DE69826082T2 - Immunochromatographie-unterstützer Behelf - Google Patents

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Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine extrakorporale diagnostische Substanz oder eine tragbare diagnostische Vorrichtung zum Nachweis von Mikroorganismen in Wasser und von geringen Mengen von Markern in Körperflüssigkeiten. Präziser ausgedrückt, dient die vorliegende Erfindung zur Verbesserung der Nachweisfähigkeit einer Immunochromatographie-gestützten Vorrichtung, welche einfache und rasche Messungen solcher Substanzen in kleinen Klinikbetrieben ohne entsprechende analytische Ausstattung und Personal erleichtert.
  • STAND DER TECHNIK
  • Extrakorporale diagnostische Substanzen zum Nachweis geringer Mengen von Markern in Körperflüssigkeiten wie beispielsweise Urin, Schweiß und Blut haben eine anerkannte Bedeutung als wichtige Hilfsmittel bei der klinischen Diagnose und der häuslichen Betreuung. Die Immunochromatographie ist eine Basistechnik zum Nachweis von extrakorporalen diagnostischen Substanzen, wobei sich diese Technik der spezifischen Reaktion eines Antikörpers bedient. Dabei ist die typischste und am weitesten auf dem Markt verbreitete Immunochromatographie-gestützte Vorrichtung der Schwangerschaftstest.
  • Während der Schwangerschaft wird bei Frauen das humane Choriongonadotropin (HCG) aus der Plazenta abgesondert und später mit dem Urin ausgeschieden. Nach dem Einbringen der Urinprobe einer Frau, entscheidet der Schwangerschaftstest gewöhnlich innerhalb von etwa 3 Minuten, ob diese Urinprobe positiv oder negativ für eine Schwangerschaft ist und ermöglicht so eine einfache Schwangerschaftserkennung auch durch nicht entsprechend ausgebildetes Personal. Einen repräsentativen Aufbau einer solchen Immunochromatographie-gestützten Vorrichtung zeigt beispielsweise das US-Patent Nr. 5,602,040.
  • Das oben genannte US-Patent beschreibt eine Immunochromatographie-gestützte Vorrichtung zur Antigendetektion, wobei genannte Vorrichtung mindestens zwei verschiedene Antikörper umfasst, welche fähig sind, an ein Antigen als Analyt zu binden sowie einen Teststreifen bestehend aus einem porösen Träger mit zwei unterschiedlichen Bereichen, welche jeweils immobilisierte Antikörper enthalten; der erste Antikörper ist ein markierter Antikörper, der andere der beiden genannten Antikörper ist an den zweiten Bereich des genannten Trägers gebunden und durchdringt das poröse Trägermaterial mit einer oberflächenaktiven Substanz, um die dem Material eigene Hydrophobizität herunterzusetzen.
  • Nachfolgend werden Aufbau und Funktionsweise einer höchst einfachen Immunochromatographie-gestützten Vorrichtung beschrieben, wobei der Schwangerschaftstest als Beispiel herangezogen wird.
  • 1 zeigt den Aufbau eines porösen Trägers, der in einer typischen Immunochromatographie-gestützten Vorrichtung verwendet wird. Bei dem am weitesten verbreiteten porösen Träger handelt es sich um Nitrozellulosebögen, da dieses Material eine rasche Antikörperfixierung erlaubt. Wird allerdings der poröse Träger 1 ausschließlich aus diesem Material geformt, verringert sich dadurch die Flussrate einer Probe beträchtlich. Es ist daher vorteilhafter, wenn bei dem Träger nur für den messenden Bereich Nitrozellulose verwendet wird, zusammen mit einem Glasfilter, welcher der Probe erlaubt die restliche Strecke schneller zu durchlaufen. Der Probenaufnahmebereich 2, der an einem Ende des Trägers lokalisiert ist, besteht aus einem porösen Träger wie beispielsweise Glasfilter, welches naturgegeben eine Probe zwar rasch absorbiert die Probe aber nur schwach zurückhält und somit ein rasches und reibungsloses Passieren der Probe zum Bereich des eigentlichen Reaktionsablaufs ermöglicht. Falls der poröse Träger 1 in einem Hohlgehäuse angebracht werden muss, wird der Probenaufnahmebereich 2 relativ lang geformt, damit dieser teilweise aus dem Hohlgehäuse austritt, um so die direkte Einbringung einer Urinprobe im Probenaufnahmebereich 2 zu ermöglichen. Falls, alternativ dazu, der gesamte Probenaufnahmebereich in dem Hohlgehäuse angebracht werden muss, so sollte dieses Hohlgehäuse eine Öffnung besitzen durch welche eine Probe in den Probenaufnahmebereich eingebracht werden kann. Ein markierender Bereich 3 wird geformt durch Imprägnieren eines Glasfilters mit einer wässrigen Lösung eines anti-HCG-Antikörpers, der auf kolloidalem Gold oder gefärbtem Latex absorbiert ist, gefolgt von Einfrieren und Trocknen.
  • Ein messender Bereich 4 wird hergestellt durch Auftropfen einer wässrigen Lösung eines anderen Antikörpers auf einen Nitrozellulosebogen in einer willkürlichen Form, gefolgt von Trocknung und Spülen. Die sehr hohe nichtspezifische Adsorptionseigenschaft der Nitrozellulose stellt eine starke Adhäsion des Antikörpers an den Nitrozellulosebogen sicher. Nach der Antikörperfixierung kann der Nitrozellulosebogen oberflächenbehandelt werden beispielsweise mit Rinderserumalbumin (im weiteren abgekürzt als „BSA"), um eine Färbung des Hintergrundes bedingt durch nichtspezifische Adhäsionseigenschaften der Nitrozellulose während der Antigen-Antikörper-Nachweisreaktion zu vermeiden. Diese Oberflächenbehandlung wird als „Blocking" bezeichnet. Ein flüssigkeitsabsorbierender Bereich 5, der am anderen Ende des porösen Trägers lokalisiert ist, wird aus einem Material wie beispielsweise Glasfilter geformt, welches Flüssigkeit sehr gut absorbiert und über eine hohe Flüssigkeitsabsorptionsfähigkeit verfügt, um somit die rasche Aufnahme von überschüssigem Probenmaterial sicherzustellen.
