DE2716276C2

DE2716276C2 -

Info

Publication number: DE2716276C2
Application number: DE2716276A
Authority: DE
Inventors: David Stuart London Gb Smith
Original assignee: Technicon Instruments Corp
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1976-04-15
Filing date: 1977-04-13
Publication date: 1987-11-19
Also published as: SE442679B; SE7704244L; FR2348492B1; JPS5338619A; FR2348492A1; DE2716276A1; JPS6139623B2; NL7704126A; CA1073813A; US4150949A; GB1573212A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung eines Aminoglycosidantibiotikums in einer biologischen Flüssigkeitsprobe gemäß dem Oberbegriff des Patentanspruchs 1.

Gentamycin ist einer der wichtigsten Vertreter der Aminoglycosidantibiotika. Es besitzt die folgende Struktur:

Gentamycin C₁: R = R′ = Me Gentamycin C₂: R = Me, R′ = H Gentamycin C_1a: R = R′ = H

Gentamycinpräparate bestehen im allgemeinen aus einem Gemisch der genannten Komponenten.

Gentamycin ist höchst giftig, insbesondere im Hinblick auf die Ohren (Ototoxizität), wenn es im Kreislauf nur in zwei- bis dreifacher Menge des optimalen therapeu tischen Spiegels vorhanden ist. Außerdem variieren die Ausscheidungsgeschwindigkeiten von Gentamycin aus dem Blut von Patient zu Patient in starkem Maße. Es ist daher wesentlich, daß die klinische Behandlung mit Gentamycin in jedem Einzelfall von einer Überwachung des Gentamycin spiegels im Blut begleitet ist. Zur Zeit ist die geläufigste Bestimmung für Gentamycin eine biologische Bestimmung, bei der die Fähigkeit einer Blutprobe, das Wachstum von Bakterien zu inhibieren, abgeschätzt wird. Dieses Verfahren ist langsam, ungenau und erlaubt lediglich einen sehr niedrigen Probendurchsatz. Es ist fast sicher, daß diese Schwierig keiten zur Zeit die klinische Anwendung von Gentamycin einschränken.

In neuerer Zeit wurden radioimmunologische Bestimmungs methoden (Radioimmunoassays) für Gentamycin entwickelt und beschrieben, diese sind schneller und besitzen eine größere Genauigkeit als die biologischen Bestimmungsverfahren sowie den zusätzlichen Vorteil der Immunspezifität. Nachteilig an den Radioimmunoassays sind zunächst die üblichen Gefahren von Strahlungsunfällen, die beschränkte Lebens dauer der Markierung und das Erfordernis von Radioaktivitäts zählungseinrichtungen. Außerdem ist eine besondere Abtrennungsstufe zur Isolierung der freien oder an Antikörper gebundenen markierten Fraktion zur quantitativen Bestimmung erforderlich. Drittens ist es schwierig, Gentamycin radioaktiv zu markieren. Mit Tritium markiertes Gentamycin, das im Handel erhältlich ist, ist bekanntermaßen unsauber, und die Anwendung der Markierung mit Tritium erfordert eine aufwendige Flüssigkeitsszintillationszählmethode. Die Vorteile der Markierung mit Radiojod (beispielsweise einfache quantitative Bestimmung durch Gammastrahlungsmessung) können nur erzielt werden, wenn man entweder zunächst Gentamycin an einen geeigneten Träger koppelt und anschließend den Träger mit Radiojod markiert oder indem man Gentamycin an einen vorher mit Jod markierten Träger koppelt oder mit ihm umsetzt. Dieses sind verwickelte Verfahren, die sich oft nur schlecht reproduzieren lassen.

