲンの結合がＩｇＥにより媒介され、容易に検出できることが示された。
【００８０】
実施例２
ＣＤ２３へのカバアレルゲン特異的ＩｇＥの結合は、マジックライト（登録商標）アッセイにより測定された累積カバアレルゲン特異的ＩｇＥレベルが増加しても、免疫治療血清により阻害される。
【００８１】
ＦＩＴＣ標識ベツラ・ベルコーサ（Ｂｅｔｕｌａ ｖｅｒｒｕｃｏｓａ：Ｂｅｔ ｖ）抽出物（１μｇ／ｍｌ）をカバアレルギー性患者血清８９４（マジックライト（登録商標）アッセイにおけるカバ特異的ＩｇＥ ＞８００ＳＵ／ｍｌ）と共に最終血清濃度４０％で、＞４年間カバＳＡＶを受けている患者の血清（血清１４９０、マジックライト（登録商標）アッセイにおけるカバ特異的ＩｇＥ ８８ＳＵ／ｍｌ）の不在下または存在下（これも４０％）インキュベートした。培養培地中アレルギー性患者からのＥＢＶ形質転換したＢセルを最終濃度４ｘ１０６／ｍｌで加え３７℃で１時間インキュベートし、続いて２回洗浄して過剰のアレルゲンを除去した。細胞を洗浄した後、ＦＩＴＣ標識Ｂｅｔ ｖ（Ｂｅｔ ｖ＊）のＢセルへの結合をＦＡＣＳカリビュア・フローサイトメーターを用いる蛍光測定により分析した。
【００８２】
図２ａは（ｉ）ｓ８９４およびＢｅｔ ｖ不含、（ｉｉ）ｓ８９４血清およびＢｅｔ ｖ、（ｉｉｉ）ｓ８９４およびｓ１４９０の両方およびＢｅｔ ｖ、並びに（ｉｖ）ｓ１４９０およびＢｅｔ ｖに関する平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。図２ａより明らかであるように、ｓ１４９０の添加によりＩｇＥおよびＦＩＴＣ標識カバアレルゲンのＣＤ２３に対する結合がバックグラウンドレベルまで低減する。これはＦＩＴＣ標識カバアレルゲンのＣＤ２３に対するＩｇＥ媒介結合に干渉する因子の存在を示している。
【００８３】
比較のために、図２ｂは図２ａと同一の反応物設定（ｉ）ないし（ｉｖ）に関して算出されたカバアレルゲン特異的ＩｇＥの全レベルを示しており、レベルはマジックライト（登録商標）アッセイにより測定されたｓ８９４およびｓ１４９０の全ＩｇＥレベルの別個の測定値に基づいて算出される。
【００８４】
図２ａないしｂから、捕捉物質としてＣＤ２３を用いる本発明のアッセイにより、捕捉物質としてＩｇＥに対する抗体を用いる先行技術の全ＩｇＥアッセイマジックライト（登録商標）とは全く異なる結果が得られた。さらに、インビボ抗原提示はＣＤ２３により促進されるので、本発明のアッセイにより得られた結果は試験される対象の状態をよりよく表現していると考えるべきである。
【００８５】
実施例３
レセプターのＩｇＥ結合部分との相互作用により、アレルゲンおよび特異的ＩｇＥ間の複合体は、ＣＤ２３に結合し、ＩｇＥに対する抗体により検出できる。
【００８６】
ＣＤ２３に対する三つの異なるモノクローナル抗体、すなわちＣＤ２３のＩｇＥ結合部分に特異的に結合するＣＤ２３に対する二つの抗体（ベックトン・ディッキンソン、デンマークにより販売されているファルミンゲンのＭＬ２３３、およびダッコ・エイ／エス、デンマークのＭＨＭ６）およびＣＤ２３のＩｇＥ結合に関与しない領域に特異的に結合する一つの抗体（ベックトン・ディッキンソン、デンマークのＥＢＶ ＣＳ５）で遮断実験を実施した。終わりに、無関係表面分子（ＣＤ１４）に対する抗体を参考として含めた（ダッコ・エイ／エス、デンマーク）。ＥＢＶ形質転換したＢセルを各抗体１０μｇ／ｍｌと共に４℃で１時間プレインキュベートし、洗浄して非結合抗体を除去し、その後複合体と共にインキュベートした。カバ花粉アレルギー（マジックライト（登録商標）アッセイにおいてカバ特異的ＩｇＥ ＞８００ＳＵ／ｍｌ）を有する供与者からの血清ｓ１４６４を最終血清濃度８０％で１μｇ／ｍｌのＢｅｔ ｖと３７℃で１時間接触することにより複合体を生じた。複合体を抗体処置ＥＢＶセルと４℃で１時間接触させた。続いて、細胞を洗浄し、ヒトＩｇＥ（アルク・アベロのＰＵ ＰＥＤ００４８）を認識するビオチン化抗体と共にインキュベートし、続いて洗浄し、ストレプトアビジン・フィコエリスリン抱合体（サザン・バイオテクノロジー・アソシエーツ、ケボ、デンマークにより販売）とインキュベートすることにより、結合複合体を着色した。最終洗浄の後、ＩｇＥアレルゲン複合体のＥＢＶセルに対する結合を、ＦＡＣＳカリビュア・フローサイトメーターを用いる蛍光測定により分析した。
【００８７】
図６より、アレルゲンのＣＤ２３に対する結合は、ＣＤ２３のＩｇＥ結合部位との相互作用により媒介され、非特異的相互作用によっては媒介されないと結論づけられる。加えて、未標識複合体の結合はＩｇＥに対する抗体により容易に検出できる。
【００８８】
実施例４
本発明により、認識されたアレルゲンとは無関係に、アレルギーを有する患者の血清の特異的ＩｇＥの検出が可能になる。
【００８９】
草花粉（フェレウム・ピー：Ｐｈｌｅｕｍ ｐ）アレルゲンに対するアレルギーを有する２人の別個の供与者からの血清（マジックライト（登録商標）アッセイにおいてフェレウム・ピー特異的ＩｇＥが、ｓ１０３４：５８２ＳＵ／ｍｌ、およびｓ１５２４：６５８ＳＵ／ｍｌ）を漸増量の草アレルゲン抽出物と接触させることにより複合体を生じた。３７℃で１時間反応を進行させた。続いて４℃で１時間、ＥＢＶ形質転換したＢセルを反応に加えた。細胞を洗浄し、結合複合体を可視化し、実施例３に記載のように分析した。図７ａは（ｉ）ｓ１０４３および（ｉｉ）ｓ１５２４に関する蛍光強度の幾何平均を示す。各サンプルを２検体ずつ試験し、その平均を算出した。
【００９０】
図７ｂではｓ１４６４（実施例３で記載）を漸増量の精製された、組換えＢｅｔ ｖ１、カバ花粉の主要アレルゲンの一つと接触させた。図７ａに記載されるように試験を行った。
【００９１】
図７ａおよびｂでは、本発明の一つの実施形態において、検出用にＩｇＥに対する同一の抗体を用いて、異なるアレルゲンに特異的であるＩｇＥを測定することが可能であることを示している。全アレルゲン抽出物、および単一の精製されたアレルゲンに特異的なＩｇＥを測定するためにアッセイを用いることができる。図７ａおよびｂは最適なシグナルを得るために個々のアレルゲンが異なる用量で必要とされることをも示している。
【００９２】
実施例５
カバ花粉アレルギーに関する特異的アレルギーワクチン接種（ＳＡＶ）を行った患者の血清によりカバアレルゲン特異的ＩｇＥのＣＤ２３への結合が阻害されるが、一方アレルギー性でない供与者または関連性のないアレルギーに関するＳＡＶを受けた患者の血清により結合は阻害されない。
【００９３】
カバ花粉アレルギー性供与体の血清、ｓ１４６４を以下の血清：（ｉ）非アレルギー性供与体の血清ｓ７４５（０ＳＵ／ｍｌ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）カバ花粉に関するＳＡＶを受けた供与体（ｓ１４９０およびｓ１５９８；マジックライト（登録商標）アッセイにおいてカバ特異的ＩｇＥが各々８８および５７ＳＵ／ｍｌ）、並びに（ｉｖ）草アレルギーを有する供与体（ｓ８０８９５４；マジックライト（登録商標）アッセイにおいて草特異的ＩｇＥが１３７ＳＵ／ｍｌ、カバ特異的ＩｇＥが４ＳＵ／ｍｌ）と混合した（１：１）。カバ花粉アレルゲンの抽出物（Ｂｅｔ ｖ、図８ａ）またはカバ花粉の精製された組換えアレルゲン（Ｂｅｔ ｖ１、図８ｂ）のいずれかと共に、最終濃度が各血清の４０％でインキュベートした後、ＥＢＶ形質転換したＢセルを４℃で１時間加え、細胞を洗浄し、結合した複合体を前記のように検出した。
【００９４】
図８ａおよびｂは蛍光強度の幾何平均として結果を表している。各サンプル（ｉないしｉｖ）におけるＩｇＥの全レベル（マジックライト（登録商標）アッセイで測定）を捕捉物質としてＣＤ２３を用いて得られたシグナルと比較することにより、本発明のアッセイが異なる「型」の複合体形成、ＣＤ２３結合ＩｇＥを測定すると結論づけることができる。前記で説明したように、この「型」のＩｇＥのレベルは慣用的な手段により測定されたＩｇＥレベルよりも試験される対象の状態をよりよく反映していると考えられる。
