DE69917908T2

DE69917908T2 - Verfahren zur Herstellung von wasserlöslichen,vernetzten Konjugaten

Info

Publication number: DE69917908T2
Application number: DE69917908T
Authority: DE
Inventors: Otto Allan LIHME; Christopher John Huntingdon STANLEY
Original assignee: Oakville Hong Kong Co Ltd
Current assignee: Oakville Hong Kong Co Ltd
Priority date: 1998-07-30
Filing date: 1999-07-29
Publication date: 2005-05-25
Anticipated expiration: 2019-07-30
Also published as: CN1180260C; CN1627070A; CA2336564A1; AU5027499A; PT1101115E; JP2002521693A; NO20010480L; DE69917908D1; CN1323294C; US6627460B1; JP4430234B2; EP1101115B1; EP1101115A1; CN1311856A; NO20010480D0; CA2336564C; EP1462802A1; ATE268905T1; AU755968B2; DK1101115T3

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft neue Verfahren zur Herstellung von wasserlöslichen, vernetzten Konjugaten und Konjugatkomplexen sowie neue wasserlösliche, vernetzte Konjugate und Konjugatkomplexe an sich. Die Konjugate und Konjugatkomplexe verleihen eine verbesserte Empfindlichkeit in immunochemischen Assays, insbesondere, wenn sie in Vorrichtungen mit lateralem Fluss und in Verfahren zum Bestimmen der Anwesenheit oder Abwesenheit von geringen Mengen an aktiven Komponenten, die in flüssigen Proben vorliegen, verwendet werden.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Es wurden intensive Forschungsbemühungen darauf verwendet, Wege zu entwickeln, die Verlässlichkeit und Empfindlichkeit von immunochemischen Assays, zum Beispiel in zu Hause durchzuführenden Schwangerschafts- und Fruchtbarkeitstests, zu verbessern, und folglich besteht ein anhaltender Bedarf an neuen und verbesserten Verfahren zur Herstellung von Konjugaten, welche ein hohes Maß an Empfindlichkeit und Genauigkeit aufweisen, wenn sie in derartigen immunochemischen Assays verwendet werden. Die Anzahl an "aktiven" Komponenten, wie zum Beispiel die Anzahl an, Antikörpern oder Antigenen, und die Anzahl an "nachweisbaren Einheiten", wie zum Beispiel Farbstoffinolekülen, die in dem Konjugat vorliegen, sind natürlich bei der Entwicklung von neuen Konjugaten zur Verwendung in hochempfindlichen immunochemischen Assays höchst wichtig.
Verschiedene Strategien zur Verbesserung der Empfindlichkeit und Verlässlichkeit von Immunoassays wurden von L. J. Kricka (1994) Clin. Chem. 40, 347–357 besprochen.
EP-B-0 594 772 betrifft wasserlösliche Konjugate auf Polymerbasis, welche Einheiten umfassen, die von Divinylsulfon abgeleitet sind. EP-B-0 594 772 beschreibt die Möglichkeit, die Bindung von molekularen Spezies, wie zum Beispiel Antikörpern und Antigenen, an ein wasserlösliches Trägermolekül durch Ausnutzung des so genannten „Aussalzeffektes" zu verbessern. Es zeigte sich jedoch, dass sich durch Erhöhung der Salzkonzentration auf etwa 1 M ein irreversibler Niederschlag bildete.
Es ist nun überraschenderweise gefunden worden, dass sich durch weitere Erhöhung der Konzentration von Salz in dem Reaktionsgemisch ein reversibler (d. h. ein wieder auflösbarer) Niederschlag bildet, welcher "große" wasserlösliche Konjugate enthält, die in verschiedenen immunochemischen Assays, wie zum Beispiel in Vorrichtungen mit lateralem Fluss, nützlich sind.
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
In einer ersten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines wasserlöslichen, vernetzten Konjugats, das Einheiten von mindestens einer Trägerkomponente, Einheiten von mehr als einer Verbindungskomponente, Einheiten von mindestens einer Spacerkomponente, Einheiten von mindestens einer Signalkomponente und Einheiten von mindestens einer primären Zielkomponente umfasst, wobei die Signalkomponente kovalent an die Spacerkomponente und die Spacerkomponente über die Verbindungskomponente kovalent an die Trägerkomponente gebunden ist, wobei das Verfahren umfasst:

a) Umsetzen eines wasserlöslichen Zwischenproduktkonjugats, das Einheiten von mindestens einer Trägerkomponente, Einheiten von mehr als einer Verbindungskomponente, Einheiten von mindestens einer Spacerkomponente, Einheiten von mindestens einer Signalkomponente umfasst, wobei die Signalkomponente kovalent an die Spacerkomponente und die Spacerkomponente über die Verbindungskomponente kovalent an die Trägerkomponente gebunden ist, durch Umsetzen von nicht umgesetzten, reaktiven Einheiten, die von der Verbindungskomponente abgeleitet sind, mit mindestens einer primären Zielkomponente in einer wässrigen Lösung, wobei die Bedingungen so sind, dass ein reversibler Niederschlag gebildet wird;
b) Wiederauflösen des reversiblen Niederschlags, der das wasserlösliche, vernetzte Konjugat umfasst, in einem wässrigen Medium; und
c) gegebenenfalls Unterziehen des wasserlöslichen, vernetzten Konjugats einem Reinigungsschritt.

Im vorliegenden Zusammenhang bedeutet der Begriff "wasserlöslich", wenn er im Zusammenhang mit den vernetzten Konjugaten verwendet wird, dass die nach den hier offenbarten Verfahren erhaltenen Konjugate in einem wässrigen Medium, wie zum Beispiel Wasser, bei Raumtemperatur löslich sein sollten, d. h. die vernetzten Konjugate, die durch die hier offenbarten Verfahren erhalten werden, sollten eine Lösung ergeben, welche im Wesentlichen klar und homogen ist, wie es durch eine visuelle Untersuchung der Probe beurteilt wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung haben die vernetzten Konjugate, die durch die hier offenbarten Verfahren erhalten werden, eine Wasserlöslichkeit von mindestens 0,1, vorzugsweise mindestens 1, wie zum Beispiel mindestens 10, stärker bevorzugt mindestens 50, wie zum Beispiel mindestens 100, insbesondere mindestens 200 mg trockenes Konjugat pro ml Wasser bei 25°C.
Vor einer genauen Besprechung in Bezug auf den oben erwähnten Niederschlagsschritt ist anzumerken, dass das wasserlösliche Zwischenproduktkonjugat durch ein Verfahren hergestellt werden kann, umfassend:

I) Umsetzen mindestens einer wasserlöslichen Trägerkomponente mit mehr als einer Verbindungskomponente in einer wässrigen Lösung bei einem pH-Wert von mehr als 7, um eine wässrige Lösung zu bilden, welche einen wasserlöslichen Zwischenproduktvorläufer enthält, welcher wasserlösliche Einheiten der Trägerkomponente umfasst, an die reaktive Einheiten, die von der Verbindungskomponente abgeleitet sind, gebunden sind;
II) gegebenenfalls Unterziehen des wasserlöslichen Zwischenproduktvorläufers einem Reinigungsschritt;
III) Umsetzen des gegebenenfalls gereinigten, wasserlöslichen Zwischenproduktvorläufers durch Umsetzung der reaktiven Einheiten mit
i) mindestens einer Spacerkomponente in einer wässrigen Lösung mit einem pH-Wert von mehr als 7, um einen zweiten wasserlöslichen Zwischenproduktvorläufer zu bilden, wobei die Bedingungen so sind, dass nur eine Fraktion der reaktiven Einheiten mit der Spacerkomponente umgesetzt wird und dass eine wesentliche Menge an nicht umgesetzten reaktiven Einheiten verbleibt,
ii) gegebenenfalls Unterziehen des zweiten wasserlöslichen Zwischenproduktvorläufers einem Reinigungsschritt, und
iii) Umsetzen des gegebenenfalls gereinigten zweiten wasserlöslichen Zwischenproduktvorläufers durch Umsetzung der Spacerkomponente mit mindestens einer Signalkomponente in einer wässrigen Lösung bei einem pH-Wert von mehr als 7, um ein wasserlösliches Zwischenproduktkonjugat zu bilden, wobei die Bedingungen so sind, dass der größte Teil der Signalkomponenten eher mit der Spacereinheit als mit der Verbindungskomponente umgesetzt wird und dass eine wesentliche Menge an nicht umgesetzten reaktiven Einheiten der Verbindungskomponente nicht umgesetzt bleibt (d. h. nur eine kleine Fraktion der Signalkomponenten wird mit den reaktiven Einheiten der Verbindungskomponenten umgesetzt); und
IV) gegebenenfalls Unterziehen des in Schritt III) erhaltenen wasserlöslichen Zwischenproduktkonjugats einem Reinigungsschritt.

