JPH06186231A - 免疫学的測定方法 - Google Patents

免疫学的測定方法

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JPH06186231A
JPH06186231A JP34180892A JP34180892A JPH06186231A JP H06186231 A JPH06186231 A JP H06186231A JP 34180892 A JP34180892 A JP 34180892A JP 34180892 A JP34180892 A JP 34180892A JP H06186231 A JPH06186231 A JP H06186231A
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JP
Japan
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antibody
antigen
measured
immobilized
sample
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JP34180892A
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English (en)
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Yasunobu Kaneko
恭庸 金子
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Olympus Corp
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Olympus Optical Co Ltd
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Publication date
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Abstract

(57)【要約】 【目的】本発明の第一の目的は検体の洗浄不足により生
じるフォールスネガティブをなくすことである。第二の
目的は検体中に存在する免疫グロブリン、特にIgG
性、IgA性、IgM性の抗体を見逃すことなく検出す
ることである。 【構成】本発明は、反応容器の内壁に抗原を固相し、こ
の容器に検体を数時間反応させ、洗浄後、測定すべき検
体中の抗体に対して反応する抗体および反応容器の内壁
に固相した抗原と同様の抗原を感作させた担体粒子を反
応させ、検体中に被測定物質が存在しなければ、担体粒
子が反応容器中央部に集合した像を示し、陰性。被測定
物質が存在すれば、担体粒子が反応容器全体に広がった
像を示し、陽性と判定するという免疫学的測定法を提供
する。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、免疫学的凝集反応によ
って、サンプル中に存在する抗原または抗体を測定する
ための方法に関する。
【0002】
【従来の技術】免疫学的凝集反応の測定方法として、さ
まざまな方法が見いだされている。その一つとして、特
願平1-184819号には、被測定物質が特異的に結合する抗
体または抗原を反応溶器に固定し、この容器に検体を加
え、洗浄後、被測定物質に特異的に結合する抗体または
抗原を固定化した担体粒子を反応させ、検体中に被測定
物質が存在しなければ、担体粒子が反応容器中央部に集
合した像を示し、陰性。被測定物質が存在すれば、担体
粒子が反応容器全体に広がった像を示し、陽性と判定す
る方法が報告されている。
【0003】この方法において、一つ目の課題として、
検体洗浄不足によるフォールスネガティブの出現があ
る。血清あるいは血漿が検体である場合、検体の洗浄が
不足していると、過剰の免疫グロブリンが残る。残って
いる免疫グロブリン(IgG)は、抗IgG固相化粒子
を吸収してしまうので、結果的に感度が低くなるとか、
フォールスネガティブを引き起こす原因となる。過剰の
免疫グロブリン(IgG)を洗浄の各段階で十分に除去
しなくてはならない。
【0004】例えば、American Association of blood
banks,Technical Manual 第 8版.89. には、直接、間
接抗グロブリン試験で、非結合蛋白(IgG)の十分な
洗浄が必要であり、非結合蛋白(IgG)の最終濃度は
2μg/ml以下でなくてはならないという記載がある。
【0005】実際は、洗浄を行った後すぐに次の工程、
つまり抗IgG固相化粒子を添加してしまうので、十分
な洗浄が確実に行われたかを確認する術はない。結果的
にフォールスネガティブが発生しても、それに気が付か
ないという問題を引き起こす。感染症検査等では極めて
重要な課題である。
【0006】比較的洗浄不足に対して問題が少ないと考
えられる測定方法にラジオアイソトープや酵素によって
抗原を標識して用いるものがあるが、抗体標識法に比較
し、測定感度が低下したり、プロゾーンが発生しやすい
という問題を持っている。
【0007】本発明を提供することに至ったもう一つの
理由として、次のことが挙げられる。Transfusion 199