【００９５】
参考文献の一覧
（１）「アトピー性疾患における血清ＩｇＥに促進されるアレルゲン提示」、ｖａｎ ｄｅｒ Ｈｅｉｊｄｅｎら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５０：３６４３−３６５０（１９９３）
（２）「ＩｇＥ抗原複合体がネズミＢリンパ球によるＦｃεＲおよびＩａ発現を増強する」、Ｒｉｃｈａｒｄｓら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１６８：５７１（１９９８）
（３）Ｓａｎｔａｍａｒｉａら、Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３７：２３−３０（１９９３）
（４）「高親和性ＩｇＥレセプター（ＦｃεＲＩ）がＩｇＥ依存性アレルゲン提示を媒介する」、Ｍａｕｒｅｒら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５４：６２８５−６２９０（１９９５）
【図面の簡単な説明】
【図１ａ】 図１ａは（ｉ）血清不含、アレルゲン不含、（ｉｉ）対照血清およびアレルゲン、並びに（ｉｉｉ）アレルギー性患者の血清およびアレルゲンを用いて本発明のアッセイにおいて測定された蛍光レベルを示す。
【図１ｂ】 図１ｂは（ｉ）対照血清およびアレルゲン、（ｉｉ）アレルギー性患者の血清およびアレルゲン、並びに（ｉｉｉ）アレルギー性患者の血清、ＣＤ１９およびアレルゲンに対する抗体、並びに（ｉｖ）アレルギー性患者の血清、ＣＤ２３およびアレルゲンに対する抗体を用いて本発明のアッセイにおいて測定された蛍光レベルを示す。
【図１ｃ】 図１ｃは（ｉ）血清不含、アレルゲン不含、（ｉｉ）アレルギー性患者の血清およびアレルゲン不含、（ｉｉｉ）アレルギー性患者の血清およびアレルゲン、（ｉｖ）アレルギー性患者の血清、アレルゲンおよびＩｇＧに対する抗体、並びに（ｖ）アレルギー性患者の血清、アレルゲンおよびＩｇＥに対する抗体を用いて本発明のアッセイにおいて測定された蛍光レベルを示す。
【図２ａ】 図２ａは（ｉ）アレルギー性患者の血清およびアレルゲン不含、（ｉｉ）アレルギー性患者の血清およびアレルゲン、（ｉｉｉ）アレルギー性患者の血清、ＳＡＶ処置したアレルギー性患者の血清およびアレルゲン、並びに（ｉｖ）ＳＡＶ処置したアレルギー性患者の血清およびアレルゲンを用いて本発明のアッセイにおいて測定された蛍光レベルを示す。
【図２ｂ】 図２ｂは参考全ＩｇＥアッセイにおけるアレルギー性患者の血清およびＳＡＶ処置したアレルギー性患者血清のＩｇＥレベルの測定値を基にして算出した図２ａの（ｉ）ないし（ｉｖ）の設定でのＩｇＥレベルを示す。
【図３】 図３は本発明の一つの好ましい実施形態を示す図である。
【図４】 図４は本発明の第２の好ましい実施形態を示す図である。
【図５】 図５は本発明の第３の好ましい実施形態を示す図である。
【図６】 図６は（ｉ）アレルギー性患者の血清、アレルゲンおよびＣＤ２３のＩｇＥ結合部分に対する抗体（１）、（ｉｉ）アレルギー性患者の血清、アレルゲンおよびＣＤ２３のＩｇＥ結合部分に対する抗体（２）、（ｉｉｉ）アレルギー性患者の血清、アレルゲンおよびＣＤ２３の非ＩｇＥ結合部分に対する抗体、並びに（ｉｖ）アレルギー性患者の血清、アレルゲンおよびＣＤ１４に対する抗体を用いて本発明のアッセイにおいて測定された蛍光レベルを示す。
【図７ａ】 図７ａはアレルギー性患者の血清および漸増量の草アレルゲンを用いて本発明のアッセイにおいて測定された蛍光レベルを示す。
【図７ｂ】 図７ｂはアレルギー性患者の血清および漸増量の精製され、組換えにより発現されたカバ主要アレルゲンを用いて本発明のアッセイにおいて測定された蛍光レベルを示す。
【図８ａ】 図８ａは（ｉ）カバアレルギー性患者の血清および非アレルギー性対照血清、（ｉｉ）アレルギー性患者の血清およびＳＡＶ処置したカバアレルギー性患者の血清（Ａ）、（ｉｉｉ）カバアレルギー性患者の血清およびＳＡＶ処置したカバアレルギー性患者の血清（Ｂ）、並びに（ｉｖ）カバアレルギー性患者の血清およびＳＡＶ処置した草アレルギー性患者の血清を用いて本発明のアッセイにおいて測定された蛍光レベルを示す。
【図８ｂ】 図８ｂは漸増量の精製され、組換えにより発現されたカバ主要アレルゲン、並びに（ｉ）カバアレルギー性患者の血清および非アレルギー性対照血清、（ｉｉ）アレルギー性患者の血清およびＳＡＶ処置したカバアレルギー性患者の血清（Ａ）、（ｉｉｉ）カバアレルギー性患者の血清およびＳＡＶ処置したカバアレルギー性患者の血清（Ｂ）、並びに（ｉｖ）カバアレルギー性患者の血清およびＳＡＶ処置した草アレルギー性患者の血清を用いて本発明のアッセイにおいて測定された蛍光レベルを示す。
本発明は液体サンプル中の抗原、抗体またはハプテンの形態のリガンドに特異的なＩｇＥ抗体の検出および／または定量方法に関する。
【０００２】
ＷＯ９４／１１７３４は化学ルミネセンス標識およびビオチン結合リガンドを用いる抗体の２部位イムノアッセイに関して記載し、該方法は（ａ）液体サンプルをビオチンまたはその機能的な誘導体に結合したリガンド抗原、抗体またはハプテン、常磁性粒子に結合した検出される抗体に対する抗体およびアビジン、ストレプトアビジンまたはその機能的誘導体に結合した化学ルミネセンスアクリジニウム化合物を混合し、固相混合物を形成する工程；（ｂ）液体相から固相を磁性的に分離する工程；（ｃ）あるとすれば、分離された固相中の化学ルミネセンス反応を開始する工程；並びに（ｄ）サンプル中の該抗体の存在を示す化学ルミネセンス相の存在に関して分離された固相を分析する工程からなる。
【０００３】
先行技術は体液中の特定免疫グロブリン、例えばＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭおよびそのサブクラスからなる群から選択する特定免疫グロブリンの濃度測定にとりわけ適している。
【０００４】
また先行技術はＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭおよびそのサブクラスのごときクラスまたはサブクラスの免疫グロブリンの検出および全含量の定量に適している。
【０００５】
ＷＯ９８／２３９６４ではイヌ、ネコおよびウマＩｇＥの検出法について開示している。方法の一つの実施形態は、ａ）ヒトＦｃεレセプター（ＦｃεＲＩ）を基質に結合させる工程、ｂ）この基質−ＦｃεＲＩとＩｇＥ含有組成物とを接触させて、基質−ＦｃεＲＩ−ＩｇＥの複合体を形成する工程、ｃ）過剰の非結合物質を除去する工程、ｄ）この複合体のＩｇＥに選択的に結合できる例えば抗原の形態のインジケーター分子を加える工程、該インジケーター分子は検出可能なマーカー、例えば蛍光標識またはリガンド例えばビオチンと結合できるものである、ｅ）過剰のインジケーター分子を除去する工程、およびｆ）形成した標識複合体を測定する工程からなる。
【０００６】
この文書はほかに、基質が磁性粒子またはＦｃεＲＩを発現する組換え細胞などの粒子状物質でよいことを一般的に記載している。また検出可能なマーカーは化学ルミネセンス標識であることが一般的に述べられている。
【０００７】
ＷＯ９８／２３９６４中開示された先行技術アッセイでは、過剰の基質−ＦｃεＲＩを用い、従って、使用したＦｃεＲＩに結合できる、検出される特定ＩｇＥおよびその他の免疫グロブリン例えばＩｇＧの全含量を測定する。このアッセイは、血清を基質−ＦｃεＲＩに添加した後および抗原を添加した後の洗浄工程などの厳密にインビトロ条件下で実施される。
【０００８】
