KR19990029688A - 면역 크로마토그라피장치 - Google Patents

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모리시따요오이 찌
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Abstract

검출시의 오동작이 요인이 될 수 있는 백그라운드의 착색이나 블랭크발색이 없고, 액체시료중의 항원을 정확하고 신속하게 검출할 수 있는 면역크로마토그라피장치가 개시되어 있다. 이 면역 크로마토그라피장치는, 다공질 담체의 시료도입부에서 판정부까지의 사이에 첨가제 함침부를 설치하고, 첨가제 함침부에는 계면활성제, 가용성 암모늄염 및 pH완충제로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 1종이, 담체에 도입되는 시료에 용출하고, 담체내를 시료의 이동과 함께 이동할 수 있는 상태로 담지되어 있다. 또한, 상기 표식부는 복수로 분할되어 있다.

Description

면역 크로마토그라피장치
본 발명은, 수중 미생물의 검출이나, 체액으로부터 극미량의 표식물질을 검출하는 체외진단약 내지는 휴대용 진단장치에 관한 것이다. 더욱 자세하게는, 분석설비를 갖고 있지 않은 소규모 병원이나 피험자 자신이 간편하고 또 신속하게 측정할 수 있는 면역 크로마토그라피장치의 성능향상을 도모한 것이다.
소변, 땀, 혈액 등의 체액으로부터 극미량의 표식물질을 검출하는 체외진단약은, 임상진단, 재택의료의 중심적 존재로서 중요성이 인정되고 있다. 면역 크로마토기술은, 항체가 가지는 반응특이성을 이용한 체외진단약의 기반기술이다. 그 중에서도, 임신 검사약은, 이미 일반용 의약품으로서 시장에 유통되고 있는 가장 전형적인 면역 크로마토그라피장치이다. 여성이 임신하면, 태반으로부터 인류융모성 성선자극 호르몬(hCG)이 분비되고, 그것이 소변 속에 배설된다. 임신검사기에 여성이 소변을 첨가하면, 통상 3분간 정도로 임신의 양성·음성의 판정을 비전문가라도 간단하게 할 수 있다. 이와 같은 면역 크로마토그라피장치의 대표적인 구조는, 예를 들면 미국특허 제5,602,040호에 개시되어 있다.
이하에, 가장 간단한 면역 크로마토그라피장치의 구조와 동작에 대하여, 임신검사기를 예로 들어 설명한다. 도 1에 전형적인 면역 크로마토그라피장치에 사용되는 다공질 담체의 구조를 나타낸다. 이 다공질 담체(1)는, 항체의 고정이 쉽기 때문에 니트로셀룰로오즈의 시트가 가장 널리 사용되고 있다. 단, 전체를 니트로셀룰로오즈로 구성하면, 시료의 유속이 현저하게 저하하므로, 판정부만을 유니트셀룰로오즈로 구성하고, 그 밖의 부분은 시료의 유속보다 빠른 유리여과지 등으로 구성하는 것이 바람직하다. 담체의 일끝단인 시료도입부(2)는, 시료가 신속하게 흡수되지만 유지력은 약하고, 조속히 반응부로 시료가 흘러가도록 하는 성질의, 유리여과지 등의 다공질 담체로 구성되어 있다. 다공질 담체(1)를 속이 빈 케이스에 수용하는 경우는, 시료도입부(2)는 비교적 긴 구성으로 하고, 그 일부를 케이스로부터 노출시킴으로써, 직접 시료도입부에 소변을 도입할 수 있다. 혹은, 시료도입부도 케이스내에 수납되어 있을 때는, 케이스에 구멍을 뚫어 두고, 거기에서 시료도입부에, 시료를 첨가할 수 있다.
표식부(3)는, 금 콜로이드 또는 착색 라텍스에 흡착한 항 hCG 항체의 수용액을 유리여과지에 함침시킨 후, 동결건조시킴으로써 제작한 것이다. 판정부(4)는, 니트로셀룰로오즈의 니트로셀룰로오즈의 시트상에 항체의 수용액을 임의의 형상으로 떨어뜨린 후 건조하고, 세정함으로써 제작한 것이다. 니트로셀룰로오즈의 매우 강고한 비특이 흡착특성에 의해, 항체가 니트로셀룰로오즈상에 담지되어 있다. 항체를 고정화한 후, 검출반응시의 비특이 흡착에 의한 백그라운드의 발색을 방지하기 위해서, 예를 들면 소혈청 알부민(BSA)등으로 표면처리를 실시할 수 있다. 이 조작을 블로킹이라 한다. 담체의 다른쪽 끝단부에 있는 흡액부(5)는, 과잉의 시료를 신속히 흡수하기 위해서, 우수한 흡액력, 흡액용량을 가진 재료, 유리여과지가 사용된다.
시료로서, 여성의 소변을 크로마토그라피장치의 형상에 맞추어 정해진 양(통상 0.1∼2ml)을 시료도입부(2)에 첨가한다. 시료는 표식부(3)를 경유하여, 판정부(4)를 통과해서, 흡액부(5)를 향하여 이동한다. 그 때, 표식부(3)를 시료가 통과할 때는, 표식부에 담지되어 있던 표식항체가 시료의 수분에 용해되어 시료와 함께 이동을 시작한다. 그 후, 용해된 표식항체는 판정부(4)를 통과한다. 거기서, 항원 및 항체의 특이적 결합반응에 의하여, 양성의 경우는, 판정부에서 고정화 항체와 표식 항체가 항원을 통하여 반응하고, 판정부가 착색된다. 음성의 경우는, 반응이 일어나지 않고, 표식 항체가 판정부를 통과하여 흡액부에 흡수된다. 이에 따라, 수성시료액 속의 항원의 유무를 판정할 수가 있다.