  • Als Probe wird der Urin einer Frau in den Probenaufnahmebereich 2 eingebracht mit einem Volumen, welches durch die Form der Immunographie-gestützten Vorrichtung (üblicherweise 0,1 bis 2 ml) vorbestimmt ist. Die Probe passiert den messenden Bereich 4 über den markierenden Bereich 3 in Richtung zum flüssigkeitsabsorbierenden Bereich 5. Wenn die Probe um den markierenden Bereich 3 herum passiert, löst sich der markierte Antikörper, der sich im markierenden Bereich 3 befindet, im Probenwasser und wird so zusammen mit der Probe in Richtung zum messenden Bereich 4 transportiert. Folglich erreicht der markierte in Wasser gelöste Antikörper den messenden Bereich 4. Ist der Urin positiv für eine Schwangerschaft, reagiert zu diesem Zeitpunkt der markierte Antikörper mit dem fixierten Antikörper, welcher am messenden Bereich 4 gebunden vorliegt, über ein Antigen in der Urinprobe aufgrund der spezifischen Antigen-Antikörper-Bindungsreaktion, die dazu führt, dass es am messenden Bereich 4 zu einer Farbveränderung kommt. Bei einer negativen Urinprobe findet eine solche Reaktion nicht statt und der markierte Antikörper durchläuft den messenden Bereich 4, um danach im flüssigkeitsabsorbierenden Bereich absorbiert zu werden. Auf diese Weise kann das Vorhandensein oder Fehlen eines Antigens in einer wässrigen Lösung nachgewiesen werden.
  • Bei einer solchen, wie oben beschriebenen, Immunochromatographie-gestützten Vorrichtung, führt die Farbänderung, welche an einem anderen Bereich stattfindet als an dem Antikörper in der fixierten Phase im messenden Bereich (Hintergrundfärbung) und die Färbung eines Antikörpers in der fixierten Phase bei fehlendem Analyt (Leerwertfärbung) zur Verringerung des S/N-Verhältnisses während der Detektion und ist somit eine Ursache für Fehlfunktionen. Die Hintergrundfärbung entsteht durch eine hydrophobe Bindung zwischen einem visualisierten Antikörper in einer mobilen Phase und dem porösen Träger. Andererseits kommt es zur Leerwertfärbung aufgrund elektrischer Interaktionen zwischen dem negativ geladenen Antikörper in der mobilen Phase und dem positiv geladenen Antikörper in der fixierten Phase.
  • Übliche für den Nachweis verwendete Proben sind frei von Substanzen wie oberflächenaktiven Substanzen, pH-Puffern oder ähnlichen Agenzien, die eine hydrophobe Bindung und elektrische Interaktionen ausgleichen. Daher ergeben sich Nachteile bei der konventionellen Immunochromatographie-gestützten Vorrichtung dahingehend, dass sich eine nicht unwesentliche Hintergrundfärbung entwickelt und gelegentlich Leerwertfärbungen auftreten. Insbesondere treten diese Nachteile in Erscheinung, wenn der Antikörper in der mobilen Phase mit einem organischen Farbstoff visualisiert wird.
  • Solche Immunochromatographie-gestützten Vorrichtungen können in Hinsicht auf ihre Detektionsfähigkeit verbessert werden, indem die Menge oder die Konzentration des markierten Antikörpers, der auf dem markierenden Bereich transportiert werden soll, erhöht wird. Allerdings wird durch diese Methode ungünstigerweise die Zeit bis zur visuellen Bestätigung einer Hintergrundentfärbung durch ausreichende Depletion des markierten Antikörpers verlängert. Anders ausgedrückt ist eine erhöhte Nachweisfähigkeit nicht mit einer verkürzten Reaktionszeit vereinbar. Wenn das in einer Probe enthaltene Antigen im Überschuss vorliegt, muss die gesamte Antikörpermenge in der mobilen Phase an der Antigen-Antikörper-Reaktion teilnehmen. Dies führt dann zur Depletion des Antikörpers in der mobilen Phase am messenden Bereich, was eine Fehlfunktion der Vorrichtung zur Folge hat, wie beispielsweise, dass die Antigenmenge anscheinend gering ist. Deshalb ist bei der Immunochromatographie ein dynamischer Bereich, in dem die Reaktion hauptsächlich abläuft, voreingestellt. Der dynamische Bereich für die Reaktionsentwicklung liegt in Bezug auf den Schwangerschaftstest allgemein bei 50 bis 100.000 IE/l.
  • Wenn eine Immunochromatographie-gestützte Vorrichtung so konfiguriert ist, dass die Bewegung einer Probe über den markierenden Bereich in Richtung zum messenden Bereich sichergestellt ist, reagiert das HCG mit dem markierten Antikörper, bevor es zur Reaktion mit dem fixierten Antikörper kommt. Ein solcher Aufbau ist nachteilig für den Nachweis einer geringen Konzentration von Antigen als Analyt.
  • KURZDARSTELLUNG DER ERFINDUNG
  • Im Hinblick auf die oben erwähnten Nachteile dieser Vorrichtung gemäß dem Stand der Technik, ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung eine Immunochromatographie-gestützte Vorrichtung bereitzustellen, welche die genaue und rasche Detktion eines in einer flüssigen Probe enthaltenen Antigens erleichtert durch Beseitigung von Hintergrund- und Leerwertfärbung, wodurch Fehlfunktionen während der Detektion verursacht werden.
  • Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine bahnbrechende Immunochromatographie-gestützte Vorrichtung zu liefern für die gleichzeitige Umsetzung einer verbesserten Nachweisfähigkeit und geringeren Reaktionszeit und im Weiteren für das Erreichen eines erweiterten dynamischen Bereichs für die Reaktion.
  • Zur Lösung der oben erwähnten Aufgaben bietet die vorliegende Erfindung eine Immunochromatographie-gestützte Vorrichtung an umfassend einen porösen Träger, welcher einen mit einem Additiv imprägnierten Bereich besitzt und welcher zwischen dem Probenaufnahmebereich und dem messenden Bereich des porösen Trägers lokalisiert ist, wobei der Additiv-imprägnierte Bereich mindestens ein wasserlösliches Ammoniumsalz und/oder einen pH-Puffer beinhaltet, derart, dass dieses/dieser sich in einer auf dem Träger eingebrachten Probe löst, um sich so entsprechend der Probeverlaufsrichtung durch den Träger mitzubewegen.
  • Während die neuen Merkmale der Erfindung im Einzelnen in den anhängigen Ansprüchen ausgeführt sind, ergibt sich anhand der folgenden detaillierten Beschreibung in Verbindung mit den Zeichnungen ein besseres Verständnis für die Erfindung und ihren Wert sowohl bezüglich des erfindungsgemäßen Aufbaus als auch den Kontext zusammen mit weiteren Aufgaben und Merkmalen daraus.
  • KURZBESCHREIBUNG DER VERSCHIEDENEN ANSICHTEN DER ZEICHNUNGEN
  • 1 ist eine perspektivische Ansicht, die einen Teststreifen einer konventionellen immunochromatographischen Vorrichtung darstellt.
  • 2 ist eine perspektivische Ansicht, die den Aufbau eines Teststreifens zur Verwendung in einer erfindungsgemäßen Immunochromatographie-gestützten Vorrichtung darstellt.
  • 3 ist eine perspektivische Ansicht, die einen weiteren Aufbau des Teststreifens zur Verwendung in der erfindungsgemäßen Immunochromatographie-gestützten Vorrichtung darstellt.