Das in allgemeiner Weise oben in den Schritten I–IV umrissene Verfahren und die dort erwähnten Komponenten sind schematisch in 4 dargestellt. Die Figur ist nur für Zwecke der Klarheit zu verwenden, da sie einzelne Beispiele einer Ausführungsform darstellt. Dort sind die verschiedenen Stufen von Zwischenprodukten und Vorläufern, welche Teil des Verfahrens sind, schematisch dargestellt, um es dem Leser zu ermöglichen, dem Vorgang zu folgen.
Die wasserlösliche Trägerkomponente
Der Begriff "Trägerkomponente" im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung wird verwendet, um das "Rückgrat" des Konjugats, d. h. die Trägerkomponentenfunktionen als ein Rückgrat, auf das verschiedene Moleküle gebunden werden können, zu bezeichnen.
Die wasserlöslichen Polymere, welche als die Trägerkomponente im Verfahren zur Herstellung von Konjugaten wirken, können aus einer großen Vielfalt von Arten von Polymeren ausgewählt werden, einschließlich:
natürlicher und synthetischer Polysaccharide sowie Derivate davon, zum Beispiel Dextrane und Dextranderivate, Stärken und Stärkederivate, Cellulosederivate, Amylose und Pektin, sowie bestimmte natürliche Gummiarten und Derivate von diesen, wie zum Beispiel Gummi arabicum und Salze von Alginsäure;
Homopoly(aminosäure)n mit geeigneten reaktiven Funktionalitäten, wie zum Beispiel Polylysine, Polyhistidine oder Polyornithine;
natürlicher und synthetischer Polypeptide und Proteine, wie zum Beispiel Rinderserumalbumin und andere Albumine von Säugern; und
synthetischer Polymere mit nukleophilen funktionellen Gruppen, wie zum Beispiel Polyvinylalkohole, Polyallylalkohol, Polyethylenglycole und substituierte Polyacrylate.
Für die Zwecke der Erfindung sehr gut geeignete Polymere sind Polysaccharide und Derivate davon, zum Beispiel: Dextrane; Carboxymethyldextrane, Hydroxyethyl- und Hydroxypropylstärken, Glycogen, Agarosederivate und Hydroxyethyl- und Hydroxypropylcellulosen. Wie aus den Arbeitsbeispielen hier (siehe nachstehend) ersichtlich wird, haben sich insbesondere Dextrane als besonders geeignete Polymere im Zusammenhang mit der Erfindung erwiesen, und sie sind derzeit die am stärksten bevorzugten Trägerkomponenten.
Wie bereits angegeben, ist es, insbesondere für viele der immunochemischen Anwendungen der Konjugate, oft wünschenswert, dass die Konjugate keine oder im Wesentlichen keine Gesamtladung aufweisen, da das Vorliegen einer positiven oder negativen Gesamtladung in solchen Fällen unter anderem zu einem unerwünschten, nicht-spezifischen Binden der Konjugate an Substanzen und/oder Materialien, welche nicht von Interesse sind, führen kann. In vielen Fällen wird diese Bedingung, wenn keine geladenen Spezies eingeführt werden, einfach erfüllt werden, indem sichergestellt wird, dass die polymere Trägerkomponente selber keine Gesamtladung besitzt. Somit ist eine bevorzugte polymere Trägerkomponente zur Verwendung in dem Verfahren der Erfindung in ihrem freien Zustand im Wesentlichen linear und im Wesentlichen bei einem pH-Wert im Bereich von etwa 4 bis etwa 10 nicht geladen, wobei dieser pH-Wert-Bereich der Bereich von praktischer Bedeutung für die überwiegende Mehrheit von immunochemischen Verfahren, Hybridisierungsverfahren und anderen Anwendungen von Konjugaten ist. Unter verschiedenen Polymeren, welche dieses Kriterium erfüllen, befinden sich zum Beispiel zahlreiche Polysaccharide und Polysaccharidderivate, z. B. Dextrane und Hydroxyethyl- und Hydroxypropylcellulosen.
Abhängig von der Verwendung eines Konjugats können die Konjugate auf wasserlöslichen polymeren Trägerkomponenten mit einem Bereich von Molekulargewichten basieren. In einer Ausführungsform der Erfindung kann die polymere Trägerkomponente ein Peak-Molekulargewicht im Bereich von etwa 40.000 bis etwa 40.000.000 haben (vor dem Umsetzen der wasserlöslichen polymeren Trägerkompomenten mit einem Verbindungsreagenz, wie zum Beispiel DVS oder EPCH, oder Umsetzen des resultierenden wasserlöslichen Zwischenproduktvorläufers mit einer Spacer- oder Signalkomponente für die abschließende Bildung von vernetztem Konjugat und vernetzten Konjugatkomplexen). Peak-Molekulargewichte, welche von wesentlichem Interesse sind, sind Peak-Molekulargewichte im Bereich von 100.000 bis 10.000.000, wie zum Beispiel im Bereich von 500.000 bis 8.000.000, vorzugsweise im Bereich von 500.000 bis 4.000.000, z. B. im Bereich von 500.000 bis 2.000.000. Peak-Molekulargewichte von besonderem Interesse, insbesondere im Fall von Dextranen als polymere Trägerkomponenten, sind Peak-Molekulargewichte von etwa 500.000, etwa 1.000.000, etwa 1.500.000, etwa 2.000.000, 2.500.000, etwa 3.000.000, etwa 3.500.000 und etwa 4.000.000.
Genauer werden Dextrane im Molekulargewichtsbereich von 20.000 bis 2.000.000 als Ausgangsträgerkomponenten bevorzugt. Am genauesten werden 20.000 Da-Dextrane für Komplexe unter Verwendung von Streptavidin als das primäre oder sekundäre Ziel bevorzugt, ohne darauf beschränkt zu sein. Des Weiteren werden 500.000 Da-Dextrane für Konjugate und/oder Komplexe unter Verwendung von bestimmten Farbstoffen, Enzymen und mit bestimmten spezifischen Bindungsmolekülen als das primäre oder sekundäre Ziel bevorzugt, ohne darauf beschränkt zu sein. Außerdem werden 2.000.000 Da-Dextrane für bestimmte andere Farbstoffe bevorzugt, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein.
Der Begriff "Peak-Molekulargewicht", wie er in der vorliegenden Beschreibung und in den Ansprüchen im Zusammenhang mit den Trägerkomponenten verwendet wird, bezeichnet das Molekulargewicht mit der größten Häufigkeit, d. h. das Molekulargewicht unter einer Verteilung von Molekulargewichten, welches die größte Anzahl an Molekülen in einer gegebenen Probe oder Charge des Polymers hat. Es ist wegen der Schwierigkeit (insbesondere bei den höchsten Molekulargewichten), polymere Fraktionen mit einer sehr engen Molekulargewichtsverteilung zu erhalten oder herzustellen, ganz normal, zahlreiche Arten von Polymeren auf diese Weise zu charakterisieren. Im Fall von zahlreichen im Handel erhältlichen Trägerkomponenten, welche im Zusammenhang der Erfindung von Interesse sind, zum Beispiel Dextrane, wird der Hersteller oder Vertreiber in der Lage sein, verlässliche Daten des Peak-Molekulargewichts (zum Beispiel durch Gelchromatographie bestimmt) zur Verfügung zu stellen, welche eine Basis für die Auswahl der geeigneten Fraktion der polymeren Trägerkomponente schaffen können. Es sei hier erwähnt, dass Peak-Molekulargewichtswerte (wenn sie in Verbindung mit der Trägerkomponente verwendet werden), die in der vorliegenden Beschreibung und in den Ansprüchen angegeben sind, sich auf das Peak-Molekulargewicht des betreffenden freien Polymers beziehen und zum Beispiel die mögliche Bildung von vernetzten Polymereinheiten, z. B. als Ergebnis einer Vernetzung von zwei oder mehr Polymermolekülen durch Umsetzung mit einer Verbindungskomponente, wie zum Beispiel DVS oder EPCH, während eines Verfahrens zur Herstellung eines Konjugats nicht berücksichtigen; derartige vernetzte Einheiten werden im Durchschnitt höhere Molekulargewichte aufweisen als die einzelnen freien Polymermoleküle, aus denen sie gebildet sind.
Bildung des wasserlöslichen Zwischenproduktvorläufers
In dem vorliegenden Zusammenhang soll der Begriff "Verbindungskomponente" bifunktionelle Moleküle abdecken, die kovalente Verbindungen zwischen anderen – typischerweise größeren – Molekülen herstellen können. Beispiele für Verbindungskomponenten, welche für das Verfahren gemäß der Erfindung geeignet sind, sind z. B. Moleküle, die ein bifunktionelles Reaktionsvermögen umfassen, wie zum Beispiel Glutaraldehyd, Carbodiimide, N,N'-Phenylendimaleimid, N-Succinimidyl-3-(2-pyridylthio)propionat, p-Benzochinon, Bis-oxirane, Divinylsulfon (DVS) und Epoxidderivate, wie zum Beispiel Epoxide der allgemeinen Formel I:
wobei R₁ ein Wasserstoffatom oder C_1-4-Alkyl ist, n eine ganze Zahl im Bereich von 1 bis 4, d. h. 1, 2, 3 oder 4, ist und X eine Abgangsgruppe, wie zum Beispiel Tosyl, Mesyl oder ein Halogenatom ist, wie zum Beispiel ein Fluor-, Chlor-, Brom- oder Iodatom, vorzugsweise ein Chloratom.
In dem vorliegenden Zusammenhang bezeichnet der Begriff "C_1-4-Alkyl" einen geraden oder verzweigten gesättigten Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, wie zum Beispiel Methyl, Ethyl, n-Propyl, n-Butyl, Isopropyl, Isobutyl usw.
Wie aus den Arbeitsbeispielen, die hier vorgesehen sind, ersichtlich wird, ist eine sehr viel versprechende, von Epoxid abgeleitete Verbindungskomponente Epichlorhydrin (EPCH), d. h. eine Verbindung der obigen allgemeinen Formel I, in welcher R₁ ein Wasserstoffatom ist, n 1 ist und die Abgangsgruppe X Chlor ist.
Vorzugsweise sollte die Verbindungskomponente in einer wässrigen Umgebung stabil sein und demnach stellt die Verbindungskomponente EPCH zusammen mit der Verbindungskomponente DVS die derzeit am stärksten bevorzugte Verbindurgskomponente zur Verwendung in dem Verfahren der Erfindung dar.
Der erste Schritt, d. h. Schritt I), in welchem der wasserlösliche Zwischenproduktvorläufer gebildet wird, wird zweckmäßigerweise in einer wässrigen Lösung bei einem pH-Wert von mehr als 7, wie zum Beispiel mehr als 8,5, insbesondere mehr als 9, wie zum Beispiel mehr als 10, zum Beispiel bei einem pH-Wert um 10, 10,5, 11 oder 11,5 durchgeführt. In ihrer allgemeinsten Form kann die Umsetzung bei einer Temperatur im Bereich von 0 bis 60°C erfolgen, obwohl eine Temperatur im Bereich von 20 bis 25°C oft gut geeignet sein wird, wie zum Beispiel für Trägerkomponenten, wie zum Beispiel Dextrane, in den hier angegebenen Arbeitsbeispielen veranschaulicht ist. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der pH-Wert, bei welchem die Umsetzung erfolgt, im Allgemeinen im Bereich von etwa 10 bis 11,5, welches ein pH-Wert-Bereich ist, in welchem die reaktiven Funktionalitäten auf den meisten Arten von Trägerkomponenten gegenüber den derzeit bevorzugten Verbindungskomponenten DVS und EPCH reaktiv sind.
Was die Konzentration der Trägerkomponente in der wässrigen Lösung betrifft, wird sie im Allgemeinen im Bereich von 0,1 bis 20% Gew./Vol. und oft im Bereich von 0,5 bis 10% Gew./Vol., wie zum Beispiel im Bereich von 0,5 bis 5% Gew./Vol., insbesondere im Bereich von 0,5 bis 2% Gew./Vol., wie zum Beispiel etwa 0,5% Gew./Vol., etwa 1% Gew./Vol., etwa 1,5% Gew./Vol. oder etwa 2% Gew./Vol. liegen. Die Konzentration der Verbindungskomponente in der wässrigen Lösung wird im Allgemeinen im Bereich von 0,1–35% Vol./Vol., je nach der tatsächlich verwendeten Verbindungskomponente, liegen. Die Konzentration der derzeit bevorzugten Verbindungskomponenten, d. h. DVS und EPCH, in der wässrigen Lösung ist typischerweise im Bereich von 0,1 bis 15% Vol./Vol. im Fall von DVS und oft im Bereich von 1 bis 10% Vol./Vol.. Im Fall von EPCH ist die Konzentration typischerweise im Bereich von 1 bis 30% Vol./Vol. und oft im Bereich von 3 bis 20% Vol./Vol.. In dem Fall, in dem das Reagenz zur Herstellung der Verbindungskomponente ein Feststoff ist, wird in Betracht gezogen, dass die Konzentration im Allgemeinen im Bereich von 0,1 bis 10% Gew./Vol. liegt.
Es ist schwierig, allgemeine Richtlinien bezüglich der Zeitdauer anzugeben, während welcher die Umsetzung der Verbindungskomponente mit der Trägerkomponente in der wässrigen Lösung ablaufen sollte, da diese recht erheblich variieren wird, abhängig z. B. von der Temperatur und dem pH-Wert, bei denen die Umsetzung erfolgt, der Konzentration der Trägerkomponente und der Konzentration der Verbindungskomponente in dem Reaktionsgemisch, der Art und/oder dem Molekulargewicht der Trägerkomponente und der Art der Verbindungskomponente und dem Ausmaß, bis zu dem die Vernetzung des Trägers (z. B. durch Umsetzung mit DVS) ablaufen kann, bis zum Beispiel eine Gefahr des Gelierens oder Niederschlags besteht.
Die betreffende Reaktionszeit wird jedoch normalerweise im Bereich von 5 Minuten bis 10 Stunden liegen. Wie aus den hier angegebenen Arbeitsbeispielen ersichtlich sein wird, ist die erforderliche Reaktionszeit, wenn DVS als die Verbindungskomponente verwendet wird, typischerweise im Bereich von 5 bis 120 Minuten, wie zum Beispiel im Bereich von 15 bis 60 Minuten, z. B. etwa 30 Minuten, während die Aktivierung der Trägerkomponente mit EPCH im Allgemeinen eine längere Reaktionszeit erfordert, typischerweise im Bereich von 1 bis 10 Stunden, wie zum Beispiel im Bereich von 3 bis 7 Stunden, z. B. etwa 5 Stunden.
Wie bereits besprochen, sind an die Trägerkomponente in dem wasserlöslichen Zwischenproduktvorläufer eine oder mehrere Einheiten, die von einer bifunktionellen Verbindungskomponente abgeleitet sind, gebunden, wobei jede der Einheiten durch eine kovalente Verbindung, die zwischen einer der beiden funktionellen Gruppen der bifunktionellen Verbindungskomponente und einer reaktiven Funktionalität auf der Trägerkomponente gebildet ist, verbunden ist. Wie klar sein wird, ist die verbleibende funktionelle Gruppe der bifunktionellen Verbindungskomponente frei ("hängend") und folglich in der Lage, mit z. B. primären Zielkomponenten, Spacerkomponenten und/oder Signalkomponenten unter geeigneten Bedingungen (siehe nachstehend) zu reagieren.
Die "Ladung", d. h. die Anzahl der Verbindungsgruppen, die an die Trägerkomponente gebunden wird [in Schritt I)], liegt typischerweise im Bereich von etwa 1 bis etwa 5.000 μMol Verbindungskomponenten pro Gramm Trägerkomponente, wie in jedem der folgenden Unterbereiche (ausgedrückt als μMol Verbindungskomponente pro Gramm Trägerkomponente): etwa 1 bis etwa 50; etwa 50 bis etwa 300; etwa 300 bis etwa 1.000 oder etwa 1.000 bis etwa 5.000. Die Anzahl der Verbindungsgruppen, die an die Trägerkomponente gebunden sind, kann durch an sich bekannte Titrierverfahren bestimmt werden, z. B. durch das Thiosulphat-Titrierverfahren, welches in Porath et al. (1975) J. Chromatogr. 103, 49, beschrieben ist. Wie aus hier angegebenen Beispielen ersichtlich ist, reicht die typische "Ladung" des Verbinders, ausgedrückt in μMol Verbinder pro Gramm Träger, von etwa 300 bis mehr als 2000. Somit sollte in bevorzugten Ausführungsformen dieser Ausführungsform der Erfindung der Bereich von etwa 1 bis etwa 5.000 μMol Verbindungskomponenten pro Gramm Trägerkomponente, insbesondere zwischen 200 und 3000, vorzugsweise zwischen 500 und 2500, liegen.
Der optionale Reinigungsschritt (Schritt II) kann zum Beispiel ein Verfahren, wie zum Beispiel Dialyse (zur Entfernung von überschüssigem Reagenz oder anderen Spezies mit geringem Molekulargewicht) oder eine Chromatographietechnik, die für diesen Zweck geeignet ist, wie zum Beispiel Gelfiltration, beinhalten. Es sollte jedoch selbstverständlich sein, dass die oben erwähnten Reinigungsverfahren nur als Beispiele erwähnt sind, und der Fachmann wird in der Lage sein, das geeignetste Reinigungsverfahren in jedem einzelnen Fall zu wählen, welches von den im Kopplungsschritt verwendeten tatsächlichen Bedingungen, den im Kopplungsschritt verwendeten tatsächlichen Bestandteile sowie der verfügbaren Ausrüstung am Herstellungsort abhängen kann.
Trägerkomponenten (welche, wie oben erklärt, das "Rückgrat" der Konjugate bilden), welche zur Verwendung in dem Verfahren der Erfindung geeignet sind, sind vorzugsweise anfänglich nicht vernetzt und haben im Wesentlichen keine Ladung bei pH-Werten, die innerhalb der Anwendungsgebiete der Erfindung relevant sind.
Auf Grund der Art der in dem Verfahren gemäß der Erfindung verwendeten Kopplungschemie, d. h. die Erstellung von kovalent gebundenen, reaktiven Einheiten, die von bifunktionellen Molekülen abgeleitet sind, wie zum Beispiel DVS und EPCH, auf der Trägerkomponente, wird es im Allgemeinen erforderlich sein, dass eine reaktive Funktionalität, vorzugsweise eine nukleophile Funktionalität, auf der Trägerkomponente vorliegt. Geeignete Trägerkomponenten werden dann zum Beispiel polymere Trägerkomponenten mit funktionellen Gruppen sein, wie zum Beispiel: -O^– (z. B. deprotonierte phenolische Hydroxygruppen, wie zum Beispiel deprotonierte aromatische Hydroxygruppen in Tyrosinresten von Polypeptiden oder Proteinen), -S^– (z. B. deprotonierte Thiolgruppen an aromatischen Ringen oder aliphatischen Gruppen, wie zum Beispiel deprotonierte Thiolgruppen in Cysteinresten von Polypeptiden oder Proteinen), -OH (z. B. aliphatische Hydroxygruppen an Zuckerringen, wie zum Beispiel Glucose oder andere Monosaccharidringe in Oligo- oder Polysacchariden; oder alkoholische Hydroxygruppen in Polyolen, wie zum Beispiel Polyvinylalkohol; oder Hydroxygruppen in bestimmten Aminosäureresten von Polypeptiden oder Proteinen, wie zum Beispiel Serin- oder Threoninreste), -SH (z. B. Thiolgruppen in Cysteinresten von Polypeptiden oder Proteinen), primäre Aminogruppen (z. B. in Lysin- oder Ornithinresten von Polypeptiden oder Proteinen; oder in Amino-substituierten Zuckerringen in bestimmten Polysacchariden oder Derivaten davon, wie zum Beispiel Chitosan) oder sekundäre Aminogruppen (z. B. in Histidinresten von Polypeptiden oder Proteinen). Wie dem Fachmann klar sein wird, hängt die Frage, ob die oben erwähnten funktionellen Gruppen in einem protonierten oder deprotonierten Zustand sein werden, natürlich von den gewählten Reaktionsbedingungen ab, wie zum Beispiel dem pH-Wert des Reaktionsgemischs.
Aus ähnlichen Gründen wird die betreffende funktionelle Gruppe auf Zielkomponenten und Spacerkomponenten (siehe nachstehend) im Zusammenhang der Erfindung normalerweise auch eine nukleophile Funktionalität sein, wie zum Beispiel eine nukleophile Funktionalität einer der oben beschriebenen Arten.
Bildung des zweiten wasserlöslichen Zwischenproduktvorläufers
In Schritt IIIi) des Verfahrens der Erfindung ist die Spacerkomponente durch Umsetzung mit der Verbindungskomponente kovalent an den wasserlöslichen Zwischenproduktvorläufer gebunden und bildet dadurch einen zweiten wasserlöslichen Zwischenproduktvorläufer.
Wie oben angegeben, ist die "Spacerkomponente" über die Verbindungsgruppe kovalent an die Trägerkomponente gebunden. Somit soll der Begriff "Spacerkomponente", wenn er in dem vorliegenden Zusammenhang verwendet wird, ein Protein oder ein Polypeptid bedeuten, bei welchem eine Mehrzahl von Stellen zur kovalenten Bindung von Signalkomponenten, wie zum Beispiel Farbstoffen, verfügbar sind (siehe nachstehend).
Ein Zweck der Einbringung einer Spacerkomponente, und insbesondere eines Spacers mit einer Mehrzahl an Stellen, die zur kovalenten Bindung von Signalkomponenten verfügbar sind, besteht darin, dass dieses Verfahren ein geeignetes Mittel zur Erhöhung der Anzahl an Signalkomponenten ist, welche an das Konjugat gebunden werden können (d. h. der "Ladung" der Signalkomponente in dem wasserlöslichen Zwischenproduktkonjugat, siehe vorstehend), und dadurch ein geeignetes Mittel zur Erhöhung der Empfindlichkeit derartiger Konjugate ist, wenn sie in verschiedenen Assays, z. B. immunochemischen Assays und in den hier beschriebenen Vorrichtungen mit lateralem Fluss verwendet werden (siehe nachstehend). Es sollte selbstverständlich sein, dass eine Ausführungsform, in welcher die Kopplung einer Signalkomponente (wie zum Beispiel eines Farbstoffmoleküls) direkt an die Verbindungskomponente erfolgt (und nicht durch eine Spacerkomponente) impliziert, dass (zumindest prinzipiell) nur ein Signalmolekül pro Molekül Verbindungskomponente, die in dem Konjugat vorliegt, gebunden ist.
In mehreren Ausführungsformen der Herstellung des zweiten wasserlöslichen Vorläufers reicht die Anzahl an Mol des Spacers pro Mol Ausgangsdextran (die "Ladung" des Spacers) von 1 bis 500, insbesondere von 2 bis 100, am häufigsten von 5 bis 75. Auch kann, wie hier in Beispiel 3A genau erklärt, das zweite wasserlösliche Zwischenprodukt (und somit die Effizienz der in Schritt IIIi) durchgeführten Umsetzung) auch z. B. durch die Anzahl (Mol) an Spacerkomponenten, die pro Mol Trägerkomponente gebunden sind, charakterisiert werden.
Wie zuvor angegeben, reagiert nur eine Fraktion der reaktiven Einheiten der Verbindungskomponente des wasserlöslichen Zwischenprodukts mit der Spacerkomponente. Abhängig von der Spacerkomponente und der Verbindungskomponente bleiben nach der Umsetzung der Spacerkomponente 1 bis 99% der nicht umgesetzten reaktiven Einheiten der Verbindungskomponente, vorzugsweise 20 bis 99%, insbesondere 30 bis 99%, wie zum Beispiel im Bereich von 40 bis 99% und insbesondere 50 bis 99%, nicht umgesetzt. Das heißt, dass in einer Ausführungsform unter bestimmten Bedingungen 1 bis 49% der nicht umgesetzten Verbindungseinheiten mit der Spacerkomponente umgesetzt wurden.
Vorzugsweise ist die Spacerkomponente ein Protein, wie zum Beispiel BSA, Ovalbumin, Globulin usw., oder ein Polypeptid, wie zum Beispiel Homopolypeptide, z. B. Polylysine, Polyhistidine, Polyornithine, usw. Wie es einem Fachmann jedoch klar sein wird, hängt die Auswahl der Spacerkomponente von der verwendeten Signalkomponente (z. B. dem tatsächlichen, in einem besonderen Konjugat verwendeten Farbstoff) sowie der verwendeten Verbindungskomponente ab.
Das Molekulargewicht der Spacerkomponente, z. B. eines Proteins, beträgt vorzugsweise mindestens 10.000 Da, vorzugsweise im Bereich von 10.000 bis 2.000.000, wie zum Beispiel im Bereich von 20.000 bis 500.000. Da das eine der Merkmale der eingebrachten Spacerkomponenten darin besteht, die Anzahl an verfügbaren Positionen zur Einbringung der Signalkomponenten zu vervielfachen, wird es des Weiteren bevorzugt, dass die Anzahl an verfügbaren funktionellen Gruppen zur Bindung von Signalkomponenten mindestens 5 pro Molekül Spacerkomponente, vorzugsweise 10 bis 1.000, insbesondere 10 bis 500, beträgt.
In einer anderen Ausführungsform kann die Spacerkomponente ein Polysaccharid oder eine Polynukleinsäure sein. Chemische Modifikationen dieser Polymere können vor der Herstellung des wasserlöslichen Zwischenproduktkonjugats erforderlich sein.
Wie zuvor angegeben, liegt auf Grund der Art der Kopplungschemie auf der Spacerkomponente (sowohl zur Verbindungskomponente bei der Bildung des zweiten wasserlöslichen Zwischenproduktvorläufers als auch später zu einer Signalkomponente bei der Bildung des wasserlöslichen Zwischenproduktkonjugats, siehe nachstehend) eine reaktive Funktionalität, wie zum Beispiel eine nukleophile Funktionalität, auf der Spacerkomponente vor. Geeignete Spacerkomponenten werden dann zum Beispiel diejenigen mit nukleophilen funktionellen Gruppen sein, wie zum Beispiel: -O^– (z. B. deprotonierte phenolische Hydroxygruppen, wie zum Beispiel deprotonierte aromatische Hydroxygruppen in Tyrosinresten von Polypeptiden oder Proteinen), -S^– (z. B. deprotonierte Thiolgruppen an aromatischen Ringen oder aliphatischen Gruppen, wie zum Beispiel deprotonierte Thiolgruppen in Cysteinresten von Polypeptiden oder Proteinen), -OH (z. B. aliphatische Hydroxygruppen, die in bestimmten Aminosäureresten oder Polypeptiden oder Proteinen, wie zum Beispiel Serin- oder Threoninresten, vorliegen), -SH (z. B. Thiolgruppen in Cysteinresten von Polypeptiden oder Proteinen), primäre Aminogruppen (z. B. in Lysin oder Ornithinresten von Polypeptiden oder Proteinen) oder sekundäre Aminogruppen (z. B. in Histidinresten von Polypeptiden oder Proteinen). Wie dem Fachmann klar sein wird, hängt die Frage, ob die oben erwähnten funktionellen Gruppen in einem protonierten oder deprotonierten Zustand sein werden, natürlich von den gewählten Reaktionsbedingungen ab, wie zum Beispiel dem pH-Wert des Reaktionsgemischs.
Schritt IIIi) des Verfahrens der Erfindung, in welchem der zweite wasserlösliche Zwischenproduktvorläufer gebildet wird, wird zweckmäßigerweise in einer wässrigen Lösung bei einem pH-Wert von mehr als 7, wie zum Beispiel mehr als 8, insbesondere mehr als 9, wie zum Beispiel mehr als 10, zum Beispiel bei einem pH-Wert im Bereich von 10 bis 11, z. B. 10 bis 10,5, durchgeführt. Es wird normalerweise wohl ausreichen, die Reaktion bei einer Temperatur im Bereich von 0 bis 60°C durchzuführen, wobei die optimale Temperatur unter anderem vom tatsächlich verwendeten pH-Wert abhängt. In den meisten Fällen, insbesondere, wenn die Umsetzung bei einem pH-Wert von mehr als 9 durchgeführt wird, und insbesondere, wenn die Reaktion bei einem pH-Wert von mehr als 10 durchgeführt wird, wird oft eine Temperatur im Bereich von 20 bis 40°C, z. B. etwa 30°C, gut geeignet sein. In Bezug auf die Reaktionszeit sollte es selbstverständlich sein, dass mehrere Parameter die erforderliche Reaktionszeit beeinflussen. Somit kann die Reaktionszeit je nach verwendetem pH-Wert, der Reaktionstemperatur, der Konzentration an Peptid- oder Polypeptid-Spacerkomponente und der Konzentration an wasserlöslichem Zwischenproduktvorläufer innerhalb weiter Grenzen variieren. Es wird jedoch in Betracht gezogen, dass eine geeignete Reaktionszeit im Allgemeinen im Bereich von 1 Stunde bis 48 Stunden liegt, und die Erfinder haben, wie aus den hier angegebenen Beispielen klar sein wird, gefunden, dass bei Verwendung der spezifizierten Reihe von Reaktionsbedingungen, die in den Beispielen 3A und 3B offenbart sind, eine Reaktionszeit im Bereich von 10 bis 30 Stunden, z. B. im Bereich von 15 bis 25 Stunden, wie zum Beispiel etwa 18 Stunden, gut geeignet ist.
Wie zuvor angegeben, reagiert nur eine Fraktion der nicht umgesetzten reaktiven Einheiten der Verbindungskomponente des wasserlöslichen Zwischenprodukts mit der Spacerkomponente. Das heißt, dass das zweite wasserlösliche Zwischenprodukt noch eine wesentliche Menge an nicht umgesetzten reaktiven Einheiten besitzt.
Der erhaltene zweite wasserlösliche Zwischenproduktvorläufer kann durch die bereits im Zusammenhang mit dem Reinigungsschritt II) besprochenen Verfahren, d. h. im Zusammenhang mit der Reinigung des wasserlöslichen Zwischenproduktvorläufers, gereinigt werden. Wie aus den hier angegebenen Beispielen ersichtlich sein wird, ist ein geeignetes Verfahren zum Reinigen des erhaltenen zweiten wasserlöslichen Zwischenproduktvorläufers die Gelfiltration.
Bildung des wasserlöslichen Zwischenproduktkonjugats
In Schritt IIIiii) wird die Signalkomponente durch Umsetzung mit der Spacerkomponente kovalent an den zweiten wasserlöslichen Zwischenproduktvorläufer gebunden und bildet dadurch ein wasserlösliches Zwischenproduktkonjugat.
Wenn er hier verwendet wird, soll der Begriff "Signalkomponente" derartige Komponenten abdecken, welche direkt physikalisch nachweisbar sind oder welche Vorläufer für derartige physikalisch nachweisbare Komponenten sind. Mit anderen Worten sollte die Signalkomponente als eine Markierung oder ein Marker dienen, die/der durch einige auf dem Fachgebiet bekannte physikalische Techniken, z. B. durch optische Verfahren, wie zum Beispiel Spektrophotometrie, Fluoreszenz, Lumineszenz, Phosphoreszenz oder andere Verfahren, wie zum Beispiel diejenigen, die z. B. in "Instrumental Methods of Chemical Analysis" G. W. Ewing, 5. Ausg., McGraw-Hill Book Company, New York, 1988, beschrieben sind, leicht gemessen werden kann. In einer anderen Ausführungsform kann die Signalkomponente – wie oben angegeben – ein Vorläufer für eine derartige physikalisch nachweisbare Komponente sein. Ein typisches Beispiel für einen derartigen Vorläufer ist ein Enzym, welches bei Wirkung auf ein geeignetes Substrat in der Lage ist, Spezies, vorzugsweise gefärbte Spezies, zu erzeugen, welche durch ein oder mehrere der oben erwähnten physikalischen Verfahren nachgewiesen werden können.
Angesichts der oben angegebenen Besprechung wird es dem Fachmann klar sein, dass die Signalkomponente aus Substanzen, wie zum Beispiel Farbstoffe; fluoreszierenden, lumineszierenden, phosphoreszierenden und anderen Licht emittierenden Substanzen; Metall-Chelat bildenden Substanzen, einschließlich Iminodiessigsäure, Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA) und Desferrioxamin B; Substanzen, die mit einem radioaktiven Isotop markiert sind; Substanzen, die mit einem Schweratom markiert sind; und Gemischen davon ausgewählt sein kann.
Um einige weitere Beispiele anzugeben, können fluoreszierende Substanzen aus z. B. Fluorescein (geeigneterweise als Fluoresceinisothiocyanat, FITC), Fluoresceinamin, 1-Naphthol, 2-Naphthol, Eosin, Erythrosin, Morin, o-Phenylendiamin, Rhodamin und 8-Anilino-1-naphthalinschwefelsäure ausgewählt werden. Radioaktive Isotope von Bedeutung können zum Beispiel aus Isotopen von Wasserstoff (d. h. Tritium, ³H), Kohlenstoff (wie zum Beispiel ¹⁴C), Phosphor (wie zum Beispiel ³²P), Schwefel (wie zum Beispiel ³⁵S), Iod (wie zum Beispiel ¹³¹I), Wismut (wie zum Beispiel ²¹²Bi), Yttrium (wie zum Beispiel ⁹⁰Y), Technetium (wie zum Beispiel ⁹⁹Tc), Palladium (wie zum Beispiel ¹⁰⁹Pd) und Samarium (wie zum Beispiel ¹⁵³Sm) ausgewählt werden. Schweratome von Bedeutung können zum Beispiel aus Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn, Ga, In, Ag, Au, Hg, I, Bi, Y, La, Ce, Eu und Gd ausgewählt werden. Gold (Au) ist in vielen Fällen ein besonders nützliches Schweratom.
Signalkomponenten, welche als besonders interessant angesehen werden, sind die Farbstoffe. Im vorliegenden Zusammenhang soll der Begriff "Farbstoff' jedes durch Spektrophotometrie nachweisbare Farbstoffmolekül oder Derivat davon bedeuten. Bevorzugte Farbstoffe, die in die durch die Verfahren gemäß der Erfindung hergestellten Konjugate einzubringen sind, sind von visuellen Farbstoffen, phosphoreszierenden Farbstoffen, fluoreszierenden Farbstoffen, Laser-Farbstoffen, Infrarot-Farbstoffen und Lanthanidchelaten abgeleitet. Farbstoffe, welche besonders interessant sind, sind visuelle Farbstoffe, einschließlich löslicher visueller Farbstoffe, wie zum Beispiel Lösungsmittelfarbstoffe, Pigmente, Küpenfarbstoffe, Schwefelfarbstoffe, Beizenfarbstoffe, Leukoküpenfarbstoffe und Spezies, wie zum Beispiel Fluorescein, Rhodamin und Derivate davon (wie zum Beispiel Sulphorhodamin, Rhodamin-Hydrid und Rhodamin-Hydrazid), sowie Oxazinfarbstoffe, Cyaninfarbstoffe und Azolfarbstoffe. Spezifische Beispiele für geeignete Farbstoffe sind zum Beispiel Texas Rot Hydrazin, Congo Rot, Trypan Blau, Lissamine Blau, Remazol Schwarz, Remazol Brilliant Rot, Rhodamin B Isothiocyanat, monofunktioneller reaktiver Cy5-Osu-Farbstoff, Reaktiv-Orange 16, Uniblau A, usw.
Die oben erwähnten Farbstoffe, welche als Signalkomponenten für die Zwecke der vorliegenden Erfindung nützlich sind, sind alle auf dem Fachgebiet bekannt, und es wird dem Fachmann klar sein, dass andere Farbstoffe als Signalkomponenten für die Zwecke der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Andere Beispiele für Farbstoffe, die als Signalkomponenten zu verwenden sind, sind z. B. derartige Farbstoffe, wie sie in "Dyeing and Chemical Technology of Textile Fibers", Trotman, 34. Ausg., C. Griffin & Co., London, und "The Chemistry of Synthetic Dyes", Vankataramon (Hrsg.), Academic Press, New York, 1979, erwähnt sind, deren Offenbarungen hier durch Bezugnahme einbezogen sind.
Vorzugsweise sollte die Signalkomponente in der Lage sein, mit einem Protein, wie zum Beispiel BSA, zu reagieren, und/oder, für alternative Ausführungsformen, die unten beschrieben werden, sollte sie in der Lage sein, mit einer nicht umgesetzten reaktiven Einheit einer Verbindungskomponente zu reagieren. Des Weiteren sollte die Signalkomponente bei Umsetzung oder Bindung an den Spacer vorzugsweise keine unerwünschten Eigenschaften des resultierenden wasserlöslichen Zwischenproduktkonjugats verleihen, d. h. die Signalkomponente sollte vorzugsweise keine unkontrollierbare nicht-spezifische Bindung fördern oder die Aktivität der Zielkomponenten (z. B. Antikörper), die an das Konjugat gebunden sind, hemmen. Des Weiteren sollte die Signalkomponente vorzugsweise die Wasserlöslichkeit des Konjugats nicht wesentlich verringern.
Abhängig von der Größe des Ausgangsdextrans, der Art der verwendeten Signalkomponente und insbesondere abhängig von der "Ladung" des Spacers, wird die "Ladung" der Signalkomponente offensichtlich variieren. Wie zuvor angegeben, ist jeder Spacer in der Lage, mehrere Signalkomponenten aufzunehmen. In bevorzugten Ausführungsformen reicht die Anzahl an Signalkomponenten pro Spacerkomponente von 1 bis 100, ausgedrückt in Mol jeder Komponente. Besonders interessant sind die Ausführungsformen, in welchen das Molverhältnis von 2 bis 80, insbesondere 2 bis 75, reicht.
Wie zuvor angegeben, reagiert bei der Bildung des wasserlöslichen Zwischenproduktkonjugats nur eine kleine Fraktion der reaktiven Einheiten der Verbindungskomponente des zweiten wasserlöslichen Zwischenprodukts mit der Signalkomponente. Abhängig von der Signalkomponente, der Spacerkomponente und der Verbindungskomponente bleiben nach der Umsetzung der Signalkomponente und relativ zur Menge der nicht umgesetzten, reaktiven Verbindungskomponente, die in dem zweiten wasserlöslichen Zwischenproduktvorläufer verfügbar ist, 50 bis 100% der nicht umgesetzten reaktiven Einheiten der Verbindungskomponente, vorzugsweise 60 bis 100%, insbesondere 70 bis 100%, wie zum Beispiel im Bereich von 80 bis 100% und insbesondere 90 bis 100%, nicht umgesetzt (N. B. im Vergleich zum zweiten wasserlöslichen Zwischenproduktvorläufer).
Abhängig von dem besonderen Farbstoff absorbiert oder emittiert das durch das Verfahren der Erfindung hergestellte Konjugat Photonen im sichtbaren Bereich, im UV-Bereich oder im nahen Infrarot-Bereich, vorzugsweise im sichtbaren Bereich. Die Verwendung eines visuellen Farbstoffs, wie zum Beispiel Rhodamin, bewirkt, dass das Konjugat der Erfindung Photonen im sichtbaren Bereich (z. B. blau) absorbiert, was zur Transmission der komplementären Wellenlänge von Farbe (z. B. rot) an einen Betrachter führt. In einer anderen Ausführungsform wird die Verwendung eines fluoreszierenden Farbstoffs (bei Strahlung) bewirken, dass das Konjugat der Erfindung auf Grund der Rückkehr von Elektronen in den Grundzustand Photonen mit einer spezifischen Wellenlänge emittiert.
Schritt IIIiii) des Verfahrens der Erfindung, in welchem das wasserlösliche Zwischenproduktkonjugat gebildet wird, wird zweckmäßigerweise in einer wässrigen Lösung bei einem pH-Wert von mehr als 7, wie zum Beispiel mehr als 8, insbesondere in einem Bereich von etwa 8 bis etwa 11, wie zum Beispiel im Bereich von etwa 8,5 bis 10,5, durchgeführt. Abhängig von der tatsächlich verwendeten Signalkomponente kann das wässrige Reaktionsgemisch 0 bis 60% Vol./Vol. eines organischen Co-Lösungsmittels enthalten. Somit kann es, um ziemlich hydrophobe Signalkomponenten (wie zum Beispiel bestimmte Farbstoffinoleküle) aufzulösen, notwendig sein, dem wässrigen Reaktionsgemisch verschiedene Mengen eines mit Wasser mischbaren organischen Co-Lösungsmittels, wie zum Beispiel Dimethylsulfoxid (DMSO), Ethanol, Dimethylformamid (DMF), usw. zuzugeben, um eine ausreichende Löslichkeit der verwendeten Signalkomponente zu gewährleisten. Um eine Denaturation der zuvor gekoppelten Spacerkomponenten (welche typischerweise Polypeptide oder Proteine sind) zu vermeiden, sollte die Konzentration von organischem Co-Lösungsmittel im Reaktionsgemisch vorzugsweise möglichst gering sein.
Auf eine ähnliche Weise wie oben in Verbindung mit den Schritten bezüglich der Bildung des wasserlöslichen Zwischenproduktvorläufers und der Bildung des zweiten wasserlöslichen Zwischenproduktvorläufers beschrieben, wird es auch in diesem Schritt ausreichen, die Umsetzung bei einer Temperatur im Bereich von 0 bis 60°C, wie zum Beispiel im Bereich von 20 bis 40°C, z. B. etwa 30°C durchzuführen.
Wie aus den hier angegebenen Arbeitsbeispielen ersichtlich wird, kann die Reaktionszeit innerhalb weiter Grenzen variieren. Somit kann die Reaktionszeit z. B. von der "Ladung" der Spacerkomponente auf der Trägerkomponente sowie von den üblichen Reaktionsparametern, wie zum Beispiel pH-Wert, die Temperatur und die Art und Konzentration der Reaktanden abhängen. Im Allgemeinen wird die Reaktionszeit jedoch im Bereich von 1 bis 48 Stunden liegen. Vorzugsweise sollte die Reaktionszeit möglichst kurz sein, d. h. im Bereich von 1 bis 24 Stunden, insbesondere im Bereich von 1 bis 12 Stunden, wie zum Beispiel im Bereich von 1 bis 5 Stunden.
Auf ähnliche Weise wie oben beschrieben kann das erhaltene Zwischenproduktkonjugat durch eine Anzahl von verschiedenen, dem Fachmann bekannten Verfahren gereinigt werden. Außerdem kann das erhaltene Zwischenproduktkonjugat zum Beispiel durch Gefriertrocknen oder Verdampfen des Lösungsmittels in fester Form isoliert werden. Im Fall des letzteren wird die Verdampfung typischerweise unter reduziertem Druck, z. B. durch einen (evakuierten) Exsikkator, durchgeführt.
Das erhaltene Zwischenproduktkonjugat kann auf verschiedene Arten charakterisiert werden. Wenn zum Beispiel die verwendete Signalkomponente ein visueller Farbstoff ist, kann dessen Extinktion abgelesen werden und das Zwischenproduktkonjugat (und somit die Wirksamkeit des Kopplungsschritts IIIiii)) kann zum Beispiel als die Anzahl an Extinktionseinheiten (EU), die in dem Zwischenproduktkonjugat pro mg Spacerkomponente vorliegen, wie zum Beispiel in Beispiel 4A hier beschrieben, ausgedrückt werden. Der Fachmann wird natürlich in der Lage sein, das erhaltene Zwischenproduktkonjugat auf viele andere Arten zu charakterisieren.
Es ist anzumerken, dass in dem bisher besprochenen Verfahren der Erfindung die Spacerkomponente über die Verbindungsgruppe an die Trägerkomponente gekoppelt wird, woraufhin die Signalkomponente an die Spacerkomponente gebunden wird. Somit ist die Spacerkomponente bereits (über die Verbindungsgruppe) an die Trägerkomponente gebunden, wenn die Signalkomponente (wie zum Beispiel ein Farbstoff) an die Spacerkomponente gekoppelt wird.
Alternativen zur Bildung des wasserlöslichen Zwischenproduktkonjugats
Wie zuvor angegeben und wie aus den hier angegebenen Beispielen klar werden wird, ist das Verfahren auch zur Herstellung von wasserlöslichen, vernetzten Konjugaten nützlich, wobei die Signalkomponente kovalent an die Verbindungskomponente gebunden wird, welche wiederum an die Trägerkomponente gebunden wird, d. h. keine Protein- oder Polypeptid-Spacerkomponente wird in das Konjugat eingebracht (siehe nachstehend).
In solchen Fällen kann die Signalkomponente natürlich zusätzlich zu den oben erwähnten Signalkomponenten auch aus Substanzen ausgewählt werden, wie zum Beispiel Proteinen, einschließlich Ferritin, Phycoerythrine, Phycocyanine und Phycobiline; Enzymen, einschließlich Meerrettich-Peroxidase, alkalische Phosphatase, Glucoseoxidasen, Galactosidasen und Ureasen; und Gemischen davon.
Wie für einen Fachmann ersichtlich sein wird, kann die Signalkomponente auch kovalent an die Spacerkomponente gebunden werden, bevor die Spacerkomponente (über die Verbindungsgruppe) an die Trägerkomponente gekoppelt wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform reagiert unter bestimmten Bedingungen nur eine Fraktion der reaktiven Einheiten der Verbindungskomponente des wasserlöslichen Zwischenprodukts mit der Signalkomponente. Abhängig von der Verbindungskomponente bleiben nach der Umsetzung der Signalkomponente 1 bis 99% der nicht umgesetzten reaktiven Einheiten der Verbindungskomponente, vorzugsweise 1 bis 89%, insbesondere 1 bis 69%, wie zum Beispiel im Bereich von 1 bis 59% und insbesondere 1 bis 49%, nicht umgesetzt. Das heißt, dass in bevorzugten Ausführungsformen 50 bis 99% der reaktiven Einheiten mit der Signalkomponente umgesetzt wurden.
Demnach kann in einer anderen interessanten Ausführungsform das wasserlösliche Zwischenproduktkonjugat durch ein Verfahren hergestellt werden, umfassend:

I) Umsetzen mindestens einer wasserlöslichen Trägerkomponente mit mehr als einer Verbindungskomponente in einer wässrigen Lösung bei einem pH-Wert von mehr als 7, um eine wässrige Lösung zu bilden, welche einen wasserlöslichen Zwischenproduktvorläufer enthält, welcher wasserlösliche Einheiten der Trägerkomponente umfasst, an die reaktive Einheiten, die von der Verbindungskomponente abgeleitet sind, kovalent gebunden sind;
II) gegebenenfalls Unterziehen des wasserlöslichen Zwischenproduktkonjugats einem Reinigungsschritt;
III) Umsetzen des gegebenenfalls gereinigten, wasserlöslichen Zwischenproduktvorläufers über eine Umsetzung der reaktiven Einheiten mit mindestens einer Spacerkomponente, an welche mindestens eine Signalkomponente kovalent gebunden wurde, in einer wässrigen Lösung bei einem pH-Wert von mehr als 7, um ein wasserlösliches Zwischenproduktkonjugat zu bilden, wobei die Bedingungen derart sind, dass nur eine Fraktion der reaktiven Einheiten mit der Spacerkomponente reagiert, an welche mindestens eine Signalkomponente kovalent gebunden wurde; und
IV) gegebenenfalls Unterziehen des in Schritt III) erhaltenen wasserlöslichen Zwischenproduktkonjugats einem Reinigungsschritt.

Der Reinigungs-/Isolationsvorgang kann durch bereits im Zusammenhang mit der optischen Reinigung des wasserlöslichen Zwischenproduktvorläufers besprochenen Verfahren erfolgen.
Bildung des wasserlöslichen, vernetzten Konjugats
Nun auf eine genauere Besprechung des Ausfällungsschritts eingehend, wird dem Fachmann klar sein, dass der "Schlüsselschritt" im Verfahren der Erfindung Schritt a) ist, in welchem die primäre Zielkomponente an das Zwischenproduktkonjugat gebunden wird, wobei die Reaktionsbedingungen so sind, dass ein reversibler Niederschlag gebildet wird.
Im vorliegenden Zusammenhang soll der Begriff "reversibler Niederschlag" bedeuten, dass der gebildete Niederschlag bei Verdünnung mit Wasser bei 25°C wieder aufgelöst werden kann.
Der Begriff "primäre Zielkomponente", wie er hier verwendet wird, soll Moleküle, insbesondere Moleküle biologischen Ursprungs, bezeichnen, welche in der Lage sind, sich selektiv an ein komplementäres Molekül oder einen komplementären strukturellen Bereich eines Materials biologischen Ursprungs zu binden oder selektiv mit diesem zu reagieren. Beispiele für relevante primäre Zielkomponenten sind zum Beispiel: Antigene; Haptene; monoklonale und polyklonale Antikörper; Gensonden; natürliche und synthetische Oligo- und Polynukleotide; natürliche und synthetische Mono-, Oligo- und Polysaccharide; Lektine; Avidin; Streptavidin; Biotin; Wachstumsfaktoren; Hormone; Rezeptormoleküle; Protein A und Protein G; und Gemische davon.
Beispiele für primäre Zielkomponenten, welche als für die Zwecke der vorliegenden Erfindung besonders interessant angesehen werden, sind z. B. Anti-Human-Choriongonadotropin (anti-hCG), Kaninchen-Anti-Human-CRP, Streptavidin, Avidin, Anti-HIV, Anti-Hepatitis-C, Anti-Chlamydia, Anti-Herpes, anti-thyreotropes Hormon (Anti-TSH), Anti-Listeria und Anti-Salmonella.
Beispiele für relevante primäre Zielkomponenten, welche Hormone sind, sind Stereoidhormone (z. B. Estrogen, Progesteron oder Kortison), Aminosäurehormone (z. B. Thyroxin) und Peptid- und Proteinhormone (z. B. Vasopressin, Bombesin, Gastrin oder Insulin). EP-B-0 594 772 erwähnt auf Seite 12, Zeilen 20 bis 38, dass die Wirksamkeit bei der Bindung von molekularen Spezies (wie zum Beispiel Antikörpern) an einen Träger (wie zum Beispiel Dextran) erhöht werden kann, indem der sogenannte "Aussalzeffekt" genutzt wird, und es ist angegeben, dass eine geeignete Konzentration eine Konzentration entsprechend einer ionischen Stärke im Bereich von 0,5 bis 5 ist. Die in EP-B-0 594 772 offenbarten Beispiele zeigen, dass in der Tat eine positiv Wirkung in Bezug auf die Menge von verschiedenen Spezies, die an den Träger gekoppelt sind, erhalten wurde, wenn die Salzkonzentration auf einen bestimmten Wert erhöht wurde. Wenn jedoch die Salzkonzentration auf etwa 1 M erhöht wurde, bildete sich ein irreversibler Niederschlag.
Wie bereits erwähnt haben die Erfinder nun überraschenderweise gefunden, dass sich durch eine weitere Erhöhung der Konzentration von lyotropem Salz im Reaktionsgemisch ein reversibler Niederschlag bildet, welcher "große" Konjugate enthält: i) von denen angenommen wird, dass sie weitgehend vernetzt sind, ii) welche wasserlöslich sind und iii) welche eine hohe Empfindlichkeit aufweisen (auf Grund einer "hohen" Ladung der Zielkomponente und/oder einer "hohen" Ladung der Signalkomponente), wenn sie in verschiedenen Assays verwendet werden, wie zum Beispiel in den hier offenbarten Vorrichtungen mit lateralem Fluss (siehe nachstehend). Die Vorteile der wasserlöslichen, vernetzten Konjugate, welche durch die hier beschriebenen Verfahren erhalten werden können, werden unten genau besprochen.
Ohne sich an eine spezifische Theorie zu binden, wird derzeit angenommen, dass das Vorliegen von Salz in dem Reaktionsgemisch bewirkt, dass sich der Aktivitätskoeffizient des Zwischenproduktkonjugats erhöht, wodurch sich die Löslichkeit des Zwischenproduktkonjugats verringert. Auf ähnliche Weise erhöht sich der Aktivitätskoeffizient der primären Zielkomponente (z. B. ein Antikörper), wodurch sich die Löslichkeit der primären Zielkomponente verringert. Somit kann eine Hypothese sein, dass, wenn das Zwischenproduktkonjugat sowie die primäre Zielkomponente ausgefällt werden (wahrscheinlich zusammen mit etwas mitgefälltem Wasser), die beiden Reaktanden sehr nah aneinander gebracht werden und sich dadurch die Wahrscheinlichkeit erhöht, dass eine chemische Reaktion stattfindet, d. h. dass sich die Wahrscheinlichkeit erhöht, dass die primäre Zielkomponente mit den zuvor nicht umgesetzten reaktiven Einheiten der Verbindungskomponente umgesetzt wird. Es sollte jedoch betont werden, dass der genaue Mechanismus bisher nicht genau gelöst wurde und dass im Prinzip die weitgehende Vernetzung/Bindung der primären Zielkomponente in Lösung auftreten kann, woraufhin das vernetzte Konjugat ausfällt, oder die Umsetzung kann stattfinden, während die Ausfällung stattfindet, oder die Umsetzung kann stattfinden, nachdem die Ausfällung stattgefunden hat (wie oben besprochen). Es sollte jedoch betont werden, dass ungeachtet des tatsächlichen Mechanismus, durch den die Vernetzung/Bindung der primären Zielkomponente stattfindet, geschlossen werden kann, dass der reversible Niederschlag, der erhalten wird, wenn die Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, nicht – im Gegensatz zu der Lehre, die in EP-B-0 594 772 offenbart ist – zu Konjugaten führt, welche derartige Eigenschaften haben, dass ein irreversibler Niederschlag auftritt.
Ohne sich auf eine spezifische Theorie zu beschränken, wird derzeit angenommen, dass die im Zusammenhang mit dem Ausfällungsschritt erstellten Vernetzungen zumindest bis zu einem gewissen Grad durch die bifunktionellen Verbindungskomponenten gebildet werden, d. h. die erste reaktive Einheit der Verbindungskomponente ist kovalent an eine reaktive Funktionalität an einer ersten Einheit einer Trägerkomponente gebunden und die zweite reaktive Einheit der Verbindungskomponente ist kovalent an eine reaktive Funktionalität an einer zweiten Einheit einer Trägerkomponente gebunden. Als ein Anschauungsbeispiel kann die Erstellung einer Vernetzung zwischen Dextran-Trägerkomponenten unter Verwendung von DVS als Verbindungskomponente zum Beispiel wie folgt sein: Dextran-O-CH₂-CH₂-SO₂-CH₂-CH₂-O-Dextran.
Es wird jedoch in Betracht gezogen, dass die Vernetzung der einzelnen Trägerkomponenten im Ausfällungsschritt durch die primäre Zielkomponente erleichtert werden kann, und demnach kann eine Vernetzung zwischen z. B. zwei Dextran-Trägerkomponenten, wobei z. B. DVS als die Verbindungskomponente verwendet wird, zum Beispiel die folgende Struktur aufweisen: Dextran-O-CH₂-CH₂-SO₂-CH₂-CH₂-"primäre Zielkomponente"-CH₂-CH₂-SO₂-CH₂-CH₂-O-Dextran oder Dextran-O-CH₂-CH₂-SO₂-CH₂-CH₂-"primäre Zielkomponente"-O-Dextran.
Wahrscheinlich ist mehr als eine primäre Zielkomponente in einige der Vernetzungen eingebracht, und es wird in Betracht gezogen, dass die primäre Zielkomponente mit einer dritten oder sogar mit einer vierten Verbindungskomponente reagieren kann, wodurch Vernetzungen zwischen mehr als zwei Einheiten von Trägerkomponenten gebildet werden. In der Tat kann die primäre Zielkomponente, zumindest prinzipiell, mit so vielen Verbindungskomponenten reagieren, wie sie reaktive Stellen besitzt.
Es wird angenommen, dass das Ausmaß der Vernetzung in direktem Zusammenhang mit der Menge der nicht umgesetzten reaktiven Einheiten der Verbindungskomponente steht, die zur Verfügung stehen, um während des „Aussalz"-Vorgangs zu reagieren. Die Menge an nicht umgesetzten reaktiven Einheiten, die nach der Spacerkopplung verbleiben (Bildung des zweiten wasserlöslichen Zwischenproduktvorläufers), reicht in bevorzugten Ausführungsformen von 50 bis 99%, und wenn anschließend eine Kopplung der Signalkomponente erfolgt (Bildung des wasserlöslichen Zwischenproduktkonjugats), bleibt die Menge an nicht umgesetzten reaktiven Einheiten in bevorzugten Ausführungsformen unverändert in einem Bereich von 50 bis 99%. Die Menge an reaktiven Einheiten, welche zur Vernetzung zur Verfügung stehen, und somit ein Potential für ein hohes Ausmaß der Vernetzung ist groß. Es ist klar, dass, je umfassender die Vernetzung ist (möglicherweise über eine oder mehrere Verbindungen, zwischen zwei Dextranen, durch einen Spacer oder durch ein primäres Ziel), desto größer ist das Molekulargewicht des Konjugats. Offensichtlich steht das Ausmaß der Vernetzung auch mit dem für den reversiblen Ausfällungsschritt verwendete Verfahren im Zusammenhang.
Der Ausfällungsschritt a) im Verfahren der Erfindung wird zweckmäßigerweise in einer wässrigen Lösung bei einem pH-Wert im Bereich von 6 bis 11, vorzugsweise im Bereich von 6 bis 10, z. B. im Bereich von 8 bis 10, insbesondere im Bereich von 8 bis 9, durchgeführt.
In Bezug auf die Reaktionszeit und die Reaktionstemperatur können diese Parameter abhängig von der Konzentration und/oder der Art der verwendeten Reaktanden variieren. Es ist jedoch von den Erfindern gefunden worden, dass eine geeignete Reaktionstemperatur typischerweise im Bereich von 2 bis 30°C, wie zum Beispiel im Bereich von 4 bis 16°C, vorzugsweise im Bereich von 4 bis 10°C, insbesondere bei 4 bis 6°C, liegt.
Die Reaktionszeit kann zwischen 1 und 36 Stunden, üblicherweise zwischen 6 und 24 Stunden, z. B. zwischen 15 und 21 Stunden, wie zum Beispiel etwa 18 Stunden, variieren.
In interessanten Ausführungsformen der Erfindung liegt das anfängliche Molverhältnis in der Lösung (d. h. bevor jegliche Ausfällung auftritt) zwischen dem Zwischenproduktkonjugat und der primären Zielkomponente im Bereich von 1 : 1 bis 1 : 50, wie zum Beispiel im Bereich von 1 : 1 bis 1 : 25, z. B. im Bereich von 1 : 1 bis 1 : 10, vorzugsweise im Bereich von 1 : 1 bis 1 : 5, insbesondere im Bereich von 1 : 2,5 bis 1 : 5.
Der reversible Niederschlag erfolgt vorzugsweise durch Aussalzen, was zweckmäßigerweise durch Zugabe von lyotropen Salzen zum Reaktionsgemisch erhalten wird. Beispiele für geeignete lyotrope Salze sind zum Beispiel Sulphate, Phosphate, Citrate oder Tartrate von Lithium, Natrium, Calcium, Kalium oder Ammonium, oder Gemische davon. Weitere Beispiele für lyotrope Salze sind in "Purification Tools for Monoclonal antibodies", Gagnon, P., Validated Biosystems, 1996, angegeben, welches Dokument unter Bezugnahme hier aufgenommen ist.
In derzeit bevorzugten Ausführungsformen des Aussalzverfahrens sind die lyotropen Salze Calciumphosphat und Ammoniumsulfat besonders wirksam.
Die Konzentration des lyotropen Salzes sollte ausreichend sein, um zu gewährleisten, dass das reversible Ausfällungsverfahren ein vernetztes Konjugat ergibt. Die Konzentration des Salzes, welches die wünschenswerte Wirkung ergeben soll, hängt von der Art sowohl des Kations als auch des Anions des lyotropen Salzes ab. Wie zuvor angegeben, führten Salzkonzentrationen von bis zu 1 M zur Bildung eines irreversiblen Niederschlags (EP-B-0 594 772) und ergaben nicht die wünschenswerte Wirkung. Salzkonzentrationen von mehr als 1 M, wie zum Beispiel im Bereich von 1,25 bis 3 M, ergeben jedoch die gewünschten vernetzten Konjugate. Wie angegeben, variiert die Salzkonzentration für einen bestimmten reversiblen Niederschlag je nach Auswahl des verwendeten Salzes. Außerdem variiert die Salzkonzentration für einen bestimmten reversiblen Niederschlag nach der Ladung und Art jeder der Komponenten. Die Ladung und Auswahl der Verbindungskomponente, der Spacerkomponente und der Signalkomponente beeinflussen die genaue Salzkonzentration (einer bestimmten Auswahl an Salz). In bevorzugten Ausführungsformen reichen die Konzentrationen des lyotropen Salzes von 1,25 bis 2,75 M, wie zum Beispiel mindestens 1,25 M oder mindestens 1,5 M oder mindestens 1,75 M oder mindestens 2 M oder mindestens 2,25 M, oder mindestens 2,5 M oder mindestens 2,75 M.
Das lyotrope Salz sollte in einer Konzentration vorliegen, welche ausreicht, um zu gewährleisten, dass sich ein reversibler Niederschlag bildet, d. h. die Konzentration an lyotropem Salz, nämlich Calciumphosphat oder Ammoniumsulfat, liegt vorzugsweise im Bereich von 1,25 bis 2,75, vorzugsweise im Bereich von 1,75 bis 2,50 M.
Obwohl, wie oben erklärt, der Schritt der Salzausfällung primäre Zielkomponenten sehr effizient koppelt, können alle verbleibenden freien "hängenden" Gruppen, die von der Verbindungskomponente abgeleitet sind, deaktiviert werden, indem der wässrigen Lösung, welche den reversiblen Niederschlag enthält, deaktivierende Spezies mit geringem Molekulargewicht zugegeben werden. Beispiele für geeignete deaktivierende Spezies können zum Beispiel Ethanolamin, Mercaptoethanol oder bestimmte Aminosäuren sein, wie zum Beispiel Cystein, Glycin, Alanin oder Valin.
Nach dem Ausfällungsschritt des reversiblen Salzes werden die (reversibel) ausgefällten Konjugate wieder in einem wässrigen Medium, vorzugsweise Wasser, gelöst. Die nach den hier offenbarten Verfahren erhaltenen Konjugate sollten in einem wässrigen Medium, wie zum Beispiel Wasser, bei Raumtemperatur leicht löslich sein und vorzugsweise eine Wasserlöslichkeit von mindestens 0,1, vorzugsweise mindestens 1, wie zum Beispiel mindestens 10, stärker bevorzugt mindestens 50, wie zum Beispiel mindestens 100, insbesondere mindestens 200 mg trockenes Konjugat pro ml Wasser bei 25°C aufweisen.
Offensichtlicherweise und wie es dem Fachmann klar sein wird, kann das erhaltene wasserlösliche, vernetzte Konjugat in fester Form, zum Beispiel durch Gefriertrocknen, weiter gereinigt und/oder isoliert werden. Der Reinigungs-/Isolationsvorgang kann durch bereits im Zusammenhang mit der optischen Reinigung des wasserlöslichen Zwischenproduktvorläufers besprochenen Verfahren erfolgen.
Obwohl der Ausfällschritt vorzugsweise durch Zugabe von lyotropem Salz zum Reaktionsgemisch durchgeführt wird, wird in Betracht gezogen, dass der Schritt, in welchem die Vernetzung/Bindung der primären Zielkomponente auftritt, durch andere Techniken als die Salzausfällung durchgeführt werden kann. Somit besteht ein Beispiel einer Alternative zur oben erwähnten Salzausfällung darin, die Reaktion in einer gefrorenen wässrigen Lösung, d. h. bei einer Temperatur im Bereich von etwa –20°C bis 0°C, durchzuführen. In derartigen gefrorenen Lösungen werden kleine "Taschen" von Wasser auftreten, in denen die Reaktanden in einer sehr hohen Konzentration vorliegen, wodurch sich die Wahrscheinlichkeit erhöht, dass eine chemische Reaktion stattfindet, d. h. die Wahrscheinlichkeit, dass die primäre Zielkomponente mit den zuvor nicht umgesetzten reaktiven Einheiten der Verbindungskomponente reagiert. Noch weitere Beispiele für Verfahren, welche als nützlich in dem Verfahren der Erfindung angesehen werden, umfassen zum Beispiel Lösungsmittelausfällung, d. h. die Zugabe von mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmitteln zu dem wässrigen Reaktionsgemisch; Polymerausfällung, d. h. Zugabe von einem oder mehreren inerten Polymeren zum wässrigen Reaktionsgemisch, verschiedene Konzentrationstechniken, wie zum Beispiel Verdampfung, vorzugsweise unter reduziertem Druck, usw. Das gemeinsame Merkmal für alle oben erwähnten Techniken ist die Steigerung der Nähe der Reaktanden, wodurch die Wahrscheinlichkeit erhöht wird, dass die primäre Zielkomponente mit den zuvor nicht umgesetzten reaktiven Einheiten der Verbindungskomponente reagiert.
In Ausführungsformen, in denen das wasserlösliche, vernetzte Konjugat durch Gefriertrocknen gereinigt wird und in denen alle verbleibenden nicht umgesetzten reaktiven Einheiten der Verbindungskomponente nicht deaktiviert worden sind (unter Verwendung einer deaktivierenden Spezies), kann das Ausmaß der Vernetzung durch das Verfahren der Gefriertrocknung erhöht werden. Wenn die oben angegebene Hypothese bezüglich des Mechanismus, durch welchen das vernetzte Konjugat gebildet wird, auf der Nähe der Reaktanden begründet ist, kann das Gefriertrocknen bis zu einem gewissen Grad in einer oder mehreren Hinsichten das Aussalzverfahren simulieren. Somit kann in dieser Ausführungsform das Ausmaß der Vernetzung und somit das mittlere Molekulargewicht im Vergleich zu demjenigen vor dem Reinigungsverfahren erhöht werden. Umgekehrt werden in einer anderen Ausführungsform die nicht umgesetzten reaktiven Einheiten der Verbindungskomponente vor dem möglichen Reinigungsschritt durch die Verfahren deaktiviert.
Wie bereits angegeben, wird die größte Bedeutung der wasserlöslichen vernetzten Konjugate, die durch die hier offenbarten Verfahren hergestellt werden, derzeit in Verbindung mit ihrer Verwendung in Vorrichtungen mit lateralem Fluss gesehen, was unten genau besprochen wird. Daher haben die Erfinder einen geeigneten Assay mit einer Vorrichtung mit lateralem Fluss zur Verfügung gestellt, welcher es dem Fachmann ermöglicht, wirksame und bevorzugte wasserlösliche, vernetzte Konjugate auszuwählen, welche durch die Verfahren gemäß der Erfindung hergestellt wurden. Somit offenbart Beispiel 7A einen Test für die Empfindlichkeit von wasserlöslichen, vernetzten Konjugaten, welche durch die hier offenbarten Verfahren hergestellt wurden. Es ist anzumerken, dass der Test, wenn er genau so, wie er hier beschrieben ist, verwendet wird, nur für Konjugate geeignet ist, in denen die Signalkomponente ein visueller Farbstoff und die primäre Zielkomponente Kaninchen-Anti-Human-CRP ist. Der Fachmann wird jedoch wissen, wie er den Test erweitern kann, um andere Signalkomponenten und, was wichtiger ist, andere primäre Zielkomponenten mit einzubeziehen.
Wie von dem Fachmann anerkannt werden wird und wie es aus den hier angegebenen Arbeitsbeispielen klar wird, erzeugen die hier offenbarten Verfahren nicht unbedingt "eine einzige Art" von Konjugat, sondern eher Konjugate mit einer gewissen Molekulargewichtsverteilung. Es ist möglich, aus dem oben erwähnten Test zu bewerten, ob das erhaltene wasserlösliche, vernetzte Konjugat als für den Zweck geeignet befunden wird oder ob eine weitere Reinigung/Fraktionierung wünschenswert ist. Es ist von den Erfindern gefunden worden, dass in einer sehr interessanten Ausführungsform der Erfindung die wasserlöslichen, vernetzten Konjugate, die im Ausfällungsschritt a) erhalten wurden, mittels Gelfiltration weiter gereinigt/fraktioniert werden. Somit sind wasserlösliche, vernetzte Konjugate, welche zur Verwendung zum Beispiel in Vorrichtungssystemen mit lateralem Fluss sehr geeignet sind, solche Konjugate, welche, nach Wiederauflösen in einem wässrigen Medium, in dem Hohlraumvolumen eluiert werden, wenn sie einer Gelfiltration zum Beispiel unter Verwendung des Gelmaterials Sephacryl^TM HR S-500 oder Sephacryl^TM HR S-1000 unterworfen werden (unter Verwendung der in den hier offenbarten Arbeitsbeispielen spezifizierten Bedingungen).
Wie zuvor angegeben, sind die wasserlöslichen, vernetzten Konjugate im Vergleich zu bekannten Konjugaten "groß". Wie dem Fachmann klar sein wird und wie oben erwähnt, ergeben die Konjugate, welche durch die hier offenbarten Verfahren hergestellt wurden, kein Konjugat mit einem einzigen gleichmäßigen Gewicht. Vielmehr werden die erhaltenen Konjugate eine bestimmte Molekulargewichtsverteilung aufweisen. Mehrere mögliche Verfahren, welche dem Fachmann bekannt sein werden, können zur Bestimmung von verschiedenen Arten des durchschnittlichen Molekulargewichts derartiger heterogener Konjugate verwendet werden. Es wird jedoch ins Auge gefasst, dass sehr geeignete Verfahren zum Beispiel analytische Ultrazentrifugierung und insbesondere Lichtstreutechniken sind. Somit haben in interessanten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung die durch die hier offenbarten Verfahren erhaltenen Konjugate ein Massenmittel des Molekulargewichts von mindestens 10⁶, mindestens 2 × 10⁶, mindestens 3 × 10⁶, mindestens 4 × 10⁶, mindestens 5 × 10⁶, mindestens 6 × 10⁶, mindestens 7 × 10⁶, mindestens 8 × 10⁶, mindestens 9 × 10⁶, mindestens 10⁷, mindestens 2 × 10⁷, mindestens 3 × 10⁷, mindestens 4 × 10⁷, mindestens 5 × 10⁷, mindestens 6 × 10⁷, mindestens 7 × 10⁷, mindestens 8 × 10⁷, mindestens 9 × 10⁷, mindestens 10⁸, mindestens 2 × 10⁸, mindestens 3 × 10⁸, mindestens 4 × 10⁸, mindestens 5 × 10⁸, mindestens 6 × 10⁸, mindestens 7 × 10⁸, mindestens 8 × 10⁸, mindestens 9 × 10⁸, mindestens 10⁹, mindestens 2 × 10⁹, mindestens 3 × 10⁹, mindestens 4 × 10⁹, mindestens 5 × 10⁹, mindestens 6 × 10⁹, mindestens 7 × 10⁹, mindestens 8 × 10⁹, mindestens 9 × 10⁹, mindestens 10¹⁰, mindestens 2 × 10¹⁰, mindestens 3 × 10¹⁰, mindestens 4 × 10¹⁰, mindestens 5 × 10¹⁰ mindestens 6 × 10¹⁰ mindestens 7 × 10¹⁰ mindestens 8 × 10¹⁰ mindestens 9 × 10¹⁰ mindestens 10¹¹, mindestens 2 × 10¹¹, mindestens 3 × 10¹¹, mindestens 4 × 10¹¹, mindestens 5 × 10¹¹, mindestens 6 × 10¹¹, mindestens 7 × 10¹¹, mindestens 8 × 10¹¹, mindestens 9 × 10¹¹, mindestens 10¹², mindestens 2 × 10¹², mindestens 3 × 10¹², mindestens 4 × 10¹², mindestens 5 × 10¹², mindestens 6 × 10¹², mindestens 7 × 10¹², mindestens 8 × 10¹², mindestens 9 × 10¹² oder mindestens 10¹³ g/mol. Obwohl es bevorzugt wird, dass die Konjugate möglichst groß sind, sollte es selbstverständlich sein, dass die Konjugate vorzugsweise nicht größer als die Porengröße des festen Trägermaterials (z. B. Nitrocellulose) sein sollten, das in den Vorrichtungen mit lateralem Fluss verwendet wird, da die Konjugate in die Poren fließen können sollen. In einer besonders interessanten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung haben die durch die hier offenbarten Verfahren erhaltenen Konjugate ein Massenmittel des Molekulargewichts im Bereich von etwa 10⁶ bis etwa 10¹⁰ Da, vorzugsweise im Bereich von 10⁶ bis etwa 10⁸ Da, wie zum Beispiel im Bereich von etwa 10⁶ bis etwa 10⁸ Da.
Wenn das Massenmittel des Molekulargewichts verwendet wird, werden die einzelnen Konjugate nach ihren Massenfraktionen, m/m, in der Probe gewichtet. Somit ist der Begriff "Massenmittel des Molekulargewichts" im vorliegenden Zusammenhang anhand der folgenden Formel II definiert: <M> = (1/m)Σ_im_iM_i (II)wobei <M> das Massenmittel des Molekulargewichts ist, m die Gesamtmasse der Probe (d. h. die Gesamtmasse der Konjugate) ist, und m_i die Gesamtmasse an Molekülen (d. h. Konjugaten) mit einem Molekulargewicht von M_i ist.
Die Gelfiltrationsprofile (3a–3f) zeigen deutlich, dass die Molekulargewichte der in hoher ionischer Stärke (3a, c, e) hergestellten Konjugate höher sind als die in niedriger ionischer Stärke (3b, d, f) hergestellten Konjugate. Somit besteht ein wichtiges Merkmal der vorliegenden Erfindung darin, dass die durch das Verfahren der Erfindung hergestellten Konjugate sich bemerkbar von denjenigen unterscheiden, welche zu wasserlöslichen Konjugaten auf Polymerbasis durch das Verfahren hergestellt werden, das in EP-B-0 594 772 beschrieben ist. Strukturelle Unterschiede (das Ausmaß und die Art der Vernetzung), die sich von dem Verfahren der Erfindung ableiten, wirken teilweise, zusammen mit Unterschieden des Molekulargewichts und anderen Merkmalen, dahingehend, zuvor für wasserlösliche Konjugate auf Polymerbasis nicht beschriebene Aktivitäten zu verleihen.
Wie zuvor in Verbindung mit der Definition des Begriffs "Signalkomponente" erwähnt, sind die hier offenbarten Verfahren auch zur Herstellung von wasserlöslichen, vernetzten Konjugaten geeignet, bei denen keine Spacerkomponente vorliegt, d. h. die Signalkomponente, wie zum Beispiel ein Enzym oder ein Farbstoffmolekül, ist direkt über die Verbindungskomponente an die Trägerkomponente gebunden (wie in Alternativen zur Bildung des wasserlöslichen Zwischenproduktkonjugats beschrieben).
Somit betrifft die vorliegende Erfindung in einer weiteren Ausführungsform ein Verfahren zur Herstellung eines wasserlöslichen, vernetzten Konjugats, das Einheiten von mindestens einer Trägerkomponente, Einheiten von mehr als einer Verbindungskomponente, Einheiten von mindestens einer Signalkomponente und Einheiten von mindestens einer primären Zielkomponente umfasst, wobei die Signalkomponente über die Verbindungskomponente kovalent an die Trägerkomponente gebunden ist, wobei das Verfahren umfasst:

a) Umsetzen eines wasserlöslichen Zwischenproduktkonjugats, das, Einheiten von mindestens einer Trägerkomponente, Einheiten von mehr als einer Verbindungskomponente, Einheiten von mindestens einer Signalkomponente umfasst, wobei die Signalkomponente über die Verbindungskomponente kovalent an die Trägerkomponente gebunden ist, durch Umsetzen von nicht umgesetzten reaktiven Einheiten, die von der Verbindungskomponente abgeleitet sind, mit mindestens einer primären Zielkomponente in einer wässrigen Lösung, wobei die Bedingungen so sind, dass ein reversibler Niederschlag gebildet wird;
b) Wiederauflösen des reversiblen Niederschlags, der das wasserlösliche, vernetzte Konjugat umfasst, in einem wässrigen Medium; und
c) gegebenenfalls Unterziehen des wasserlöslichen, vernetzten Konjugats einem Reinigungsschritt.

Auf ähnliche Weise kann das wasserlösliche Zwischenproduktkonjugat, das zur Herstellung des wasserlöslichen, vernetzten Konjugats, wie oben beschrieben, verwendet wird, durch ein Verfahren hergestellt werden, umfassend:

I) Umsetzen mindestens einer wasserlöslichen Trägerkomponente mit mehr als einer Verbindungskomponente in einer wässrigen Lösung bei einem pH-Wert von mehr als 7, um eine wässrige Lösung zu bilden, welche einen wasserlöslichen Zwischenproduktvorläufer enthält, welcher wasserlösliche Einheiten der Trägerkomponente umfasst, an die reaktive Einheiten, die von der Verbindungskomponente abgeleitet sind, gebunden sind;
II) gegebenenfalls Unterziehen des wasserlöslichen Zwischenproduktkonjugats einem Reinigungsschritt;
III) Umsetzen des gegebenenfalls gereinigten, wasserlöslichen Zwischenproduktvorläufers über eine Umsetzung der reaktiven Einheiten mit mindestens einer Signalkomponente in einer wässrigen Lösung bei einem pH-Wert von mehr als 7, um ein wasserlösliches Zwischenproduktkonjugat zu bilden, wobei die Bedingungen so sind, dass nur eine Fraktion der reaktiven Einheiten mit der Signalkomponente reagiert; und
IV) gegebenenfalls Unterziehen des in Schritt III) erhaltenen wasserlöslichen Zwischenproduktkonjugats einem Reinigungsschritt.

Wie es erscheint, ist die Bildung des wasserlöslichen Zwischenproduktkonjugats in Schritt III) der Schritt, welcher sich von den zuvor besprochenen Verfahren zur Herstellung des wasserlöslichen Zwischenproduktkonjugats unterscheidet. Im Allgemeinen kann der obige Schritt III) unter sehr ähnlichen Bedingungen durchgeführt werden, wie zuvor für die Bindung von Signalkomponenten an die Spacerkomponenten beschrieben. Somit wird Schritt III) des oben offenbarten Verfahrens, in welchem das wasserlösliche Zwischenproduktkonjugat gebildet wird, zweckmäßig in wässriger Lösung bei einem pH-Wert von mehr als 7 durchgeführt, wie zum Beispiel im Bereich von etwa 8 bis 12, vorzugsweise im Bereich von etwa 9 bis 12, insbesondere im Bereich von 10 bis 12 oder im Bereich von 11 bis 12. Abhängig von der tatsächlich verwendeten Signalkomponente kann das wässrige Reaktionsgemisch 0 bis 60% Vol./Vol. eines organischen Co-Lösungsmittels enthalten. Somit kann es, um ziemlich hydrophobe Signalkomponenten (wie zum Beispiel bestimmte Farbstoffmoleküle) aufzulösen, notwendig sein, dem wässrigen Reaktionsgemisch verschiedene Mengen eines mit Wasser mischbaren organischen Co-Lösungsmittels, wie zum Beispiel Dimethylsulfoxid (DMSO), Ethanol, Dimethylformamid (DMF), usw. zuzugeben, um eine ausreichende Löslichkeit der verwendeten Signalkomponente zu gewährleisten. Es wird normalerweise ausreichen, die Umsetzung bei einer Temperatur im Bereich von 0 bis 60°C, wie zum Beispiel im Bereich von 15 bis 40°C, z. B. im Bereich von 20 bis 25°C, durchzuführen.
Im Allgemeinen wird die Reaktionszeit im Bereich von 1 bis 48 Stunden liegen. Vorzugsweise sollte die Reaktionszeit jedoch möglichst kurz sein, d. h. im Bereich von 1 bis 24 Stunden, insbesondere im Bereich von 1 bis 12 Stunden, wie zum Beispiel im Bereich von 1 bis 5 Stunden.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind die Verwendung eines Dextrans mit einem Peak-Molekulargewicht von 500.000 mit der Verwendung der Verbindungskomponente DVS innerhalb eines Aktivierungsgrads von 20 bis 30%, die Verwendung der Spacerkomponente BSA, die Verwendung der Signalkomponente Rhodamin B Isothiocyanat und die Verwendung entweder der primären Zielkomponenten Streptavidin oder eines monoklonalen oder polyklonalen Antikörpers die Komponenten, die in dem reversiblen Schlüssel-Ausfällungsschritt vorliegen.
Wie zuvor besprochen, ist der "Schlüsselschritt" in den hier beschriebenen Verfahren Schritt a), in welchem die primäre Zielkomponente an das Zwischenproduktkonjugat gebunden wird, wobei die Reaktionsbedingungen so sind, dass ein reversibler Niederschlag gebildet wird. Normalerweise ist das teuerste Reagenz, welches zur Herstellung der hier beschriebenen Konjugate zu verwenden ist, die primäre Zielkomponente (wie zum Beispiel ein Antikörper oder ein Antigen) und gleichzeitig ist der reversible Salzausfällungsschritt einer der zeitaufwändigsten Schritte bei der Herstellung der Konjugate. Des Weiteren betrifft, da die primäre Zielkomponente je nach der tatsächlichen nachzuweisenden Zielkomponente variieren wird, ein sehr interessanter Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Test-Kit, welches das wasserlösliche Zwischenproduktkonjugat (vorzugsweise in der Form eines Feststoffes) umfasst, versehen mit einer Anleitung zur Durchführung des reversiblen Salzausfällungsschritts, zur anschließenden Wiederauflösung des reversiblen Niederschlags und der abschließenden Reinigung des so gebildeten wasserlöslichen, vernetzten Konjugats (z. B. durch Gelfiltration). Verschiedene Modifikationen des Kits, wie zum Beispiel einschließlich Sets von primären Zielkomponenten, welche oft zur Diagnose/Analyse zum Beispiel in der Lebensmittelindustrie oder in Krankenhäusern verwendet werden, liegen auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung. Das Kit kann natürlich auch mit einer Anleitung zur Verwendung der hergestellten Konjugate in einer Vorrichtung mit lateralem Fluss, wie hier beschrieben, versehen sein.
Bildung des wasserlöslichen, vernetzten Konjugatkomplexes
In einer anderen interessanten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines wasserlöslichen, vernetzten Konjugatkomplexes, der ein nach einem der hier offenbarten Verfahren hergestelltes Konjugat, einen Liganden und eine sekundäre Zielkomponente umfasst, wobei der Ligand kovalent an die sekundäre Zielkomponente gebunden ist und der Ligand durch nichtkovalente Bindungen an die primäre Zielkomponente des Konjugats gebunden ist, wobei das Verfahren umfasst:

I) Herstellen eines wasserlöslichen Konjugats nach den hier offenbarten Verfahren;
II) Umsetzen des gegebenenfalls gereinigten, wasserlöslichen, vernetzten Konjugats mit einem Liganden, wobei der Ligand kovalent an eine sekundäre Zielkomponente gebunden ist, in einer wässrigen Lösung;
III) Beenden der Reaktion; und
IV) gegebenenfalls Unterziehen des wasserlöslichen, vernetzten Konjugatkomplexes einem Reinigungsschritt.

Im vorliegenden Zusammenhang bedeutet der Begriff "sekundäre Zielkomponente" Moleküle, insbesondere Moleküle biologischen Ursprungs, welche in der Lage sind, sich selektiv an ein komplementäres Molekül oder einen komplementären strukturellen Bereich eines Materials biologischen Ursprungs zu binden oder selektiv mit diesem zu reagieren. Somit kann die sekundäre Zielkomponente aus der gleichen Klasse von Molekülen ausgewählt werden, wie oben in Verbindung mit der Definition des Begriffs "primäre Zielkomponente" erwähnt wurde, d. h. Beispiele für interessante sekundäre Zielkomponenten sind zum Beispiel: Antigene; Haptene; monoklonale und polyklonale Antikörper; Gensonden; natürliche und synthetische Oligo- und Polynukleotide; natürliche und synthetische Mono-, Oligo- und Polysaccharide; Lektine; Avidin; Streptavidin; Biotin; Wachstumsfaktoren; Hormone; Rezeptormoleküle; Protein A und Protein G; und Gemische davon. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die sekundäre Zielkomponente Anti-hCG.
Wenn er hier verwendet wird, soll der Begriff "Ligand" ein Molekül mit einer hohen Affinität für die tatsächlich verwendete primäre Zielkomponente bedeuten, wodurch eine thermodynamisch stabile, nichtkovalente Bindung zwischen dem Liganden und der primären Zielkomponente, die in dem wasserlöslichen, vernetzten Konjugat vorliegen, gesichert wird. Somit werden in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung der Ligand/die primäre Zielkomponente so gewählt, dass die Assoziationskonstante zwischen dem Liganden und der primären Zielkomponente des Konjugats mindestens 10⁶, vorzugsweise mindestens 10⁸, wie zum Beispiel mindestens 10¹⁰, stärker bevorzugt mindestens 10¹¹, wie zum Beispiel mindestens 10¹², insbesondere mindestens 10¹³, wie zum Beispiel mindestens 10¹⁴, z. B. mindestens 10¹⁵ l/mol beträgt.
Wie oben angegeben, wird die Auswahl des Liganden natürlich von der tatsächlich verwendeten primären Zielkomponente abhängen. Spezifische Beispiele für geeignete Liganden sind zum Beispiel Biotin, Anti-Dinitrophenol oder Anti-Dioxygenin, insbesondere Biotin.
In einer sehr interessanten Ausführungsform der Erfindung ist der verwendete Ligand/die verwendete primäre Zielkomponente das "Biotin/Streptavidin-System" oder das "Biotin/Avidin-System", d. h. der Ligand ist Biotin und die primäre Zielkomponente ist Streptavidin oder Avidin. Wie oben erwähnt, sollte der verwendete Ligand kovalent an eine sekundäre Zielkomponente gebunden sein, und, wie dem Fachmann bekannt sein wird, sind biotinylierte Verbindungen, wie zum Beispiel biotinylierte Antikörper, ohne weiteres erhältlich, da sie hergestellt werden können, wie es zum Beispiel in Kendall et al. Journal of Immunological Methods (1993), 56, 329–339, beschrieben ist. Somit würde man durch Herstellung der wasserlöslichen; vernetzten Konjugate durch die hier offenbarten Verfahren unter Verwendung von Streptavidin oder Avidin als die primäre Zielkomponente ein nützliches "Templat" erhalten, auf das jede interessante biotinylierte sekundäre Zielkomponente gebunden werden kann. Es sollte jedoch selbstverständlich sein, dass alle "Hapten/Antikörper-Systeme" als Ligand/primäre Zielkomponente nützlich sein können, mit der Maßgabe, dass die Assoziationskonstante zwischen dem verwendeten Antikörper und dem verwendeten Hapten die oben angegebenen Erfordernisse erfüllt.
Der Reaktionsschritt II), der oben angegeben ist, wird normalerweise bei Raumtemperatur durchgeführt, wonach die Umsetzung beendet werden kann [(Schritt III)], zum Beispiel indem der pH-Wert des Reaktionsgemisches geändert und/oder indem überschüssige freie Liganden, wie zum Beispiel Biotin, zugegeben werden.
Wie einem Fachmann klar sein wird, können die wasserlöslichen, vernetzten Konjugatkomplexe durch die gleichen Verfahren gereinigt werden, wie oben in Verbindung mit der Reinigung der wasserlöslichen, vernetzten Konjugate erwähnt. Außerdem sei angemerkt, dass die Konjugatkomplexe natürlich in einer festen Form auf ähnliche Weise, wie zuvor in Verbindung mit den Konjugaten besprochen wurde, isoliert werden können.
Da die wasserlöslichen, vernetzten Konjugate und die wasserlöslichen, vernetzten Konjugatkomplexe eine neue Klasse von Verbindungen darstellen, betrifft ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ein wasserlösliches, vernetztes Konjugat, welches Einheiten von mindestens einer Trägerkomponente, Einheiten von mehr als einer Verbindungskomponente, Einheiten von mindestens einer Spacerkomponente, Einheiten von mindestens einer Signalkomponente und Einheiten von mindestens einer primären Zielkomponente umfasst, wobei die Signalkomponente kovalent an die Spacerkomponente gebunden ist und die Spacerkomponente über die Verbindungskomponente kovalent an die Trägerkomponente gebunden ist, wobei
die Signalkomponente ausgewählt ist aus Farbstoffen, Proteinen (einschließlich Ferritin, Phycoerythrine, Phycocyanine und Phycobiline), Enzymen (einschließlich Meerrettich-Peroxidase, alkalischer Phosphatase, Glucoseoxidasen, Galactosidasen und Ureasen), fluoreszierenden, lumineszierenden, phosphoreszierenden und anderen Licht-emittierenden Substanzen, Metall-Chelat bildenden Substanzen (einschließlich Iminodiessigsäure, Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), Diethylentriaminpentaessigsäure (DTP) und Desferrioxamin B), Substanzen, die mit einem radioaktiven Isotop markiert sind, Substanzen, die mit einem Schweratom markiert sind und Gemischen davon;
und die Spacerkomponente aus Proteinen und Polypeptiden ausgewählt ist.
Noch eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft einen wasserlöslichen, vernetzten Konjugatkomplex, welcher ein wasserlösliches, vernetztes Konjugat, wie es hier definiert ist, einen Liganden und eine sekundäre Zielkomponente umfasst, wobei der Ligand kovalent an die sekundäre Zielkomponente gebunden ist und der Ligand über nichtkovalente Bindungen an die primäre Zielkomponente des Konjugats gebunden ist.
Wie klar sein wird, sind die Details und Besonderheiten bezüglich der Eigenschaften und Bestandteile der wasserlöslichen, vernetzten Konjugate sowie der wasserlöslichen, vernetzten Konjugatkomplexe der Erfindung gleich den oder analog zu den Details und Besonderheiten bezüglich der Eigenschaften und Bestandteile der wasserlöslichen, vernetzten Konjugate sowie der wasserlöslichen, vernetzten Konjugatkomplexe, welche in Verbindung mit den obigen Verfahrensaspekten besprochen wurden. Dies bedeutet, dass, wann immer es angebracht ist, die Angaben, die in Verbindung mit den Verfahrensaspekten gemacht wurden, entsprechend für die Konjugate und Konjugatkomplexe als solche gelten.
Vorrichtungen und Verwendungen von Konjugaten und Komplexen
Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine Vorrichtung mit lateralem Fluss zum Bestimmen der Anwesenheit oder Abwesenheit mindestens einer Zielkomponente in einer flüssigen Probe, wobei die Vorrichtung mit lateralem Fluss umfasst:

I) einen Teststreifen, der einen Aufbringungsteil, einen Ablagerungsteil und einen Detektionsteil umfasst und so angeordnet ist, dass die flüssige Probe von dem Aufbringungsteil durch den Ablagerungsteil zu dem Detektionsteil fließen kann;
II) eine trockene Ablagerung, die sich in dem Ablagerungsteil des Teststreifens befindet, von mindestens einem Konjugat, wie hier definiert, oder eine trockene Ablagerung von mindestens einem Konjugatkomplex, wie hier definiert, oder ein Gemisch davon; und
III) mindestens eine Zielkomponente, die sich selektiv an eine oder mehrere Zielkomponenten, die in der flüssigen Probe vorhanden sind, binden kann oder selektiv damit reagieren kann, wobei die Zielkomponente auf dem Detektionsteil des Teststreifens immobilisiert ist.