상기와 같은 면역 크로마토그라피장치에 있어서, 판정부의 고정상항체 이외의 부분의 착색(백그라운드) 및 검출물질이 존재하지 않는 경우에서의 고정화상의 발색(블랭크)는, 검출시의 SN비를 내릴 뿐만 아니라, 오동작의 원인도 될 수 있다. 백그라운드 착색의 원인은, 가시화된 이동상항체와 다공질 담체와의 소수적인 결합이다. 또한, 블랭크 발색의 원인은, 음전하를 띤 이동상항체와 양전하를 띤 고정상항체와의 전기적 상호작용이다.
통상, 검출에 사용되는 시료에는, 소수결합이나 전기적 상호작용을 부정하는 효과가 있는 물질, 예를 들면 계면활성제나 pH 완충제 등은 포함되어 있지 않다. 따라서, 종래의 면역 크로마토그라피장치에 있어서는, 적지 않게 백그라운드의 착색이 일어나, 경우에 따라서는 블랭크가 발생한다고 하는 문제가 있었다. 이것은, 유기색소를 이용하여 이동상항체를 가시화했을 때에, 특히 현저하게 볼 수 있다.
상기의 면역 크로마토그라피장치에 있어서, 표식부에 담지된 표식항체의 양 및 농도를 증가시킴으로써 감도의 향상을 도모할 수 있다. 그러나, 이 방법을 취하면, 표식항체가 많이 흘러나와 백그라운드가 색이 바래고, 눈으로 확인할 수 있도록 되기까지의 시간이 걸린다. 즉, 감도의 향상과 반응시간의 저감이 상반하고 있다. 또한, 시료중에 포함되는 항원이 크게 과잉인 경우에는, 이동상의 항체가 전부 항원과 반응하여 버림으로써, 판정부에 도달할 수 없게 되기 때문에, 외견상 항원이 적은 것 같은 오동작을 하게 된다. 이 이유 때문에, 면역 크로마토그라피에는 본질적으로 반응이 일어나는 다이나믹 레인지가 존재하게 되고, 통상 임신검사기의 경우의 반응의 다이나믹 레인지는 50∼100,000 IU/L의 범위이다.
또한, 시료가 반드시 표식부를 경유하여 판정부로 이동하도록 구성하면, hCG가 고정화 항체와 반응하기 전에, 표식된 항체와 반응하여 버리기 때문에, 저농도에서의 항원의 검출이 불리하다.
본 발명은, 상기에 감안하여, 검출시의 오동작이 요인이 될 수 있는 백그라운드의 착색이나 블랭크 발색을 제거하고, 액체 시료속의 항원을 정확하고 또한 신속하게 검출할 수 있는 면역 크로마토그라피장치를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은, 또한, 감도의 향상과 반응시간의 저감을 동시에 달성하고, 또한 반응의 다이나믹 레인지를 확대하는 효과를 달성하는 획기적인 면역 크로마토그라피장치를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은, 상기 과제를 해결하기 위해서, 다공질 담체의 시료도입부에서 판정부까지의 사이에 첨가제 함침부를 설치하고, 첨가제 함침부에는 계면활성제, 가용성 암모늄염 및 pH 완충제로 이루어지는 군(群)에서 택해진 적어도 1종류가, 담체에 도입되는 시료에 용출하고, 담체내를 시료의 이동과 함께 이동할 수 있는 상태로 담지되어 있는 면역 크로마토그라피장치를 제공한다.
본 발명은, 또한 상기 표식부가 복수로 분할되어 있는 면역 크로마토그라피장치를 제공한다.
또한, 본 발명은, 항체의 한쪽을 포함하는 표식부와 항체의 다른쪽을 포함하는 판정부를 시료도입부에 도입된 시료가 표식부를 지나서 판정부에 이동하도록 양자를 배열한 다공질 담체로 이루어지는 시험편을 구비하고, 상기 다공질 담체에는 또한, 시료도입부에서 표식부의 끝단부를 경유하거나 또는 표식부를 경유하지 않고서 판정부에 이르는 시료의 바이패스 유로를 설치한 면역 크로마토그라피장치를 제공한다.
도 1은 종래의 면역 크로마토그라피장치의 시험편을 나타내는 사시도이다.
도 2는 본 발명의 면역 크로마토그라피장치에 사용하는 시험편의 구성예를 나타내는 사시도이다.
도 3은 본 발명의 면역 크로마토그라피장치에 사용하는 시험편의 다른 구성예를 나타내는 사시도이다.
도 4는 실시예에 사용한 시험편의 종단면도이다.
도 5는 시료중의 hCG농도와 판정부에서의 흡광도(발색강도)와의 관계를 비교한 그래프이다.
도 6은 시료중의 hCG농도와 검출가능한 최단시간과의 관계를 비교한 그래프이다.
도 7은 시료중의 hCG농도와 판정부에서의 흡광도와의 관계를 비교한 그래프이다.
도 8은 시료중의 hCG농도와 검출가능한 최단시간과의 관계를 비교한 그래프이다.
도 9는 시료중의 hCG농도와 판정부에서의 흡광도와의 관계를 비교한 그래프이다.
도 10은 시료중의 hCG농도와 검출가능한 최단시간과의 관계를 비교한 그래프이다.
도 11은 시험편에 전개하는 시료액의 pH를 바꾸었을 때의 시료중의 hCG농도와 판정부에서의 흡광도와의 관계를 나타내는그래프이다.
도 12는 다른 실시예에 사용한 시험편의 종단면도이다.
도 13은 또 다른 실시예에 이용한 시험편의 종단면도이다.
도 14는 시료중의 hCG농도와 판정부에서의 흡광도와의 관계를 비교한 그래프이다.