  • 4 ist eine vertikale Ansicht des Querschnittes mit Darstellung eines Teststreifens zur Verwendung in einem Beispiel der vorliegenden Erfindung.
  • 5 ist ein Diagramm, das die Beziehung zwischen der Konzentration an HCG in einer Probe und der Absorption (Farbintensität) am messenden Bereich zeigt.
  • 6 ist ein Diagramm, das die Beziehung zwischen der Konzentration an HCG in einer Probe und der minimalen Detektionszeit darstellt.
  • 7 ist ein weiteres Diagramm, das die Beziehung zwischen der Konzentration an HCG in einer Probe und der Absorption am messenden Bereich darstellt.
  • 8 ist ein weiteres Diagramm, das die Beziehung zwischen der Konzentration an HCG in einer Probe und der minimalen Detektionszeit darstellt.
  • 9 ist noch ein weiteres Diagramm, das die Beziehung zwischen der Konzentration an HCG in einer Probe und der Absorption am messenden Bereich zeigt.
  • 10 ist noch ein weiteres Diagramm, das die Beziehung zwischen der Konzentration an HCG in einer Probe und der minimalen Detektionszeit darstellt.
  • 11 ist ein weiteres Diagramm, das die Beziehung zwischen der Konzentration an HCG in einer Probe und der Absorption am messenden Bereich darstellt, erhalten durch Variation von pH-Werten einer Probelösung auf dem Teststreifen.
  • 12 ist eine vertikale Ansicht eines Querschnittes, die einen Teststreifen zur Verwendung in einem anderen Beispiel der vorliegenden Erfindung darstellt.
  • 13 ist ein weiteres Diagramm, das die Beziehung zwischen der Konzentration an HCG in einer Probe und der Absorption am messenden Bereich darstellt.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die erfindungsgemäße Immunochromatographie-gestützte Vorrichtung weist ein Antigen in einer wässrigen Lösung auf Grundlage einer spezifischen Antigen-Antikörper-Bindungsreaktion auf, welche mindestens zwei verschiedene Antikörper umfasst, die an ein Antigen als Analyt binden, und einen Teststreifen, bestehend aus einem porösen Träger auf welchem sich ein markierender Bereich befindet, enthaltend einen der Antikörper und einen messenden Bereich enthaltend den zweiten Antikörper. Beide Bereiche sind so ausgerichtet, dass eine in den Probenaufnahmebereich eingebrachte Probe sich über den markierenden Bereich in Richtung zum messenden Bereich bewegt, worin einer der Antikörper (der Antikörper der mobilen Phase) chemisch visualisiert wird und so im markierenden Bereich des porösen Trägers enthalten ist, dass er sich in einer Probenlösung, die auf den Träger gebracht wird löst, um sich innerhalb des Trägers mit der Probenlösung mitzubewegen. Der andere Antikörper (der Antikörper in einer fixierten Phase) ist an den messenden Bereich des porösen Trägers so gebunden, dass durch die Bewegungsrichtung der Probe seine Position nicht verändert wird. Der poröse Träger besitzt einen imprägnierten Bereich mit einem Additiv an einer bestimmten Stelle zwischen dem Probenaufnahmebereich und dem messenden Bereich, wobei der das Additiv beinhaltende Bereich darauf an verschiedenen Stellen sein kann und mindestens eine Substanz enthält aus der Gruppe enthaltend eine oberflächenaktive Substanz, ein Ammoniumsalz und einen pH-Puffer von der Art, dass diese sich in der Probenlösung auflösen und sich in der Bewegungsrichtung der Probe durch den porösen Träger mitbewegen.
  • Der Additiv-imprägnierte Bereich kann zwischen dem Probenaufnahmebereich und dem markierenden Bereich positioniert sein oder als integraler Bestandteil mit dem Probenaufnahmebereich kombiniert sein.
  • Wenn der Additiv-imprägnierte Bereich zwischen dem Probenaufnahmebereich und dem messenden Bereich positioniert ist, wird das Additiv wie beispielsweise in Form einer oberflächenaktiven Substanz, eines Ammoniumions des Ammoniumsalzes oder eines pH-Puffers mit der eingebrachten Probe vermischt und bewegt sich im Verlauf der Analyse in Richtung zum messenden Bereich. Die Probe wird nach Erreichen des messenden Bereiches im flüssigkeitsabsorbierenden Bereich absorbiert.
  • Von den verschiedenen Additiven senkt die oberflächenaktive Substanz die Oberflächenspannung einer flüssigen Probe und beschleunigt so den Probenfluss und modifiziert die Oberflächenmerkmale des Antikörpers in der mobilen Phase, um so die hydrophobe Bindung mit dem porösen Träger zu beeinträchtigen. Dieser Aufbau verkürzt die Detektionsdauer mithilfe einer Immunochromatographie-gestützten Vorrichtung und beschränkt die Hintergrundfärbung auf ein Minimum.
  • Das Ammoniumion ist eine typischerweise positiv geladene Verbindung, welche die negative Ladung des Antikörpers in der mobilen Phase ausgleicht.
  • Der pH-Puffer kontrolliert den pH-Wert der eingebrachten Probe und gleicht damit die positive Ladung des Antikörpers in der fixierten Phase aus.
  • Auf diese Weise können die beiden Additive elektrische Interaktionen zwischen dem Antikörper in der mobilen Phase und dem Antikörper in der fixierten Phase unterbinden und somit die Entwicklung von Leerwertfärbung verhindern.
  • Bei einer bevorzugten Methode der vorliegenden Erfindung ist der markierende Bereich in verschiedene Zonen unterteilt und ein poröses Material, welches die Bewegung der Probe und des markierten Antikörpers ermöglicht ist zusätzlich als Spacer (Abstandshalter) zwischen den unterschiedlichen Zonen des markierenden Bereichs positioniert, derart dass die Probe durch den segmentierten markierenden Bereich fließen kann. Der so aufgebaute markierende Bereich kann verschiedene Arten und/oder unterschiedliche Absolutmengen eines markierten Antikörpers tragen.