Aus der Literaturstelle "Immunochemistry", 10, Seiten 219 bis 227 (1973) ist die Bestimmung des Aminoglycosidantibiotikums Streptomycin mit Hilfe eines Fluoreszenzpolarisations immunoassays bekannt. Dabei werden Intensitäten in der Vertikalen und Horizontalen gemessen und daraus die Polarisation errechnet.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein meßtechnisch bequemeres immunologisches Verfahren zur Bestimmung von Gentamycin und anderen ähnlichen Aminoglycosidantibiotika zu schaffen, das die Verwendung radioaktiver Materialien vermeidet und gegenüber den oben erwähnten biologischen Bestimmungsmethoden eine Reihe von Vorteilen aufweist. Dabei wurde gefunden, daß wenn man die Aminoglycosidantibiotika mit einer fluoreszierenden Gruppe wie beispielsweise der Fluoresceingruppe markiert, die Fluoreszenz des markierten Bestandteils verringert wird, wenn das Antibiotikum mit einem bestimmten Antikörper behandelt wird. Folglich ist es möglich, den Antibiotika gehalt biologischer Flüssigkeitsproben zuverlässig und wirksam durch Bestimmung der Fluoreszenz festzustellen.

Gegenstand der Erfindung ist das in Anspruch 1 angegebene Verfahren.

Unter fluoreszenzmarkierter Verbindung ist also eine Verbindung zu verstehen, die eine fluoreszierende Gruppe enthält, deren Fluoreszenz verringert wird, wenn die Verbindung sich mit dem Antikörper verbindet. Als Antikörper kann beispielsweise ein Antiserum oder ein Immunoglobulin aus dem Antiserum verwendet werden. Auf diese Weise ist die Fluoreszenz des Gemisches geringer als die Fluoreszenz der markierten Verbindung, und zwar um den Betrag, der von der Menge des in der ursprünglichen Probe vorhandenen Aminoglycosidantibiotikums abhängt. Durch Messung der Fluoreszenz des Gemisches und Vergleichen mit beispielsweise einer Standardkurve kann, wie im einzelnen weiter unten beschrieben wird, die Menge an Aminoglycosidantibiotikum bestimmt werden.

Die fluoreszenzmarkierte Verbindung muß in der Lage sein, mit dem bei dem Verfahren verwendeten Antikörper einen Komplex zu bilden, und der Antikörper muß in der Lage sein, einen Komplex mit dem Gentamycin oder der anderen zu untersuchenden antibiotischen Verbindung zu bilden. Daraus folgt, daß die markierte Verbindung, abgesehen von dem markierten Anteil, die gleiche Struktur besitzen muß wie das Gentamycin oder das andere zu untersuchende Antibiotikum oder eine sehr ähnliche Struktur aufweisen muß, weil es sich sonst mit dem Antikörper nicht verbinden würde. Somit muß die bei dem Verfahren zur Bestimmung des Anti biotikums A verwendete markierte Verbindung entweder A selbst mit einer Fluoreszenzmarkierung sein oder eine A sehr ähnliche Verbindung sein, die ebenfalls eine Fluoreszenz markierung trägt.

Bei dem Verfahren gemäß der Erfindung kommt es nicht darauf an, einen Antikörper zu verwenden, der durch Verwendung des zu untersuchenden Antibiotikums oder ggf. der nahe verwandten Verbindung, die die Fluoreszenzmarkierung tragen soll, erzeugt worden ist. Der Antikörper kann statt dessen unter Verwendung eines anderen Materials erzeugt worden sein, jedoch ist dieses notwendigerweise in seiner Struktur dem zu untersuchenden Antibiotikum und der Markierungs verbindung sehr ähnlich, da sich sonst der Antikörper nicht mit diesen beiden Materialien verbinden würde.