도 15는 시료중의 hCG농도와 검출가능한 최단시간과의 관계를 비교한 그래프이다.
도 16은 시료중의 hCG농도와 판정부에서의 흡광도와의 관계를 비교한 그래프이다.
도면의 주요 부분에 대한 부호의 설명
1 : 다공질 담체 2, 11 : 시료도입부
3, 13(13a, 13b, 13c) 24(24a, 24b, 24c) : 표식부
4, 14, 26 : 판정부 5, 16, 27 : 흡액부
10, 20 : 시험편 12, 22 : 첨가제 함침부
15 : 고정화부 21 : 배접
23 : 유리섬유 여과지 25 : 바이패스용 다공질체
28 : 화살표 29a, 29b, 29c : 유로
30 : 스페이서
본 발명의 면역 크로마토그라피장치는, 항원·항체의 특이적 결합반응에 의하여 수성시료액 속의 항원을 검출하는 것이며, 검출대상의 항원에 결합하는 적어도 2종의 항체 및 상기 항체의 한쪽을 포함하는 표식부와 항체의 다른쪽을 포함하는 판정부를 시료도입부에 도입된 시료가 표식부를 지나서 판정부로 이동하도록 양자를 배열한 다공질 담체로 이루어지는 시험편을 구비하고, 상기 한쪽의 항체 즉 이동상항체는, 화학적으로 가시화처리가 실시되어 있어, 담체에 도입되는 시료액에 용출하고, 담체내를 시료의 이동과 함께 이동할 수 있는 상태로 담체의 표식부에 함유되고, 다른쪽의 항체 즉 고정상항체는, 담체의 판정부에, 시료의 이동에 따른 위치의 변화가 일어나지 않는 강도로 고정화되어 있다. 또한 상기 담체에는, 시료도입부에서 판정부까지의 사이에 첨가제 함침부가 설치되고, 첨가제 함침부에는 계면활성제, 가용성 암모늄염, 및 pH 완충제로 이루어지는 군(郡)에서 선택된 적어도 1종류가, 시료액으로 용출하고, 담체내를 시료의 이동과 함께 이동할 수 있는 상태로 담지되어 있는 것을 특징으로 한다.
그래서, 첨가제 함침부는, 시료도입부와 표식부와의 사이에, 또는 시료도입부와 일체화하여 설치할 수 있다.
시료도입부에서 판정부까지의 사이에 첨가제 함침부를 설치함으로써, 분석시에는 계면활성제, 암모늄이온 또는 pH완충제가 시료와 혼합하면서 이동한다. 그리고, 이 시료는 판정부에 이른 후, 흡액부에 흡수된다. 첨가제중 계면활성제는, 액체시료의 표면장력을 눌러, 시료의 흐름을 조장함과 동시에 이동상항체의 표면특성을 개질하여 다공질 담체와의 소수결합력을 약하게 한다. 그 결과, 면역 크로마토그라피장치를 사용한 검출시간을 단축할 수 있고, 또한 백그라운드의 착색을 억제하는 것이 가능해진다.
한편, 암모늄이온은, 전형적인 양전하 화합물이기 때문에, 이동상항체의 음전하를 부정하는 효과가 있다. 또한, pH완충제는, 도입된 시료의 pH를 제어함으로써, 고정상항체의 양전하를 상쇄할 수 있다. 이들의 결과로서, 이동상항체와 고정상항체와의 전기적 상호작용은 해소되고, 블랭크의 발색을 제거하는 것이 가능해진다.
본 발명의 바람직한 양태에 있어서, 표식부가 복수로 분할되고, 각각의 표식부의 사이는, 시료 및 표식항체의 이동을 허용하는 다공질 재료를 스페이서로서 보완하여, 시료는 분할된 표식부를 흐르는 구성을 취한다. 또한, 이 구성에 덧붙여, 각 표식부에 담지된 표식항체의 종류 및/또는 절대량을 다른 것으로 할 수 있다.
표식부를 복수로 분할하여, 판정부에 가까운 쪽의 표식부 즉 유로의 하류쪽의 표식부에 비교적 대량의 표식항체를 담지하고, 상류쪽의 표식부에는 소량의 표식항체를 담지시킬 수 있다. 이 구성을 취했을 때, 우선, 시료중에 대량의 항원이 있을 때에는 유로의 하류쪽에서 대량의 항원과 대량의 표식항체가 공존하게 되며, 항체가 부족을 일으키지 않고, 매우 빨리 반응 초기에 짙은 발색을 얻을 수 있다. 또한, 시료중의 항원이 소량인 경우에는, 상기의 하류에서의 대량의 표식항체는 그다지 반응에 기여하지 않지만, 판정부에서 항원이 농축되면서, 뒤에서부터 시간을 들여 균일에 가까운 상태로 흘러 가는 표식항체에 의해 발색한다. 요컨대, 감도는 높은 채로 유지할 수 있다. 이 경우, 뒤에서 흘러가는 표식항체의 농도는 낮기 때문에, 백그라운드는 저감된 채이며, 판정부의 발색을 방해하지 않는다. 이 구성에 의하면, 항원이 높은 농도, 낮은 농도 각각에서 최적의 반응계가 작용하기 때문에, 결과적으로 감도의 다이나믹 레인지가 향상하게 된다.