  • Der markierende Bereich kann in verschiedene Zonen unterteilt werden, so dass die unterschiedlichen Zonen des segmentierten markierenden Bereichs, welche proximal zum messenden Bereich lokalisiert sind, das bedeutet, diejenigen Zonen, die stromabwärts der Flussrichtung lokalisiert sind, die markierten Antikörper in relativ großer Menge tragen und die unterschiedlichen Zonen, welche distal zum messenden Bereich lokalisiert sind, das bedeutet, diejenigen, welche stromaufwärts zur Flussrichtung lokalisiert sind, geringe Antikörpermengen tragen. Dieser Aufbau des markierenden Bereichs ermöglicht das gleichzeitige Auftreten einer großen Menge an Antigen in einer Probe mit einer großen Menge an markiertem Antikörper im markierenden Bereich stromabwärts der Flussrichtung, wenn die Probe eine große Antigenmenge enthält. Somit kann eine intensive Färbung in einer akuten Phase der Antigen-Antikörper-Reaktion induziert werden, ohne einen Mangel an markiertem Antikörper zu entwickeln. Wenn die Probe nur eine geringe Menge an Antigen enthält, kann die große Menge an markiertem Antikörper stromabwärts der Flussrichtung nicht zur Antigen-Antikörper-Reaktion beitragen; allerdings wird das Antigen am messenden Bereich aufkonzentriert und durch den markierten Antikörper gefärbt, der während seines fast homogenen Durchflusses mit der Zeit das Antigen einholt. Das bedeutet, dass die Vorrichtung aufgrund dieser Struktur eine hohe Nachweisfähigkeit besitzt. Im letzteren Fall, in dem der markierte Antikörper, welcher später das Antigen einholt, eine niedrige Konzentration aufweist, bleibt die Hintergrundfärbung gering und hat somit keine Auswirkung auf die Färbung am messenden Bereich. Gemäß dieser Struktur ist ein optimales Reaktionssystem an der Antigen-Antikörper-Reaktion beteiligt in Abhängigkeit von der Konzentration des Antigens, welches den dynamischen Bereich für den Nachweis erhöht.
  • Die Unterteilung des Probenflussweges in zwei Wege ist ein Effekt, der durch einen Nebenweg hervorgerufen wird, welcher sich vom Probenaufnahmebereich in Richtung zum messenden Bereich erstreckt, so dass die Probe zum Teil den markierenden Bereich passieren oder den markierten Bereich umgehen und auf direktem Weg zum messenden Bereich gelangen kann. Einer der Wege ist ein einfacher Weg, der vom Probenaufnahmebereich ausgehend über den Träger in Richtung zum messenden Bereich führt. Auf dieser Route trifft die Probe nur auf minimale Hindernisse und kann mit hoher Geschwindigkeit passieren. Der alternative Weg führt durch den markierenden Bereich, Idealerweise durch den segmentierten markierenden Bereich und entwickelt einen Kontakt-induzierten Widerstand an der Grenzfläche zwischen dem markierenden Bereich und dem Spacer und verlangsamt so den Probenfluss. Anders ausgedrückt, gemäß dieser Struktur erreicht nach Eingabe der Probe in die Vorrichtung im Wesentlichen nur die Probe den messenden Bereich und erst nach einer gewissen zeitlichen Verzögerung holt der markierte Antikörper, welcher sich in der Probenlösung gelöst hat, die Probe ein und kommt zusammen mit der Probe am messenden Bereich an. Während dieser Zeitverzögerung akzeptiert der messende Bereich vorläufig eine Mischung aus markiertem Antikörper und Antigen in der Probe, derart, dass das Antigen bis zu einem gewissen Maß an den markierten Antikörper gebunden ist. Auf diese Weise kann das Antigen wirksam abgefangen werden, selbst wenn die Antigenmenge in der Probe gering ist und resultiert in einer erhöhten Nachweisfähigkeit der Vorrichtung. Dieser Aufbau scheint offensichtlich die Reaktionszeit wegen der auftretenden Zeitverzögerung zu verlängern. Allerdings führt die Tatsache, dass die Nachweisempfindlichkeit der Vorrichtung verbessert werden kann, ohne dass die absolute Menge an markiertem Antikörper im markierenden Bereich erhöht werden muss, zu einer kürzeren Zeitdauer für die Reduzierung der Hintergrundfärbung, wodurch die Gesamtreaktionszeit verringert wird.
  • Bei einer anderen bevorzugten Methode der vorliegenden Erfindung wird der chemisch visualisierte Antikörper, das heißt, der Antikörper in der mobilen Phase, durch Bindung an kolloidales Gold, Latexpartikel, organischen Farbstoff, Pigment, Metall, Metalloxid und Enzym oder eine willkürliche unterschiedliche Kombination aus der oben genannten Gruppe gebunden und so visualisiert. Ein Beispiel für einen bevorzugten Farbstoff ist Cyaninfarbstoff mit folgender chemischer Formel:
    Figure 00100001
  • Die Immunochromatographie-gestützte Vorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung ist besonders effektiv, wenn es sich bei dem Antigen entweder um HCG, luteinisierendes Hormon (LH) oder C-reaktives Protein (CRP) handelt.
  • Die in der vorliegenden Erfindung verwendete oberflächenaktive Substanz kann beispielsweise nichtionischer Alkylphenolether sein. Ein Triton-Surfactant, insbesondere das kommerziell erhältliche Triton X-100, wird bevorzugt.
  • Bevorzugte Ammoniumsalze umfassen Tetramethylammoniumsalze wie beispielsweise Tetramethylammoniumchlorid, Tetramethylammoniumbromid, Tetramethylammoniumjodid usw.
  • Der Additiv-imprägnierte Bereich trägt vorzugsweise einen pH-Puffer in einer solchen Menge, dass sich für die Probe am messenden Bereich ein pH-Wert von 8,0 bis 8,5 ergibt, wenn die Probe in einem vordefinierten Volumen in den Probenaufnahmebereich des Trägers eingebracht wird.
  • Der pH-Puffer wird vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe enthaltend Borsäure, 2-(N-morpholino)ethansulfonsäure, Tris(hydroxymethyl)aminomethan und Phosphorsäure.
  • 2 zeigt den Aufbau eines Teststreifens bestehend aus einem porösen Träger zur Verwendung in der Immunochromatographie-gestützten Vorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung. Ein Teststreifen 10 bestehend aus einem porösen Träger umfassend einen Probenaufnahmebereich 11, einen Additiv-imprägnierten Bereich 12, einen markierenden Bereich 13, enthaltend einen visualisierten Antikörper in der mobilen Phase, einen messenden Bereich 14 enthaltend einen fixierten Bereich 15 mit einem Antikörper in der fixierten Phase und einen flüssigkeitsabsorbierenden Bereich 16, welche nacheinander in dieser Reihenfolge auf dem porösen Träger angeordnet sind.
  • Der Teststreifen 10 befindet sich in einem Hohlgehäuse aus feuchtigkeitsunempfindlichem Material. Das Gehäuse hat ein Fenster oder eine Fensterung für die externe visuelle Beobachtung dessen, was am messenden Bereich 14 auf dem Träger passiert. Um die Probeneingabe in den Probenaufnahmebereich 11 auf dem porösen Träger von außen zu erleichtern, ist das Gehäuse zum Teil offen oder der poröse Träger ist in entgegengesetzter Richtung vom messenden Bereich ausgehend erweitert durch die Platzierung des markierenden Bereichs im Zentrum, so dass der poröse Träger aus dem Gehäuse herausragt, um einen Probenaufnahmebereich zu bilden.