Einige der Aminoglycosidantibiotika sind chemisch eng miteinander verwandt, und es wurde gefunden, daß beispielsweise Antigentamycinantiserum von Kaninchen sich nicht nur mit Gentamycin, sondern auch mit Sisomycin und Schering 20569 verbindet. Kreuzreaktionen dieser Art erschweren es, eine Probe zu bestimmen, die zwei oder mehrere derartiger Antibiotika enthält, jedoch werden in der Praxis derartige Bestimmungen nur selten erforderlich. Normalerweise enthält die biologische Flüssigkeitsprobe lediglich ein einziges Aminoglycosidantibiotikum, und in diesen Fällen ist die Möglichkeit von Kreuzreaktionen von Vorteil. So ist beispielsweise zur Bestimmung von Gentamycin, Sisomycin oder Schering 20569 nach dem erfindungsgemäßen Verfahren lediglich ein Antiserum erforderlich, wie beispielsweise das Antigentamycinantiserum von Kaninchen. Dies bedeutet nicht nur, daß in einem klinischen Laboratorium die Vorratshaltung verringert werden kann, sondern auch, daß Antibiotika oder andere Medikamente bestimmt werden können, für die es schwierig ist, spezifische Antiseren herzu stellen.

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es bevorzugt, die markierte Verbindung der zu untersuchenden Probe zuzusetzen und anschließend das Gemisch mit dem Antikörper zu versetzen. Alternativ kann der Antikörper auch zuerst mit der Probe vermischt und dem Gemisch danach die markierte Verbindung zugesetzt werden.

Die Bestimmung von Aminoglycosidantibiotika in der Probe kann nach der Messung der Fluoreszenz zweckmäßiger weise unter Verwendung einer Standardkurve durchgeführt werden. Eine Standardkurve für ein beliebiges System, d. h. ein aus Antibiotikum und fluoreszenzmarkiertem Antibiotikum oder aus einer anderen Verbindung und Antiserum bestehendes System kann beispielsweise wie folgt erhalten werden. Lösungen mit bekannter Konzentration an dem zu bestimmenden Antibiotikum werden in gemischtem Normalserum oder einem geeigneten Puffer hergestellt, Jede dieser Lösungen wird mit einer konstanten bekannten Menge eines fluoreszenzmarkierten Antibiotikums oder einer fluoreszenzmarkierten anderen Verbindung sowie mit so viel Antiserum versetzt, daß eine Lösung mit einer vorherbestimmten Verdünnung des Antiserums hergestellt wird. Die Fluoreszenzintensitäten der Lösungen werden danach gemessen und eine Standard- oder Normalkurve der Fluoreszenz intensität gegen die Konzentration an nicht markiertem Antibiotikum aufgetragen.

Eine derartige Kurve kann anschließend bei dem erfindungsgemäßen Verfahren beispielsweise wie folgt verwendet werden. Ein bekanntes Volumen der biologischen Flüssig keitsprobe, die das zu bestimmende Antibiotikum enthält und die einen Puffer enthalten kann, wird mit einer konstanten, bekannten Menge des fluoreszenzmarkierten Antibiotikums oder der anderen fluoreszenzmarkierten Verbindung, die zur Herstellung der Standardkurve verwendet wurde, versetzt. Danach wird soviel Antiserum zugesetzt, bis die Verdünnung des Antiserums erreicht ist, die bei der Bestimmung der Standardkurve angewandt wurde. Die Fluoreszenzintensität des erhaltenen Gemisches wird gemessen und mit Hilfe der Standardkurve die Menge an Antibiotikum in der biologischen Flüssigkeitsprobe bestimmt.

Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich insbesondere zur Bestimmung von Gentamycin, kann jedoch auch zur Bestimmung anderer Aminoglycosidantibiotika verwendet werden, wie beispielsweise von Streptomycin, Tobramycin, Neomycin, Kanamycin, Amikacin und dem erst kürzlich entdeckten Sisomycin und Schering 20569. Die Formeln für Sisomycin und Schering 20569 sind:

Sisomycin Schering 20569

Bei der Bestimmung von Gentamycin nach dem erfindungs gemäßen Verfahren wird als bevorzugte Fluoreszenz markierung Fluorescein verwendet, das an das Gentamycin beispielsweise dadurch gebunden werden kann, daß man Gentamycin mit Fluoresceinisothiocyanat zu Fluorescein thiocarbamylgentamycin (im folgenden FTC-G genannt) um setzt. Es können auch andere fluoreszierende Gruppen verwendet werden, wie beispielsweise die Dansyl-, Rhodamin- Fluorescamin-, Pyren- und 2-Methoxy-2,4-diphenyl-3(2H)- furanon-Gruppe. Die Eignung einer bestimmten fluoreszierenden Gruppe für ein bestimmtes System aus Antibiotikum und Antiserum kann leicht mit routinemäßigen Versuchen und Proben bestimmt werden. Die fluoreszierende Gruppe muß mit dem System als Ganzem verträglich sein, so daß sie einen verläßlichen und reproduzierbaren Fluoreszenzlöscheffekt zeigt, wenn sich der Komplex aus markiertem Antibiotikum und Antiserum gebildet hat.

In diesem Zusammenhang ist darauf hinzuweisen, daß die Fluoreszenzlöschung nicht nur von der im einzelnen als Markierung verwendeten fluoreszierenden Gruppe, sondern auch von der Art des Antibiotikums und des Antiserums abhängt. Das Antiserum muß auch im Hinblick auf seine Eignung im Gesamtsystem ausgewählt werden. Auch hier führen routine mäßige Proben und Untersuchungen zum Auffinden des geeigneten Antiserums in einem bestimmten System aus Antibiotikum und fluoreszenzmarkierten Antibiotikum. Es wurde gefunden, daß bei Markierung von Gentamycin mit Fluorescein sich Kaninchen antisera eignen, die dadurch hergestellt worden sind, daß man Gentamycin, das mit Hilfe der Carbodiimidmethode an Rinderserumalbumin gekoppelt war injizierte.

In dem besonderen Falle von Gentamycin/FTC-G/Kaninchen antiserum wird angenommen, daß die Fluoreszenzlöschung durch die Wechselwirkung zwischen der Fluoreszenzmarkierung und Gruppen des Antikörpermoleküls erfolgt.

Das erfindungsgemäße Verfahren umfaßt auch die sog. kompetitive Bindungstechnik, bei der zwischen dem markierten und unmarkierten Antigen (Antibiotikum) im Hinblick auf ihre Vereinigung mit einer beschränkten Menge Antikörper (Antiserum) Wettbewerb herrscht. Immunologische Bestimmungen mit kompetitiver Bindung sind bekannt und erfordern normaler weise die Abtrennung des gebundenen Komplexes aus Antikörper und Antigen von freiem Antigen. Diese Abtrennungsstufe, die beispielsweise bei dem Radioimmunoassay notwendig ist, ist praktisch sehr unbequem. Bei dem Verfahren gemäß der Erfindung ist jedoch ein derartiger Abtrennungsschritt nicht erforderlich, was das erfindungsgemäße Verfahren in idealer Weise für Analysen mit kontinuierlichem Durchflußbetrieb geeignet macht. Dementsprechend läßt sich das erfindungsgemäße Verfahren vorteilhaft nach dem kontinuierlichen Durchflußprinzip durchführen.

Bei der kontinuierlichen Durchflußanalyse wird das Gemisch aus Probe, Antikörper und fluoreszenz markierter Verbindung in einer Leitung geführt und die Fluoreszenz gemessen. Bevorzugt werden, wie gemäß der US-PS 27 97 149, einzelne Gemischabschnitte, die durch Abschnitte eines inerten Fluids, wie beispielsweise von Luft, sowie gewünschtenfalls von einem Waschflüssigkeitsabschnitt getrennt sind, in der Leitung entlanggeführt. Das Gemisch kann in der Leitung selbst gebildet werden, indem in die Leitung phasengleich mit den bereits in der Leitung vorhandenen Abschnitten von Kompo nentengemischen eine oder mehrere weitere Komponenten zu geführt werden, wobei das Vermischen der Komponenten in der Leitung erfolgt, während das Gemisch hindurchfließt.