「ＩｇＥおよびＩｇＧ抗体によるＴセル免疫応答の制御および標的化」、Ｂｈｅｅｋｈａ Ｅｓｃｕｒａら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８６：３３４−３５０（１９９５）ではａ）ＮＩＰ（５−ヨード−４−ヒドロキシル−３−ニトロフェンアセチル）に特異的なマウス／ヒトキメラモノクローナルＩｇＥをアレルゲン−ＮＩＰと共にインキュベートして複合体を形成する工程、ｂ）この複合体をＢセルとインキュベートする工程、ｃ）洗浄により過剰の複合体を除去する工程、およびｄ）得られた細胞を蛍光標識した、ＮＩＰ特異的抗体に対する抗体と共にインキュベートする工程、およびｅ）蛍光を検出する工程からなる方法について開示している。
【０００９】
本出願の優先期間の後に公開されたＷＯ９９／５１９８８は、ＦｃεＲＩ−免疫グロブリン−アレルゲンの複合体を形成し、形成した複合体を検出することからなる、ＦｃエプシロンレセプターＩ分子を用いる生物学的に活性なアレルゲン特異的免疫グロブリンの検出法について開示している。開示された好ましい実施形態では、プラスチックビーズ粒子に結合したアレルゲンと免疫グロブリン含有サンプルを接触させて基質結合免疫グロブリンアレルゲン複合体を形成させ、該複合体をＦｃεＲＩと接触させる。
【００１０】
発明の要旨
本発明で取扱う技術的問題は、ただサンプル中のＩｇＥの存在を測定するというよりむしろ、ＩｇＥがそのレセプターに結合することによりそのエフェクター機能を呈する能力を反映するＩｇＥ測定を提供できる、よりインビボに近い条件下で実施できる、種々反応物質間での結合反応が可能になるところの、液体サンプル中の特異的ＩｇＥ抗体を検出および／または定量する方法を提供することである。
【００１１】
本発明の方法は；
（ａ）（ｉ）サンプルを（ｉｉ）抗原、抗体またはハプテンの形態の遊離リガンドと接触させ、ＩｇＥ−含有複合体を含んでなる混合物Ｉを形成する工程；
（ｂ）混合物Ｉを（ｉｉｉ）ＩｇＥレセプターに結合するキャリヤと混合してキャリヤ結合ＩｇＥ含有複合体を含んでなる混合物ＩＩを形成する工程、該ＩｇＥレセプターはＣＤ２３（ＦｃεＲＩＩ）および／またはＦｃεＲＩである；
（ｃ）混合物ＩＩからキャリヤ結合ＩｇＥ含有複合体を分離する工程；並びに
（ｄ）形成したキャリヤ結合ＩｇＥ含有複合体の量を測定する工程；
からなることを特徴とする。
【００１２】
低親和性ＩｇＥレセプターＣＤ２３（ＦｃεＲＩＩ）は好酸球、活性化ＢおよびＴセル並びに樹状細胞の表面に見出される。ＣＤ２３は多機能レセプターであり、ＩｇＥ媒介抗原提示において重要な役割を果たすことが示されている。ＣＤ２３は、最初、ＩｇＥおよび抗原／アレルゲンの両方を含有する多成分複合体の形態で存在するＩｇＥに結合すると考えられている（１、２）。しかしながら、単量体の形態のＮＩＰ特異的モノクローナルＩｇＥがＣＤ２３に結合できるということが報告されている（３）。しかしながら、精製されたモノクローナルＩｇＥ抗体の凝集が生じることは無視できない。ＣＤ２３はα鎖からなり、単量体、二量体または三量体として存在できる。
【００１３】
高親和性ＩｇＥレセプターＦｃεＲＩは、肥満細胞および好塩基球の表面に、並びにランゲルハンス細胞、単球および樹状細胞にも、見出される。ＦｃεＲＩもまたＩｇＥ媒介抗原／アレルゲン提示において重要な役割を果たすことが示されている（４）。ＩｇＥは、単量体ＩｇＥの形態でＦｃεＲＩに、ＩｇＥ−抗原／アレルゲンに、並びにＩｇＥおよび抗原／アレルゲンの両方を含有する多成分複合体に結合できる。肥満細胞および好塩基球のＦｃεＲＩはα鎖、β鎖およびγ鎖からなり、ランゲルハンス細胞、単球および樹状細胞のＦｃεＲＩはα鎖およびγ鎖からなる。
【００１４】
本発明は、ＣＤ２３への結合の前または少なくとも同時にＩｇＥ含有サンプルを抗原／アレルゲンと反応させるならば、抗体検出アッセイにおいてＣＤ２３を使用できるという認識に基づいている。
【００１５】
本発明はさらに、一般に第１工程でＩｇＥ含有液体サンプルを溶解した状態の抗原／アレルゲンと反応させ、反応を完了して得られた混合物をキャリヤ−ＩｇＥレセプターと接触させるアッセイ過程は、インビボで同一の反応が生じる条件によく似ているという認識に基づいている。
【００１６】
とりわけ本発明のアッセイは、ＩｇＥおよび抗原／アレルゲン含有多成分複合体の形成中に、並びにＩｇＥ−抗原／アレルゲンの形成中に生じるかもしれない、サンプル中に存在するその他の免疫グロブリンおよびいずれかのその他の干渉する可能性を有する成分からの干渉をまねしている。また、一方はキャリヤ−ＩｇＥレセプターと、および単量体ＩｇＥ、ＩｇＥ−抗原／アレルゲン、およびＩｇＥおよび抗原／アレルゲンを含有する多成分複合体との間の結合において、得られた混合物のその他の成分からの干渉もまた生じる可能性がある。
【００１７】
このように、本発明のアッセイによりインビボ条件下でＣＤ２３および／またはＦｃεＲＩレセプターに結合でき、それによりその生物学的機能を呈する特定ＩｇＥのレベル、以下ではＩｇＥの適切インビボレベルという、を測定することが可能になる。本発明は、サンプルを採取した対象の免疫学的状態を決定するのは、ＩｇＥの全レベルよりむしろ存在するＩｇＥのＩｇＥレセプターへの結合能力であるので、ＩｇＥの適切インビボレベルのかかる測定は該対象についての貴重な情報を有しているという認識により達成されている。このように本発明のアッセイは先行技術のアッセイよりもより正確に対象の免疫学的状態を決定できる可能性を提供している。
【００１８】
とりわけ、本発明のアッセイは特異的アレルギーワクチン接種（ＳＡＶ）処置を受けている対象の免疫学的状態のモニター観察および評価に関して価値がある。このように、ＳＡＶ処置は、ＩｇＥのＩｇＥレセプターに対する結合を阻害するかまたは低減させ、従って、ＩｇＥの適切インビボレベルおよび全ＩｇＥレベルが有意に異なるかぎりにおいて、ＩｇＥの適切インビボレベルは全ＩｇＥレベルよりもアレルギー性疾患の重篤度のより正確な判断基準を与えることが示された。例えば、本発明の方法によりＳＡＶ処置前および後に決定されるインビボＩｇＥレベルは第４因子により異なるが、それに比較して慣用的なＩｇＥアッセイにより測定されるＩｇＥレベルはＳＡＶ処置前および後で変化しない。
【００１９】
本発明はさらに、アレルギー性および非アレルギー性の両方の対象を含む対象、とりわけヒト、の免疫学的状態をモニター観察および評価するための請求項１ないし１３のいずれかの方法の使用に関する。
【００２０】
とりわけ本発明は特異的アレルギーワクチン接種（ＳＡＶ）処置を受けている対象とりわけヒトの免疫学的状態をモニター観察および評価するための請求項１ないし１３のいずれかの方法の使用に関する。
【００２１】
発明の詳細な説明
本発明の実施形態ではリガンドは標識されている。
【００２２】
「標識されたリガンド」なる表現は標識された原子または部分例えば放射性原子標識を含んでなるいずれものリガンドを意味する。
【００２３】
本発明の別の実施形態では、工程ａ）で用いるリガンドは（ｉｖ）標識化合物に結合している。本発明の別の実施形態では、工程ａ）において（ｉ）サンプルおよび（ｉｉ）リガンドに加えて（ｉｖ）標識化合物を加える。また、（ｉｖ）標識化合物を工程ａ）で形成したＩｇＥ含有複合体に加えてもよい。
【００２４】
本発明の好ましい実施形態では、（ｉｖ）標識化合物を工程（ｂ）で形成したキャリヤ結合ＩｇＥ含有複合体に加える。
【００２５】
本発明のとりわけ好ましい実施形態では、（ｉｖ）標識化合物を分離工程（ｃ）から得られたキャリヤ結合ＩｇＥ含有複合体に加え、混合物ＩＩ’を形成し、この場合得られた標識およびキャリヤ結合ＩｇＥ含有複合体を混合物ＩＩ’から分離し、工程（ｄ）の前に洗浄する。
【００２６】
「標識化合物」なる表現は、ルミネセンス標識、化学ルミネセンス標識、酵素標識、放射性標識、蛍光標識および吸収標識からなるイムノアッセイで慣用的に用いられるいずれかの適当な標識系を意味する。
【００２７】
本発明の好ましい実施形態では、（ｉｖ）標識化合物はアビジン、ストレプトアビジンまたはその機能的誘導体に共有結合した化学ルミネセンス化合物である。
【００２８】