또한, 시료가 표식부의 일부를 경유하거나 또는 표식부를 전혀 경유하지 않고서 직접 판정부에 이르는 바이패스유로를 설치하는 구성에 의해 발생하는 효과는, 시료의 유로가 2계통으로 나누어지는 것이다. 요컨대, 하나의 경로는, 단순히 시료도입부에서 담체를 경유하여, 판정부에 도착한다. 이 경로는 가장 장해가 적고 시료의 흐름은 빠르게 진행한다. 또 하나의 경로는, 표식부, 바람직하게는 분할된 표식부를 통과함으로써, 표식부와 스페이서와의 계면에서의 접촉저항이 생겨, 그 때문에 지연된 시료의 유로이다. 바꾸어 말하면, 이 구성을 취함으로써, 시료를 도입하면, 우선 실질적으로 시료만이 판정부에 이르고, 일정한 시간이 경과한 후 시료에 의해서 용출된 표식항체가 판정부에 이른다. 이 지연시간 동안에, 판정부에서는, 미리 항원이 어느 정도 결합한 상태로 표식항체와 항원의 혼합물을 받아들이게 되고, 소량의 항원밖에 존재하지 않는 경우에도 효율적으로 이것을 받아들이는 것이 가능해져, 결과적으로 감도를 향상시킬 수 있다. 이 구성에 의하면, 지연시간을 설치함으로써, 일견 반응시간은 걸리는 것이 되지만, 실제로는 담지하는 표식항체의 절대량을 증가시키지 않고 감도향상을 도모할 수 있으므로, 백그라운드 소실의 시간이 감축되고, 전체로서는 반응시간은 단축되게 된다.
본 발명에 있어서, 화학적으로 가시화된 항체, 즉 이동상항체는, 금 콜로이드, 라텍스입자, 유기색소, 안료, 금속, 금속산화물, 및 효소 가운데 어느 하나 또는 이 중의 몇개의 조합을 결합시킴으로써, 가시화되어 있는 것이 바람직하다. 다음 구조식으로 나타내는 시아닌계 색소는, 바람직한 색소의 예이다.
본 발명의 면역 크로마토그라피장치는, 항원이 hCG, LH(황체형성 호르몬), 또는 CRP(C 반응성 단백질)중 어느 하나인 경우에 특히 효과적이다.
본 발명에 사용하는 계면활성제로서는, 알킬페놀에테르계의 비이온계면활성제가 사용된다. 트리톤계 계면활성제, 그 중에서도 트리톤(Triton) X-100의 이름으로 판매되고 있는 것이 바람직하다.
암모늄염으로서는, 테트라메틸 암모늄염, 예컨대 염화테트라메틸 암모늄, 브롬화테트라메틸 암모늄, 요오드화테트라메틸 암모늄 등이 바람직하다.
첨가제 함침부에서의 pH완충제의 담지량은, 담체의 시료도입부에 미리 정한 부피의 시료를 첨가하였을 때, 판정부에서의 시료의 pH가 8.0∼8.5의 범위가 되는 것이 바람직하다.
pH완충제는, 붕산, 2-(N-몰포리노)에탄술폰산, 트리스(히드록시메틸)아미노메탄, 및 인산으로 이루어지는 군에서 고르는 것이 바람직하다.
도 2는, 본 발명의 면역 크로마토그라피장치에 사용하는 다공질 담체로 이루어지는 시험편의 구성예를 나타낸다. 시험편(10)은, 다공질 담체로 이루어지며, 시료도입부(11), 첨가제 함침부(12), 가시화처리가 실시된 이동상항체를 함유하는 표식부(13), 고정상항체의 고정화부(15)를 갖는 판정부(14), 및 흡액부(16)가 차례로 배열된 구성을 갖는다.
이 시험편은, 액체를 투과하지 않은 재질의 중공의 용기내에 수납된다. 그리고, 용기에는, 외부에서 담체상의 판정부를 눈으로 관찰하기 위한 창문이 설치된다. 더욱, 외부로부터의 시료를 다공질 담체상에 도입할 수 있도록, 중공의 용기의 일부를 개방하거나, 또는 표식부를 중심으로 하여, 판정부의 반대방향으로 다공질 담체가 연장되고, 그 일부가 시료의 도입부가 되도록, 중공의 용기로부터 외부로 노출된다.
도 3은 시험편의 다른 바람직한 구성예를 나타낸다. 표식부(13)는, (13a), (13b), 및 (13c)로 분할되어 있다. 도시하지 않았으나, 첨가제 함침부(12)는 설치되어 있다.
이하, 본 발명의 실시예를 상세하게 설명한다.
《실시예 1》
[각 부재의 제작방법]
(1) 판정부의 블로킹제 및 세정제의 제작방법
증류수 1L에 트리스(히드록시메틸) 아미노메탄(이하 Tris로 나타낸다)를 0.1mol(12.1lg) 가하여 교반한 후, 1N의 HCl로써 pH8.2로 조정하고, 니트로셀룰로오즈의 세정제로 하였다. 또한, 상기의 세정제에 스킴밀크를 1Og 가하여 교반하여, 니트로셀룰로오즈의 블로킹제로 하였다.
(2) 판정부의 항체고정화방법
니트로셀룰로오즈의 니트로셀룰로오즈(미리포아사 제(製) HFM SPHF04020)를 크기 0.9cm×1.2cm로 재단한 두께 약 220μm(지지체를 포함한다)의 시트를 담체로 하였다. 이 시트의 위에, 시료도입부쪽으로부터 0.5cm, 흡액부쪽으로부터 0.7cm인 부분에, 인류융모성 성선자극 호르몬에 대한 항 hCGβ항체(α-hCGβ)의 인산완충용액(이하 PBS 용액으로 나타낸다) (5 mg/mL)을 도포하여, 40℃에서 8시간 차광 상태로 건조하였다. 건조후, 시트를 상기의 블로킹제에, 블로킹제가 30시트당 70mL의 비율이 되도록 침윤하여, 30℃에서 30분간 셰이커로써 블로킹하였다. 블로킹 후, 상기의 세정제(70 mL/30 시트)에 의해 30℃에서 30분간 세정하는 조작을 3회 반복한 후, 데시케이터 내에서 하룻밤 건조하였다.