Von besonderem Vorteil ist es, daß nach dem erfindungs gemäßen Verfahren Analysen der in Rede stehenden Arzneimittel nach der geschilderten kontinuierlichen Durch flußmethode verhältnismäßig einfach durchgeführt werden können, wobei dies im wesentlichen ein Ergebnis der Tatsache ist, daß keine Abtrennungsstufe erforderlich ist. Auf diese Weise kann das in der Leitung fließende Gemisch zur direkten Messung unmittelbar einer Fluoreszenzzelle zu- oder durch sie hindurchgeführt werden. Nach dem erfindungs gemäßen Verfahren ist es somit möglich, das zu untersuchende Arzneimittel im kontinuierlichen Fließbetrieb zu analysieren, was bisher unmöglich oder äußerst schwierig durchführbar gewesen ist.

Das erfindungsgemäße Verfahren besitzt u. a. die weiteren folgenden Vorteile:

1. FTC-G läßt sich in ausgezeichneter Ausbeute aus leicht zugänglichen und wohlfeilen Ausgangsprodukten leicht herstellen.
2. FTC-G besitzt eine gute Haltbarkeit.
3. Weder müssen Strahlungsunfälle befürchtet werden, noch sind Radioaktivitätszählungseinrichtungen erforderlich.
4. Bei dem Verfahren ist ein Abtrennungsschritt nicht erforderlich.
5. Die Messung erfolgt durch herkömmliche Fluorimetrie.
6. Wegen der Punkte 4. und 5. kann das Verfahren leicht automatisiert werden.
7. Die Bestimmung erfolgt sehr rasch. Lediglich wenige Minuten sind erforderlich, um zwischen Antikörper FTC-G und Gentamycin ein immunologisches Gleichgewicht zu erzielen, wonach das Ergebnis mit einer einzigen Fluoreszenzmessung erzielt wird.
8. Unter Berücksichtigung der oben erwähnten Kreuzreaktionen kann die Bestimmung für das bestimmte Antibiotikum als immunospezifisch angesehen werden.
9. Die Menge der erforderlichen Serumprobe ist sehr gering. 5 µl oder weniger genügen für eine bestimmte Analyse.

Die Erfindung wird im folgenden an Hand von Beispielen näher erläutert.

Beispiel 1 Herstellung von fluoresceinmarkiertem Gentamycin (FTC-G)

Ein mmol Gentamycin und 1,25 mmol Fluoresceiniso thiocyanat (FITC) wurden 2 h bei Raumtemperatur in einem 0,05 molaren Natriumcarbonat/Bicarbonat-Puffer vom pH 9,0 reagieren gelassen. 2 ml des Umsetzungsgemisches wurden auf eine G-15 Sephadexsäule (1 × 97 cm) gegeben und mit dem oben erwähnten Carbonat/Bicarbonat-Puffer unter einer Durchfluß geschwindigkeit von 1,8 ml/h eluiert. Säulenfraktionen (1,8 ml) wurden durch Radioimmunoassay auf Gentamycin und durch Fluorie metrie auf Fluorescein analysiert. Fig. 1 der Zeichnungen stellt das Ergebnis dar. Nicht umgesetztes Gentamycin verließ die Säule zuerst. Danach erschien das gebildete FTC-G, gut von dem Gentamycinpeak getrennt. Nicht umgesetztes FITC wurde sehr fest auf der G-15 Säule gehalten und nicht eluiert.

Das gebildete FTC-G wurde in Lösung entweder gefroren oder bei 4°C aufbewahrt. Elektrophoretische Charakterisierung ergab die Anwesenheit einer Hauptbande (wahrscheinlich mono-FTC-markiertes Gentamycin) und zwei kleinere Banden (Wahrscheinlich poly-FTC-markiertes Gentamycin).