化学ルミネセンス標識はアクリジニウム化合物、例えばＮ−ヒドロキシサクシンイミド・ジメチルアクリジニウムエステル（ＮＨＳ−ＤＭＡＥ）であるのが好ましい。Ｗｅｅｋｓら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍ．２９：１４７４−１４７９（１９８３）の方法によりアビジン／ストレプトアビジンおよびＤＭＡＥを結合できる。本発明の使用に適した化学ルミネセンス化合物のその他の例としてはルミノール、ルシゲニンおよびロフィンなどがある。
【００２９】
本発明の別の好ましい実施形態では、（ｉｖ）標識化合物はアビジン、ストレプトアビジンまたはその機能的誘導体に共有結合した蛍光標識である。蛍光標識の好ましい例としてはフィゴエリスリン（ＰＥ）がある。
【００３０】
用いる標識の型に依存して、標識化合物をリガンドに直接結合できるか、またはビオチンによりリガンドに結合できる。本発明の好ましい実施形態ではリガンドをビオチンまたはその機能的誘導体に結合する。好ましくはビオチンは工程（ａ）で加えたリガンドに結合する。
【００３１】
標識化合物は、また、検出されるＩｇＥに対する抗体により、検出されるＩｇＥと結合できる。これでは、ＩｇＥに対するこの抗体は、ＩｇＥのＩｇＥレセプターに対する結合を妨害しないように、ＩｇＥに結合される。標識化合物の組合わせおよび検出抗体を工程（ｂ）または（ｃ）において形成されるキャリヤ結合ＩｇＥ含有複合体に加えるのが好ましい。別法として、標識化合物の組合わせおよび検出抗体を工程（ａ）においてサンプルおよびリガンドの前かまたは同時に加えるかまたは工程（ａ）において形成されたＩｇＥ含有複合体に加える。
【００３２】
検出抗体はポリクローナル抗体であるのが好ましい。
【００３３】
標識化合物に結合した検出抗体からなる検出系を使用することは、同一の系を検出されるＩｇＥから独立して用いることができるという利点を有する。また、未標識リガンドを使用できる検出系を用いることは、インビボ条件を最もよく擬似しているので有利であると考えられる。
【００３４】
用いる標識系の型に依存して、標識化合物を検出抗体に直接結合できるかまたはビオチンにより検出抗体に結合できる。本発明の好ましい実施形態では、検出抗体をビオチンまたはその機能的誘導体に結合する。ビオチンを工程（ｃ）の後に加えた検出抗体に結合するのが好ましい。
【００３５】
好ましくはＩｇＥ含有サンプルをリガンドと接触させてインキュベートし、混合物Ｉを形成させた（工程（ａ））後、混合物Ｉをキャリヤ／ＩｇＥレセプターと接触させる（工程（ｂ））。サンプルおよびリガンドのインキュベーション時間は１ないし１２０、好ましくは５ないし６０、より好ましくは１０ないし４０分間である。
【００３６】
この工程は、ＩｇＥレセプターと接触する前にリガンドおよびＩｇＥの複合体を形成させるので、および、ＣＤ２３が該複合体の形態のＩｇＥに結合するので、この工程が最もよくインビボ条件に、似ていると考えられる。
【００３７】
別法として、工程（ａ）および（ｂ）を１回の操作で同時に実施する、すなわちＩｇＥ含有サンプル、リガンドおよびキャリヤ−ＩｇＥレセプターを混合し、一緒にインキュベートする。この場合、インキュベーション時間は１ないし１２０、好ましくは５ないし６０、より好ましくは１０ないし３０分間である。
【００３８】
キャリヤは免疫学的アッセイにおいて共通に用いられるいずれかの固体物質、例えば生物学的細胞、例えばＢセル；例えばガラス、金属すなわち鉄または重合体からなる粒子状物質；常磁性粒子；および重合体からなるプレート、ウェル、皿またはチューブでよい。
【００３９】
キャリヤは好ましくは粒子、最も好ましくは常磁性粒子である。「常磁性粒子」なる用語は液体培地に分散または懸濁できるいずれかの常磁性粒子、例えばアドバンスト・マグネチックス・インコーポレーティッド（米国）により販売されている「バイオマグ」粒子（アミン末端基で被覆された酸化鉄粒子）、ダイナル・エイ・エス（ノルウェイ）により販売されている「ダイナビーズ」（重合体で覆われた酸化鉄）を意味する。
【００４０】
粒子状物質をキャリヤとして用いる場合、液体相からの固体相複合体の分離は用いる固体粒子の型に依存して、すなわち磁性分離、濾過、沈殿、遠心、クロマトグラフィー、カラムクロマトグラフィーにより実施できる。
【００４１】
本発明の好ましい実施形態では、第１の測定値を得るためにＣＤ２３単独、および第２の測定値を得るためにＦｃεＲＩ単独、の両方を用いて検出されるＩｇＥを定量する。
【００４２】
Ｂセルによる低抗原濃度でのＣＤ２３媒介抗原提示は、ＣＤ４＋Ｔセルの活性化を促進し、後期相アレルギー性応答、すなわち暴露の約６から２４時間の間に現れる応答、において重要な役割果たす。ＩｇＥの架橋結合後の、肥満細胞および好塩基球のＦｃεＲＩ引き金は、即時型アレルギー応答を誘起する。このように、ＣＤ２３およびＦｃεＲＩの生物学的機能は異なり、それ故にＩｇＥレセプターとしてＣＤ２３およびＦｃεＲＩを用いる本発明のアッセイで得られる結果は各々、ＩｇＥ含有サンプルの源である対象の免疫学的状態に関して異なる情報を有している。従って、対象の免疫学的状態をモニター観察および評価するためのより完全な基礎を提供するために、ＣＤ２３およびＦｃεＲＩの両方に関する結果を得るのが有利である。
【００４３】
本発明の別の好ましい実施形態では、ＣＤ２３およびＦｃεＲＩの組合わせを用いる。用いるキャリヤが粒子状物質である場合、ＣＤ２３およびＦｃεＲＩを別個の粒子にまたは同一の粒子に結合できる。
【００４４】
本発明の方法はサンプル中の予期されるＩｇＥレベルに比較して過剰のリガンドを用いて実施できる。多量の過剰リガンド、例えばＩｇＥに対するリガンドの比率が１００００まで、を用いることができる。
【００４５】
本発明の好ましい実施形態では、リガンド分子数は検出されるＩｇＥ分子数の１００％から１０．０００％の間、好ましくは１００％から１０００％の間、より好ましくは１００％から２００％の間、より好ましくは１００％から１５０％の間、および最も好ましくは１００％から１２０％の間である。
【００４６】
前記から明らかなように、リガンドおよびＩｇＥを対応する規模の量でまたはリガンドを少し過剰にして混合するのが好ましい。これは複合体形成に都合のよいインビボ条件に対応すると考えられるので好ましい。
【００４７】
ＩｇＥに対するリガンドの好ましい比率は、多くの因子、例えばキャリヤの型、検出されるＩｇＥの特性、並びに検出されるＩｇＥに対応するＩｇＥレセプターおよびリガンドの特性、に依存し、従って実施される特定の的アッセイに関して最適化されるべきである。しかしながら、ＩｇＥの適切インビボレベルの測定に関して前記の範囲内の比率で最もよい結果が得られるので、一般にかかる比率であるのが好ましい。これは、前記のＣＤ２３媒介抗原提示が低い抗原濃度で抗原提示を増強するメカニズムであることにより説明されると考えられる。高い抗原濃度では、ＣＤ２３による特異的捕捉がなくとも、抗原提示細胞により十分な抗原が提示されるので、該メカニズムが不適切になる。換言すれば、リガンドおよびＩｇＥの複合体は、ＣＤ２３およびＦｃεＲＩの両方に結合し、前記したＩｇＥに対するリガンドの比率で平衡がＣＤ２３に対する結合の方向にシフトすると考えられる。
【００４８】
好ましくは、本発明の方法は０℃ないし１００℃、より好ましくは０℃ないし４０℃、および最も好ましくは２０℃ないし３８℃の温度で実施される。
【００４９】
キャリヤとして生物学的細胞を用いる場合、そして標識化合物に結合した検出抗体からなる検出系を用いる場合、細胞の外表面上の、ＩｇＥレセプターに結合したＩｇＥおよびアレルゲンの複合体が、標識される前に細胞内部へ内向する（これは測定の不正確性を招く）のを避けるために、相対的に低い温度、０℃ないし１０℃、より好ましくは０℃ないし６℃でアッセイを実施するのが好ましい。
【００５０】
本発明はとりわけ：