(3) 첨가제 함침부의 제작방법
증류수 1L에 Tris를 1mo1(121.lg) 가하여 교반한 후, 1N의 HCl으로써 pH8.2로 조정하였다. 여기에 염화테트라메틸 암모늄(이하 TMA로 나타낸다) 1mol(109.6g)과 트리톤계 계면활성제 Triton X-100(이하 Triton으로 나타낸다)의 10% 수용액 1OmL을 가하여 교반하여, pH8.2의Tris(1M)-TMA(1M)-Triton(0.1%)용액을 제작하였다. 이것을 유리섬유 여과지(와트만사 제(製):F075-14)를 크기 0.9cm×6.0cm로 재단한 것에 0.36mL 함침시킨 후, 동결건조하였다.
(4) 표식부의 제작방법
a) 항 hCGα항체(α-hCGα) PBS용액(1Omg/mL)에 디티오비스(술포숙신이미딜프로피오네이트) (이하 DTSSP로 나타낸다)의 PBS용액(4.06mg/0.1mL)을 천천히 떨어뜨리고, 35℃에서 30분간 교반한 후, 분자량 분화 컬럼(파르마샤사 제: 세파덱스 G25M)으로써 겔여과하였다.
b) 겔여과후, 항 hCGα중합항체의 PBS용액(10mg/6mL)으로 되었다. 이것을 4℃로 보존하였다.
c) 소혈청알부민(BSA)의 PBS용액(11Omg/mL)으로 디티오스레이톨(DTT)77mg을 가하여, 실온에서 30분간 교반한 후(최종농도 7.7mg/mL), 조속히 분자량 분화컬럼(파르마샤사 제:세파덱스 G25M)으로써 겔여과하였다. 그 결과, SH기가 유리한 BSA(전체량 24mL)용액을 얻었다.
d) 상기 SH기가 유리한 BSA(전체량24 mL)에, b)의 4℃ 보존의 항 hCGα 중합항체의 PBS용액(1Omg/6mL)을 혼합하여, 4℃에서 20시간 교반하였다.
e) 미반응의 BSA를 제거하기 위해서 분자량 분화컬럼(파르마샤사제 :세파크릴 S300HR)으로써 겔여과하였다. 항 hCGα 중합항체-BSA(전체량40m L∼50mL)을 얻었다.
f) 여기에 상기 화2에 나타낸 시아닌계 색소(이하 SLIC3로 나타낸다)의 PBS용액(350mg/2mL)을 천천히 떨어뜨린 후, 4℃에서 20시간 교반하였다.
g) 미반응의 시아닌계 색소를 제거하기 위해서 분자량 분화칼럼 50cm과 150cm(파르마샤사 제:세파덱스 G25M)으로써 겔여과하였다. 항 hCGα중합항체-BSA-SLIC3(전체량 60mL∼90mL)를 얻을 수 있었다. 이것을 표식항체원액이라고 부른다.
h) 표식항체원액에 안정제로서 BSA와 스크로스를 각각 1% 첨가하였다.
i) 유리여과지(와트만사 제:F075-14)를 크기 0.9cm×5.0cm로 재단하고, 여기에 상기 안정제를 첨가한 표식항체원액을 1시트당 0.3mL의 비율로 함침한 후, 동결건조하였다.
j) 동결건조후, 차광건조상태로 보존하였다.
(5) 흡액부의 제작방법
유리섬유 여과지(와트만사 제:GF/D)을 크기 0.9cm×2.5cm로 재단하여, 이것을 6매 겹쳐 사용한다.
[시험편의 제작방법]
도 4에 본 실시예에 의한 시험편(20)의 구조를 나타낸다. 도 4는, 각 구성재의 사이즈는 반드시 정확히 나타내고 있지 않다.
크기 0.9cm×5.5cm의 양면 테이프(니치반사 제:TW-12SD)를 전체면에 펼친 크기 0.9cm×5.5cm, 두께 0.5mm의 배접(메이반사 제:965-05경질염화 비닐백)(21)의 표면에, 판정부(26), 그 하류쪽에 흡액부(27), 판정부(26)의 상류쪽에 표식부(24)를 각각 접착시키었다. 또한, 표식부(24)의 상류쪽에 유리섬유 여과지(와트만사 제:F075-14)의 크기 0.9cm×0.5cm인 것(23) 및 첨가제 함침부(22)를 차례로 접착시키고, 그 위에 표식부(24)로부터 첨가제 함침부(22)의 상부 전체에, 유리섬유 여과지(와트만사 제:FO75-14)의 크기 0.9 cm×3.5cm인 것 2장을 바이패스용 다공질체(25)로 하여 장착하였다. 이렇게 해서 얻은 시험편(20)을 중공의 케이스에 조립하였다.
이 시험편(20)은, 첨가제 함침부(22)의 끝단부쪽이 시료도입부를 겸하고 있다. 시료를 도면의 화살표(28)와 같이 시험편에 첨가하면, 주로 첨가제 함침부(22)로부터 유리섬유 여과지(23), 표식부(24)를 경유하여 판정부(26)에 이르는 유로(29a)와, 바이패스용 다공질체(25)로부터 표식부(24)의 끝단부를 경유하거나 또는 이것을 건너 판정부(26)에 이르는 유로(29b)로 흐른다. 도면에서는, 바이패스용 다공질체(25)의 끝단부에는 표식부(24)가 접하고 있으나, 표식부를 건너 직접 판정부(26)에 접하도록 하는 것이 보다 바람직하다.