Die unten angegebenen FTC-G-Konzentrationen sind auf den Gentamycingehalt bezogen, wie der durch Radioimmuno assay festgestellt worden ist.

Beispiel 2 Herstellung von Antigentamycinsera

Kaninchen wurden mit Gentamycin immunisiert, das mit Hilfe der Carbodiimidmethode an Rinderserumalbumin gekoppelt war.

Beispiel 3 Immunologische Bestimmung von Gentamycin durch Fluoreszenzlöschung (I) Antikörperverdünnungskurve

Um zu optimalen Bestimmungsbedingungen zu gelangen, wurden 0,5 ml Mengen einer FTC-G-Lösung in 0,1 molarem Natriumphosphatpuffer vom pH 7,5 von einer Konzentration von 16,4 ng/ml einem Antiserum in demselben Puffer bis zu sich verdoppelnden Verdünnungen (1 ml) zugesetzt. Nachdem man einige Minuten zur Bildung des Gleichgewichts stehengelassen hatte, wurde die Fluoreszenzintensität gemessen (siehe Fig. 2 der Zeichnungen). Aus dieser Kurve wurde eine Endverdünnung an Antikörper von 1/240 in 1,5 ml zur Herstellung der Standardkurve ausgewählt.

(II) Standardkurve

Gentamycin wurde in bekannten Mengen gemischtem menschlichem Normal-Serum zugesetzt. Aliquote Teile dieser Standardproben wurden auf 1/50 in 0,1 molarer Natriumphosphatpufferlösung vom pH 7,5 verdünnt. 0,5 ml der verdünnten Standardproben wurden mit 0,5 ml einer Lösung von FTC-G in demselben Puffer mit einer Konzentration von 16,4 ng/ml und anschließend mit 0,5 ml eines in derselben Pufferlösung auf 1/80 verdünnten Anti serumlösung versetzt. Nachdem man einige Minuten zur Aus bildung des Gleichgewichtes stehengelassen hatte, wurde die Fluoreszenzintensität der Bestimmungsgemische gemessen. Das Verhältnis von der Eigenfluoreszenz des vermischten normalen menschlichen Serums zur Gesamtfluoreszenzintensität der Bestimmungsgemische wurde unabhängig voneinander bestimmt, indem man 1 ml Phosphatpuffer zu 0,5 ml der verdünnten Standard proben hinzugab und die Fluoreszenz maß. Durch Subtraktion der Eigenfluoreszenzintensität des Serums von der Gesamtintensität der Bestimmungsgemische wurde die in Fig. 3 gezeigte Standardkurve ermittelt.

Beispiel 4 Bestimmung von Gentamycin in Proben aus Patientenserum

Serumproben von Patienten, die mit Gentamycin behandelt wurden, wurden nach dem Verfahren gemäß Beispiel 3, Abschnitt II bestimmt. Der Anteil der Eigenfluoreszenz jeder Serumprobe, die unabhängig festgestellt worden war, wurde von der Gesamtfluoreszenzintensität der entsprechenden Bestimmungsgemische subtrahiert und das erhaltene Ergebnis zur Bestimmung der Gentamycinmenge in der Serumprobe mit Hilfe einer geeigneten Standardkurve verwendet.

Fig. 4 zeigt die Korrelation zwischen Gentamycin spiegeln, die durch Fluoreszenzlöschungsimmunoassay bestimmt worden waren und solchen Spiegeln, die mit Hilfe eines üblichen biologischen Bestimmungsverfahrens von einem unab hängigen Laboratorium ermittelt worden waren. Die errechnete am besten passende Kurve ist dargestellt. Berücksichtigt man die bekanntermaßen auftretenden Ungenauigkeiten bei der biologischen Bestimmungstechnik, so zeigt die Kurve eine annehmbare Übereinstimmung beider Methoden, die für klinische Zwecke ausreichend ist.