1;31:397-400 でなく、IgA性、IgM性の抗体が存
在する場合がある。感染症抗体検査において、こういっ
たIgG性、IgA性、IgM性の抗体を見逃すことな
く、検出することは感染初期において極めて重要であ
る。
【0008】しかし、前記特願平1−184819号の
方法は、被測定物質が一種類のものであることが明確な
ときに有効である。例えば、被測定物質がIgG性の抗
体が明確なとき、抗IgG固相化粒子により測定され
る。被測定物質がIgM性の抗体の場合は、抗IgM固
相化粒子により測定され、IgA性の抗体の場合は、抗
IgA固相化粒子により測定される。この方法では、実
際の検体スクリーニングにおいて、一度にIgG性、I
gA性、IgM性等の免疫グロブリン抗体を検出するこ
とができない。一つの担体粒子に、抗IgG抗体と抗I
gM抗体、抗IgA抗体を固相化することが考えられる
が、測定対照の抗体種が増えるにしたがい、それぞれの
抗体種に対する検出感度を十分に確保することは現実的
に困難となる。
【0009】
【発明が解決しようとする課題】本発明の第一の課題は
検体の洗浄不足により生じるフォールスネガティブをな
くすことである。第二の課題は検体中に存在する免疫グ
ロブリン、特にIgG性、IgA性、IgM性の抗体を
見逃すことなく検出することである。
【0010】
【課題を解決するための手段】本発明は、測定すべき抗
体が特異的に反応する抗原を固相化した反応容器に検体
を反応させ、洗浄後、測定すべき検体中の抗体に対して
反応する抗体および反応容器に固相した抗原と同様の抗
原を固相化させた担体粒子を反応させるという免疫学的
測定方法を提供する。
【0011】また、本発明は、測定すべき抗体が特異的
に反応する抗原を固相化した担体粒子に検体を反応さ
せ、洗浄後、測定すべき検体中の抗体に対して反応する
抗体および担体粒子に固相した抗原と同様の抗原とを結
合させた標識物質を反応させるという免疫学的測定方法
を提供する。
【0012】前記、第一の課題である検体の洗浄不足に
より生じるフォールスネガティブは、血清あるいは血漿
中の過剰の免疫グロブリンにより、抗IgG抗体等固相
化粒子が吸収されることにより起こるものである。
【0013】本発明は、この吸収作用があっても、フォ
ールスネガティブが生じないように考案したものであ
る。従来、担体粒子に測定すべき検体中の抗体に対して
反応する抗体を固相化したものがあるが、本発明は、担
体粒子に測定すべき検体中の抗体に対して反応する抗体
のほかに、反応容器の内壁に固相した抗原と同様の抗原
すなわち、測定すべき抗体が特異的に反応する抗原を担
体粒子に固相化し用いるものである。
【0014】本発明は、まず反応容器の内壁に固相した
抗原と測定すべき抗体が反応する。反応すべきでない抗
体は洗浄により除かれる。洗浄後、反応容器の内壁に固
相した抗原に反応している抗体に、本発明の粒子は反応
し粒子像は陽性を示す。この際、フォールスネガティブ
の原因となる洗浄で除かれなかった抗体は、本発明の粒
子により吸収される作用も生じるが、本発明の粒子には
反応容器の内壁に固相した抗原と同様の抗原も固相され
ているので、粒子に固相されているこの抗原と反応容器
の内壁に固相した抗原に反応している抗体が反応し、結
果的に陽性を示す。
【0015】また、第2の課題である検体中に存在する
免疫グロブリン、特にIgG性、IgA性、IgM性の
抗体の検出にあたっては、従来、担体粒子に抗IgG抗
体を固相化しており、IgG性抗体しか検出できなかっ
たが、第1の課題をクリアしながら、IgG性、IgA
性、IgM性等の免疫グロブリンを一度に測定したいと
いう願望により、考案することができたものである。
【0016】本発明は先にも述べたとおり、担体粒子に
測定すべき検体中の抗体に対して反応する抗体のほか
に、反応容器の内壁に固相した抗原と同様の抗原、すな
わち、測定すべき抗体が特異的に反応する抗原を担体粒
子に固相化し用いるものである。
【0017】ここでは測定すべき検体中の抗体に対して
反応する抗体を抗IgG抗体とすると、まず、反応容器
の内壁に固相した抗原と測定すべき抗体であるが反応す
る。IgG性、IgA性、IgM性等の抗体が反応す
る。次に洗浄し、本発明の粒子を添加するわけである
が、反応容器の内壁に固相した抗原に特異的に反応して
いる抗体が、IgG抗体である場合は、粒子に固相化さ
れている抗IgG抗体と反応し、粒子像は陽性を示す。
反応容器の内壁に固相した抗原に特異的に反応している
抗体が、IgM性、IgA性抗体の場合は、粒子に固相
した抗原と反応し、粒子像は陽性を示す。IgM性、I
gA性(2量体)抗体は、抗IgG抗体に比較し、抗原
結合部位が多く存在するので、本発明の粒子に固相化し
た抗原と反応しやすい。
【0018】本発明において測定すべき物質は、例え
ば、ウイルス、細菌、その他の種々のタンパク質、アレ
ルゲン等の抗原物質に対する抗体等である。
【0019】本発明で用いる反応容器は、U底ウエル、
V底ウエル、平底ウエル等、形状にこだわらない。
【0020】本発明の反応容器内壁に固相化する物質
は、例えば、ウイルス、細菌、その他の種々のタンパク
質、アレルゲン等の抗原物質である。
【0021】本発明で用いる担体粒子としては、古典的
な方法である受身凝集反応に使用可能なものであれば、
如何なる材質、形状、寸法等の粒子でも良く、ヒト赤血
球、動物赤血球、リポソーム、ラテックス粒子、ゼラチ