이 구성에 의하면, 표식부(24) 전체를 통과하는 유로(29a)에 비해서 표식부(24)의 끝단부를 경유하거나 또는 이것을 건너 판정부에 이르는 유로(29b)에서는 후자의 유로쪽이 장해가 적고, 시료의 흐름은 빠르게 진행한다. 따라서, 전자의 유로(29a)는, 지연된 시료의 유로이다. 그 때문에, 시료를 도입하면, 표식부의 항체를 거의 포함하지 않은 시료가 우선 판정부에 도착하고, 일정한 시간이 경과한 후, 시료에 의해 용출된 표식항체가 판정부에 도착한다. 이 지연시간 동안에, 판정부에서는, 미리 항원이 어느 정도결합한 상태로 표식항체와 항원의 혼합물을 받아들이게 되고, 소량의 항원밖에 존재하지 않는 경우에도 효율적으로 이것을 받아들이는 것이 가능해진다.
그 결과, 시인성(視認性)이 높아지며, 감도가 향상한다. 이 구성에 의하면, 지연시간을 설치함으로써, 일견 반응시간은 걸리게 되지만, 실제로는 담지하는 표식항체의 절대량을 증가시키지 않고 감도향상을 도모할 수 있으므로, 백그라운드 소실의 시간이 감축되고, 전체로서는 반응시간은 단축되게 된다.
《비교예 1》
도 4의 시험편 가운데, 첨가제 함침부(22) 대신에 (23)과 같은 유리섬유 여과지를 사용하고, 또 바이패스용 다공질체(25)를 생략한 것 외에는 실시예 1과 동일하다.
상기 실시예 1의 시험편 및 비교예 1의 시험편을 사용한 면역 크로마토그라피장치에 대하여, 감도, 반응시간 및 시인성의 시험을 행하였다. 분석대상물은, 인류융모성 성선자극 호르몬(hCG)이다. 측정농도(감도)는 1O0,OOO IU/L∼0 IU/L, 시료도입부에 첨가하는 hCG 용액량은 O.45mL로 하였다. 이 경우의 반응시간은, hCG용액을 시료도입부에 첨가하고 나서, 고정화항체의 항 hCGβ항체와 표식항체의 항 hCGα항체가 hCG를 통해 반응하여 고정화부의 라인이 보이기 시작할 때까지의 시간이다. 또한, 시인성의 수치에 관해서는, 반사흡광도 측정(시마즈제작소 제:CS-9300)에 의한 것이고, 입사광 550nm(SLIC3의 흡수)에 대한 반사광의 강도를 측정하고 있다. O 설정은 미사용의 니트로셀룰로오즈이고, 반사광 강도의 측정시간은 크로마토그라피 종료후 30분 이내이다.
도 5는 시인성을 상기 흡광도로 비교한 것이며, 도 6은 속도의 비교를 나타내고 있다. 또한, 도면에는 나타나 있지 않으나, hCG농도가 10,OOO IU/L인 때는, 비교예 1에서는 시료첨가후 30초에 흡광도가 0.5에 달한 데 반하여, 본 실시예에서는 시료첨가후 20초에 흡광도가 0.7에 달하였다. 이들 결과로부터, 본 발명에 의한 면역 크로마토그라피장치는, 감도, 속도 및 시인성에 있어서 종래예에 해당하는 비교예 1에 비해서 우수한 것을 알 수 있다.
《실시예 2》
첨가제 함침부의 제작방법에 있어서, 실시예 1의 Tris(1M)-TMA(1M)-Triton(O.1%)용액 대신에 Tris(1M)-TMA(1M) 용액을 사용한 것 외에는 실시예 1과 같이 하여 시험편을 제작하였다.
《실시예 3》
첨가제 함침부의 제작방법에 있어서, 실시예 1의 Tris(1M)-TMA(1M)-Triton(O.1%)용액 대신에 Tris(1M)-Triton(O.1%)용액을 사용한 것 외에는 실시예 1과 같이 하여 시험편을 제작하였다.
《비교예 2》
실시예 2의 첨가제 함침부 대신에 (23)과 같은 유리섬유 여과지를 사용한 것 외에는 실시예 2와 동일하게 한 시험편을 제작하였다.
실시예 2, 3 및 비교예 2의 시험편을 사용한 면역 크로마토그라피장치에 대하여, 실시예 1과 같은 시험을 행한 결과를 도 7∼10에 나타낸다. 또한, 첨가제 함침부의 제작방법에 있어서, 실시예 1의Tris(1M)-TMA(1M)-Triton(O.1%)용액 대신에 각 pH의 Tris용액을 사용한 것 외에는 실시예 1과 같이 하여 시험편을 제작하였다. 이렇게 해서, 미리 정한 부피의 시료를 첨가하였을 때 시료의 pH가 각종치가 되도록 하였다. 시료분석시의 pH와 흡광도의 관계를 도 11에 나타낸다.
블랭크발색(O IU/L)의 원인은, 음전하를 갖는 색소표식항체와 양전하를 갖는 고정화항체와의 전기적 결합이기 때문에, 시험편에 전개시키는 시료액을 pH8.2로 조정하면, 고정화항체의 양전하를 부정하는 것이 가능해지며, 또한 양전하를 갖는 TMA를 첨가하면, 색소표식항체의 색소의 음전하를 부정하는 것이 가능해져, 블랭크의 발색을 제거할 수 있다(도 7 참조). 또한, 계면활성제를 첨가함으로써, 발색과 검출시간을 단축할 수 있다(도 10 참조).
《실시예 4》
표식부를 다음과 같이 하여 제작한 것 외에는 실시예 1과 같이 하여 시험편을 제작하였다.
표식부의 작성방법:
실시예 1의 표식부의 제작방법에 있어서, a)∼j)의 처리를 한 후, 그 위에 다음의 처리를 행하였다.
k) 동결건조한 표식부 함침여과지를 크기 0.9cm×0.1cm로 재단하였다. 이것을 표식부(24c)로 하였다.
l) 표식항체원액을 PBS로 4배로 희석한 것을 상기와 같은 방법으로 유리섬유 여과지에 함침한 후, 동결건조하여, 크기 0.9cm×0.1cm로 재단하였다. 이들을 표식부(24a) 및 (24b)로 하였다.