（ａ）（ｉ）サンプルを（ｉｉ）抗原、抗体またはハプテンの形態の遊離リガンドと接触させて、ＩｇＥ含有複合体を含んでなる混合物Ｉを形成する工程、ここでリガンドはビオチンまたはその機能的誘導体に結合している；
（ｂ）混合物Ｉを（ｉｉｉ）ＩｇＥレセプターが結合しているキャリヤと混合して、キャリヤ結合ＩｇＥ含有複合体を含んでなる混合物ＩＩを形成する工程、該ＩｇＥレセプターはＣＤ２３（ＦｃεＲＩＩ）および／またはＦｃεＲＩである；
（ｂ’）混合物ＩＩからキャリヤ結合ＩｇＥ含有複合体を分離し、該複合体を洗浄する工程；
（ｂ’’）洗浄したキャリヤ結合ＩｇＥ含有複合体にアビジン、ストレプトアビジンまたはその機能的誘導体に共有結合した（ｉｖ）化学ルミネセンス化合物の溶液を加え、混合物ＩＩ’を形成する工程；
（ｃ）混合物ＩＩ’からキャリヤ結合ＩｇＥ含有複合体を分離し、該複合体を洗浄する工程；
（ｄ）得られたＩｇＥ含有複合体において化学ルミネセンス反応を開始し、あるとすれば、得られた化学ルミネセンスを検出／測定する工程；
からなる液体サンプル中の特定ＩｇＥ抗体を検出および／または定量する方法に関する。
【００５１】
定義
本発明において「特定ＩｇＥ抗体」なる表現は、ＩｇＥレセプターＣＤ２３および／またはＦｃεＲＩに親和性を有するＩｇＥアイソタイプのいずれかの特定免疫グロブリンおよびいずれかのその他の免疫グロブリンを意味する。
【００５２】
「生物学的サンプル」なる用語は、生物学的有機体内で排出、分泌または輸送されるいずれかの生物学的流体、例えば血液、血漿、血清、尿、唾液およびいずれかのその他の流体を意味する。
【００５３】
「抗原、抗体、またはハプテンの形態のリガンド」なる表現はいずれかの免疫学的に活性な物質であり得る。「抗原」はアレルゲン例えば樹木、草、雑草等の花粉、カビアレルゲン、ダニ（コナダニ）および動物例えばネコ、イヌ、ウマ、ウシおよびトリからのアレルゲン、有刺昆虫のアレルゲンおよび昆虫の吸入アレルゲン、および食物アレルゲンなどであり得；「抗体」は組換えおよびフラグメント化抗体などのモノクローナルまたはポリクローナル抗体であり得；並びに「ハプテン」はその炭水化物部分またはフラグメント、酵素インヒビターまたは薬物例えばペニシリンまたはその誘導体であり得る。
【００５４】
本発明に関して「ＩｇＥレセプター」なる用語は、ＣＤ２３（ＦｃεＲＩＩ）および／またはＦｃεＲＩを意味する。「ＣＤ２３」なる用語は、純粋な形態のまたは混合物、溶液もしくは抽出物中のＣＤ２３；合成または組換えＣＤ２３；天然の供給源に由来するＣＤ２３；並びにＣＤ２３全体およびその部分などの、いずれかのその調合物およびいずれかのその部分を意味する。ＣＤ２３のα鎖を三量体、二量体または単量体として用いることができ、α鎖またはその可溶性部分のみ、すなわち細胞膜の外表面から伸びている部分またはα鎖の可溶性部分の切片をＣＤ２３として用いることができる。「ＦｃεＲＩ」は純粋な形態のまたは混合物、溶液または抽出物中のＦｃεＲＩ；合成または組換えＦｃεＲＩ；天然の供給源に由来するＦｃεＲＩ；並びにＦｃεＲＩ全体およびその部分などのそのいずれかの、調合物およびそのいずれかの部分を意味する。とりわけ最初にＩｇＥの結合に寄与するα鎖のみ、またはその可溶性部分すなわち細胞膜の外表面から伸びている部分またはα鎖の可溶性部分の切片をＦｃεＲＩとして用いることができる。
【００５５】
「遊離の溶解したリガンド」なる表現は、妨害されずに自由にＩｇＥと複合体を形成するリガンドを意味し、この表現は溶液中のリガンドおよび溶液中の物質に結合したリガンドを含む。
【００５６】
本発明を以下の図面に関してより詳細に記載する。
【００５７】
図１ａは（ｉ）血清不含、アレルゲン不含、（ｉｉ）対照血清およびアレルゲン、並びに（ｉｉｉ）アレルギー性患者の血清およびアレルゲンを用いて本発明のアッセイにおいて測定された蛍光レベルを示す。
【００５８】
図１ｂは（ｉ）対照血清およびアレルゲン、（ｉｉ）アレルギー性患者の血清およびアレルゲン、並びに（ｉｉｉ）アレルギー性患者の血清、ＣＤ１９およびアレルゲンに対する抗体、並びに（ｉｖ）アレルギー性患者の血清、ＣＤ２３およびアレルゲンに対する抗体を用いて本発明のアッセイにおいて測定された蛍光レベルを示す。
【００５９】
図１ｃは（ｉ）血清不含、アレルゲン不含、（ｉｉ）アレルギー性患者の血清およびアレルゲン不含、（ｉｉｉ）アレルギー性患者の血清およびアレルゲン、（ｉｖ）アレルギー性患者の血清、アレルゲンおよびＩｇＧに対する抗体、並びに（ｖ）アレルギー性患者の血清、アレルゲンおよびＩｇＥに対する抗体を用いて本発明のアッセイにおいて測定された蛍光レベルを示す。
【００６０】
図２ａは（ｉ）アレルギー性患者の血清およびアレルゲン不含、（ｉｉ）アレルギー性患者の血清およびアレルゲン、（ｉｉｉ）アレルギー性患者の血清、ＳＡＶ処置したアレルギー性患者の血清およびアレルゲン、並びに（ｉｖ）ＳＡＶ処置したアレルギー性患者の血清およびアレルゲンを用いて本発明のアッセイにおいて測定された蛍光レベルを示す。
【００６１】
図２ｂは参考全ＩｇＥアッセイにおけるアレルギー性患者の血清およびＳＡＶ処置したアレルギー性患者血清のＩｇＥレベルの測定値を基にして算出した図２ａの（ｉ）ないし（ｉｖ）の設定でのＩｇＥレベルを示す。
【００６２】
図３は本発明の一つの好ましい実施形態を示す図である。
【００６３】
図４は本発明の第２の好ましい実施形態を示す図である。
【００６４】
図５は本発明の第３の好ましい実施形態を示す図である。
【００６５】
図６は（ｉ）アレルギー性患者の血清、アレルゲンおよびＣＤ２３のＩｇＥ結合部分に対する抗体（１）、（ｉｉ）アレルギー性患者の血清、アレルゲンおよびＣＤ２３のＩｇＥ結合部分に対する抗体（２）、（ｉｉｉ）アレルギー性患者の血清、アレルゲンおよびＣＤ２３の非ＩｇＥ結合部分に対する抗体、並びに（ｉｖ）アレルギー性患者の血清、アレルゲンおよびＣＤ１４に対する抗体を用いて本発明のアッセイにおいて測定された蛍光レベルを示す。
【００６６】
図７ａはアレルギー性患者の血清および漸増量の草アレルゲンを用いて本発明のアッセイにおいて測定された蛍光レベルを示す。
【００６７】
図７ｂはアレルギー性患者の血清および漸増量の精製され、組換えにより発現されたカバ主要アレルゲンを用いて本発明のアッセイにおいて測定された蛍光レベルを示す。
【００６８】
図８ａは（ｉ）カバアレルギー性患者の血清および非アレルギー性対照血清、（ｉｉ）アレルギー性患者の血清およびＳＡＶ処置したカバアレルギー性患者の血清（Ａ）、（ｉｉｉ）カバアレルギー性患者の血清およびＳＡＶ処置したカバアレルギー性患者の血清（Ｂ）、並びに（ｉｖ）カバアレルギー性患者の血清およびＳＡＶ処置した草アレルギー性患者の血清を用いて本発明のアッセイにおいて測定された蛍光レベルを示す。
【００６９】
図８ｂは漸増量の精製され、組換えにより発現されたカバ主要アレルゲン、並びに（ｉ）カバアレルギー性患者の血清および非アレルギー性対照血清、（ｉｉ）アレルギー性患者の血清およびＳＡＶ処置したカバアレルギー性患者の血清（Ａ）、（ｉｉｉ）カバアレルギー性患者の血清およびＳＡＶ処置したカバアレルギー性患者の血清（Ｂ）、並びに（ｉｖ）カバアレルギー性患者の血清およびＳＡＶ処置した草アレルギー性患者の血清を用いて本発明のアッセイにおいて測定された蛍光レベルを示す。
【００７０】