  • 3 zeigt einen anderen bevorzugten Aufbau des Teststreifens. Der markierende Teil 13 ist unterteilt in 13a, 13b und 13c. Obwohl nicht dargestellt, wird der Additiv-imprägnierte Teil auch von dem porösen Träger geformt.
  • Im Folgenden wird die vorliegende Erfindung spezifisch unter Bezugnahme auf Referenzen zu konkreten Beispielen beschrieben.
  • Beispiel 1
  • I Methode zur Herstellung der Einzelbestandteile
  • (1) Methode zur Herstellung eines Blockers und eines Detergens für den messenden Bereich
  • Zu 1 l destilliertem Wasser wurde 0,1 mol (12,11 g) Tris(hydroxymethyl)aminomethan (im weiteren "Tris" genannt) hinzugefügt und geschüttelt und dann mit 1 N HCl auf einen pH-Wert von 8,2 eingestellt, um ein Detergens für Nitrozellulose zu erhalten. Es wurden separat davon 10 g entrahmte Milch zu dem bereits vorbereiteten Detergens gegeben und geschüttelt, um einen Blocker für die Nitrozellulose herzustellen.
  • (2) Methode zur Fixierung des Antikörpers im messenden Bereich
  • (Herstellung eines Antikörpers in der fixierten Phase)
  • Ein Nitrozellulosebogen (HFM SPHF04020, hergestellt von Nihon Millipore Limited) wurde zugeschnitten auf die Maße 0,9 cm × 1,2 cm mit einer Dicke von etwa 220 μm (einschließlich der Substratdicke) zur Verwendung als Trägermaterial. Der Bogen als Trägermaterial wurde mit einer Phosphatpufferlösung (im Weiteren abgekürzt als „PBS") behandelt, enthaltend einen anti-HCGβ (α-HCGβ) gegen HCG (5 mg/ml) in einem Abstand von 0,5 cm vom Probenaufnahmebereich und 0,7 cm vom flüssigkeitsabsorbierenden Bereich und für 8 Stunden bei 40°C im Dunkeln getrocknet. Nach dem Trocknen wurde der Bogen mit dem oben genannten Blocker imprägniert, so dass sich ein Verhältnis von 70 ml Blocker pro 30 Bögen ergab und dann zum Blocking in einem Schüttler für 30 min bei 30°C geschüttelt. Nach dem Blocking wurde der Bogen mit dem oben genannten Detergens (70 ml/30 Bögen) dreimal für 30 min bei 30°C abgespült und dann in einem Trockner über Nacht getrocknet.
  • (3) Methode zur Herstellung des Additiv-imprägnierten Bereichs
  • Zu 1 l destilliertem Wasser wurde 1 mol (121,1g) Tris zugegeben und geschüttelt und dann mit 1N HCL auf pH 8,2 eingestellt. Der Mischung wurden weiterhin zugefügt 1 mol (109,6g) Tetramethylammoniumchlorid (hierin im Weiteren abgekürzt als „TMA") und 10 ml einer 10 %igen wässrigen Lösung enthaltend ein oberflächenaktives Triton-Agens, Triton-X) (im Weiteren abgekürzt als „Triton") und das Ganze geschüttelt, um eine Tris-Lösung mit (1M)-TMA (1M)-Triton (0,1%) herzustellen. Von der entstandenen Lösung wurden 0,36 ml auf einen Glasfiberfilterbogen (F075-14, hergestellt von Whatman Japan Ltd.), welcher auf die Maße 0,9 cm × 6,0 cm zugeschnitten war, gegeben und anschließend eingefroren und getrocknet.
  • (4) Methode zur Herstellung des markierenden Bereichs
    • (a) Eine PBS-Lösung enthaltend Dithiobis(sulfosuccinimidylpropionat) (im Weiteren abgekürzt als „DTSSP") (4,06 mg/0,1 ml) wurde vorsichtig in eine PBS-Lösung mit anti-HCGα-Antikörper (α-HCGα) (10 mg/ml) getropft und für 30 min bei 35°C geschüttelt. Anschließend wurde diese Lösung einer Gelfiltration unterzogen unter Verwendung einer Säule zur Auftrennung nach Molekulargewicht (Sephadex G25M, hergestellt von Amersham Pharmacia Biotech)
    • (b) Die Gelfiltration ergab PBS mit polymerisiertem HCGα-Antikörper (10 mg/6 ml). Die so hergestellte Lösung wurde bis zur weiteren Verwendung bei 4°C aufbewahrt.
    • (c) BSA PBS (110 mg/ml) wurden 77 mg Dithiothreitol (im Weiteren abgekürzt als „DTT") zugegeben und für 30 min bei Raumtemperatur geschüttelt, um eine Endkonzentration von 7,7 mg/ml zu erhalten, welche dann sofort einer Gelfiltration unterzogen wurden unter Verwendung einer Säule zur Auftrennung nach Molekulargewicht (Sephadex G25M, hergestellt von Amersham Pharmacia Biotech). Das Ergebnis der Gelfiltration war eine BSA-Lösung mit einer freien SH-Gruppe (insgesamt 24 ml).
    • (d) BSA mit einer freien SH-Gruppe (insgesamt 24 ml) wurde mit dem den polymerisierten anti-HCGα-Antikörper enthaltenden PBS (10 mg/6 ml), welcher nach der oben unter (b) beschriebenen Herstellung bei 4°C aufbewahrt wurde, gemischt und für 20 Stunden bei 4°C geschüttelt.
    • (e) Um nicht reagiertes BSA zu entfernen, wurde die oben unter (d) hergestellte Mischung einer Gelfitration unterzogen unter Verwendung einer Säule zur Auftrennung nach Molekulargewicht (Sephacryl S300HR, hergestellt von Amersham Pharmacia Biotech). Dies ergab eine den polymerisierten anti-HCGα-Antikörper enthaltende BSA-Lösung (insgesamt 40 ml bis 50 ml).
    • (f) Dem Produkt aus (e) wurde vorsichtig PBS mit Cyaninfarbstoff (im Weiteren abgekürzt als „SLIC3"), dargestellt anhand der oben gezeigten chemischen Formel, zugetropft und dann für 20 Stunden bei 4°C geschüttelt.
    • (g) Um überschüssigen Zyanfarbstoff zu entfernen, wurde die in (f) hergestellte Mischung einer Gelfiltration unterzogen unter Verwendung einer Säule zur Auftrennung nach Molekulargewicht von 50 cm bis 150 cm Länge (Sephadex G25M, hergestellt von Amersham Pharmacia Biotech). Dies ergab polymerisierten anti-HCGα-Antikörper -BSA enthaltendes SLIC3 (insgesamt 60 ml bis 90 ml). Auf diese Lösung wird als Stammlösung für den markierten Antikörper verwiesen.
    • (h) Der so erhaltenen Stammlösung werden BSA und Sucrose als Stabilisatoren in einer Konzentration von jeweils 1% zugesetzt.