표식부(24a, 24b, 24c)를 동일 사이즈의 유리섬유 여과지(와트만사제:F075-14)로 이루어진 스페이서(30)를 끼워 도 12와 같이 배열하여 접착시켰다.
《실시예 5》
도 13에 나타내는 바와 같이, 실시예 4에 있어서 첨가제 함침부(22)를 설치하지 않고, 대신에 유리섬유 여과지(와트만사제:F075-14)로 구성한 것 외에는 실시예 4와 같이 하여 시험편을 제작하였다.
우선, 표식부를 분할하는 것에 의한 효과를 실증하기 위한 비교실험의 결과를 나타낸다.
본 실험에서 사용한 것은, 실시예 5의 시험편을 사용한 면역 크로마토그라피장치 및 표식부는 분할하지 않고 비교예용 표식부를 그 판정부쪽을 실시예 5에 있어서의 표식부(24c)와 동일한 장소가 되도록 한 것 외에는 실시예 5와 같은 시험편을 사용한 비교예의 장치이다. 요컨대, 양자에서 사용한 표식부 및 표식부에 담지된 표식항체의 전체량은 동일하다. 분석대상물에는 인류융모성 성선자극 호르몬(hCG)을 사용하였다. 또한, 반응의 정색의 측정은, 반사흡광도 측정(시마즈제작소 제:CS-9300)에 의한 것으로, 입사광 55Onm(SLIC3의 흡수)에 대한 반사광의 강도를 측정하고 있다. O 설정은 미사용의 니트로셀룰로오즈로 하였다. 0, 50, 1,000, 1O,O00 IU/L의 농도로 조정한 hCG의 인산완충액(PBS)을 시험편의 시료도입부에 첨가하고, 장치를 실온(25℃)속에서 수평으로 방치하여, 반응을 검출하였다.
도 14는 시료첨가 3분후의 각 hCG농도에 있어서의 흡광도(발색농도)를 측정한 결과를 나타내며, 도 15는 시료를 첨가하고 나서, 판정과 백그라운드에서의 흡광도의 차가 0.2가 될 때까지의 시간을 플롯한 것이다. 도 14에 나타내고 있는 바와 같이, hCG농도의 전체영역에 걸쳐, 본 실시예의 장치에서는 높은 발색을 나타내고 있다. 특히, 10,000 IU/L의 고농도 영역에서, 비교예에서는 발색이 내려가는 오동작이 발생하고 있는 데 반하여, 본 실시예에서는 이 농도에서도 정상적인 발색을 보이고, 본 발명에 의한 감도향상과, 다이나믹 레인지의 개선을 시사하고 있다. 또한, 도 15에 나타내고 있는 바와 같이, 발색시간(반응시간)은, 역시 hCG 전체영역에 있어서 비교예보다 가속되고 있다. 또한, 도면에서는 나타나고 있지 않지만, hCG농도가 1O,00O IU/L일 때는, 비교예에서는 시료첨가후 30초에 흡광도가 0.5에 달한 데 반하여, 본 실시예에서는 시료첨가후 20초에 흡광도가 0.7에 달하였다.
다음에, 실시예 4, 5및 실시예 1의 시험편을 사용한 크로마토그라피장치의 비교시험의 결과를 설명한다. 분석대상물에는 인류융모성 성선자극 호르몬(hCG)을 사용하였다. 상기와 같이 시인성에 관해서는 입사광 550nm 에 대한 반사광의 강도를 측정하였다. 0, 50, 100, 1000, 및 10000 IU/L의 농도로 조정한 hCG의 인산완충액(PBS)을 시험편의 시료도입부에 첨가하고, 실온(25℃)에서 수평으로 방치하였다. 시료첨가 3분후의 각 hCG농도에 있어서의 흡광도(발색강도)의 비교를 도 16에 나타낸다. 첨가제를 넣음과 동시에 표식부를 복수로 분할한 구성의 실시예 4는, 어느쪽인가 한쪽을 채택한 실시예 1 및 실시예 5에 비해서, 발색강도가 향상하고 있는 것을 알 수 있다. 또한, 오동작이 요인이 되는 0 IU/L 에 있어서의 발색도 완전히 제거할 수 있다.
이상과 같이 본 발명에 의하면, 검출시의 오동작이 요인이 될 수 있는 백그라운드의 착색이나 블랭크발색을 완전히 제거할 수 있다. 따라서, 본 발명의 면역 크로마토그라피장치를 사용하면, 모든 액체시료중의 항원을 정확하고 또한 신속하게 검출할 수 있다. 또한, 본 발명에 의하면, 표식항체를 최적의 조건으로 반응에 이용하는 것이 가능해지며, 검출속도의 향상, 검출감도의 증가, 및 검출감도의 다이나믹 레인지의 확대를 동시에 달성하는 것이 가능해진다.