Beispiel 5 Kontinuierliches Durchflußsystem zur automatischen Gentamycinbestimmung

In Fig. 5 ist eine Form eines Durchflußsystems dargestellt, das sich zur kontinuierlichen Durchflußanalyse eignet. Das System umfaßt eine Probeneinlaßleitung 1, eine Einlaßleitung 2 für FTC-G, eine Lufteinlaßleitung 3 und eine Einlaßleitung 4 für das Antiserum. Leitungen 2 und 3 treffen sich beim Abschnittsbilder 6, der mit der Abzweigung 7 verbunden ist, wo Leitungen 1 und 2 zusammentreffen. Stromabwärts von der Verbindungsstelle 7 ist Leitung 2 mit einer Mischschlange 8 versehen und führt weiter zur Verbindungs stelle 9, wo Leitung 4 einmündet. Stromabwärts von Verbindungsstelle 9 ist eine weitere Mischschlange 10 vorgesehen und schließlich ein Fluorimeter 11, das einen Abfallauslaß 12 sowie einen Auslaß 13 stromabwärts der Fluoreszenzzelle aufweist, der mit Leitung 5 verbunden ist und danach ins Freie führt. Das Fluorimeter 11 ist an das Aufzeichnungsgerät 14 angeschlossen.

Im Betrieb wird Leitung 2 mit einer gesteuerten Menge FTC-G beschickt und im Abschnittsbildner 6 durch Luft in Abschnitte aufgeteilt. Die zu bestimmende Probe (beispielsweise Serum), wird in der nötigen Verdünnung an der Einmündungs stelle 7 in den segmentierten Strom eingeführt, das Ganze in der Mischschlange 8 vermischt, wonach eine gesteuerte Menge Antiserum an der Einmündungsstelle 9 zugesetzt und das Ganze in der Mischschlange 10 vermischt wird, bevor es in das Fluorimeter 11 gelangt.

Beispiel 6 Automatisierte Gentamycinbestimmung: Standardkurve

Gentamycin wurde in bekannten Mengen gemischtem menschlichem Normal-Serum zugesetzt. Aliquote Teile dieser Standardproben wurden in 0,1 molarem Tris/HCl- Puffer vom pH 7,5 und einem Gehalt von 10 mmol Magnesium chlorid (Tris/MgCl₂-Puffer) auf 1 zu 100 verdünnt. Unter Verwendung des Strömungssystems gemäß Fig. 5 wurde auf folgende Weise eine Standardkurve hergestellt.

Die Standardproben wurden durch Eingangsleitung 1 in einer Geschwindigkeit von 0,16 ml/min gepumpt. Jede Probe wurde 1 min lang gepumpt, danach wurde wiederum 1 min Tris/ MgCl₂-Puffer als Waschflüssigkeit gepumpt, bevor die nächste Probe eingeführt wurde. Danach wurde durch Einlaßleitung 2 in einer Geschwindigkeit von 0,16 ml/min FTC-G in einer Konzentration von 8,2 mg/ml in Tris/MgCl₂-Puffer mit einem Gehalt von 0,1 Vol.-% des Detergents Triton X-100 gepumpt, während auf 1 zu 160 verdünntes Antiserum von Tris/MgCl₂- Puffer mit einem Gehalt von 0,1 Vol.-% an dem Detergents Triton X-100 mit einer Geschwindigkeit von 0,16 ml/min durch Einlaßleitung 6 gepumpt wurde. Die vermischten Ströme wurden mit einer Geschwindigkeit von 0,42 ml/min (Leitung 5) durch die Fluorimeterfließzelle geführt. Die Gesamtfluoreszenz intensität der vermischten Ströme wurde auf dem Registrier streifenanzeigegerät aufgezeichnet. Die Intensität, die während der Waschperioden registriert wurde (entsprechend der maximalen Bindung von FTC-G an das Antiserum in Abwesen heit der Probe) wurde von der während des Durchtrittes jedes Bestimmungsgemisches durch die Fluorimeterfließzelle aufgezeichneten Intensität subtrahiert. Aus diese Weise wurde der Nettoanstieg an Fluoreszenzintensität, der auf jede Probe zurückzuführen war gemessen. Nachdem die Standardproben das System passiert hatten, wurde die durch Leitungen 2 und 4 gepumpte Lösung durch Tris/MgCl₂-Puffer mit einem Gehalt an 0,1 Vol.-% des Detergents Triton X-100 ersetzt. Danach wurden die Standardproben erneut durch das System geführt. Dabei wurde die Eigenfluoreszenzintensität der Standard serumproben gemessen. Durch Subtraktion der Eigenfluoreszenz intensität des Serums von der Zunahme der Nettofluoreszenz intensität, die für jedes Bestimmungsgemisch gemessen wurde, wurde die in Fig. 6 dargestellte Standardkurve ermittelt.