    • (i) Glasfilter (F075-14, Hersteller Whatman Japan Ltd.) wurden auf Bögen der Maße 0,9 cm × 5,0 cm zugeschnitten und mit der den markierten Antikörper und die beiden Stabilisatoren enthaltenden Stammlösung mit jeweils 0,3 ml imprägniert und anschließend eingefroren und getrocknet.
    • (j) Nach Einfrieren und Trocknen wurde ein so vorbereiteter Bogen in einer lichtdichten Umgebung bis zur weiteren Verwendung gelagert.
  • (5) Methode zur Herstellung des flüssigkeitsabsorbierenden Bereichs
  • Ein Glasfiberfilter (GF/D, hergestellt von Whatman Japan Ltd.) wurde auf die Maße 0,9 cm × 2,5 cm zugeschnitten und sechs (6) solcher Bögen wurden zur Verwendung als flüssigkeitsabsorbierender Bereich aufeinander gelegt.
  • II Methode zur Herstellung des Teststreifens
  • 4 zeigt den Aufbau von Teststreifen 20 gemäß Beispiel 1. Die Größe der einzelnen Bestandteile in 4 entspricht nicht unbedingt der tatsächlichen Größe.
  • An der Oberfläche von Linie 21 mit einer Größe von 0,9 × 5,5 cm und einer Dicke von 0,5 mm (hartes Polyvinylchlorid (weiß)) vollständig und durchgehend ausgekleidet mit einem doppelseitigen Klebeband der gleichen Größe (TW-12SD, Hersteller Nichiban Co., Ltd.) wurden jeweils ein messender Bereich 26, ein flüssigkeitsabsorbierender Bereich 27 in Fließrichtung nach unten vom messenden Bereich 26 und ein markierender Bereich 24 in Fließrichtung nach oben vom messenden Bereich 26 gebunden. In Fließrichtung nach oben vom markierenden Bereich 24 wurden ein auf eine Größe von 0,9 cm × 0,5 cm aus einem Glasfiberbogen (8F075-14, hergestellt von Whatman Japan Ltd.) zurechtgeschnittener Bogen 23 und ein Additiv-imprägnierter Bereich 22 nah einander in dieser Reihenfolge aufgebracht. Zwei (2) zusätzliche Bögen des gleichen Glasfiberfilters geschnitten auf die Größe 0,9 × 3,5 cm wurden ebenso auf den gesamten oberen Bereich vom markierenden Bereich 24 bis zum Additiv-imprägnierten Bereich 22 aufgebracht und bilden den porösen Nebenweg 25. Der so hergestellte Teststreifen 20 wurde dann in einem Hohlgehäuse eingebracht.
  • Auf dem Teststreifen 20 dient auch ein Ende des Additiv-imprägnierten Bereichs 22 als Probenaufnahmebereich. Nach Einbringen einer Probe auf den Teststreifen, wie anhand von Pfeil 28 in 4 dargestellt, fließt die Probe auf zwei Wegen. Der Hauptprobenweg ist Flussrichtung 29a, welche vom Additiv-imprägnierten Bereich 22 in Richtung zum messenden Bereich 26 über Glasfiberfilter 23 verläuft und den markierenden Bereich 24 passiert. Der andere Probenweg ist 29b, welcher vom porösen Nebenweg 25 in Richtung zum messenden Bereich 26 verläuft, indem die Peripherie des markierenden Bereichs 24 oder der Bereich über dem markierenden Bereich 24 passiert wird. 4 zeigt, wie der poröse Nebenweg 25 in Kontakt zu dem markierenden Bereich 24 an der Peripherie steht; idealer ist allerdings, wenn der poröse Nebenweg 25 in direkten Kontakt mit dem messenden Bereich 26 über dem markierenden Bereich 24 kommt.
  • Wird der Teststreifen auf diese Weise gebildet, stellt die Fließrichtung 29b, die in Richtung zum messenden Bereich 26 verläuft, indem sie durch einen Peripheriebereich des markierenden Bereichs 24 oder oberhalb des markierenden Bereichs 24 passiert, ein geringeres Hindernis dar und ermöglicht einen rascheren Probenlauf als Fließrichtung 29a, die durch alle Bereiche passiert, bevor Sie am Zielbereich ankommt. Die Probenflussrichtung 29a ist ein Weg, der den Probenfluss verzögert. Wird also eine Probe eingebracht, kommt ein Teil der Probe, der fast keinen markierten Antikörper im markierenden Bereich 24 enthält, zuerst am messenden Bereich 26 an; nach einer gewissen Zeit holt der markierte Antikörper, der in der gleichen Probe gelöst ist, die Probe ein und erreicht ebenfalls den messenden Bereich. Während dieser zeitlichen Verzögerung nimmt der messende Bereich zunächst eine Mischung von markiertem Antikörper und Antigen in der Probe an und zwar so, dass das Antigen bis zu einem gewissen Grad an den markierten Antikörper gebunden ist. Somit kann das Antigen wirksam abgefangen werden, selbst wenn die Antigenkonzentration in der Probe gering ist. Wie bereits ausgeführt, werden durch diesen Aufbau Sichtbarkeit und Nachweisfähigkeit der Vorrichtung verbessert. Obwohl das Auftreten einer zeitlichen Verzögerung anscheinend die Reaktionszeit verlängert, führt dies zu einer tatsächlich erhöhten Nachweisfähigkeit, ohne dass hierzu die absolute Konzentration an markiertem Antikörper am markierenden Bereich erhöht werden muss, wodurch die Zeit, welche benötigt wird, um den Hintergrund zu entfärben, verringert und dadurch wiederum die Reaktionszeit insgesamt verkürzt wird.
  • Vergleichendes Beispiel 1
  • Zum Vergleich wurde ein Teststreifen, wie in 4 gezeigt, auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 vorbereitet, mit Ausnahme, dass anstelle des Additiv-imprägnierten Bereichs 22 der gleiche Glasfiberfilter wie Glasfiberfilter 23 verwendet und auf den porösen Nebenweg 25 vom Glasfiberfilter verzichtet wurde.
  • Zwei Immunochromatographie-gestützte Vorrichtungen wurden hergestellt unter jeweiliger Verwendung des Teststreifens, vorbereitet in Beispiel 1 oder desjenigen im vergleichenden Beispiel 1 und auf Nachweisfähigkeit, Reaktionszeit und Sichtbarkeit getestet. Das Analyt ist HCG. Der Bereich der HCG-Konzentrationen für die Messungen zur Bestimmung der Nachweisfähigkeit lag zwischen 100.000 IE/l und 0 IE/l und die Menge an HCG-Lösung als in den Probenaufnahmebereich einzubringende Probe betrug 0,45 ml. Die Reaktionszeit wurde definiert als die Zeitspanne vom Einbringen der HCG-Lösung in den Probenaufnahmebereich bis zur Visualisierung einer Linie im fixierten Bereich mit dem fixierten Antikörper anhand einer Reaktion zwischen dem fixierten anti-HCGβ-Antikörper und dem markierten HCGα-Antikörper über HCG als Antigen. Der numerische Wert für die Sichtbarkeit wurde abgeleitet aus den Messergebnissen mit einem Reflexionsspektrometer (CS-9300, hergestellt von Shimadzu Corporation). Die Intensität des reflektierten Lichtes wurde bei einfallendem Licht mit einer Wellenlänge von 550 nm (Absorption von SLIC3) ermittelt. Als Basislinienwert 0 wurde die Absorption der reinen Nitrozellulose zugrunde gelegt. Die Messung erfolgt zeitlich innerhalb von 30 Minuten nach Beendigung der immunochromatographischen Analyse.