Claims (15)

  1. 항원·항체의 특이적 결합반응에 의하여 수성시료액중의 항원을 검출하는 면역 크로마토그라피장치로서, 검출대상의 항원에 결합하는 적어도 2종의 항체, 및 상기 항체의 한쪽을 포함하는 표식부와 항체의 다른쪽을 포함하는 판정부를 시료도입부에 도입된 시료가 표식부를 지나서 판정부로 이동하도록 양자를 배열한 다공질 담체로 이루어지는 시험편을 구비하고, 상기 한쪽의 항체는 화학적으로 가시화처리가 실시되어 있고, 담체에 도입되는 시료액에 의해 용출하고, 담체내를 시료의 이동과 함께 이동할 수 있는 상태로 담체의 표식부에 함유되고, 다른쪽의 항체는 담체의 판정부에, 시료의 이동에 따른 위치의 변화가 일어나지 않은 강도로 고정화되어 있으며, 또한 상기 담체에는, 시료도입부에서 판정부까지의 사이에 첨가제 함침부가 설치되고, 첨가제 함침부에는 계면활성제, 암모늄염, 및 pH완충제로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 1종류가, 시료액에 의해 용출하고, 담체내를 시료의 이동과 함께 이동할 수 있는 상태로 담지되어 있는 것을 특징으로 하는 면역 크로마토그라피장치.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 표식부는 복수로 분할되어 있는 것을 특징으로 하는 면역 크로마토그라피장치.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 한쪽의 항체가, 금 콜로이드, 라텍스입자, 유기색소, 안료, 금속, 금속산화물, 및 효소로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 1종과 결합하여 가시화되어 있는 것을 특징으로 하는 면역 크로마토그라피장치.
  4. 제 1 항에 있어서, 가시화처리된 항체가 다음식으로 나타내지는 구조의 시아닌계 색소로 표식된 항체인 것을 특징으로 하는 면역 크로마토그라피장치.
  5. 제 1 항에 있어서, 계면활성제가 알킬페놀에테르계의 비이온계면활성제인 것을 특징으로 하는 면역 크로마토그라피장치.
  6. 제 1 항에 있어서, 암모늄염이 테트라메틸암모늄염인 것을 특징으로 하는 면역 크로마토그라피장치.
  7. 제 1 항에 있어서, 첨가제 함침부에서의 pH완충제의 담지량이, 담체의 시료도입부에 미리 정한 부피의 시료를 첨가하였을 때, 판정부에서의 시료의 pH가 8.0∼8.5의 범위가 되는 양인 것을 특징으로 하는 면역 크로마토그라피장치.
  8. 제 1 항에 있어서, pH 완충제가, 붕산, 2- (N-몰포리노)에탄술폰산, 트리스(히드록시메틸)아미노메탄, 및 인산으로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 1종인 것을 특징으로 하는 면역 크로마토그라피장치.
  9. 제 2 항에 있어서, 분할된 1개의 표식부에 담지된 표식항체의 함유량이 다른 표식부에 담지된 표식항체의 함유량과 다른 것을 특징으로 하는 면역 크로마토그라피장치.
  10. 제 9 항에 있어서, 분할된 표식부 가운데, 판정부에 가까운 쪽에 담지되는 표식항체의 함유량이 판정부에 먼 쪽의 표식부에 함유되는 표식항체의 양보다도 많은 것을 특징으로 하는 면역 크로마토그라피장치.
  11. 제 2 항에 있어서, 시료가 복수의 표식부를 직렬로 통과하여 판정부에 도착하는 유로 외에, 표식부의 일부를 경유하거나 또는 표식부를 전혀 경유하지 않고서 직접 판정부에 도착하는 유로를 갖는 것을 특징으로 하는 면역 크로마토그라피장치.
  12. 제 2 항에 있어서, 여러개의 표식부 사이에, 시료 및 표식항체의 이동을 허용하는 다공질재료가 개재하고 있는 것을 특징으로 하는 면역 크로마토그라피장치.
  13. 제 1 항에 있어서, 더욱, 상기 담체에는, 상기 시료도입부로부터 표식부의 끝단부를 경유하거나 또는 표식부를 경유하지 않고서 판정부에 도착하는 시료의 바이패스유로를 갖는 것을 특징으로 하는 면역 크로마토그라피장치.
  14. 항원·항체의 특이적 결합반응에 의하여 수성시료액 속의 항원을 검출하는 면역 크로마토그라피장치로서, 검출대상의 항원에 결합하는 적어도 2종의 항체, 및 상기 항체의 한쪽을 포함하는 표식부와 항체의 다른쪽을 포함하는 판정부를 시료도입부에 도입된 시료가 표식부를 지나서 판정부로 이동하도록 양자를 배열하여 설치한 다공질 담체를 구비하고, 상기 한쪽의 항체는, 화학적으로 가시화처리가 실시되어 있고, 담체에 도입되는 시료액에 용출하고, 담체내를 시료의 이동과 함께 이동할 수 있는 상태로 담체의 표식부에 함유되고, 다른쪽의 항체는, 담체의 판정부에, 시료의 이동에 따른 위치의 변화가 일어나지 않은 강도로 고정화되어 있고, 또한 상기 표식부는 복수로 분할되어 있는 것을 특징으로 하는 면역 크로마토그라피장치.
  15. 항원·항체의 특이적 결합반응에 의하여 수성시료액중의 항원을 검출하는 면역 크로마토그라피장치로서, 검출대상의 항원에 결합하는 적어도 2종의 항체, 및 상기 항체의 한쪽을 포함하는 표식부와 항체의 다른쪽을 포함하는 판정부를 시료도입부에 도입된 시료가 표식부를 지나서 판정부로 이동하도록 양자를 배열한 다공질 담체로 이루어지는 시험편을 구비하고, 상기 한쪽의 항체는 화학적으로 가시화처리가 실시되어 있고, 담체에 도입되는 시료액에 의해 용출하고, 담체내를 시료의 이동과 함께 이동할 수 있는 상태로 담체의 표식부에 함유되고, 다른쪽의 항체는 담체의 판정부에, 시료의 이동에 따른 위치의 변화가 일어나지 않는 강도로 고정화되어 있고, 또한, 상기 담체에는, 상기 시료도입부로부터 표식부의 끝단부를 경유하거나 또는 표식부를 경유하지 않고서 판정부에 도착하는 시료의 바이패스유로를 갖는 것을 특징으로 하는 면역 크로마토그라피장치.
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