図３は原理的に本発明のアッセイの好ましい実施形態の工程を示す。第１の工程ではビオチン化アレルゲンと、およびアレルゲンに特異的なＩｇＥを含有するサンプル（図では「ＩｇＥ」で表す）とを混合し、インキュベートして多くのＩｇＥ分子および多くのアレルゲン分子を含む複合体を含有する混合物Ｉを形成する。この混合物Ｉはさらに過剰のＩｇＥおよびアレルゲンを含んでいる。第２の工程では多くのＣＤ２３分子（および／または多くのＦｃεＲＩ分子）が結合した粒子状キャリヤを加え、該複合体はＣＤ２３を介してキャリヤに結合し、混合物ＩＩを形成する。恐らく少量のＩｇＥは単量体形態でＣＤ２３に結合するであろう。第３の工程ではキャリヤ結合複合体を混合物ＩＩから分離し、１または２回洗浄して非結合反応物質を除去する。また、前記したように、本アッセイで生じる干渉はＩｇＥレセプターに対する複合体の結合の阻害の結果による可能性があるので、洗浄により、存在し得るいずれかの非結合複合体をも除去する。混合物ＩＩからの複合体の分離は例えばキャリヤとして常磁性粒子を用いた場合、磁性分離により実施できる。化学ルミネセンス標識、好ましくはストレプトアビジン・アクリジニウム・エステル試薬をキャリヤ結合複合体と共にインキュベートして複合体結合ビオチンに標識を結合させる。インキュベーションの後、キャリヤ結合標識複合体を分離し、洗浄して未反応標識分子を除去し、適当な試薬例えば水酸化ナトリウムを用いて化学ルミネセンス反応を開始し、キャリヤ結合標識複合体の化学ルミネセンスを測定する。
【００７１】
図４は原理的に本発明のアッセイの好ましい実施形態の工程を示す。第１の工程ではビオチン化アレルゲンおよびアレルゲンに特異的なＩｇＥを含有するサンプル（図では「ＩｇＥ」で表す）および多くのＣＤ２３分子（および／または多くのＦｃεＲＩ分子）が結合した粒子状キャリヤを混合し、インキュベートして多くのＩｇＥ分子および多くのアレルゲン分子を含むキャリヤ結合複合体を含有する混合物ＩＩを形成する。混合物ＩＩはさらに過剰のＩｇＥおよびアレルゲン並びに非結合複合体を含んでなる。次いでキャリヤ結合複合体を混合物ＩＩから分離し、１または２回洗浄する。
【００７２】
続いて化学ルミネセンス標識、好ましくはストレプトアビジン・アクリジニウム・エステル試薬、をキャリヤ結合複合体と共にインキュベートして、複合体結合ビオチンにこの標識を結合させる。インキュベーションの後、キャリヤ結合標識複合体を分離し、洗浄して未反応標識分子を除去し、適当な試薬例えば水酸化ナトリウムを用いて化学ルミネセンス反応を開始し、キャリヤ結合標識複合体の化学ルミネセンスを測定する。
【００７３】
図５は本発明の別の好ましい実施形態の工程を示す。第１のインキュベーション工程ではアレルゲンおよびアレルゲンに特異的なＩｇＥを含有するサンプル（図では「ＩｇＥ」で表す）を混合し、インキュベートして多くのＩｇＥ分子および多くのアレルゲン分子を含む複合体を含有する混合物Ａを形成する。混合物Ａはさらに過剰のＩｇＥおよびアレルゲンを含んでなる。第２のインキュベーション工程では多くのＣＤ２３分子（および／または多くのＦｃεＲＩ分子）が結合した粒子状キャリヤを加える。該複合体はＣＤ２３を介してキャリヤに結合して混合物Ｂを形成する。恐らく少量のＩｇＥは単量体形態でＣＤ２３に結合するであろう。続いてキャリヤ結合複合体を混合物Ｂから分離し、１または２回洗浄して非結合反応物質を除去する。また、前記するように本アッセイで生じる干渉はＩｇＥレセプターに対する複合体の結合の阻害の結果による可能性があるので、洗浄により存在し得るいずれもの非結合複合体をも除去する。混合物Ｂからの複合体の分離は、例えばキャリヤとして常磁性粒子を用いた場合、磁性分離により実施できる。第３のインキュベーション工程では、ＩｇＥに対するビオチン化抗体（検出抗体）を加えて混合物Ｃを形成する。検出抗体はポリクローナルであり、ＩｇＥの特異性にかかわらず全てのＩｇＥに結合する。得られたキャリヤ結合複合体を混合物Ｃから分離し、該複合体を洗浄する。第４のインキュベーション工程では、化学ルミネセンス標識、好ましくはストレプトアビジン・アクリジニウム・エステル試薬、をキャリヤ結合複合体と共にインキュベートして複合体結合ビオチンに標識を結合させる。インキュベーションの後、キャリヤ結合標識複合体を分離し、洗浄して未反応標識分子を除去し、適当な試薬例えば水酸化ナトリウムを用いて化学ルミネセンス反応を開始し、キャリヤ結合標識複合体の化学ルミネセンスを測定する。
【００７４】
以下では実施例に関して本発明をさらに詳細に記載する。
【００７５】
実施例
実施例において以下の略語を用いる：
ＦＩＴＣ：フルオレセイン・イソチオシアネート
ＥＢＶ：エプスタイン・バー・ウイルス
ＳＵ：標準単位
ＳＡＶ：特異的アレルギーワクチン接種
実施例１
フローサイトメトリー分析によるＥＢＶ形質転換したＢセルにより発現されたＣＤ２３に対するカバアレルゲン特異的ＩｇＥの結合の検出
ＦＩＴＣ標識ベツラ・ベルコーサ（Ｂｅｔｕｌａ ｖｅｒｒｕｃｏｓａ：Ｂｅｔ ｖ）抽出物（１μｇ／ｍｌ）を対照血清７３４（ＩｇＥ全含量を測定する参考アッセイ（マジックライト（登録商標）、アルク・アベロ、ヘルスホルム、デンマーク））では検出できないＩｇＥと共に、またはカバアレルギー性患者血清１４６４（マジックライト（登録商標）アッセイにおいてカバ特異的ＩｇＥ＞８００ＳＵ／ｍｌ）と共に最終血清濃度６０％でインキュベートした。培養培地中アレルギー性患者からのＥＢＶ形質転換したＢセルを最終濃度４ｘ１０６／ｍｌで加え、３７℃で１時間インキュベートし、続いて２回洗浄して過剰のアレルゲンを除去した。細胞を洗浄した後、Ｂセルに対するＦＩＴＳ標識Ｂｅｔ ｖ（Ｂｅｔ ｖ＊）の結合をＦＡＣＳカリビュア・フローサイトメーターを用いる蛍光測定により分析した。
【００７６】
結果を図１ａに示す。（ｉ）図１ａにおいて「培地のみ」と表する血清不含、Ｂｅｔ ｖ不含（バックグラウンド）（ｉｉ）ｓ７３４およびＢｅｔ ｖ、並びに（ｉｉｉ）ｓ１４６４およびＢｅｔ ｖについての平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。結果はＣＤ２３を発現するＢリンパ球に対するＦＩＴＣ標識カバアレルゲン抽出物の結合が直接的に表されることを表している。
【００７７】
ＣＤ２３に対する抗体および参考としてＣＤ１９に対する抗体を用いる遮断実験では、ＥＢＶ−Ｂセルをこれらの抗体と共に４℃で１時間インキュベートし、その後Ｂｅｔ ｖおよび血清の混合物に細胞を加える。図１ｂは（ｉ）ｓ７３４血清、（ｉｉ）ｓ１４６４、（ｉｉｉ）ｓ１４６４およびＣＤ１９に対する抗体、並びに（ｉｖ）ｓ１４６４およびＣＤ２３に対する抗体に関する平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。図１ｂから明らかであるように、ＢセルとＣＤ２３に対する抗体とのプレインキュベーションは、ＦＩＴＣ標識カバ抽出物のＢセルに対する結合を阻害し、一方無関係なＢセル表面抗原ＣＤ１９に対する抗体とのプレインキュベーションは、結合を阻害しない。これはＦＩＴＣ標識カバ抽出物は低親和性ＩｇＥレセプターであるＣＤ２３と結合することを表している。
【００７８】
さらなる実験では、ポリクローナル抗ＩｇＧまたは抗ＩｇＥ抗体をアレルギー性患者血清（ｓ１４６４）と共に３７℃で１時間プレインキュベートし、その後Ｂｅｔ ｖを添加した。図１ｃは（ｉ）バックグラウンド、（ｉｉ）ｓ１４６４およびＢｅｔ ｖ不含、（ｉｉｉ）ｓ１４６４およびＢｅｔ ｖ、（ｉｖ）ｓ１４６４、ＩｇＧおよびＢｅｔ ｖに対する抗体、（ｖ）ｓ１４６４、ＩｇＥおよびＢｅｔ ｖに対する抗体についての平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。図１ｃより明らかであるように、ＩｇＧではなくＩｇＥがＦＩＴＣ標識カバ抽出物のＢリンパ球に対する結合に寄与する。
【００７９】
結論として、図１ａないしｃで示される実験では、固体キャリヤ上でのＣＤ２３に対する標識アレルゲンの結合がＩｇＥにより媒介され、容易に検出できることが示された。
【００８０】
実施例２
ＣＤ２３へのカバアレルゲン特異的ＩｇＥの結合は、マジックライト（登録商標）アッセイにより測定された累積カバアレルゲン特異的ＩｇＥレベルが増加しても、免疫治療血清により阻害される。
【００８１】