  • 5 zeigt einen Vergleich der Sichtbarkeit zwischen den beiden Vorrichtungen basierend auf der Absorptionsstärke wie oben definiert und 6 zeigt einen Vergleich der minimalen Nachweiszeit. Obwohl nicht in den Abbildungen gezeigt, ergab sich ein Absorptionspeak bei 0,5 30 Sekunden nach Probeneingabe für die Vorrichtung im vergleichenden Beispiel 1 und ein Absorptionspeak bei 0,7 20 Sekunden nach der Probeneingabe für die Vorrichtung in Beispiel 1, wenn die Konzentration von HCG bei 10.000 IE/l lag. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass die erfindungsgemäße Immunochromatographie-gestützte Vorrichtung der konventionellen Vorrichtung aus dem vergleichenden Beispiel 1 hinsichtlich Nachweisfähigkeit, Reaktionszeit und Sichtbarkeit überlegen ist.
  • Beispiel 2
  • In diesem Beispiel wurde ein Teststreifen auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 vorbereitet. Mit Ausnahme, dass anstelle einer Lösung mit Tris (1M)-TMA (1M)-Triton (0,1%) in Beispiel 1 zur Herstellung des Additiv-imprägnierten Bereichs eine Lösung aus Tris (1M)-TMA (1M) verwendet wurde.
  • Beispiel 3
  • In diesem Beispiel wurde ein weiterer Teststreifen auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 vorbereitet. Mit Ausnahme, dass anstelle einer Lösung mit Tris (1M)-TMA (1M)-Triton (0,1 %) in Beispiel 1 zur Herstellung des Additiv-imprägnierten Bereichs eine Lösung aus Tris (1M)-Triton (0,1 %) verwendet wurde.
  • Vergleichendes Beispiel 2
  • Zum Vergleich wurde ein Teststreifen auf die gleiche Weise wie in Beispiel 2 vorbereitet. Mit Ausnahme, dass anstelle des Additiv-imprägnierten Bereichs 22 in Beispiel 2 der gleiche Glasfiberfilter verwendet wurde wie Glasfiberfilter 23.
  • Drei Immunochromatographie-gestützte Vorrichtungen wurden mithilfe der jeweils in den Beispielen 2 und 3 sowie im vergleichenden Beispiel 2 vorbereiteten Testbestandteile hergestellt und auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 getestet. Die Ergebnisse sind in 7 bis 10 dargestellt.
  • Weitere Testbestandteile wurden auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 hergestellt. Mit Ausnahme, dass Tris-Lösungen mit unterschiedlichen pH-Werten anstelle der Lösung mit Tris (1M)-TMA (1M)-Triton (1 %) in Beispiel 1 zur Herstellung des Additiv-imprägnierten Bereichs verwendet wurden. Damit werden die Proben auf unterschiedliche pH-Werte eingestellt, wenn sie in den Teststreifen in einer vordefinierten Menge eingebracht werden. 11 zeigt das Verhältnis zwischen dem pH-Wert der Probe bei der Analyse und der Absorption.
  • Wie zuvor angeführt, liegt der Grund für die Leerwertfärbung (0 IE/l) in der elektrischen Bindung zwischen dem Antikörper, der mit einem Farbstoff mit negativer Ladung markiert ist und dem Antikörper der fixierten Phase mit einer positiven Ladung.
  • Wenn die zu testende Probenlösung auf dem Teststreifen einen auf pH 8,2 eingestellten Wert aufweist, kann die positive Ladung des Antikörpers in der fixierten Phase eliminiert werden. Wenn dann im Weiteren TMA mit positiver Ladung auf den Teststreifen gebracht wird, wird die negative Ladung des Farbstoffs, welcher zur Markierung des Antikörpers dient, eliminiert und führt somit zur erfolgreichen Verhinderung der Leerwertfärbung (siehe 7). Die weitere Zugabe eines oberflächenaktiven Agens verkürzte die Zeitspanne bis zur Färbung und Detektion (siehe 10).
  • Beispiel 4
  • Es wurde ein Teststreifen auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 vorbereitet. Mit Ausnahme, dass der markierende Bereich auf die wie unten beschriebene Weise hergestellt wurde.
  • Methode zur Herstellung des markierenden Bereiches
  • Nach den Verfahren a) bis j) in Beispiel 1, wurden zusätzliche Behandlungen k) und 1) wie unten stehend durchgeführt.
    • k) Der tief gefrorene und getrocknete Glasfilter, imprägniert mit dem markierten Antikörper wurde auf eine Größe von 0,9 cm × 0,1 cm zugeschnitten und als markierender Bereich 24c verwendet.
    • l) Die Stammlösung mit dem markierten Antikörper wurde vierfach mit PBS verdünnt und, wie bereits zuvor beschrieben, im Glasfiberfilter imprägniert (F075-14, hergestellt von Whatman Japan Ltd.), welcher in zwei Bögen von 0,9 cm × 0,1 cm zugeschnitten und als markierende Bereiche 24a und 24b verwendet wurde.
  • Die so hergestellten markierenden Bereiche 24a, 24b und 24c wurden zusammengesetzt und wie in 12 gezeigt an den porösen Träger gebunden, indem in Sandwich-Technik die gleich großen Abstandshalter 30 aus Glasfiberfilter ( (F075-14, hergestellt von: Whatman Japan Ltd.) eingeschoben wurden.