ン粒子、磁性粒子等が挙げられる。磁性粒子を用いると
判定時間が短くなるという利点がある。このような担体
粒子は、適用する測定系の種類や測定対象等の反応条件
に応じて適宜選択すれば良い。
【0022】本発明の担体粒子に固相化する物質は、測
定すべき検体中の抗体に対して反応する抗体および反応
容器内壁に固相した抗原と同様の抗原である。前者の測
定すべき検体中の抗体に対して反応する抗体は、抗Ig
G、抗IgM、抗IgA、抗IgE、抗IgDが挙げら
れる。固相化する抗グロブリン抗体は何種類使用しても
良いが、生体内においてIgG性抗体が一般に多く認め
られるため、抗IgG抗体を使用することが好ましい。
後者の反応容器内壁に固相した抗原と同様の抗原は、測
定すべき抗体が特異的に反応する抗原であれば良く、好
ましくは反応容器内壁に固相した抗原と同じものであれ
ば良い。
【0023】また、測定すべき検体中の抗体に対して反
応する抗体と、反応容器内壁に固相した抗原および担体
に固相する反応容器内壁に固相した抗原と同様の抗原
は、互いに反応しないものを用いる。
【0024】本発明の担体粒子に、測定すべき検体中の
抗体に対して反応する抗体と、担体に固相する反応容器
内壁に固相した抗原と同様の抗原を固相化する順番は問
わず、同時に固相してもかまわない。また、固相方法は
従来知られている種々の技術を用いれば良い。
【0025】本発明の適用可能な測定系は、凝集法以外
にも、EIA、CLIAのような標識物質を用いるもの
が、原理的に応用可能である。例えば、測定すべき抗体
が特異的に反応する抗原を固相化した担体粒子に検体を
反応させ、洗浄後、測定すべき検体中の抗体に対して反
応する抗体および担体粒子に固相した抗原と同様の抗原
とを結合させた標識物質を反応させるというように実施
すれば良い。検体中に測定すべき抗体が存在している
時、洗浄後、除去されずに残っている抗体は、標識物質
に固相化している抗体または抗原と反応し、再び洗浄し
た後、適当な発光または発色性試薬を反応させ、発光量
または発色度を計測することにより、本発明の凝集法の
場合と同様に高感度に測定できる。
【0026】
【実施例】以下、本発明の方法を免疫学的凝集反応に適
用した場合を例に説明するが、これは本発明の請求範囲
を何等制限するものではない。 HCV抗体の検出 HCVコアペプチド抗原 1.5μg/ml固相化U底プレ
ートの各ウエルに検体として、HCVコアIgG抗体陽
性血清およびHCVコアIgM抗体陽性血清、HCV抗
体陰性血清を検体希釈液で1/2〜1/128倍に希釈
し、25μl ずつ添加し、室温、30分間、インキュベ
ーションする。
【0027】次に、洗浄液により各ウエルを6回洗浄し
た後、ウサギ抗ヒトIgG 10μg/mlおよびHCVコ
アペプチド抗原 25μg/mlを固相化した磁性ゼラチン
粒子(粒子濃度0.65%)を25μl ずつ分注する。
【0028】その直後、磁石上にプレートを室温で3分
間静置し、粒子パターンを形成させる。ウサギ抗ヒトI
gGおよびHCVコアペプチド抗原固相化磁性ゼラチン
粒子の対照として、ウサギ抗ヒトIgG 10μg/mlを
固相化した磁性ゼラチン粒子(粒子濃度0.65%)を
作成し、比較する。
【0029】以上より、ウサギ抗ヒトIgGおよびHC
Vコアペプチド抗原固相化磁性ゼラチン粒子は、HCV
コアIgG抗体陽性血清およびHCVコアIgM抗体陽
性血清で陽性を示し、HCV抗体陰性血清で陰性を示
す。ウサギ抗ヒトIgG固相化磁性ゼラチン粒子はHC
VコアIgG抗体陽性血清で陽性を示すが、HCVコア
IgM抗体陽性血清、HCV抗体陰性血清で陰性を示
す。
【0030】また、HCVコアIgG抗体陽性血清にお
いて、ウサギ抗ヒトIgGおよびHCVコアペプチド抗
原固相化磁性ゼラチン粒子の方が、ウサギ抗ヒトIgG
固相化磁性ゼラチン粒子よりも感度が高くなる。
【0031】
【発明の効果】担体粒子に測定すべき検体中の抗体に対
して反応する抗体および反応容器に固相した抗原と同様
の抗原を固相することにより、洗浄不足による低感度お
よびフォールスネガティブを改善でき、かつ高感度に被
測定物質を検出できる。
【0032】また、被測定物質が免疫グロブリンIg
G、IgM、IgA等の異なったクラスのどの抗体も検
出できるので、感染症等の早期診断にも有効に適用でき
る。

Claims (2)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】測定すべき抗体が特異的に反応する抗原を
    固相化した反応容器に検体を反応させ、洗浄後、測定す
    べき検体中の抗体に対して反応する抗体および反応容器
    に固相した抗原と同様の抗原を固相化させた担体粒子を
    反応させることを特徴とする免疫学的測定方法。
  2. 【請求項2】測定すべき抗体が特異的に反応する抗原を
    固相化した担体粒子に検体を反応させ、洗浄後、測定す
    べき検体中の抗体に対して反応する抗体および担体粒子
    に固相した抗原と同様の抗原とを結合させた標識物質を
    反応させることを特徴とする免疫学的測定方法。
JP34180892A 1992-12-22 1992-12-22 免疫学的測定方法 Withdrawn JPH06186231A (ja)

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