ＦＩＴＣ標識ベツラ・ベルコーサ（Ｂｅｔｕｌａ ｖｅｒｒｕｃｏｓａ：Ｂｅｔ ｖ）抽出物（１μｇ／ｍｌ）をカバアレルギー性患者血清８９４（マジックライト（登録商標）アッセイにおけるカバ特異的ＩｇＥ ＞８００ＳＵ／ｍｌ）と共に最終血清濃度４０％で、＞４年間カバＳＡＶを受けている患者の血清（血清１４９０、マジックライト（登録商標）アッセイにおけるカバ特異的ＩｇＥ ８８ＳＵ／ｍｌ）の不在下または存在下（これも４０％）インキュベートした。培養培地中アレルギー性患者からのＥＢＶ形質転換したＢセルを最終濃度４ｘ１０６／ｍｌで加え３７℃で１時間インキュベートし、続いて２回洗浄して過剰のアレルゲンを除去した。細胞を洗浄した後、ＦＩＴＣ標識Ｂｅｔ ｖ（Ｂｅｔ ｖ＊）のＢセルへの結合をＦＡＣＳカリビュア・フローサイトメーターを用いる蛍光測定により分析した。
【００８２】
図２ａは（ｉ）ｓ８９４およびＢｅｔ ｖ不含、（ｉｉ）ｓ８９４血清およびＢｅｔ ｖ、（ｉｉｉ）ｓ８９４およびｓ１４９０の両方およびＢｅｔ ｖ、並びに（ｉｖ）ｓ１４９０およびＢｅｔ ｖに関する平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。図２ａより明らかであるように、ｓ１４９０の添加によりＩｇＥおよびＦＩＴＣ標識カバアレルゲンのＣＤ２３に対する結合がバックグラウンドレベルまで低減する。これはＦＩＴＣ標識カバアレルゲンのＣＤ２３に対するＩｇＥ媒介結合に干渉する因子の存在を示している。
【００８３】
比較のために、図２ｂは図２ａと同一の反応物設定（ｉ）ないし（ｉｖ）に関して算出されたカバアレルゲン特異的ＩｇＥの全レベルを示しており、レベルはマジックライト（登録商標）アッセイにより測定されたｓ８９４およびｓ１４９０の全ＩｇＥレベルの別個の測定値に基づいて算出される。
【００８４】
図２ａないしｂから、捕捉物質としてＣＤ２３を用いる本発明のアッセイにより、捕捉物質としてＩｇＥに対する抗体を用いる先行技術の全ＩｇＥアッセイマジックライト（登録商標）とは全く異なる結果が得られた。さらに、インビボ抗原提示はＣＤ２３により促進されるので、本発明のアッセイにより得られた結果は試験される対象の状態をよりよく表現していると考えるべきである。
【００８５】
実施例３
レセプターのＩｇＥ結合部分との相互作用により、アレルゲンおよび特異的ＩｇＥ間の複合体は、ＣＤ２３に結合し、ＩｇＥに対する抗体により検出できる。
【００８６】
ＣＤ２３に対する三つの異なるモノクローナル抗体、すなわちＣＤ２３のＩｇＥ結合部分に特異的に結合するＣＤ２３に対する二つの抗体（ベックトン・ディッキンソン、デンマークにより販売されているファルミンゲンのＭＬ２３３、およびダッコ・エイ／エス、デンマークのＭＨＭ６）およびＣＤ２３のＩｇＥ結合に関与しない領域に特異的に結合する一つの抗体（ベックトン・ディッキンソン、デンマークのＥＢＶ ＣＳ５）で遮断実験を実施した。終わりに、無関係表面分子（ＣＤ１４）に対する抗体を参考として含めた（ダッコ・エイ／エス、デンマーク）。ＥＢＶ形質転換したＢセルを各抗体１０μｇ／ｍｌと共に４℃で１時間プレインキュベートし、洗浄して非結合抗体を除去し、その後複合体と共にインキュベートした。カバ花粉アレルギー（マジックライト（登録商標）アッセイにおいてカバ特異的ＩｇＥ ＞８００ＳＵ／ｍｌ）を有する供与者からの血清ｓ１４６４を最終血清濃度８０％で１μｇ／ｍｌのＢｅｔ ｖと３７℃で１時間接触することにより複合体を生じた。複合体を抗体処置ＥＢＶセルと４℃で１時間接触させた。続いて、細胞を洗浄し、ヒトＩｇＥ（アルク・アベロのＰＵ ＰＥＤ００４８）を認識するビオチン化抗体と共にインキュベートし、続いて洗浄し、ストレプトアビジン・フィコエリスリン抱合体（サザン・バイオテクノロジー・アソシエーツ、ケボ、デンマークにより販売）とインキュベートすることにより、結合複合体を着色した。最終洗浄の後、ＩｇＥアレルゲン複合体のＥＢＶセルに対する結合を、ＦＡＣＳカリビュア・フローサイトメーターを用いる蛍光測定により分析した。
【００８７】
図６より、アレルゲンのＣＤ２３に対する結合は、ＣＤ２３のＩｇＥ結合部位との相互作用により媒介され、非特異的相互作用によっては媒介されないと結論づけられる。加えて、未標識複合体の結合はＩｇＥに対する抗体により容易に検出できる。
【００８８】
実施例４
本発明により、認識されたアレルゲンとは無関係に、アレルギーを有する患者の血清の特異的ＩｇＥの検出が可能になる。
【００８９】
草花粉（フェレウム・ピー：Ｐｈｌｅｕｍ ｐ）アレルゲンに対するアレルギーを有する２人の別個の供与者からの血清（マジックライト（登録商標）アッセイにおいてフェレウム・ピー特異的ＩｇＥが、ｓ１０３４：５８２ＳＵ／ｍｌ、およびｓ１５２４：６５８ＳＵ／ｍｌ）を漸増量の草アレルゲン抽出物と接触させることにより複合体を生じた。３７℃で１時間反応を進行させた。続いて４℃で１時間、ＥＢＶ形質転換したＢセルを反応に加えた。細胞を洗浄し、結合複合体を可視化し、実施例３に記載のように分析した。図７ａは（ｉ）ｓ１０４３および（ｉｉ）ｓ１５２４に関する蛍光強度の幾何平均を示す。各サンプルを２検体ずつ試験し、その平均を算出した。
【００９０】
図７ｂではｓ１４６４（実施例３で記載）を漸増量の精製された、組換えＢｅｔ ｖ１、カバ花粉の主要アレルゲンの一つと接触させた。図７ａに記載されるように試験を行った。
【００９１】
図７ａおよびｂでは、本発明の一つの実施形態において、検出用にＩｇＥに対する同一の抗体を用いて、異なるアレルゲンに特異的であるＩｇＥを測定することが可能であることを示している。全アレルゲン抽出物、および単一の精製されたアレルゲンに特異的なＩｇＥを測定するためにアッセイを用いることができる。図７ａおよびｂは最適なシグナルを得るために個々のアレルゲンが異なる用量で必要とされることをも示している。
【００９２】
実施例５
カバ花粉アレルギーに関する特異的アレルギーワクチン接種（ＳＡＶ）を行った患者の血清によりカバアレルゲン特異的ＩｇＥのＣＤ２３への結合が阻害されるが、一方アレルギー性でない供与者または関連性のないアレルギーに関するＳＡＶを受けた患者の血清により結合は阻害されない。
【００９３】
カバ花粉アレルギー性供与体の血清、ｓ１４６４を以下の血清：（ｉ）非アレルギー性供与体の血清ｓ７４５（０ＳＵ／ｍｌ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）カバ花粉に関するＳＡＶを受けた供与体（ｓ１４９０およびｓ１５９８；マジックライト（登録商標）アッセイにおいてカバ特異的ＩｇＥが各々８８および５７ＳＵ／ｍｌ）、並びに（ｉｖ）草アレルギーを有する供与体（ｓ８０８９５４；マジックライト（登録商標）アッセイにおいて草特異的ＩｇＥが１３７ＳＵ／ｍｌ、カバ特異的ＩｇＥが４ＳＵ／ｍｌ）と混合した（１：１）。カバ花粉アレルゲンの抽出物（Ｂｅｔ ｖ、図８ａ）またはカバ花粉の精製された組換えアレルゲン（Ｂｅｔ ｖ１、図８ｂ）のいずれかと共に、最終濃度が各血清の４０％でインキュベートした後、ＥＢＶ形質転換したＢセルを４℃で１時間加え、細胞を洗浄し、結合した複合体を前記のように検出した。
【００９４】
図８ａおよびｂは蛍光強度の幾何平均として結果を表している。各サンプル（ｉないしｉｖ）におけるＩｇＥの全レベル（マジックライト（登録商標）アッセイで測定）を捕捉物質としてＣＤ２３を用いて得られたシグナルと比較することにより、本発明のアッセイが異なる「型」の複合体形成、ＣＤ２３結合ＩｇＥを測定すると結論づけることができる。前記で説明したように、この「型」のＩｇＥのレベルは慣用的な手段により測定されたＩｇＥレベルよりも試験される対象の状態をよりよく反映していると考えられる。
【００９５】
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【図面の簡単な説明】
【図１ａ】 図１ａは（ｉ）血清不含、アレルゲン不含、（ｉｉ）対照血清およびアレルゲン、並びに（ｉｉｉ）アレルギー性患者の血清およびアレルゲンを用いて本発明のアッセイにおいて測定された蛍光レベルを示す。