  • Als nächstes folgen die Ergebnisse eines Vergleichtests zwischen zwei (2) Immunochromatographie-gestützten Vorrichtungen unter Verwendung des Teststreifens aus Beispiel 1 und Beispiel 4. Als Analyt wurde HCG verwendet. Wie zuvor ausgeführt wurde die Sichtbarkeit abgeleitet von der Messung der Intensität an reflektiertem Licht bei einfallendem Licht mit einer Wellenlänge von 550 nm. HCG-PBS mit einer Konzentration von 0, 50, 100, 1000 oder 10.000 IE/l wurde in den Probenaufnahmebereich des Teststreifens jeder einzelnen Vorrichtung eingebracht und jede Vorrichtung wurde in horizontaler Ausrichtung bei Raumtemperatur (25°C) stehen gelassen. 13 zeigt die Zusammenfassung eines Vergleichs zwischen den Vorrichtungen bezüglich der Absorption (Farbintensität) bei den einzelnen HCG-Konzentrationen 3 Minuten nach der Probeneingabe. Die Abbildung lässt vermuten, dass die Vorrichtung, welche den Teststreifen aus Beispiel 4 verwendet, welcher ein Additiv enthält und im markierenden Bereich segmentiert ist, eine erhöhte Farbintensität aufweist im Vergleich zu der Vorrichtung, die den Teststreifen aus Beispiel 1 verwendet, welcher nicht segmentiert ist. Eine Leerwertfärbung bei einer Konzentration von 0 IE/l als verursachender Faktor von Fehlfunktionen wurde auf perfekte Weise im bevorzugten Beispiel 4 ausgeschlossen.
  • Wie oben diskutiert, werden durch die vorliegende Erfindung auf vorteilhafte Weise Hintergrund- und Leerwertfärbung, die zu Fehlfunktionen bei der Messung führen können, ausgeschlossen. Die Verwendung der erfindungsgemäßen Immunochromatographie-gestützten Vorrichtung erleichtert daher den genauen und raschen Nachweis eines in flüssigen Proben jeglicher Art enthaltenen Antigens. Durch die vorliegende Erfindung wird es einem markierten Antikörper unter idealen Bedingungen ermöglicht, seine Rolle bei einer Antigen-Antikörperreaktion zu übernehmen. Das Ergebnis ist die gleichzeitige Umsetzung von Nachweisgeschwindigkeit, Nachweisfähigkeit und dynamischem Nachweisbereich.

Claims (12)

  1. Eine Immunochromatographie-gestützte Vorrichtung zur Detektion eines Antigens in einer wässrigen Probenlösung basierend auf einer spezifischen Antigen-Antikörper-Bindungsreaktion, diese Vorrichtung umfasst: mindestens zwei verschiedene Antikörper, welche fähig sind, an ein Antigen als einen Analyten zu binden und einen Teststreifen bestehend aus einem porösen Träger, der einen markierenden Bereich, welcher eines dieser Antikörper enthält und einen messenden Bereich aufweist, der den anderen dieser Antikörper enthält, wobei dieser markierende Bereich und dieser messende Bereich derart angeordnet sind, dass eine in den Probenaufnahmebereich eingebrachte Probe sich durch den markierenden Bereich in Richtung des messenden Bereichs bewegen kann, wobei einer dieser Antikörper ein chemisch visualisierter Antikörper ist und so in diesem markierenden Bereich dieses porösen Trägers enthalten ist, dass er sich in einer in diesen porösen Träger eingebrachte Probenlösung löst, um sich in den Träger zusammen mit der Bewegung der besagten Probe hineinzubewegen; der andere dieser Antikörper ist in einem solchen Maße in dem messenden Bereich des Trägers fixiert, dass er durch die Bewegung der Probe nicht in seiner Position verändert wird; und dieser poröse Träger weist einen mit einem Additiv imprägnierten Bereich in einem bestimmten Bereich zwischen dem Probenaufnahmebereich und dem messenden Bereich auf, dieser imprägnierte Bereich trägt in beweglicher Form mindestens ein Ammoniumsalz und/oder einen pH-Puffer, so dass dieses/dieser sich in der Probenlösung löst, um sich zusammen mit der Bewegung dieser Probe durch den porösen Träger zu bewegen.
  2. Die Immunochromatographie-gestützte Vorrichtung gemäß Anspruch 1, worin dieser markierende Bereich in eine Mehrzahl von Zonen unterteilt ist.
  3. Die Immunochromatographie-gestützte Vorrichtung gemäß Anspruch 1, worin einer dieser Antikörper an mindestens einem ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus kolloidem Gold, Latexpartikel, organischem Farbstoff, Pigment, Metal, Metalloxid und Enzym gebunden und visualisiert ist.
  4. Die Immunochromatographie-gestützte Vorrichtung gemäß Anspruch 1, worin dieser visualisierte Antikörper mit einem Cyaninfarbstoff markiert ist, der durch die folgende Formel wiedergegeben wird:
    Figure 00210001
  5. Die Immunochromatographie-gestützte Vorrichtung gemäß Anspruch 1, worin das Ammoniumsalz ein Tetramethylammoniumsalz ist
  6. Die Immunochromatographie-gestützte Vorrichtung gemäß Anspruch 1, worin der imprägnierte Bereich diesen pH-Puffer in einer solchen Menge trägt, dass ein pH der Probe im messenden Bereich von 8,0 bis 8,5 ermöglicht wird, wenn die Probe in den Probeaufnahmebereich des Trägers in einer vorbestimmten Menge eingebracht wird.
  7. Die Immunochromatographie-gestützte Vorrichtung gemäß Anspruch 1, worin der pH-Puffer mindestens einer ausgewählt aus der Gruppe ist, welche aus Borsäure, 2-(N-morpholino)ethansulfonsäure, Tris(hydroxymethyl)-aminomethan und Phosphorsäure besteht.
  8. Die Immunochromatographie-gestützte Vorrichtung gemäß Anspruch 2, worin eine Zone dieses unterteilten markierenden Bereichs diesen markierten Antikörper in einer unterschiedlichen Menge als in den anderen Zonen trägt.
  9. Die Immunochromatographie-gestützte Vorrichtung gemäß Anspruch 8, worin mehrzählige Zonen dieses unterteilten markierenden Bereichs, welche nah beim messenden Bereich angeordnet sind, diesen markierten Antikörper in einer größeren Menge tragen, als mehrzählige Zonen, welche entfernt zum messenden Bereich angeordnet sind.
  10. Die Immunochromatographie-gestützte Vorrichtung gemäß Anspruch 2, des weiteren umfassend eine Flussstrecke, welche die direkte Annäherung der Probe zum messenden Bereich entweder durch nur teilweises Passieren oder durch vollständiges Umgehen des markierenden Bereichs erlaubt, zusätzlich zu einer Flussstrecke, welche das Passieren der Probe in Reihe durch die Mehrzahl von Zonen dieses markierenden Bereichs vor der Erreichung des messenden Bereichs erlaubt.
  11. Die Immunochromatographie-gestützte Vorrichtung gemäß Anspruch 2, worin ein poröses Material Bewegungen dieser Probe zulässt und der markierte Antikörper zwischen diesen mehrzähligen Zonen dieses markierenden Bereichs angeordnet ist.
  12. Die Immunochromatographie-gestützte Vorrichtung gemäß Anspruch 1, des weiteren umfassend einen Nebenweg für die Probe, welcher sich von dem Probenaufnahmebereich zum messenden Bereich unter Passieren der Peripherie des markierenden Bereichs oder unter Umgehung dieses markierenden Bereichs erstreckt.
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