Beispiel 7 Automatisierte Bestimmung von Gentamycin in Patientenserumproben

Serumproben von Patienten, die mit Gentamycin behandelt wurden, wurden gemäß der in Beispiel 6 beschriebenen Methode analysiert. Der Anteil der Eigenfluoreszenz jeder Serumprobe, unabhängig voneinander gemessen, wurde von der Zunahme der Nettofluoreszenzintensität, die für das entsprechende Bestimmungsgemisch ermittelt worden war abgezogen, und das Ergebnis wurde zur Bestimmung der Gentamycinmenge in der Serumprobe mit Hilfe einer geeigneten Standardkurve verwendet.

Fig. 7 zeigt die Korrelation zwischen den Gentamycinwerten, die durch automatisierten Fluoreszenzlöschimmunoassay bestimmt worden waren, und Werten, die von einem unabhängigen Laboratorium unter Verwendung üblicher biologischer Bestimmungs methoden ermittelt worden waren. Die berechnete Linie der besten Zuordnung ist dargestellt. Berücksichtigt man die bekanntermaßen den biologischen Methoden anhaftende Ungenauigkeit, ist die Übereinstimmung zwischen beiden Methoden annehmbar und für klinische Zwecke zufrieden stellend.

Claims

1. Verfahren zur Bestimmung eines Aminoglycosidantibiotikums in einer biologischen Flüssigkeitsprobe, wobei man ein Gemisch aus der Probe, einer fluoreszenzmarkierten Verbindung und einem Antikörper gegenüber dem zu bestimmenden Antibiotikum und der fluoreszenzmarkierten Verbindung bildet, die Fluoreszenz dieses Gemisches mißt, die gemessene Fluoreszenz mit Standard werten vergleicht und dadurch die Menge an in der Probe vorhandenem Aminoglycosidantibiotikum bestimmt, dadurch gekennzeichnet, daß man als fluoreszenzmarkierte Verbindung eine Verbindung verwendet, die eine fluoreszierende Gruppe trägt, deren Fluoreszenz reduziert wird, wenn die Verbindung sich mit dem Antikörper verbindet.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Antibiotikum Gentamycin, Sisomycin, Schering 20569, Streptomycin, Tobramycin, Neomycin, Kanamycin und Amikacin verwendet.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als fluoreszenzmarkierte Verbindung fluorescein markiertes Gentamycin verwendet.

4. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als fluoresceinmarkiertes Gentamycin Fluorescein thiocarbamylgentamycin verwendet.

5. Verfahren gemäß Anspruch 2, 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als Antikörper Antigentamycinantiserum des Kaninchens verwendet.

6. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man das Verfahren nach dem kontinuierlichen Durchfluß prinzip durchgeführt.

7. Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man Abschnitte des Gemisches, die durch Abschnitte eines inerten Fluids voneinander getrennt sind, in einer Leitung entlangströmen läßt und die Fluoreszenz der Gemisch abschnitte ohne Abtrennung eines Reaktionsproduktes von dem Gemisch mißt.