【図１ｂ】 図１ｂは（ｉ）対照血清およびアレルゲン、（ｉｉ）アレルギー性患者の血清およびアレルゲン、並びに（ｉｉｉ）アレルギー性患者の血清、ＣＤ１９およびアレルゲンに対する抗体、並びに（ｉｖ）アレルギー性患者の血清、ＣＤ２３およびアレルゲンに対する抗体を用いて本発明のアッセイにおいて測定された蛍光レベルを示す。
【図１ｃ】 図１ｃは（ｉ）血清不含、アレルゲン不含、（ｉｉ）アレルギー性患者の血清およびアレルゲン不含、（ｉｉｉ）アレルギー性患者の血清およびアレルゲン、（ｉｖ）アレルギー性患者の血清、アレルゲンおよびＩｇＧに対する抗体、並びに（ｖ）アレルギー性患者の血清、アレルゲンおよびＩｇＥに対する抗体を用いて本発明のアッセイにおいて測定された蛍光レベルを示す。
【図２ａ】 図２ａは（ｉ）アレルギー性患者の血清およびアレルゲン不含、（ｉｉ）アレルギー性患者の血清およびアレルゲン、（ｉｉｉ）アレルギー性患者の血清、ＳＡＶ処置したアレルギー性患者の血清およびアレルゲン、並びに（ｉｖ）ＳＡＶ処置したアレルギー性患者の血清およびアレルゲンを用いて本発明のアッセイにおいて測定された蛍光レベルを示す。
【図２ｂ】 図２ｂは参考全ＩｇＥアッセイにおけるアレルギー性患者の血清およびＳＡＶ処置したアレルギー性患者血清のＩｇＥレベルの測定値を基にして算出した図２ａの（ｉ）ないし（ｉｖ）の設定でのＩｇＥレベルを示す。
【図３】 図３は本発明の一つの好ましい実施形態を示す図である。
【図４】 図４は本発明の第２の好ましい実施形態を示す図である。
【図５】 図５は本発明の第３の好ましい実施形態を示す図である。
【図６】 図６は（ｉ）アレルギー性患者の血清、アレルゲンおよびＣＤ２３のＩｇＥ結合部分に対する抗体（１）、（ｉｉ）アレルギー性患者の血清、アレルゲンおよびＣＤ２３のＩｇＥ結合部分に対する抗体（２）、（ｉｉｉ）アレルギー性患者の血清、アレルゲンおよびＣＤ２３の非ＩｇＥ結合部分に対する抗体、並びに（ｉｖ）アレルギー性患者の血清、アレルゲンおよびＣＤ１４に対する抗体を用いて本発明のアッセイにおいて測定された蛍光レベルを示す。
【図７ａ】 図７ａはアレルギー性患者の血清および漸増量の草アレルゲンを用いて本発明のアッセイにおいて測定された蛍光レベルを示す。
【図７ｂ】 図７ｂはアレルギー性患者の血清および漸増量の精製され、組換えにより発現されたカバ主要アレルゲンを用いて本発明のアッセイにおいて測定された蛍光レベルを示す。
【図８ａ】 図８ａは（ｉ）カバアレルギー性患者の血清および非アレルギー性対照血清、（ｉｉ）アレルギー性患者の血清およびＳＡＶ処置したカバアレルギー性患者の血清（Ａ）、（ｉｉｉ）カバアレルギー性患者の血清およびＳＡＶ処置したカバアレルギー性患者の血清（Ｂ）、並びに（ｉｖ）カバアレルギー性患者の血清およびＳＡＶ処置した草アレルギー性患者の血清を用いて本発明のアッセイにおいて測定された蛍光レベルを示す。
【図８ｂ】 図８ｂは漸増量の精製され、組換えにより発現されたカバ主要アレルゲン、並びに（ｉ）カバアレルギー性患者の血清および非アレルギー性対照血清、（ｉｉ）アレルギー性患者の血清およびＳＡＶ処置したカバアレルギー性患者の血清（Ａ）、（ｉｉｉ）カバアレルギー性患者の血清およびＳＡＶ処置したカバアレルギー性患者の血清（Ｂ）、並びに（ｉｖ）カバアレルギー性患者の血清およびＳＡＶ処置した草アレルギー性患者の血清を用いて本発明のアッセイにおいて測定された蛍光レベルを示す。
Claims (22)
- （ａ）（ｉ）サンプルを（ｉｉ）抗原、抗体またはハプテンの形態の遊離の溶解したリガンドと接触させ、ＩｇＥ含有複合体を含んでなる混合物Ｉを形成する工程；
（ｂ）混合物Ｉを（ｉｉｉ）ＩｇＥレセプターに結合したキャリヤと混合し、キャリヤ結合ＩｇＥ含有複合体を含んでなる混合物ＩＩを形成する工程、該ＩｇＥレセプターはＣＤ２３（ＦｃεＲＩＩ）および／またはＦｃεＲＩである；
（ｃ）混合物ＩＩからキャリヤ結合ＩｇＥ含有複合体を分離する工程；および
（ｄ）形成したキャリヤ結合ＩｇＥ含有複合体の量を測定する工程；
を含む、生物学的サンプル中の抗原、抗体またはハプテンの形態のリガンドに特異的なＩｇＥ抗体を検出および／または定量する方法。 - リガンドが標識されている請求項１に記載の方法。
- 工程ａ）で用いるリガンドが（ｉｖ）標識化合物に結合している請求項１に記載の方法。
- 工程ａ）で（ｉ）サンプルおよび（ｉｉ）リガンドに加えて（ｉｖ）標識化合物を加える請求項１に記載の方法。
- 工程（ｂ）で形成したキャリヤ結合ＩｇＥ含有複合体に標識化合物を加える請求項１に記載の方法。
- 分離工程（ｃ）から得られたキャリヤ結合ＩｇＥ含有複合体に（ｉｖ）標識化合物を加え、混合物ＩＩ’を形成する請求項１に記載の方法。
- 工程（ｄ）の前に，標識されたキャリヤ結合ＩｇＥ含有複合体を混合物ＩＩ’から分離し、洗浄する請求項６に記載の方法。
- （ｉｖ）標識化合物がアビジン、ストレプトアビジンまたはその機能的誘導体に共有結合している化学ルミネセンス化合物である請求項３ないし７のいずれか一項に記載の方法。
- 化学ルミネセンス化合物がアクリジニウム化合物である請求項８に記載の方法。
- リガンドがビオチンまたはその機能的誘導体に結合している請求項１ないし９のいずれか一項に記載の方法。
- ＩｇＥ含有サンプルをリガンドと接触させ、インキュベートして混合物Ｉを形成した（工程（ａ））後、混合物Ｉをキャリヤ／ＩｇＥレセプター（工程（ｂ））と接触させる請求項１ないし１０のいずれか一項に記載の方法。
- 工程（ａ）および（ｂ）を１回の操作で同時に実施する請求項１ないし１０のいずれか一項に記載の方法。
- キャリヤが粒子状物質である請求項１ないし１２のいずれか一項に記載の方法。
- キャリヤが常磁性粒子状物質である請求項１３に記載の方法。
- 第１の測定値を得るためにＣＤ２３単独、および第２の測定値を得るためにＦｃεＲＩ単独の両方を用いて、検出されるＩｇＥを定量する請求項１ないし１４のいずれか一項に記載の方法。
- リガンド分子の数が検出されるＩｇＥ分子の数の１００％から２００％の間である請求項１ないし１５のいずれか一項に記載の方法。
- 検出されるＩｇＥに対する抗体に結合した標識化合物の形態の検出系を用いることからなる請求項１に記載の方法。
- 標識化合物がビオチンを介して抗体に結合している請求項１７に記載の方法。
- 検出系に工程ｃ）で形成したキャリヤ結合複合体を加える請求項１７または１８に記載の方法。
- （ａ）（ｉ）サンプルを（ｉｉ）抗原、抗体またはハプテンの形態の遊離リガンドと接触させ、ＩｇＥ含有複合体を含んでなる混合物Ｉを形成する工程であって、ここでリガンドはビオチンまたはその機能的誘導体と結合している工程；
（ｂ）混合物Ｉを（ｉｉｉ）ＩｇＥレセプターに結合するキャリヤと混合し、キャリヤ結合ＩｇＥ含有複合体を含んでなる混合物ＩＩを形成する工程であって、該ＩｇＥレセプターはＣＤ２３（ＦｃεＲＩＩ）および／またはＦｃεＲＩである工程；
（ｂ’）混合物ＩＩからキャリヤ結合ＩｇＥ含有複合体を分離し、該複合体を洗浄する工程；
（ｂ’’）洗浄したキャリヤ結合ＩｇＥ含有複合体に（ｉｖ）アビジン、ストレプトアビジンまたはその機能的誘導体に共有結合している化学ルミネセンス化合物の溶液を加え、混合物ＩＩ’を形成する工程；
（ｃ）混合物ＩＩ’からキャリヤ結合ＩｇＥ含有複合体を分離し、該複合体を洗浄する工程；
（ｄ）得られたＩｇＥ含有複合体において化学ルミネセンス反応を開始し、あるとすれば、得られた化学ルミネセンスを検出／測定する工程；
を含む、液体サンプル中の特異的ＩｇＥ抗体を検出および／または定量する方法。 - 対象の免疫学的状態をモニター観察および評価するための請求項１ないし１７のいずれかの方法の使用。
- 特異的アレルギーワクチン接種（ＳＡＶ）処置を受けた対象の免疫学的状態をモニター観察および評価するための請求項１ないし１７のいずれかの方法の使用。
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