In einer weiteren interessanten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Bestimmen der Anwesenheit oder Abwesenheit mindestens einer Zielkomponente in einer flüssigen Probe, wobei das Verfahren umfasst:

I) Zugeben der flüssigen Probe zum Aufbringungsteil der Vorrichtung mit lateralem Fluss, wie hier definiert;
II) gegebenenfalls Zugeben eines Waschpuffers zum Aufbringungsteil der Vorrichtung mit lateralem Fluss;
III) Abwarten einer ausreichenden Zeitdauer, so dass die aufgebrachte Flüssigkeit und, falls zutreffend, der Waschpuffer, vom Aufbringungsteil durch den Ablagerungsteil zum Detektionsteil fließen kann;
IV) Bestimmen der Anwesenheit oder Abwesenheit eines Signals in dem Detektionsteil.

Das Konjugat und/oder der Konjugatkomplex der Erfindung wird (als eine trockene Ablagerung) auf dem Ablagerungsteil des Teststreifens derart getragen, dass bei Befeuchtung das Konjugat und/oder der Konjugatkomplex durch Kapillarkräfte (in einem aufgelösten Zustand) zum Detektionsteil des Teststreifens transportiert werden kann.
Die Zielkomponente, welche auf dem Detektionsteil des Teststreifens getragen wird, wird derart getragen, dass die Zielkomponente immobil bleibt und folglich nicht mittels Kapillarkräften transportiert werden kann. Somit kann die Zielkomponente auf dem Teststreifen z. B. mittels Adsorption, kovalenter Kopplung usw. getragen werden. Verfahren zur Immobilisierung von Zielkomponenten, wie zum Beispiel Antikörpern und Antigenen, auf einem Trägermaterial sind im Allgemeinen auf dem Fachgebiet bekannt.
In einer Ausführungsform der Erfindung wird die sogenannte "Sandwich"-Technik in all ihren Variationen, wie sie dem Fachmann bekannt sind, für die Testanalyse verwendet.
Wie dem Fachmann klar sein wird, kann der sogenannte "Aufbringungs"-teil des Teststreifens, d. h. der Teil des Teststreifens, der durch die Probe, welche die nachzuweisende Zielkomponente (d. h. den Analyten) enthält, befeuchtet werden soll, zum Ablagerungsteil identisch sein. Somit wird in einer interessanten Ausführungsform der Erfindung die Probe, welche die nachzuweisende Zielkomponente enthält, direkt auf den Teil des Teststreifens aufgebracht, welcher das Konjugat und/oder den Konjugatkomplex enthält.
Der Teststreifen ist ein Streifen, welcher die Zielkomponente von der aufgebrachten Probe absorbieren kann und welcher, wenn er befeuchtet wird, für einen Fluss der Zielkomponente durch Kapillaranziehung von dem Aufbringungsteil durch den Ablagerungsteil (wodurch die trockene Ablagerung von Konjugat und/oder Konjugatkomplex, welches/welcher dann an die Zielkomponente gebunden ist und mit dieser transportiert wird, aufgelöst wird) zum Detektionsteil sorgt.
Der verwendete Streifen ist aus einem Material gefertigt, welches die Konjugate und/oder die Konjugatkomplexe der Erfindung sowie Zielkomponenten, wie zum Beispiel Antikörper und/oder Antigen, tragen kann. Beispiele für geeignete Materialien, aus denen der Teststreifen gefertigt sein kann, sind z. B. Glasfaser, Cellulose, Nylon, vernetztes Dextran, verschiedene chromatographische Papiere, Celluloseester, wie zum Beispiel Nitrocellulose, usw. Derzeit ist das am stärksten bevorzugte Material Nitrocellulose.
Obwohl als "Streifen" bezeichnet, in dem die verschiedenen Teile in der gleichen Ebene derart angeordnet sind, dass die Flüssigkeit, die. die Zielkomponente umfasst, durch Kapillaranziehung von dem Aufbringungsteil durch den Ablagerungsteil zum Detektionsteil fließen kann, kann das Trägermaterial natürlich jede Form haben, so lange die Erfordernisse in Hinblick auf die verschiedenen Teile und die Fließbarkeit erfüllt sind.
Die Flüssigkeit, die die nachzuweisende Zielkomponente enthält, wird meistens (aber nicht unbedingt) von biologischem Ursprung sein, wie zum Beispiel eine Blutprobe, eine Serumprobe, eine Plasmaprobe, eine Urinprobe, eine Samenprobe oder Gemische davon.
Die hier beschriebene Vorrichtung mit lateralem Fluss kann kleine Mengen einer Vielfalt von Zielkomponenten, wie zum Beispiel Antigene; Haptene; monoklonale und polyklonale Antikörper; Gensonden; natürliche und synthetische Oligo- und Polynukleotide; natürliche und synthetische Mono-, Oligo- und Polysaccharide; Wachstumsfaktoren; Hormone; Rezeptormoleküle sowie Gemische davon nachweisen. Spezifische Beispiele für Zielkomponenten sind zum Beispiel hCG, Kaninchen-Human-CRP, HIV, Hepatitis C, Chlamydia, Herpes, thyreotropes Hormon (TSH), Listeria, Salmonella und Gemische davon.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Signalkomponente des verwendeten wasserlöslichen, vernetzten Konjugats und/oder Konjugatkomplexes ein Farbstoff, welcher direkt mit dem bloßen Auge erkennbar ist. Folglich wird es, wenn derartige Konjugate/Konjugatkomplexe in der hier offenbarten Vorrichtung mit lateralem Fluss verwendet werden, möglich sein, die Anwesenheit oder Abwesenheit der Zielkomponente in der aufgebrachten flüssigen Probe visuell zu bestimmen. Eine weitere interessante Ausführungsform der Erfindung umfasst jedoch die Verwendung von Konjugaten/Konjugatkomplexen, wie hier beschrieben, wobei die Signalkomponente eine derartige Signalkomponente ist, dass das Signal, wenn es in der hier offenbarten Vorrichtung mit lateralem Fluss aufgebracht wird, nach Zugabe eines Reagenzes zum Detektionsteil mit dem bloßen Auge erkennbar sein kann.
Wie zuvor besprochen, sind die Konjugate der vorliegenden Erfindung wesentlich "größer" im Vergleich zu den im Stand der Technik offenbarten Konjugaten. Obwohl es schwierig sein kann, die genaue Struktur der Konjugate gemäß der Erfindung zu ermitteln, wird derzeit angenommen, dass eine umfassende Vernetzung stattgefunden hat, was wiederum für die Größe (und damit das Massenmittel des Molekulargewichts) der Konjugate verantwortlich ist. Wie aus den hier offenbarten Arbeitsbeispielen ersichtlich wird, scheint es die Regel zu sein, dass, je höher das Molekulargewicht, desto besser die erhaltene Leistung (d. h. desto höher die Empfindlichkeit) ist, wenn sie in dem hier in Beispiel 7A beschriebenen "Standardtest der Leistung des lateralen Flusses" getestet wird.
Es ist anzumerken, dass die Vorrichtung mit lateralem Fluss, die in EP-A-0 291 194 offenbart ist, ein Beispiel für eine geeignete Vorrichtung mit lateralem Fluss ist, wobei die wasserlöslichen, vernetzten Konjugate und/oder Konjugatkomplexe der vorliegenden Erfindung eingebracht werden können.
In noch weiteren Ausührungsformen betrifft die vorliegende Erfindung auch die Verwendung eines, wasserlöslichen, vernetzten Konjugats, wie hier definiert, und die Verwendung eines wasserlöslichen, vernetzten Konjugatkomplexes, wie hier definiert, in immunochemischen Assaytechniken, einschließlich enzymatischer Immunoassays (EIA), wie zum Beispiel ELISA, Radioimmunoassays (RIA), nephelometrischer und turbidimetrischer Immunoassays, immunohistochemischer Verfahren, cytochemischer Verfahren, Flusscytometrie, in situ Hybridisierungstechniken, Membranhybridisierungstechniken, einschließlich Southern and Northern Blotting, Biosensoren, Vorrichtungen mit lateralem Fluss oder Verfahren, die auf Lectin/Kohlenhydratwechselwirkungen beruhen.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1: Reinigung von Dex-BSA-Rhodamin/a-CRP-Konjugat
UV-Absorption-Gelfiltrationsprofil (Beispiel 5A "Lösung B", Gelfiltration durchgeführt auf Sephacryl^TM S-300) für eine Probe, die nach Koppeln von Kaninchen-Anti-Human-CRP an DVS-aktivierte "Dex-BSA-Rhodamin"-Konjugate in hoher ionischer Stärke (1,75 M Kaliumphosphatpuffer) erhalten wurde. Der Hauptpeak, (1), enthält das wasserlösliche, vernetzte "Dex-BSA-Rhodamin/a-CRP"-Konjugat. Auf der horizontalen Achse bedeutet jede Markierung 2 ml. Die Markierungen auf der vertikalen Achse zeigen willkürliche Absorptionseinheiten bei 280 nm. Die Figur zeigt, dass freier, ungebundener Antikörper, Peak (2), von dem Konjugat getrennt werden kann.
2: Charakterisierung c: Dex-BSA-Rhodamin/a-CRP-Konjugat
UV-Absorption-Gelfiltrationsprofil (Beispiel 5A "Lösung B", Gelfiltration durchgeführt auf Sephacryl^TM S-500) für eine Probe, die nach Koppeln von Kaninchen-Anti-Human-CRP an DVS-aktivierte "Dex-BSA-Rhodamin"-Konjugate in hoher ionischer Stärke (1,75 M Kaliumphosphatpuffer) erhalten wurde. Die Hauptfraktion, (1), enthält das wasserlösliche, vernetzte "Dex-BSA-Rhodamin/a-CRP"-Konjugat. Auf der horizontalen Achse bedeutet jede Markierung 2 ml. Die Markierungen auf der vertikalen Achse zeigen willkürliche Absorptionseinheiten bei 280 nm. Die Figur zeigt, dass das Konjugat ein hohes und definiertes Molekulargewicht aufweist, welches eine frühe Elution und einen scharfen Peak ergibt.
3a–3f: Charakterisierung von Konjugaten, die in hohen und niedrigen ionischen Stärken ausgefällt wurden
UV-Absorption-Gelfiltrationsprofile (3a–b: Charakterisierungsprofile von Gelfiltration, durchgeführt auf Sephacryl^TM HR S-300; 3c–d: Charakterisierungsprofile von Gelfiltration, durchgeführt auf Sephacryl^TM HR S-500; 3e–f: Charakterisierungsprofile von Gelfiltration, durchgeführt auf Sephacryl^TM HR S-1000) für Proben, die nach dem Koppeln von Kaninchen-Anti-Human-CRP an DVS-aktivierte "Dex-BSA-Rhodamin"-Konjugate in hoher ionischer Stärke (2,2 M Kaliumphosphatpuffer) und niedriger ionischer Stärke (0,1 M Kaliumphosphatpuffer) erhalten wurden.
Die 3a, 3c, 3e zeigen Konjugate, die in hoher ionischer Stärke hergestellt wurden, während die 3b, 3d, 3f Konjugate zeigen, die in niedriger ionischer Stärke hergestellt wurden. Markierung (1) zeigt das Konjugat, während Markierung (2) freien, nicht gekoppelten Antikörper zeigt. Auf der horizontalen Achse bedeutet jede Markierung 2 ml. Die Markierungen auf der vertikalen Achse zeigen willkürliche Absorptionseinheiten bei 280 nm.
Die Gelfiltrationsprofile zeigen deutlich, dass die Molekulargewichte der in hoher ionischer Stärke hergestellten Konjugate höher sind als die in niedriger ionischer Stärke hergestellten Konjugate.
4: Übersicht des Verfahrens zur Herstellung des wasserlöslichen, vernetzten Konjugatkomplexes
Eine schematische Darstellung einer Ausführungsform der Herstellung von Komponenten und Vorläufern, die in der Beschreibung erwähnt ist, ist in 4 gezeigt. Die Figur ist nur zum Zweck der Klarheit zu verwenden, da sie einzelne Beispiele einer Ausführungsform darstellt, um dem Leser zu helfen, der allgemeinen Übersicht des in dem Verfahren beschriebenen Ablaufs zu folgen.
Die Erfindung wird ferner durch die im Folgenden beschriebenen Arbeitsbeispiele erläutert.
VERSUCHE
BEISPIEL 1: Bildung des wasserlöslichen Zwischenproduktvorläufers
BEISPIEL 1A
DVS-Aktivierung von Dextran mit einem Peak-MW von 500.000 und 2.000.000
Fünf separate Lösungen (A, B, C, D und E), die die gleiche Menge Dextran (erhalten von Pharmacia, Schweden), verschiedene Konzentrationen von DVS und 0,25 mg Natriumborhydrid/ml enthielten, wurden in 0,25 M Dikaliumhydrogenphosphat/Natriumhydroxid (pH-Wert 11,5) hergestellt, um die folgenden Endkonzentration zu erhalten:
Das Dextran wurde bei Raumtemperatur (20 bis 25°C) in Wasser gelöst. Der Lösung wurde das gleiche Volumen von 0,5 M Dikaliumhydrogenphosphat/Natriumhydroxid (pH-Wert 11,5) und 0,25 mg Borhydrid/ml zugegeben. Sofort nach der Auflösung des Natriumborhydrids wurde das Reaktionsgemisch in einen gut belüfteten Abzug transferiert und es wurde DVS (Merck Kat. Nr. 821215) zugegeben. Es wurde während 30 Minuten ein sanftes Rühren mit einem Magnetrührwerk durchgeführt. Nach der Aktivierung wurde der pH-Wert des Reaktionsgemisches mit 25% (Vol./Vol.) Salzsäure auf einen pH-Wert von 7 eingestellt.
Alle fünf Proben wurden gründlich gegen Wasser dialysiert, um überschüssige Reagenzien zu entfernen. Nach der Dialyse wurde das Volumen jeder Lösung gemessen und die Endkonzentration von Dextran wurde berechnet.
Der Gehalt an freien, reaktiven Vinylgruppen wurde durch Umsetzung mit einem großen Überschuss an Natriumthiosulphat bestimmt, gefolgt von Titration der resultierenden Hydroxidionen mit standardisierter Salzsäure. Die Umsetzung von freien Vinylgruppen mit Thiosulphat findet nach dem folgenden Reaktionsschema statt (Porath et al. (1975) J. Chromatogr. 103, 49): (Substrat)-O-CH₂-CH₂-SO₂-CH=CH₂ + S₂O₃ ^2– + H₂O → (Substrat)-O-CH₂-CH₂-SO₂-CH₂-CH₂-S₂O₃ ^– + OH^–
Die Titrationsergebnisse (siehe folgende Tabelle) werden zweckmäßig als μMol von Vinylgruppen pro Gramm Dextran und/oder als Mol von Vinylgruppen pro Mol Dextran ausgedrückt. Die durchschnittliche Anzahl der aktivierten Glucoseeinheiten wurde in Prozent der Gesamtmenge an Glucoseeinheiten in dem Dextranmolekül berechnet (Dextran mit einem Peak-MW von 500.000 enthält durchschnittlich 2.778 Glucoseeinheiten/Dextranmolekül, und Dextran mit einem Peak-MW von 2.000.000 enthält durchschnittlich 11.112 Glucoseeinheiten/Dextranmolekül):
BEISPIEL 1B
Epichlorhydrin-Aktivierung von Dextran mit einem Peak-MW von 500.000
Drei separate Lösungen (A, B und C), welche die gleiche Menge an Dextran mit einem Peak-MW von 500.000 enthielten, wurden hergestellt, um die folgenden Endkonzentrationen zu erhalten:
Das Dextran wurde bei Raumtemperatur (20 bis 25°C) in Wasser gelöst. Den Lösungen wurde Natriumhydroxid zugegeben und die Gemische wurden in einen gut belüfteten Abzug transferiert und es wurde Epichlorhydrin (Merck Kat. Nr. 903296) zugegeben. Es wurde während 5 Stunden ein sanftes Rühren mit einem Magnetrührwerk durchgeführt. Nach der Aktivierung wurde der pH-Wert des Reaktionsgemisches mit 25% (Vol./Vol.) Salzsäure auf einen pH-Wert von 7 eingestellt.
Alle drei Proben wurden gründlich gegen Wasser dialysiert, um überschüssige Reagenzien zu entfernen. Nach der Dialyse wurde das Volumen jeder Lösung gemessen und die Endkonzentration von Dextran wurde berechnet.
Der Gehalt an freien, reaktiven Epoxidgruppen wurde durch Umsetzung mit einem großen Überschuss an Natriumthiosulphat bestimmt, gefolgt von Titration der resultierenden Hydroxidionen mit standardisierter Salzsäure, wie in Beispiel 1A beschrieben.
Die erhaltenen Ergebnisse waren:
Für die angegebenen Beispiele kann abgeleitet werden, dass sowohl DVS als auch EPCH gut als Aktivierungsreagenzien auf Dextranen mit hohem und geringem Molekulargewicht wirken.
Beispiel 2: Bildung des zweiten wasserlöslichen Zwischenproduktvorläufers
BEISPIEL 2A
Koppeln von Rinderserumalbumin (BSA) an DVS-aktivierte Dextrane mit einem Peak-MW von 500.000 und 2.000.000
Fünf Lösungen (A, B, C, D und E) von DVS-aktiviertem Dextran wurden mit BSA (Boehringer Mannheim Kat. Nr. 100 350) gekoppelt. Das Verfahren zum Koppeln von BSA an das DVS-aktivierte Dextran war wie folgt:
Lösung A: 60 mg DVS-aktiviertes Dextran (Peak-MW von 500.000). Hergestellt, wie für "Lösung A" in Beispiel 1A beschrieben) und 200 mg BSA wurden in Dikaliumhydrogenphosphat/Natriumhydroxidpuffer, pH-Wert 10,4, aufgelöst.
Lösung B: 30 mg DVS-aktiviertes Dextran (Peak-MW von 500.000). Hergestellt, wie für "Lösung A" in Beispiel 1A beschrieben) und 200 mg BSA wurden in Dikaliumhydrogenphosphat/Natriumhydroxidpuffer, pH-Wert 10,4, aufgelöst.
Lösung C: 152 mg DVS-aktiviertes Dextran (Peak-MW von 2.000.000). Hergestellt, wie für "Lösung C" in Beispiel 1A beschrieben) und 500 mg BSA wurden in Dikaliumhydrogenphosphat/Natriumhydroxidpuffer, pH-Wert 10,4, aufgelöst.
Lösung D: 152 mg DVS-aktiviertes Dextran (Peak-MW von 2.000.000). Hergestellt, wie für "Lösung D" in Beispiel 1A beschrieben) und 500 mg BSA wurden in Dikaliumhydrogenphosphat/Natriumhydroxidpuffer, pH-Wert 10,4, aufgelöst.
Lösung E: 152 mg DVS-aktiviertes Dextran (Peak-MW von 2.000.000). Hergestellt, wie für "Lösung E" in Beispiel 1A beschrieben) und 500 mg BSA wurden in Dikaliumhydrogenphosphat/Natriumhydroxidpuffer, pH-Wert 10,4, aufgelöst.
Nachdem das BSA aufgelöst war, wurde der Puffer zugegeben, um die folgenden Endkonzentrationen zu ergeben:
17 mg BSA/ml
5,2 mg DVS-aktiviertes Dextran/ml
10 mM Dikaliumhydrogenphosphat/Natriumhydroxidpuffer, pH-Wert 10,4
Es wurde eine Kopplung bei 30°C während 18 Stunden durchgeführt, woraufhin die Umsetzung gestoppt wurde, indem der pH-Wert der Lösungen auf einen pH-Wert von 6 bis 7 eingestellt wurde, indem 1 M Salzsäure zugegeben wurde.
Die Menge an gekoppeltem BSA wurde durch Gelfiltration auf Sephacryl HR S-300 (Pharmacia, Schweden, Kat. Nr. 17-0599-01) bestimmt. Alle Gelfiltrationen wurden mittels FPLC (Pharmacia, Schweden) unter Verwendung einer Pharmacia-Säule (Kat. Nr. XK26/40) mit einem Durchmesser von 2,7 cm und einem Bettvolumen von 230 ml Sephacryl HR S-300 durchgeführt. Die Gelfiltration wurde in 100 mM Natriumchlorid mit einer Flussrate von 3 ml/Minute und einer maximalen Probenladung von 20 ml durchgeführt. Die Fraktionen wurden unter Verwendung eines UV-Monitors (Pharmacia, Schweden, Kat. Nr. 19-2448-01/18-0601-01) und eines Messschreibers (Pharmacia, Schweden, Kat. Nr. 19-8004-01) überwacht.
Die Trennung auf Sephacryl HR S-300 führte zu zwei Peaks, welche in zwei separaten Fraktionen aufgefangen wurden.
Bei der Verwendung der Gelfiltrationstechnik können große Moleküle über der sogenannten "Ausschlussgrenze" des Gels nicht in die Poren gelangen und folglich werden derartige große Moleküle von der Säule in dem sogenannten "Hohlraumvolumen" eluiert, d. h. das Hohlraumvolumen ist das Volumen zwischen den einzelnen Tropfen. Normalerweise beträgt das Hohlraumvolumen etwa 1/3 des Gesamtvolumens der Säule.
OD 280 nm wurde bei beiden der aufgefangenen Fraktionen gemessen und die erhaltenen Ergebnisse wurden als die Zahl an BSA-Molekülen ausgedrückt, die an ein Molekül von Dextran mit einem durchschnittlichen MW entsprechend dem Peak-MW des Dextrans gebunden sind. Die erhaltenen Ergebnisse sind unten zusammengestellt.
Die obigen Werte können wie unten beschrieben berechnet werden:
Das Koppeln, das mit 30 mg Dextran (Peak-MW 500.000) und 200 mg BSA durchgeführt wurde (d. h. das Molverhältnis in der Lösung ist Dextran : BSA = 1 : 25) kann folgendermaßen berechnet werden:
A = OD 280 nm, 1 cm Küvette, Peak 1 von Sephacryl S-300;
B = OD 280 nm, 1 cm Küvette, Peak 2 von Sephacryl S-300;
C = Peakvolumen 1 (in ml);
D = Peakvolumen 2 (in ml);
ε (BSA, 280 nm, 1 cm, 1 mg/ml) = 0,65;
mg BSA in Peak 1 = (A × C)/0,65 = Y mg BSA;
mg BSA in Peak 2 = (B × D)/0,65 = Z mg BSA;
Prozent gekoppeltes BSA = (Y × 100)/(Y + Z);
Gekoppelte Mol BSA/Mol Dextran = (Verhältnis von Dextran : BSA × % gekoppeltes BSA)/100;
Der erste Peak (d. h. der in dem Hohlraumvolumen von Sephacryl HR S-300 erhaltene Peak), der an Dextran gekoppeltes BSA enthält, wird im Folgenden als "Dex-BSA"-Konjugat bezeichnet.
Die "Dex-BSA"-Konjugate wurden auf Sephacryl HR S-500 (Pharmacia, Schweden, Kat. Nr. 17-0613-01) charakterisiert. Alle Gelfiltrationen wurden mittels FPLC (Pharmacia, Schweden) unter Verwendung einer FPLC-Säule (Kat. Nr. HR 10/30, Pharmacia, Schweden) mit einem Bettvolumen von 25 ml Sephacryl HR S-500 durchgeführt. Die Gelfiltration wurde in 100 mM Natriumchlorid mit einer Flussrate von 1 ml/Minute und einer maximalen Probenladung (bei jedem Durchlauf) von 100 bis 500 μl durchgeführt.
Die Trennung auf Sephacryl HR S-500 führte zu zwei teilweise verschmolzenen Peaks. Der erste Peak (Peak eins) wurde nach 8 ml in dem "Hohlraumvolumen" eluiert (Das Hohlraumvolumen von 25 ml Sephacryl HR S-500 ist 8 ml).
Charakterisierung auf Sephacryl HR S-500 wurde als Prozent "Dex-BSA"-Konjugat im ersten Peak des Profils ausgedrückt (im Folgenden als "im Hohlraumvolumen eluiertes Konjugat" bezeichnet). Durch Berechnung der Größe der Fraktion wurde die Fraktion vom Beginn des Peak eins bis zur Markierung 5,25 (d. h. 10,5 ml vom Beginn der Gelfiltration) gemessen. Die erhaltenen Ergebnisse waren:

Lösung % "Deg-BSA"-Konjugat, eluiert im Hohlraumvolumen

A 30

B 18

C 41

D 41

E 36
BEISPIEL 2B
Koppeln von Rinderserumalbumin (BSA) an Epichlorhydrin-aktivierte Dextrane mit einem Peak-MW von 500.000
Drei Lösungen (A, B und C) von Epichlorhydrin-aktiviertem Dextran wurden mit BSA (Boehringer Mannheim Kat. Nr. 100 350) gekoppelt. Das Verfahren zum Koppeln von BSA an das DVS-aktivierte Dextran war wie folgt:
Lösung A: 90 mg Epichlorhydrin-aktiviertes Dextran (Peak-MW von 500.000). Hergestellt, wie für "Lösung A" in Beispiel 1B) beschrieben, und 300 mg BSA wurden in Dikaliumhydrogenphosphat/Natriumhydroxidpuffer, pH-Wert 10,4, aufgelöst.
Lösung B: 90 mg Epichlorhydrin-aktiviertes Dextran (Peak-MW von 500.000). Hergestellt, wie für "Lösung B" in Beispiel 1B) beschrieben, und 300 mg BSA wurden in Dikaliumhydrogenphosphat/Natriumhydroxidpuffer, pH-Wert 10,4, aufgelöst.
Lösung C: 90 mg Epichlorhydrin-aktiviertes Dextran (Peak-MW von 500.000). Hergestellt, wie für "Lösung C" in Beispiel 1B) beschrieben, und 300 mg BSA wurden in Dikaliumhydrogenphosphat/Natriumhydroxidpuffer, pH-Wert 10,4, aufgelöst.
Nachdem das BSA aufgelöst war, wurde Puffer zugegeben, um die folgenden Endkonzentrationen zu ergeben:
18 mg BSA/ml
5,5 mg Epichlorhydrin-aktiviertes Dextran/ml
10 mM Dikaliumhydrogenphosphat/Natriumhydroxidpuffer, pH-Wert 10,4
Es wurde eine Kopplung bei 30°C während 18 Stunden durchgeführt, woraufhin die Reaktion gestoppt wurde, indem der pH-Wert der Lösungen auf einen pH-Wert von 6 bis 7 eingestellt wurde, indem 1 M Salzsäure zugegeben wurde.
Die Menge an gekoppeltem BSA wurde durch Gelfiltration auf Sephacryl HR S-300 bestimmt, wie in Beispiel 2A beschrieben.
Die erhaltenen Ergebnisse waren:
Die "Dex-BSA"-Konjugate wurden dann auf Sephacryl HR S-500 charakterisiert, wie in Beispiel 3A beschrieben. Die Trennung auf Sephacryl führte zu einem Doppelpeak, aber es wurde kein Peak von "Dex-BSA"-Konjugat in der Hohlraumvolumen-Fraktion beobachtet.
Aus den angegebenen Beispielen kann abgeleitet werden, dass unter Verwendung von BSA als die Spacerkomponente zwei verschiedene Arten von Dextranaktivierung zufriedenstellende Kopplungsausbeuten ergeben.
Beispiel 3: Bildung des wasserlöslichen Zwischenproduktkonjugats
BEISPIEL 3A
Kopplung von Rhodamin-Farbstoff an DVS-aktivierte Dextran-BSA-Konjugate
Drei Lösungen (A, B und C) von "Dex-BSA" mit zwei verschiedenen Peak-MW von Dextran (Peak-MW 500.000 bzw. 2.000.000) wurden mit Rhodamin B Isothiocyanat (Sigma, Kat. Nr. 1755, Rhodamin ITC) gekoppelt.
Lösung A: "Dex-BSA" mit Peak-MW 500.000 koppelte 17 Mol BSA/Mol Dextran, wie für "Lösung A" in Beispiel 2A beschrieben.
Lösung B: "Dex-BSA" mit Peak-MW 500.000 koppelte 17 Mol BSA/Mol Dextran, wie für "Lösung A" in Beispiel 2A beschrieben.
Lösung C: "Dex-BSA" mit Peak-MW 2.000.000 koppelte 48 Mol BSA/Mol Dextran, wie für "Lösung C" in Beispiel 2A beschrieben.
Drei separate Lösungen mit 20 mg BSA (als "Dex-BSA") und Rhodamin ITC (aus einer Ansatzlösung bei 5 mg Rhodamin ITC/ml DMSO) wurden mit Puffer gemischt, um die folgenden Endkonzentrationen zu ergeben:
Lösung A: 400 mg Rhodamin ITC/ml und 2 mg BSA/ml
Lösung B + C: 200 mg Rhodamin ITC/ml und 2 mg BSA/ml
Alle drei Lösungen enthielten 30% DMSO und 0,2 M Natriumhydrogencarbonat, pH-Wert 8,6.
Es wurde ein Koppeln bei 30°C während 3 Stunden durchgeführt, woraufhin die Lösungen gründlich gegen 10 mM Kaliumphosphatpuffer, pH-Wert 7,2, dialysiert wurden, um überschüssige Reagenzien zu entfernen.
Nach der Dialyse wurde das Volumen jeder Lösung gemessen und die Menge an "Dex-BSA", die an Rhodamin ITC gekoppelt war (im Folgenden als "Dex-BSA-Rhodamin"-Konjugat bezeichnet) wurde berechnet. Die optische Dichte bei 558 nm (1 cm Küvette) wurde bei allen Proben gemessen und bei jeder Probe wurden Extinktionseinheiten berechnet. Die erhaltenen Ergebnisse waren:
Wie in obiger Tabelle angezeigt, kann die Menge an gekoppeltem Rhodamin ITC als OD 558 EU/mg BSA ausgedrückt werden. Dieser Wert kann wie folgt berechnet werden:
A = Volumen von "Dex-BSA-Rhodamin"-Lösung nach Dialyse
B = mg von beim Koppeln verwendetem BSA
Gekoppeltes OD 558 EU/mg BSA = (A × OD 558)/B
Die "Dex-BSA-Rhodamin"-Konjugate wurden auf Sephacryl HR S-500 (Pharmacia, Schweden, Kat. Nr. 17-0613-01) und Sephacryl S-300 (Pharmacia, Schweden, Kat. Nr. 17-0599-01) charakterisiert.
Alle Gelfiltrationen wurden wie in Beispiel 2A für S-500 Gelfiltration beschrieben auf einer FPLC (Pharmacia, Schweden) in einer FPLC-Säule (Pharmacia, Schweden, Kat. Nr. HR 10/30) mit einem Bettvolumen von 25 ml Sephacryl HR S-300 oder 25 ml Sephacryl HR S-500 durchgeführt. Die Gelfiltrationen wurden in 50 mM Tris, 0,1 M Natriumchlorid, 1% Vol./Vol. Tween 20, mit 1 M Salzsäure auf einen pH-Wert von 9 eingestellt, durchgeführt. Die Flussrate betrug 1 ml/Minute und die Probenladung war 100 bis 500 μl (bei jedem Durchlauf), abhängig von der Konzentration der Probe. Die erhaltenen Ergebnisse waren:
BEISPIEL 3B
Kopplung von Rhodamin-Farbstoff an EPCH-aktivierte Dextran-BSA-Konjugate
Drei Lösungen (A, B und C) von "Dex-BSA" mit einem Peak-MW von 500.000 wurden mit Rhodamin B Isothiocyanat (Sigma, Kat. Nr. R 1755, Rhodamin ITC) gekoppelt.
Lösung A: "Dex-BSA" mit Peak-MW 500.000 koppelte 4 Mol BSA/Mol Dextran, wie bei "Lösung A" in Beispiel 2B beschrieben.
Lösung B: "Dex-BSA" mit Peak-MW 500.000 koppelte 5 Mol BSA/Mol Dextran, wie bei "Lösung B" in Beispiel 2B beschrieben.
Lösung C: "Dex-BSA" mit Peak-MW 500.000 koppelte 6 Mol BSA/Mol Dextran, wie bei "Lösung C" in Beispiel 2B beschrieben.
Drei separate Lösungen mit 6 mg BSA (als "Dex-BSA") und Rhodamin ITC (aus einer Ansatzlösung bei 5 mg Rhodamin ITC/ml DMSO) wurden mit Puffer gemischt, um die folgenden Endkonzentrationen zu ergeben:
200 mg Rhodamin ITC/ml
0,5 mg BSA/ml
30% Dimethylsulfoxid
0,2 M Natriumhydrogencarbonat, pH-Wert 8,6
Es wurden ein Koppeln und die anschließende Dialyse wie in Beispiel 3A beschrieben durchgeführt.
Nach der Dialyse wurde die optische Dichte bei 558 nm (1 cm Küvette) bei allen Proben gemessen und bei jeder Probe wurden Extinktionseinheiten (EU) berechnet. Die erhaltenen Ergebnisse waren:
Die Dex-BSA-Rhodamin-Konjugate wurden auf Sephacryl HR S-500 und Sephacryl S-300 wie in Beispiel 4A beschrieben charakterisiert, wobei der einzige Unterschied das Elutionsmittel war, welches 50 mM Tris, 0,1 M Natriumchlorid, 0,5% Vol./Vol. Tween-20 enthielt, das mit 1 M Salzsäure auf einen pH-Wert von 7,2 eingestellt war. Die erhaltenen Ergebnisse waren
BEISPIEL 3C
Kopplung von Cy5-Farbstoff an DVS-aktivierte Dextran-BSA-Konjugate
Zwei Lösungen (A und B) von "Dex-BSA" mit einem Peak-MW von 500.000 wurden mit monofunktionellem reaktivem Cy5-OSu-Farbstoff (Amersham Pharmacia Biotec UK, Kat. Nr. PA 15102) gekoppelt.
Lösung A und B: "Dex-BSA" mit Peak-MW 500.000 koppelte 17 Mol BSA/Mol Dextran, wie bei "Lösung A" in Beispiel 2A beschrieben.
Zwei separate Lösungen mit BSA (als "Dex-BSA") und Cy5 (aus einer Ansatzlösung bei 8 mg Cy5/ml DMSO) wurden mit Puffer gemischt, um die folgenden Endkonzentrationen zu ergeben:
Lösung A: 2 mg BSA/ml, 4000 mg Cy5/ml, 50% DMSO, 0,05 M Natriumhydrogencarbonat, pH-Wert 8,6.
Lösung B: 1 mg BSA/ml, 4000 mg Cy5/ml, 50% DMSO, 0,05 M Natriumhydrogencarbonat, pH-Wert 8,6.
Es wurden ein Koppeln und die anschließende Dialyse wie in Beispiel 3A beschrieben durchgeführt, wobei der einzige Unterschied darin bestand, dass die Reaktionszeit auf 2 Stunden gesenkt wurde.
Nach der Dialyse wurde die optische Dichte bei 655 nm (1 cm Küvette) bei allen Proben gemessen und bei jeder Probe wurden Extinktionseinheiten (EU) berechnet. Die erhaltenen Ergebnisse waren:
BEISPIEL 3D
Kopplung von Reaktiv-Orange-Farbstoff an DVS-aktivierte Dextran-BSA-Konjugate
Eine Lösung von "Dex-BSA" mit einem Peak-MW 500.000, gekoppelt als 17 Mol BSA/Mol Dextran, wie bei "Lösung A" in Beispiel 2A beschrieben, wurde mit Reaktiv-Orange 16 (Aldrich, Kat. Nr. 30.650-9) gekoppelt.
Eine Lösung, enthaltend 10 mg BSA (als "Dex-BSA") und Reaktiv-Orange 16 (aus einer Ansatzlösung bei 5 mg Reaktiv-Orange 16/ml DMSO) wurden mit einem Puffer gemischt, um die folgenden Endkonzentrationen zu ergeben:
5 mg BSA/ml
250 mg Reaktiv-Orange 16/ml
5% DMSO
0,4 M Kaliumphosphat, pH-Wert 10,4
Es wurde ein Koppeln und die anschließende Dialyse wie in Beispiel 3A beschrieben durchgeführt, wobei der einzige Unterschied darin bestand, dass die Reaktionszeit auf 18 Stunden erhöht wurde.
Nach der Dialyse wurde die optische Dichte bei 493 nm (1 cm Küvette) bei allen Proben gemessen und bei jeder Probe wurden Extinktionseinheiten (EU) berechnet. Die erhaltenen Ergebnisse waren:
Das "Dex-BSA-Reaktiv-Orange-16"-Konjugat wurde auf Sephacryl HR S-500 und Sephacryl HR S-300 wie in Beispiel 3A beschrieben charakterisiert, wobei der einzige Unterschied das Elutionsmittel war, das 50 mM Tris, 0,1 M Natriumchlorid, 0,5% Vol./Vol. Tween-20 enthielt, das mit 1 M Salzsäure auf einen pH-Wert von 7,2 eingestellt war. Die erhaltenen Ergebnisse waren:

% "Deg-BSA-Reaktiv-Orange-16" (S-300) Konjugat im Hohlraumvolumen (S-500)

86% 17,4%
BEISPIEL 3E
Kopplung von Uniblau-A-Farbstoff an DVS-aktivierte Dextran-BSA-Konjugate
Eine Lösung von "Dex-BSA" mit einem Peak-MW 500.000, gekoppelt als 17 Mol BSA/Mol Dextran, wie bei "Lösung A" in Beispiel 2A beschrieben, wurde mit Uniblau A (Sigma, Kat. Nr. 29.840-9) gekoppelt.
Eine Lösung, enthaltend 10 mg BSA (als "Dex-BSA") und Uniblau A (aus einer Ansatzlösung bei 5 mg Uniblau A/ml DMSO) wurden mit Puffer gemischt, um die folgenden Endkonzentrationen zu ergeben:
5 mg BSA/ml
500 mg Uniblau A/ml
10% DMSO
0,4 M Kaliumphosphat, pH-Wert 10,4
Es wurden ein Koppeln und die anschließende Dialyse wie in Beispiel 3A beschrieben durchgeführt.
Nach der Dialyse wurde die optische Dichte bei 595 nm (1 cm Küvette) bei der Probe gemessen und bei der Probe wurden Extinktionseinheiten (EU) berechnet. Die erhaltenen Ergebnisse waren:
Das "Dex-BSA-Uniblau-A"-Konjugat wurde auf Sephacryl HR S-500 und Sephacryl HR S-300 wie in Beispiel 3A beschrieben charakterisiert, wobei der einzige Unterschied das Elutionsmittel war, das 50 mM Tris, 0,1 M Natriumchlorid, 0,5% Vol./Vol. Tween-20 enthielt, das mit 1 M Salzsäure auf einen pH-Wert von 7,2 eingestellt war. Die erhaltenen Ergebnisse waren:

% "Dex-BSA-Uniblau-A" (S-300) Konjugat im Hohlraumvolumen (S-500)

78% 16%
Aus den angegebenen Beispielen kann abgeleitet werden, dass sich eine Anzahl von verschiedenen Farbstoffen wirksam an ein Dex-BSA-Zwischenprodukt koppelte, welches entweder durch DVS oder durch EPCH aktiviert worden war.
Beispiel 4: Bildung des wasserlöslichen Zwischenproduktkonjugats
BEISPIEL 4A
Kopplung von Kaninchen-Anti-Human-CRP an DVS-aktivierte "Dex-BSA-Rhodamin"-Konjugate in hoher ionischer Stärke
Fünf Lösungen (A, B, C, D und E) von "Dex-BSA-Rhodamin"-Konjugaten wurden mit der Kaninchen-Anti-Human-CRP-Immunoglobulin-Fraktion (DAKO, Dänemark, Kat. Nr. Q 0329) gekoppelt.
Lösung A und D: "Dex-BSA-Rhodamin" mit einem Peak-MW 500.000 koppelte 29 OD 558 Einheiten/mg BSA, wie bei "Lösung A" in Beispiel 3A beschrieben.
Lösung B, C und E: "Dex-BSA-Rhodamin" mit einem Peak-MW 500.000 koppelte 13 OD 558 Einheiten/mg BSA, wie bei "Lösung B" in Beispiel 3A beschrieben.
Die folgenden Lösungen, die Antikörper und "Dex-BSA-Rhodamin" enthielten, wurden hergestellt:
Lösung A und B: 0,0016 μMol Antikörper und 0,000645 μMol Dextran (als "Dex-BSA-Rhodamin") wurden mit 3,5 M Kaliumphosphatpuffer, pH-Wert 8,8, gemischt, um die folgenden Endkonzentrationen zu ergeben:
1,75 M Kaliumphosphatpuffer
pH-Wert 8,6
0,24 mg Antikörper/ml
Molverhältnis in der Lösung: "dex-BSA-Rhodamin"/Antikörper: 1/2,5
Lösung C: 0,007742 μMol Antikörper und 0,001548 μMol Dextran (als "dex-BSA-Rhodamin") wurden mit 3,5 M Kaliumphosphatpuffer, pH-Wert 8,8, gemischt, um die folgenden Endkonzentrationen zu ergeben:
2,2 M Kaliumphosphatpuffer
pH-Wert 8,6
0,21 mg Antikörper/ml
Molverhältnis in der Lösung: "dex-BSA-Rhodamin"/Antikörper: 1/5
Lösung D: 0,003226 μMol Antikörper und 0,00129 μMol Dextran (als "dex-BSA-Rhodamin") wurden mit 3,5 M Kaliumphosphatpuffer, pH-Wert 8,8, gemischt, um die folgenden Endkonzentrationen zu ergeben:
2,2 M Kaliumphosphatpuffer
pH-Wert 8,6
0,13 mg Antikörper/ml
Molverhältnis in der Lösung: "dex-BSA-Rhodamin"/Antikörper: 1/2,5
Lösung E: 0,0016 μMol Antikörper und 0,000645 μMol Dextran (als "dex-BSA-Rhodamin") wurden mit 3,5 M Kaliumphosphatpuffer, pH-Wert 8,8, gemischt, um die folgenden Endkonzentrationen zu ergeben:
2,2 M Kaliumphosphatpuffer
pH-Wert 8,6
0,15 mg Antikörper/ml
Molverhältnis in der Lösung: "dex-BSA-Rhodamin"/Antikörper: 1/2,5
Nach dem Mischen wurde ein Niederschlag in der Lösung beobachtet und das Koppeln des Antikörpers wurde bei 4 bis 6°C während 18 Stunden fortgeführt. Nach dem Koppeln wurde Cystein (Merck, Kat. Nr. 1.02838) den Proben bis zu einer Endkonzentration von 0,01 M Cystein zugegeben. Die Konzentration von Phosphatpuffer in Lösung C, D und E wurde auf 1,75 M eingestellt, indem der Lösung deionisiertes Wasser zugegeben wurde. Alle fünf Lösungen wurden während 5 Minuten bei 10.000 U/Min zentrifugiert und die überstehenden Flüssigkeiten, welche klar und nahezu farblos waren, wurden vorsichtig mit einer Pipette abgesaugt. Der Niederschlag (Pellets), der freien Antikörper und gekoppelten Antikörper enthielt, wurde in deionisiertem Wasser aufgelöst.
Pellets von Lösung A und B wurden in 400 μl deionisiertem Wasser gelöst und Tween-20 wurde bis zu einer Endkonzentration von 1% Vol./Vol. zugegeben.
Pellets von Lösung C wurden in 700 μl deionisiertem Wasser aufgelöst, gefolgt von einer Dialyse während einer Stunde gegen 50 mM Tris und 0,1 M Natriumchlorid, das mit 1 M Salzsäure auf einen pH-Wert von 7,2 eingestellt war. Nach der Dialyse wurde Tween-20 bis zu einer Endkonzentration von 0,5% Vol./Vol. zugegeben.
Pellets von Lösung D und C wurden in 500 μl deionisiertem Wasser gelöst und Tween-20 wurde bis zu einer Endkonzentration von 0,5% Vol./Vol. zugegeben.
Freier Antikörper und "Dex-BSA-Rhodamin"-gebundener Antikörper in den Proben wurden durch Gelfiltration auf Sephacryl HR S-300 (Pharmacia, Schweden, Kat. Nr. 17-0599-01) getrennt. Alle Gelfiltrationen wurden auf einer FPLC (Pharmacia, Schweden) unter Verwendung einer Pharmacia-Säule (Kat. Nr. HR 10/30) mit einem Durchmesser von 1 cm und einem Bettvolumen von 25 ml Sephacryl HR S-300 durchgeführt. Die Gelfiltrationen der Lösungen A und B wurden in 50 mM Tris, 0,1 M Natriumchlorid, 1% Vol./Vol. Tween-20, mit 1 M Salzsäure auf einen pH-Wert von 9 eingestellt, durchgeführt. Die Gelfiltrationen der Lösungen C, D und E wurden in 50 mM Tris, 0,1 M Natriumchlorid, Tween-20, mit 1 M Salzsäure auf einen pH-Wert von 7,2 eingestellt, durchgeführt (Konzentration von Tween-20 für Lösung C und D: 0,5% Vol./Vol.. Konzentration von Tween-20 für Lösung E: 0,1% Vol./Vol.). Alle Gelfiltrationen wurden mit einer Flussrate von 1 ml/Minute durchgeführt.
Die Trennung auf Sephacryl HR S-300 führte zu zwei Peaks. Peak eins von Sephacryl HR S-300, enthaltend Kaninchen-Anti-Human-CRP, gekoppelt an "Dex-BSA-Rhodamin ITC" wird im Folgenden als "Dex-BSA-Rhodamin/a-CRP"-Konjugat bezeichnet.
Das "Dex-BSA-Rhodamin/a-CRP"-Konjugat (erhalten aus "Lösung B") wurde als eine Fraktion von 8 bis 10,5 ml (von Markierung 4 bis 5,25 in dem in 1 gezeigten Profil) aufgefangen.
OD 558 wurde für die "Dex-BSA-Rhodamin/a-CRP"-Konjugate gemessen und die Konjugate wurden dann auf Sephacryl HR S-500 (Pharmacia, Schweden, Kat. Nr. 17-0613-01) charakterisiert. Alle Gelfiltrationen wurden mittels FPLC (Pharmacia, Schweden) unter Verwendung einer FPLC-Säule (Kat. Nr. HR 10/30, Pharmacia, Schweden) mit einem Bettvolumen von 25 ml Sephacryl HR S-500 durchgeführt. Die Lösungen A und B wurden in 50 mM Tris, 0,1 M Natriumchlorid, 1% Vol./Vol. Tween-20, mit 1 M Salzsäure auf einen pH-Wert von 9 eingestellt, gelfiltriert. Die Lösungen C und E wurden in 50 mM Tris, 0,1 M Natriumchlorid, Tween-20, mit 1 M Salzsäure auf einen pH-Wert von 7,2 eingestellt, gelfiltriert (Konzentration von Tween-20 für Lösung C: 0,5% Vol./Vol.. Konzentration von Tween-20 für Lösung E: 0,1% Vol./Vol.). Alle Gelfiltrationen wurden mit einer Flussrate von 1 ml/Minute durchgeführt.
Die Trennung auf Sephacryl HR S-500 ("Lösung B") führte zu einem größeren Peak, der nach 7 ml eluiert wurde, wie in 2 gezeigt. Durch Gelfiltration des Konjugats aus Lösung C wurden zwei Peaks aufgefangen. Fraktion eins wurde von 7 bis 10,5 ml aufgefangen und Fraktion zwei wurde von 10,5 bis 18 ml aufgefangen.
Die Charakterisierung auf Sephacryl HR S-500 wurde als Prozent "Dex-BSA-Rhodamin/a-CRP"-Konjugat ausgedrückt, das sich im ersten Peak des Profils befindet, im Folgenden als "im Hohlraumvolumen eluiertes Konjugat" bezeichnet. Die Größe der Fraktion war vom Beginn des Peak eins bis 10,5 ml vom Beginn der Gelfiltration. Die erhaltenen Ergebnisse waren:
BEISPIEL 4B
Kopplung von Kaninchen Anti-Human-CRP an EPCH-aktivierte "Dex-BSA-Rhodamin"-Konjugate in hoher ionischer Stärke
Eine Lösung von "Dex-BSA-Rhodamin"-Konjugat wurde mit der Kaninchen-Anti-Human-CRP-Immunoglobulin-Fraktion (DAKO, Dänemark, Kat. Nr. Q 0329) gekoppelt.
"Dex-BSA-Rhodamin" mit einem Peak-MW 500.000 koppelte 25 OD 558 Einheiten/mg BSA, wie bei "Lösung C" in Beispiel 3B beschrieben.
Die folgende Lösung, die Antikörper und "Dex-BSA-Rhodamin" enthielt, wurde hergestellt:
0,003226 μMol Antikörper und 0,00129 μMol Dextran (als "Dex-BSA-Rhodamin") wurden mit 3,5 M Kaliumphosphatpuffer, pH-Wert 8,8, gemischt, um die folgenden Endkonzentrationen zu ergeben:
2,2 M Kaliumphosphatpuffer
pH-Wert 8,6
0,1 mg Antikörper/ml
Molverhältnis in der Lösung: "Dex-BSA-Rhodamin"/Antikörper: 1/2,5
Nach dem Mischen wurde ein Niederschlag in der Lösung beobachtet und das Koppeln des Antikörpers wurde bei 4 bis 6°C während 18 Stunden fortgeführt. Nach dem Koppeln wurde Cystein (Merck, Kat. Nr. 1.02838) den Proben bis zu einer Endkonzentration von 0,01 Cystein zugegeben. Die Konzentration an Phosphatpuffer in der Lösung wurde durch Zugabe von deionisiertem Wasser zur Lösung auf 1,75 M eingestellt. Die Lösung wurde während 5 Minuten bei 10.000 U/Min zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit, welche klar und nahezu farblos war, wurde vorsichtig mit einer Pipette abgesaugt. Die Pellets, die freien und gekoppelten Antikörper enthielten, wurden in 500 μl deionisiertem Wasser gelöst und Tween-20 wurde bis zu einer Endkonzentration von 0,5% Vol./Vol. zugegeben.
Freier Antikörper und "Dex-BSA-Rhodamin"-gebundener Antikörper in der Probe wurden durch Gelfiltration auf Sephacryl HR S-300 in 50 mM Tris, 0,1 M Natriumchlorid, 0,5% Tween-20, mit 1 M Salzsäure auf einen pH-Wert von 7,2 eingestellt, getrennt, und Peak eins von Sephacryl HR S-300 wurde auf Sephacryl HR S-500 charakterisiert, wie in Beispiel 4A beschrieben. Die anschließende Trennung auf Sephacryl HR S-500 (wie in Beispiel 4A beschrieben) führte zu zwei sich überlappenden Peaks. Der erste Peak, Peak eins, wurde nach 7 ml eluiert. Die erhaltenen Ergebnisse waren:

OD 558 von Peak eins, erhalten nach Gelfiltration auf Sephacryl HR S-300 % Konjugat, eluiert im Hohlraumvolumen nach Gelfiltration auf Sephacryl HR S-500

0,45 42%
BEISPIEL 4C
Kopplung von monoklonalem Anti-hCG-Antikörper an DVS-aktivierte "Dex-BSA-Rhodamin"-Konjugate in hoher ionischer Stärke
Eine Lösung von "Dex-BSA-Rhodamin"-Konjugat wurde mit monoklonalem Anti-hCG-Antikörper, Mab (Genzyme MIH, Charge Nr. M21452), gekoppelt.
"Dex-BSA-Rhodamin" mit einem Peak-MW 500.000 koppelte 29 OD 558 Einheiten/mg BSA, wie bei "Lösung A" in Beispiel 3A beschrieben.
Die folgende Lösung, die Antikörper und "Dex-BSA-Rhodamin" enthielt, wurde hergestellt:
0,0016 μMol Antikörper und 0,00064 μMol Dextran (als "Dex-BSA-Rhodamin") wurden mit 3,5 M Kaliumphosphatpuffer, pH-Wert 8,8, gemischt, um die folgenden Endkonzentrationen zu ergeben:
2,2 M Kaliumphosphatpuffer
pH-Wert 8,6
0,06 Antikörper/ml
Molverhältnis in der Lösung: "Dex-BSA-Rhodamin"/Antikörper: 1/2,5
Nach dem Mischen wurde ein Niederschlag in der Lösung beobachtet und das Koppeln des Antikörpers wurde bei 4 bis 6°C während 18 Stunden fortgeführt. Nach dem Koppeln wurde Cystein (Merck, Kat. Nr. 1.02838) den Proben bis zu einer Endkonzentration von 0,01 M Cystein zugegeben. Die Konzentration an Phosphatpuffer in der Lösung wurde durch Zugabe von deionisiertem Wasser zur Lösung auf 1,75 M eingestellt. Die Lösung wurde während 5 Minuten bei 10.000 U/Min zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit, welche klar und nahezu farblos war, wurde vorsichtig mit einer Pipette abgesaugt. Die Pellets, die freien Antikörper und gekoppelten Antikörper enthielten, wurden in 500 μl deionisiertem Wasser gelöst und Tween-20 wurde bis zu einer Endkonzentration von 0,5% Vol./Vol. zugegeben.
Freier Antikörper und "Dex-BSA-Rhodamin"-gebundener Antikörper in der Probe wurden durch Gelfiltration auf Sephacryl HR S-300 in 50 mM Tris, 0,1 M Natriumchlorid, 0,5% Tween-20, mit 1 M Salzsäure auf einen pH-Wert von 7,2 eingestellt, getrennt, und Peak eins von Sephacryl HR S-300 wurde auf Sephacryl HR S-500 charakterisiert, wie in Beispiel 4A beschrieben. Die anschließende Trennung auf Sephacryl HR S-500 (wie in Beispiel 4A beschrieben) führte zu zwei sich überlappenden Peaks. Der erste Peak, Peak eins, wurde nach 7 ml eluiert. Die erhaltenen Ergebnisse waren:

OD 558 von Peak eins, erhalten nach Gelfiltration auf Sephacryl HR S-300 % Konjugat, eluiert im Hohlraumvolumen nach Gelfiltration auf Sephacryl HR S-500

0,88 58%
BEISPIEL 4D
Kopplung von Kaninchen-Anti-Human-CRP an DVS-aktivierte "Dex-BSA-Reaktiv-Orange-16"-Konjugate in hoher ionischer Stärke
Eine Lösung von "Dex-BSA-Reaktiv-Orange-16"-Konjugat wurde mit der Kaninchen-Anti-Human-CRP-Immunoglobulin-Fraktion (DAKO, Dänemark, Kat. Nr. Q 0329) gekoppelt.
"Dex-BSA-Reaktiv-Orange-16" mit einem Peak-MW 500.000 koppelte 1,4 OD 493 Einheiten/mg BSA, wie in Beispiel 3D beschrieben.
Die folgende Lösung, die Antikörper und "Dex-BSA-Reaktiv-Orange-16" enthielt, wurde hergestellt:
0,00323 μMol Antikörper und 0,00129 μMol Dextran (als "Dex-BSA-Reaktiv-Orange-16") wurden mit 3,5 M Kaliumphosphatpuffer, pH-Wert 8,8, gemischt, um die folgenden Endkonzentrationen zu ergeben:
2,2 M Kaliumphosphatpuffer
pH-Wert 8,6
0,23 mg Antikörper/ml
Molverhältnis in der Lösung: "Dex-BSA-Reaktiv-Orange-16"/Antikörper: 1/2,5
Nach dem Mischen wurde ein Niederschlag in der Lösung beobachtet und das Koppeln des Antikörpers wurde bei 4 bis 6°C während 18 Stunden fortgeführt. Nach dem Koppeln wurde Cystein (Merck, Kat. Nr. 1.02838) den Proben bis zu einer Endkonzentration von 0,01 M Cystein zugegeben. Die Konzentration an Phosphatpuffer in der Lösung wurde durch Zugabe von deionisiertem Wasser zur Lösung auf 1,75 M eingestellt. Die Lösung wurde während 5 Minuten bei 10.000 U/Min zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit, welche klar und nahezu farblos war, wurde vorsichtig mit einer Pipette abgesaugt. Die Pellets, die freien Antikörper und gekoppelten Antikörper enthielten, wurden in 500 μl deionisiertem Wasser gelöst und Tween-20 wurde bis zu einer Endkonzentration von 0,5% Vol./Vol. zugegeben.
Freier Antikörper und "Dex-BSA-Reaktiv-Orange-16"-gebundener Antikörper in der Probe wurden durch Gelfiltration auf Sephacryl HR S-300 in 50 mM Tris, 0,1 M Natriumchlorid, 0,5% Tween-20, mit 1 M Salzsäure auf einen pH-Wert von 7,2 eingestellt, getrennt, und Peak eins von Sephacryl HR S-300 wurde auf Sephacryl HR S-500 charakterisiert, wie in Beispiel 4A beschrieben. Die anschließende Trennung auf Sephacryl HR S-500 (wie in Beispiel 4A beschrieben) führte zu zwei sich überlappenden Peaks. Der erste Peak, Peak eins, wurde nach 7 ml eluiert. Die erhaltenen Ergebnisse waren:

OD 493 von Peak eins, erhalten nach Gelfiltration auf Sephacryl HR S-300 % Konjugat, eluiert im Hohlraumvolumen nach Gelfiltration auf Sephacryl HR S-500

0,73 55%
BEISPIEL 4E
Kopplung von Kaninchen-Anti-Human-CRP an DVS-aktivierte "Dex-BSA-Uniblau-A"-Konjugate in hoher ionischer Stärke
Zwei Lösungen (A und B) von "Dex-BSA-Uniblau-A"-Konjugaten wurden mit der Kaninchen-Anti-Human-CRP-Immunoglobulin-Fraktion (DAKO, Dänemark, Kat. Nr. Q 0329) gekoppelt.
"Dex-BSA-Uniblau-A" mit einem Peak-MW 500.000 koppelte 3 OD 595 Einheiten/mg BSA, wie in Beispiel 3E beschrieben.
Die folgenden Lösungen, die Antikörper und "Dex-BSA-Uniblau-A" enthielten, wurden hergestellt:
Lösung A: 0,0015 μMol Antikörper und 0,0015 μMol Dextran (als "dex-BSA-Uniblau-A") wurden mit 3,5 M Kaliumphosphatpuffer, pH-Wert 8,8, gemischt, um die folgenden Endkonzentrationen zu ergeben:
2,2 M Kaliumphosphatpuffer
pH-Wert 8,6
0,09 mg Antikörper/ml
Molverhältnis in der Lösung: "dex-BSA-Uniblau-A"/Antikörper: 1/1
Lösung B: 0,0030 μMol Antikörper und 0,0015 μMol Dextran (als "dex-BSA-Uniblau-A") wurden mit 3,5 M Kaliumphosphatpuffer, pH-Wert 8,8, gemischt, um die folgenden Endkonzentrationen zu ergeben:
2,2 M Kaliumphosphatpuffer
pH-Wert 8,6
0,2 mg Antikörper/ml
Molverhältnis in der Lösung: "dex-BSA-Uniblau-A"/Antikörper: 1/2
Nach dem Mischen wurde ein Niederschlag in der Lösung beobachtet und das Koppeln des Antikörpers wurde bei 4 bis 6°C während 18 Stunden fortgeführt. Nach dem Koppeln wurde Cystein (Merck, Kat. Nr. 1.02838) den Proben bis zu einer Endkonzentration von 0,01 M Cystein zugegeben. Die Konzentration an Phosphatpuffer in der Lösung wurde durch Zugabe von deionisiertem Wasser zur Lösung auf 1,75 M eingestellt. Beide Lösungen wurden während 5 Minuten bei 10.000 U/Min zentrifugiert und die überstehenden Flüssigkeiten, welche klar und nahezu farblos waren, wurden vorsichtig mit einer Pipette abgesaugt. Die Pellets, die freien und gekoppelten Antikörper enthielten, wurden in 500 μl deionisiertem Wasser gelöst und Tween-20 wurde bis zu einer Endkonzentration von 0,5% Gew./Vol. zugegeben.
Freier Antikörper und "Dex-BSA-Uniblau-A"-gebundener Antikörper in der Probe wurden durch Gelfiltration auf Sephacryl HR S-300 in 50 mM Tris, 0,1 M Natriumchlorid, 0,5% Tween-20, mit 1 M Salzsäure auf einen pH-Wert von 7,2 eingestellt, getrennt, und Peak eins von Sephacryl HR S-300 wurde auf Sephacryl HR S-500 charakterisiert, wie in Beispiel 4A beschrieben. Die anschließende Trennung auf Sephacryl HR S-500 (wie in Beispiel 4A beschrieben) führte zu zwei sich überlappenden Peaks. Der erste Peak, Peak eins, wurde nach 7 ml eluiert. Die erhaltenen Ergebnisse waren:
BEISPIEL 4F
Vergleich der Kopplung von Kaninchen-Anti-Human-CRP an DVS-aktivierte "Dex-BSA-Rhodamin"-Konjugate in hoher und in niedriger ionischer Stärke
Zwei Lösungen (A und B) von "Dex-BSA-Rhodamin"-Konjugaten wurden mit der Kaninchen-Anti-Human-CRP-Immunoglobulin-Fraktion (DAKO, Dänemark, Kat. Nr. Q 0329) gekoppelt.
Lösung A und B: "Dex-BSA-Rhodamin" mit einem Peak-MW 500.000 koppelte 13 OD 558 Einheiten/mg BSA, wie bei "Lösung B" in Beispiel 3A beschrieben.
Die folgenden Lösungen, die Antikörper und "Dex-BSA-Rhodamin" enthielten, wurden hergestellt:
Lösung A: 0,01548 μMol Antikörper und 0,003097 μMol Dextran (als "dex-BSA-Rhodamin") wurden mit 3,5 M Kaliumphosphatpuffer, pH-Wert 8,8, gemischt, um die folgenden Endkonzentrationen zu ergeben:
2,2 M Kaliumphosphatpuffer
pH-Wert 8,6
0,21 mg Antikörper/ml
Molverhältnis in der Lösung: "dex-BSA-Rhodamin"/Antikörper: 1/5
Lösung B: 0,00645 μMol Antikörper und 0,00129 μMol Dextran (als "dex-BSA-Rhodamin") wurden mit 3,5 M Kaliumphosphatpuffer, pH-Wert 8,8, und Wasser gemischt, um die folgenden Endkonzentrationen zu ergeben:
0,1 M Kaliumphosphatpuffer
pH-Wert 8,6
0,54 mg Antikörper/ml
Molverhältnis in der Lösung: "dex-BSA-Rhodamin"/Antikörper: 1/5
Nach dem Mischen wurde ein Niederschlag in Lösung A beobachtet. Beide Kopplungen wurden bei 4 bis 6°C während 18 Stunden fortgesetzt. Nach dem Koppeln wurde Cystein (Merck, Kat. Nr. 1.02838) den Proben bis zu einer Endkonzentration von 0,01 M Cystein zugegeben. Die Konzentration an Phosphatpuffer in Lösung A wurde durch Zugabe von deionisiertem Wasser zur Lösung auf 1,75 M eingestellt. Dann wurde Lösung A während 5 Minuten bei 10.000 U/Min zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit, welche klar und nahezu farblos war, wurde vorsichtig mit einer Pipette abgesaugt. Der Niederschlag (Pellets), der freien Antikörper und gekoppelten Antikörper enthielt, wurde in 1 ml deionisiertem Wasser aufgelöst. Der wieder aufgelöste Niederschlag (erhalten von Lösung A) und Lösung B (welche, eine klare Flüssigkeit ohne Niederschlag war) wurden während einer Stunde gegen 50 mM Tris, 0,1 M Natriumchlorid, welches mit 1 M Salzsäure auf einen pH-Wert von 7,2 eingestellt worden war, dialysiert.
Charakterisierung durch Gelfiltration
Peak eins, der von der Gelfiltration auf Sephacryl HR S-300 erhalten wurde, wurde auf Sephacryl HR S-500 und Sephacryl HR S-1000 charakterisiert, wie in Beispiel 4A beschrieben.
Die erhaltenen Profile von der Gelfiltration auf Sephacryl HR-300, HR S-500 und HR S-1000 sind in den 3a–3f gezeigt.
BEISPIEL 4G
Kopplung von Streptavidin an DVS-aktivierte "Dex-BSA-Rhodamin"-Konjugate in hoher ionischer Stärke
Fünf Lösungen (A, B, C, D und E) von "Dex-BSA-Rhodamin"-Konjugaten wurden mit Streptavidin (KEM-EN-TEC, Dänemark, Kat. Nr. 4610H) gekoppelt. Alle Proben koppelten 25 OD 558 Einheiten/mg BSA, wie bei "Lösung A" in Beispiel 3B beschrieben.
Die folgenden Lösungen, die Antikörper und "Dex-BSA-Rhodamin" enthielten, wurden hergestellt:
Lösung A: 0,00833 μMol Streptavidin und 0,004165 μMol Dextran (als "dex-BSA-Rhodamin") wurden mit 3,5 M Kaliumphosphatpuffer, pH-Wert 9, gemischt, um die folgenden Endkonzentrationen zu ergeben:
2,5 M Kaliumphosphatpuffer
pH-Wert 9
0,05 mg Streptavidin/ml
Molverhältnis in der Lösung: "dex-BSA-Rhodamin"/Streptavidin: 1/2
Lösung B: 0,00833 μMol Streptavidin und 0,001667 μMol Dextran (als "dex-BSA-Rhodamin") wurden mit 3,5 M Kaliumphosphatpuffer, pH-Wert 9, gemischt, um die folgenden Endkonzentrationen zu ergeben:
2,5 M Kaliumphosphatpuffer
pH-Wert 9
0,11 mg Streptavidin/ml
Molverhältnis in der Lösung: "dex-BSA-Rhodamin"/Streptavidin: 1/5
Lösung C: 0,00833 μMol Streptavidin und 0,000833 μMol Dextran (als "dex-BSA-Rhodamin") wurden mit 3,5 M Kaliumphosphatpuffer, pH-Wert 9, gemischt, um die folgenden Endkonzentrationen zu ergeben:
2,5 M Kaliumphosphatpuffer
pH-Wert 9
0,22 mg Streptavidin/ml
Molverhältnis in der Lösung: "dex-BSA-Rhodamin"/Streptavidin: 1/10
Lösung D: 0,00833 μMol Streptavidin und 0,0004165 μMol Dextran (als "dex-BSA-Rhodamin") wurden mit 3,5 M Kaliumphosphatpuffer, pH-Wert 9, gemischt, um die folgenden Endkonzentrationen zu ergeben:
2,5 M Kaliumphosphatpuffer
pH-Wert 9
0,42 mg Streptavidin/ml
Molverhältnis in der Lösung: "dex-BSA-Rhodamin"/Streptavidin: 1/20
Lösung E: 0,00833 μMol Streptavidin und 0,000208 μMol Dextran (als "dex-BSA-Rhodamin") wurden mit 3,5 M Kaliumphosphatpuffer, pH-Wert 9, gemischt, um die folgenden Endkonzentrationen zu ergeben:
2,5 M Kaliumphosphatpuffer
pH-Wert 9
0,71 mg Streptavidin/ml
Molverhältnis in der Lösung: "dex-BSA-Rhodamin"/Streptavidin: 1/40
Nach dem Mischen wurde ein Niederschlag in den Lösungen beobachtet und das Koppeln von Streptavidin wurde bei 4 bis 6°C während 18 Stunden fortgeführt. Nach dem Koppeln wurde Cystein (Merck, Kat. Nr. 1.02838) den Proben bis zu einer Endkonzentration von 0,01 M Cystein zugegeben. Die Konzentration an Phosphatpuffer in allen Lösungen wurde durch Zugabe von deionisiertem Wasser zu den Lösungen auf 1,75 M eingestellt. Alle fünf Lösungen wurden während 5 Minuten bei 10.000 U/Min zentrifugiert und die überstehenden Flüssigkeiten, welche klar und nahezu farblos waren, wurden vorsichtig mit einer Pipette abgesaugt. Der Niederschlag (Pellets), der freies Streptavidin und gekoppeltes Streptavidin enthielt, wurde in deionisiertem Wasser aufgelöst.
Die Pellets von allen Lösungen wurden in 1 ml deionisiertem Wasser aufgelöst. Die Lösungen wurden während einer Stunde gegen 0,1 M Natriumchlorid und 50 mM Tris, das mit 1 M Salzsäure auf einen pH-Wert von 7,2 eingestellt war, dialysiert. Nach der Dialyse wurde den Lösungen Tween-20 bis zu einer Endkonzentration von 0,1% Vol./Vol. zugegeben und die Lösungen wurden während 5 Minuten bei 10.000 U/Min zentrifugiert und die überstehenden Flüssigkeiten (die Probe) wurden vorsichtig mit einer Pipette abgesaugt, während der Rest der Konjugate (Pellets) nicht verwendet wurde.
Freies Streptavidin und "Dex-BSA-Rhodamin"-gebundenes Streptavidin in den Proben wurden durch Gelfiltration auf Sephacryl HR S-300 (Pharmacia, Schweden, Kat. Nr. 17-0599-01) getrennt. Alle Gelfiltrationen wurden auf einer FPLC (Pharmacia, Schweden) unter Verwendung einer Pharmacia-Säule (Kat. Nr. HR 10/30) mit einem Durchmesser von 1 cm und einem Bettvolumen von 25 ml Sephacryl HR S-300 durchgeführt. Alle Gelfiltrationen wurden in 50 mM Tris, 0,1 M Natriumchlorid, 0,1% Vol./Vol. Tween-20, mit 1 M Salzsäure auf einen pH-Wert von 7,2 eingestellt, unter Verwendung einer Flussrate von 1 ml/Minute durchgeführt.
Die Trennung auf Sephacryl HR S-300 führte zu zwei Peaks. Peak eins von Sephacryl HR S-300, enthaltend Streptavidin, welches an "Dex-BSA-Rhodamin ITC" gekoppelt war, wird im Folgenden als "Dex-BSA-Rhodamin/Streptavidin"-Konjugat bezeichnet.
Das "Dex-BSA-Rhodamin/Streptavidin"-Konjugat wurde als eine Fraktion nach 8 ml aufgefangen.
OD 558 wurde für die "Dex-BSA-Rhodamin/Streptavidin"-Konjugate gemessen und die Konjugate wurden dann auf Sephacryl HR S-500 (Pharmacia, Schweden, Kat. Nr. 17-0613-01) charakterisiert. Alle Gelfiltrationen wurden mittels FPLC (Pharmacia, Schweden) unter Verwendung einer FPLC-Säule (Kat. Nr. HR 10/30, Pharmacia, Schweden) mit einem Bettvolumen von 25 ml Sephacryl HR S-500 durchgeführt. Alle Lösungen wurden in 50 mM Tris, 0,1 M Natriumchlorid, 0,1% Vol./Vol. Tween-20, mit 1 M Salzsäure auf einen pH-Wert von 7,2 eingestellt, unter Verwendung einer Flussrate von 1 ml/Minute gelfiltriert.
Die Trennung auf Sephacryl HR S-500 führte zu einem größeren Peak, der nach 7 ml eluiert wurde.
Die Charakterisierung auf Sephacryl HR S-500 wurde als Prozent "Dex-BSA-Rhodamin/Streptavidin"-Konjugat ausgedrückt, das sich im ersten Peak des Profils befindet, im Folgenden als "im Hohlraumvolumen eluiertes Konjugat" bezeichnet. Die erhaltenen Ergebnisse waren:
Aus den angegebenen Beispielen kann abgeleitet werden, dass eine Anzahl von verschiedenen primären Zielkomponenten, welche Antikörper oder spezifische Bindungsmoleküle sind, vorzugsweise in hoher ionischer Stärke, an aktivierte Dextrane gekoppelt werden können, die eine Spacerkomponente und einen Farbstoff tragen.
Beispiel 5: Alternativen zur Bildung des wasserlöslichen Konjugats
BEISPIEL 5A
Koppeln von Farbstoff an DVS-aktiviertes Dextran mit einem Peak-MW von 2.000.000 Dextran (Peak-MW von 2.000.000) wurde mit DVS aktiviert, wie bei "Lösung C" in Beispiel 1A beschrieben (d. h. unter Verwendung von 1% (Gew./Vol.) Dextran und 3% (Vol./Vol.) DVS). Das aktivierte Dextran hatte einen Gehalt von 554 μMol reaktive Vinylgruppen pro Gramm Dextran. Die Endkonzentration von DVS-aktiviertem Dextran war 8,3 mg aktiviertes Dextran/ml.
Vier separate Lösungen (A, B, C und D), welche die gleiche Konzentration an DVS-aktiviertem Dextran enthielten, wurden hergestellt. Es wurde Puffer zugegeben, so dass die Endkonzentration von Dikaliumhydrogenphosphat/Natriumhydroxid 0,25 M war und die Endkonzentration von Natriumchlorid 0,50 M war. Der pH-Wert der Lösungen war 11,5.
Eine konzentrierte Lösung von Farbstoff (Remazol-Schwarz-B-gran, DE HA 725, Hoechst) wurde nach dem Filtern durch einen 0,45-μm-Filter zugegeben. Die Endkonzentrationen von DVS-aktiviertem Dextran und Farbstoff waren wie folgt:
Lösung A, B, C und D wurden bei Raumtemperatur (20–25°C) während 3 Stunden inkubiert. Nach der Kopplung wurde der pH-Wert des Reaktionsgemisches mit 1 M Salzsäure auf einen pH-Wert von 8 eingestellt. Alle Proben wurden gründlich gegen 50 mM Natriumchlorid dialysiert, um nicht gekoppelten Farbstoff zu entfernen. Nach der Dialyse wurde das Volumen jeder Lösung gemessen und die Endkonzentrationen von Dextran wurden berechnet.
Nach der Dialyse wurde jede Probe bei OD 600 nm (1 cm Küvette) gemessen und durch die Anzahl an OD 600 Einheiten/mg Dextran charakterisiert. Die Ergebnisse der Kopplungsreaktionen sind unten zusammengestellt:

Lösung gekoppelte OD 600 Einheiten/mg Dextran

A 11

B 8

C 4

D 2
Die Anzahl an gekoppelten OD 600 Einheiten/mg Dextran wurde nach Formel: (A × B)/C = gekoppelte OD 600 Einheiten/mg Dextran berechnet, wobei A OD 600 ist, wie nach der beendeten Dialyse gemessen, B das Volumen der Lösung ist, erhalten nach der beendeten Dialyse, und C die Menge (mg) von DVS-aktiviertem Dextran, die in dem Experiment verwendet wurde, ist.
BEISPIEL 5B
Koppeln von Farbstoff an DVS-aktiviertes Dextran mit einem Peak-MW von 2.000.000
Dextran (Peak-MW von 2.000.000) wurde mit DVS aktiviert, wie bei "Lösung C" in Beispiel 1A beschrieben (d. h. unter Verwendung von 1% (Gew./Vol.) Dextran und 3% (Vol./Vol.) DVS). Das aktivierte Dextran hatte einen Gehalt von 554 μMol reaktive Vinylgruppen pro g Dextran. Die Endkonzentration von DVS-aktiviertem Dextran war 8,3 mg aktiviertes Dextran/ml.
Zwei separate Lösungen (A und B), welche die gleiche Konzentration an DVS-aktiviertem Dextran enthielten, wurden hergestellt. Es wurde Puffer zugegeben, so dass die Endkonzentration von Dikaliumhydrogenphosphat/Natriumhydroxid 0,25 M war und die Endkonzentration von Natriumchlorid 0,50 M war. Der pH-Wert der Lösungen war 11,5.
Eine konzentrierte Lösung von Farbstoff (Remazol-Brilliant-Rot F3B, DE BE 305, Hoechst) wurde nach dem Filtern durch einen 0,45-μm-Filter zugegeben. Die Endkonzentrationen von DVS-aktiviertem Dextran und Farbstoff waren wie folgt:
Lösung A und B wurden bei Raumtemperatur (20 bis 25°C) während 4 Stunden inkubiert. Nach der Kopplung wurde der pH-Wert des Reaktionsgemisches mit 1 M Salzsäure auf einen pH-Wert von 7 eingestellt. Alle Proben wurden gründlich gegen 50 mM Natriumchlorid dialysiert, um nicht gekoppelten Farbstoff zu entfernen. Nach der Dialyse wurde das Volumen jeder Lösung gemessen und die Endkonzentrationen von Dextran wurden berechnet.
Nach der Dialyse wurde jede Probe bei OD 530 nm (1 cm Küvette) gemessen und durch die Anzahl an gekoppelten OD 530 Einheiten/mg Dextran charakterisiert. Die Ergebnisse der Kopplungsreaktionen sind unten zusammengestellt:

Lösung gekoppelte OD 350 Einheiten/mg Dextran

A 5

B 7
Die Anzahl an gekoppelten OD 530 Einheiten/mg Dextran wurde wie in Beispiel 5A beschrieben berechnet.
Aus den angegebenen Beispielen kann abgeleitet werden, dass zwei verschiedene Farbstoffe (schwarz oder rot) nahezu die gleiche Menge OD koppelte.
Beispiel 6: Alternativen zur Bildung von wasserlöslichem, vernetztem Konjugat
BEISPIEL 6A
Kopplung von Kaninchen-Anti-Human-CRP an DVS-aktivierte "Dex-Remazol-Schwarz"-Konjugate in hoher ionischer Stärke
Fünf Lösungen (A, B, C, D und E) von "Dex-Remazol-Schwarz"-Konjugaten wurden mit der Kaninchen-Anti-Human-CRP-Immunoglobulin-Fraktion (DAKO, Dänemark, Kat. Nr. Q 0329) gekoppelt.
Lösung A und E: "Dex-Remazol-Schwarz" mit einem Peak-MW 2.000.000 koppelte 11 OD 600 Einheiten/mg Dextran, wie bei "Lösung A" in Beispiel 5A beschrieben.
Lösung B: "Dex-Remazol-Schwarz" mit einem Peak-MW 2.000.000 koppelte 8 OD 600 Einheiten/mg Dextran, wie bei "Lösung B" in Beispiel 5A beschrieben.
Lösung C: "Dex-Remazol-Schwarz" mit einem Peak-MW 2.000.000 koppelte 4 OD 600 Einheiten/mg Dextran, wie bei "Lösung C" in Beispiel 5A beschrieben.
Lösung D: "Dex-Remazol-Schwarz" mit einem Peak-MW 2.000.000 koppelte 2 OD 600 Einheiten/mg Dextran, wie bei "Lösung D" in Beispiel 5A beschrieben.
Lösung A, B, C und D: 0,003226 μMol Antikörper und 0,000645 μMol Dextran (als "Dex-Remazol-Schwarz") wurden mit 3,5 M Kaliumphosphatpuffer, pH-Wert 8,8, gemischt, um die folgenden Endkonzentrationen zu ergeben:
1,75 M Kaliumphosphatpuffer
pH-Wert 8,6
0,6 mg Antikörper/ml
Molverhältnis in der Lösung: "Dex-Remazol-Schwarz"/Antikörper: 1/5
Lösung E: 0,00645 μMol Antikörper und 0,00129 μMol Dextran (als "Dex-Remazol-Schwarz") wurden mit 3,5 M Kaliumphosphatpuffer, pH-Wert 8,8, gemischt, um die folgenden Endkonzentrationen zu ergeben:
2,2 M Kaliumphosphatpuffer
pH-Wert 8,6
0,22 mg Antikörper/ml
Molverhältnis in der Lösung: "Dex-Remazol-Schwarz"/Antikörper: 1/5
Nach dem Mischen wurde ein Niederschlag in den Lösungen beobachtet und das Koppeln des Antikörpers wurde bei 4 bis 6°C während 18 Stunden fortgeführt. Nach dem Koppeln wurde Cystein (Merck, Kat. Nr. 1.02838) den Proben bis zu einer Endkonzentration von 0,01 M Cystein zugegeben. Die Lösungen A, B, C und D wurden während einer Stunde gegen 0,1 M Kaliumphosphatpuffer, pH-Wert 9, dialysiert. Nach der Dialyse wurde Tween-20 bis zu einer Endkonzentration von 0,5% Vol./Vol. zugegeben.
Die Konzentration von Phosphatpuffer in Lösung E wurde auf 1,75 M eingestellt, indem der Lösung deionisiertes Wasser zugegeben wurde. Das Konjugat wurde während 5 Minuten bei 10.000 U/Min zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit, welche klar und nahezu farblos war, wurde vorsichtig mit einer Pipette abgesaugt. Der Niederschlag (Pellets) wurde in 1 ml deionisiertem Wasser aufgelöst und Tween-20 wurde bis zu einer Endkonzentration von 0,5% Vol./Vol. zugegeben.
Freier Antikörper und "Dex-Remazol-Schwarz"-gebundener Antikörper in den Proben wurden durch Gelfiltration auf Sephacryl HR S-300 (Pharmacia, Schweden, Kat. Nr. 17-0599-01) getrennt. Alle Gelfitrationen wurden auf einer FPLC (Pharmacia, Schweden) unter Verwendung einer Pharmacia-Säule (Kat. Nr. HR 10/30) mit einem Durchmesser von 1 cm und einem Bettvolumen von 25 ml Sephacryl HR S-300 durchgeführt. Für die Lösungen A, B, C und D wurde die Gelfiltration in 0,1 M Kaliumphosphatpuffer, pH-Wert 9, 0,5% Vol./Vol. Tween-20 durchgeführt. Lösung E wurde in 50 mM Tris, 0,1 M Natriumchlorid, 0,5% Tween, dessen pH-Wert mit 1 M Salzsäure auf 7,2 eingestellt worden war, gelfiltriert. Alle Gelfiltrationen wurden mit einer Flussrate von 1 ml/Minute durchgeführt.
Die Trennung auf Sephacryl HR S-300 führte zu zwei Peaks. Peak eins von Sephacryl HR S-300, enthaltend Kaninchen-Anti-Human-CRP, gekoppelt an "Dex-Remazol-Schwarz", wird im Folgenden als "Dex-Remazol-Schwarz/a-CRP"-Konjugat bezeichnet.
Das "Dex-Remazol-Schwarz/a-CRP"-Konjugat wurde als eine Fraktion nach 8 ml aufgefangen.
OD 600 wurde für die "Dex-Remazol-Schwarz/a-CRP"-Konjugate gemessen und die Konjugate von Lösung A, B, C und D wurden dann auf Sephacryl HR S-500 (Pharmacia, Schweden, Kat. Nr. 17-0613-01) charakterisiert. Alle Gelfiltrationen wurden mittels FPLC (Pharmacia, Schweden) unter Verwendung einer FPLC-Säule (Kat. Nr. HR 10/30, Pharmacia, Schweden) mit einem Bettvolumen von 25 ml Sephacryl HR S-500 durchgeführt. Die Gelfiltrationen wurden in 0,1 M Kaliumphosphatpuffer, pH-Wert 9, 0,5% Vol./Vol. Tween-20 und mit einer Flussrate von 1 ml/Minute durchgeführt.
Die Trennung auf Sephacryl HR S-500 führte zu zwei sich überlappenden Peaks. Der erste Peak, Peak eins, wurde nach 7 ml eluiert.
Die Charakterisierung auf Sephacryl HR S-500 wurde als Prozent "Dex-Remazol-Schwarz/a-CRP"-Konjugat ausgedrückt, das sich im ersten Peak des Profils befindet, im Folgenden als "im Hohlraumvolumen eluiertes Konjugat" bezeichnet. Die erhaltenen Ergebnisse waren
BEISPIEL 6B
Kopplung von Kaninchen-Anti-Human-CRP an DVS-aktivierte "Dex-Remazol-Brilliant-Rot"-Konjugate in hoher ionischer Stärke
Eine Lösung von "Dex-Remazol-Brilliant-Rot"-Konjugat wurde mit der Kaninchen-Anti-Human-CRP-Immunoglobulin-Fraktion (DAKO, Dänemark, Kat. Nr. Q 0329) gekoppelt.
"Dex-Remazol-Brilliant-Rot" mit einem Peak-MW 2.000.000 koppelte 7 OD 530 Einheiten/mg Dextran, wie bei "Lösung A" in Beispiel 5B beschrieben.
Die folgende Lösung, die Antikörper und "Dex-Remazol-Brilliant-Rot" enthielt, wurde hergestellt:
0,00645 μMol Antikörper und 0,00129 μMol Dextran (als "Dex-Remazol-Brilliant-Rot") wurden mit 3,5 M Kaliumphosphatpuffer, pH-Wert 8,8, gemischt, um die folgenden Endkonzentrationen zu ergeben:
1,75 M Kaliumphosphatpuffer
pH-Wert 8,6
0,57 mg Antikörper/ml
Molverhältnis in der Lösung: "Dex-Remazol-Brilliant-Rot"/Antikörper: 1/5
Nach dem Mischen wurde ein Niederschlag in der Lösung beobachtet und das Koppeln des Antikörpers wurde bei 4 bis 6°C während 18 Stunden fortgeführt. Nach dem Koppeln wurde Cystein (Merck, Kat. Nr. 1.02838) den Proben bis zu einer Endkonzentration von 0,01 M Cystein zugegeben. Das Konjugat wurde während einer Stunde gegen 0,1 M Natriumchlorid, 50 mM Tris, das mit 1 M Salzsäure auf einen pH-Wert von 9 eingestellt war, dialysiert. Nach der Dialyse wurde Tween-20 bis zu einer Endkonzentration von 1% Vol./Vol. zugegeben.
Freier Antikörper und "Dex-Remazol-Brilliant-Rot"-gebundener Antikörper in der Probe wurden durch Gelfiltration auf Sephacryl HR S-300 in 50 mM Tris, 0,1 M Natriumchlorid, 1% Tween-20, mit 1 M Salzsäure auf einen pH-Wert von 9 eingestellt, getrennt. Die Flussrate betrug 1 ml/Minute.
Die Trennung auf Sephacryl HR S-300 führte zu zwei Peaks. Peak eins von Sephacryl HR S-300, welches Kaninchen-Anti-Human-CRP enthielt, das an "Dex-Remazol-Brilliant-Rot" gekoppelt war, wird im Folgenden als "Dex-Remazol-Brilliant-Rot/a-CRP"-Konjugat bezeichnet. Das Dex-Remazol-Brilliant-Rot-Konjugat wurde als eine Fraktion nach 8 ml aufgefangen und OD 530 wurde gemessen:
OD 558 von Peak eins, erhalten nach Gelfiltration auf Sephacryl HR S-300

1,67

Aus den angegebenen Beispielen kann abgeleitet werden, dass eine primäre Zielkomponente an ein DVS-aktiviertes Dextran gekoppelt werden kann, welches zwei verschiedene Farbstoffe trägt.
Beispiel 7: Vorrichtungen und Verwendungen von vernetztem Konjugat und vernetzten Konjugatkomplexen
BEISPIEL 7A
Der "Standardtest der Leistung des lateralen Flusses"

Der folgende "Standardtest der Leistung des lateralen Flusses" wird mit dem Zweck entworfen, jedes gefärbte Konjugat unter Verwendung einer Reihe von reproduzierbaren Standardbedingungen und eines handelsüblichen Antigens zu testen. Materialien

Nitrocellulosepapier:	Millipore SRHF, 25 × 300 mm, Kat. Nr. SRHF 02020
Glasfaserpapier:	Whatman Glasfaserpapier mit Bindemittel, 20 × 300 mm, Kat. Nr. 9599-9432
Absorbierendes Polster:	Whatman, 20 × 300 mm, Cellulosepapier 3 mm, Kat. Nr.: 3030-9433
Kunststoffträger:	0,01 White. Adhesives Research Inc., P. O. Box 100, Glen Rock, Pennsylvania, 17327, USA
Antigen:	Kreuzaktives Humanserumprotein (CRP) DAKO Humanserum-Standardlösung, Kat. Nr. X 0925
Antikörper:	Kaninchen-Anti-Human-CRP, DAKO, Kat. Nr.: Q 0329
Beschichtungspuffer:	0,1 M Kaliumphosphatpuffer, pH-Wert 7,2

Antigenpuffer:	50 mM Tris/HCl + 0,1 M NaCl + 0,5% Tween 20, pH-Wert 8,6
Blockierpuffer:	50 mM Tris/HCl + 0,1 M NaCl + 0,5% Tween 20, pH-Wert 8,6
Waschpuffer:	50 mM Tris/HCl + 0,1 M NaCl + 0,5% Tween 20, pH-Wert 8,6
Konjugatpuffer:	50 mM Tris/HCl + 0,1 M NaCl + 0,5% Tween 20, pH-Wert 8,6
Konjugat I:	"Dex-BSA-Rhodamin/aCRP"-Konjugat, hergestellt nach dem vorliegenden Patent mit 1,49 OD 558, hergestellt ähnlich wie in Beispiel 4A)
Konjugat II:	"Dex-BSA-Rhodamin/aCRP"-Konjugat, hergestellt nach WO 93/01498 mit 1,74 OD 558

Verfahren
Herstellung von Teststreifen mit lateralem Fluss
Das trockene Nitrocellulosepapier wird in Streifen (6 mm breit und 6 cm lang) geschnitten und auf einem Kunststoffträger (5 mm breit und 6 cm lang) angebracht. An einem Ende des Nitrocellulosestreifens wird ein Glasfaserpolster (5 mm breit, 20 mm lang) angebracht. An dem anderen Ende des Nitrocellulosestreifens wird ein absorbierendes Polster (5 mm breit, 20 mm lang) angebracht.
Herstellung von Antikörperlösung
Verdünnen von Kaninchen-Anti-Human-CRP bis zu einer Endkonzentration von 0,125 mg Immunoglobulin pro ml Beschichtungspuffer.
Herstellung von Antigenlösungen
Herstellen der folgenden Antigenlösungen durch Verdünnung der Humanserum-Standardlösung von DAKO in Antigenpuffer (die Serum-Standardlösung wird gemäß der spezifizierten Konzentration von CRP in der Standardlösung verdünnt):

A: 250 ng CRP/ml

B: 125 ng CRP/ml

C: 63 ng CRP/ml

D: 31 ng CRP/ml

E: 16 ng CRP/ml

F: 8 ng CRP/ml

G: 0 ng CRP/ml (negative Kontrolle)
Herstellung von Konjugatlösungen
Herstellen einer Verdünnung von Konjugat I und II zum Testen in Konjugatpuffer
Konjugate: "Dex-BSA-Rhodamin/a-CRP"-Konjugat (von Lösung D in Beispiel 4A) "Dex-Remazol-Schwarz/a-CRP"-Konjugat (von Lösung E in Beispiel 6A)
Verdünnung: Das Konjugat wird bis zu einer Endkonzentration mit einer Extinktion von 0,7 verdünnt, wenn es beim tatsächlichen Absorptionsmaximum des Konjugats innerhalb des sichtbaren Bereichs des Absorptionsspektrums (d. h. im Bereich von etwa 450 nm bis etwa 650 nm) unter Verwendung eines Lichtpfads von 1 cm gemessen wird.
Durchführen des Testes

1) Auf sieben Teststreifen mit lateralem Fluss mit den Markierungen A1, B1, C1, D1, E1, F1 und G1 wurden jeweils 3 μl Kaninchen-Anti-Human-CRP (0,125 mg Immunoglobulin/ml) als ein Punkt in der Mitte des Teststreifens mit lateralem Fluss aufgebracht. Trocknen lassen des Teststreifens während 15 Minuten.
2) Blockieren der verbleibenden Proteinbindekapazität der Teststreifen durch Aufbringen von 25 μl Blockierpuffer am oberen Ende des Glasfaserpolsters auf jedem Teststreifen.
3) Etwa 10 Minuten warten, bis der Puffer durch Kapillarfluss das absorbierende Polster am anderen Ende der Teststreifen erreicht hat.
4) 25 μl Antigenlösung auf jeden Teststreifen am oberen Ende des Glasfaserpolsters geben. Auf den Teststreifen mit der Markierung A1 wird Antigenlösung A (250 ng CRP/ml) aufgebracht, auf den Teststreifen mit der Markierung B1 wird Antigenlösung B aufgebracht, usw., bis zum Teststreifen mit der Markierung G1, auf welchen die negative Kontroll-Antigenlösung G aufgebracht wird. Die Antigenlösungen werden allmählich zugegeben, um ein "Überfließen" des Glasfaserpolsters zu vermeiden.
5) 10 Minuten warten, um die Antigenlösungen durch das absorbierende Polster am anderen Ende des Teststreifens fließen zu lassen.
6) 25 μl Waschpuffer auf das untere Ende des Glasfaserpolsters auf jedem Teststreifen geben. 10 Minuten warten und wieder 25 μl Waschpuffer auf das untere Ende des Glasfaserpolsters auf jedem Teststreifen geben.
7) 30 Minuten warten.
8) 50 μl Konjugat-I-Verdünnung auf das untere Ende des Glasfaserpolsters auf jedem Teststreifen geben.
9) 10 Minuten warten.
10) 25 μl Waschpuffer auf das untere Ende des Glasfaserpolsters auf jedem Teststreifen geben. 10 Minuten warten und wieder 25 μl Waschpuffer auf das untere Ende des Glasfaserpolsters von jedem Teststreifen geben.

Wiederholen des Schritts 1 mit einem neuen Satz von Teststreifen mit lateralem Fluss mit den Markierungen A2, B2, C2, D2, E2 und F2 und G2, und Durchführen der Schritte 2 bis 10, nun unter Verwendung der Konjugat-II-Verdünnung in Schritt 8.
Bewertung der Testergebnisse
Die Farbintensität der Punkte, die auf den Teststreifen erscheinen, wird durch einen Auswertungstest bewertet. Die folgenden Zahlen werden verwendet, um die Intensität der erscheinenden Punkte zu charakterisieren:

5: sehr intensiv gefärbter Punkt

4: mittel gefärbter Punkt

3: schwach gefärbter Punkt

2: Punkt kaum sichtbar

1: es kann kein Punkt erkannt werden
Ablesungen vom Auswertungstest
BEISPIEL 7B
Standardtest der Leistung des lateralen Flusses mit verschiedenen "Dex-BSA-Rhodamin/aCRP"-Konjugaten
Verschiedene "Dex-BSA-Rhodamin/a-CRP"-Konjugate wurden in den Standardtests der Leistung des lateralen Flusses getestet. Alle Tests wurden wie in Beispiel 7A beschrieben durchgeführt.
Die Antigenkonzentration (CRP) in dem Test und die "Dex-BSA-Rhodamin/a-CRP"-Konjugat-Konzentration unterscheiden sich von Test zu Test und wird daher für jeden Test separat beschrieben.
In allen Tests wurde der Antikörper auf dem Nitrocellulosestreifen in einer Konzentration von 0,1 mg Antikörper/ml als Punkt aufgebracht, und 1 μl wurde für jeden Punkt verwendet.
Test Nr. 1
Der Test der Leistung des lateralen Flusses wurde mit dem "Dex-BSA-Rhodamin/a-CRP"-Konjugat aus Beispiel 4A, Lösung C, durchgeführt.

Der Test der Leistung des lateralen Flusses wurde unter Verwendung der folgenden Konjugatfraktionen durchgeführt:

I: Peak eins von Sephacryl HR S-300	Konzentration: OD 558 = 0,1
II: Fraktion eins von Sephacryl HR S-500	Konzentration: OD 558 = 0,1
III: Fraktion zwei von Sephacryl HR S-500	Konzentration: OD 558 = 0,1

Die Farbintensität der Punkte, die auf den Teststreifen erscheinen, wird durch die Verwendung eines Flachbettscanners von AGFA, ARUS II, mit den folgenden Setup-Bedingungen gemessen:

Original:	Reflektierend
Modus:	Grauskala
Input:	240 dpi
Skalieren auf	100%
Bereich:	Histogramm Min = 130, Max = 254
Tonkurve:	Keine
Schärfe:	Keine
Descreen:	Keine
Größe:	A4 Protrait

Die Software CREAM für Windows (1-D, Kem-En-Tec A/S, Kopenhagen, Dänemark, Kat. Nr. 990012) wurde zur Berechnung der Ergebnisse, die in Intensitätseinheiten angegeben sind, verwendet.
Ergebnisse
Schlussfolgerung
Das in Fraktion eins von Sephacryl HR S-500 aufgefangene Konjugat (aufgefangen von 7 bis 10,5 ml) ergibt eine wesentlich bessere Reaktion als das Konjugat, welches in Fraktion zwei aufgefangen wurde (aufgefangen von 10,5 bis 18 ml). Der Test des Peak eins von Sephacryl HR S-300, welcher die beiden Fraktionen von Sephacryl S-500 einschließt, ergibt fast die gleiche Reaktion wie Fraktion zwei, die von Sephacryl HR S-500 erhalten wurde. Die oben angegebenen Testergebnisse veranschaulichen den Vorteil der Verwendung von wasserlöslichen Konjugaten mit hohem Molekulargewicht, d. h. Konjugaten, welche völlig oder nahezu völlig vom Volumen ausgeschlossen sind, wenn sie auf einer Sephacryl HR S-500 Säule gelfiltriert wurden.
Test Nr. 2
Der Test der Leistung des lateralen Flusses wurde mit dem "Dex-BSA-Rhodamin/a-CRP"-Konjugat aus Beispiel 4B durchgeführt.
Die Leistung des oben erwähnten Konjugats wurde mit einem Referenzkonjugat (hergestellt mit DVS-aktiviertem Dextran), "Dex-BSA-Rhodamin/a-CRP" aus Beispiel 4A, Lösung E, verglichen.

I: "Dex-BSA-Rhodamin/a-CRP", Beispiel 4B
II: "Dex-BSA-Rhodamin/a-CRP", Beispiel 4A, Lösung E (Referenz)
Konjugatkonzentration: OD 558 = 0,5

Ergebnisse
Schlussfolgerung
Die obigen Testergebnisse zeigen die Ausführbarkeit der Verwendung von EPCH-aktivierten Trägereinheiten als die Basis für Konjugate mit hohem Molekulargewicht mit einer Leistung ähnlich zu den oder besser als die Konjugate auf Basis von DVS-aktivierten Trägereinheiten.
Test Nr. 3
Der Test der Leistung des lateralen Flusses wurde mit den "Dex-BSA-Rhodamin/a-CRP"-Konjugaten aus Beispiel 4F durchgeführt (hergestellt in hoher (Lösung A) bzw. niedriger (Lösung B) ionischer Stärke). Die verschiedenen Fraktionen, die durch Gelfiltration auf Sephacryl HR S-1000 aufgefangen wurden, und das Referenzkonjugat aus Beispiel 4A, Lösung E, wurden auch getestet:

I: "Dex-BSA-Rhodamin/a-CRP", Beispiel 4F, Lösung A OD 558 = 0,35
II: "Dex-BSA-Rhodamin/a-CRP", Beispiel 4F, Lösung B OD 558 = 0,5
III: "Dex-BSA-Rhodamin/a-CRP", Beispiel 4A, Lösung E (Referenz) OD 558 = 0,5
IV: Fraktion 1 (Sephacryl S-1000) von Lösung A, aufgefangen von 8–10 ml
V: Fraktion 2 (Sephacryl S-1000) von Lösung A, aufgefangen von 10–12 ml
VI: Fraktion 3 (Sephacryl S-1000) von Lösung A, aufgefangen von 14–16 ml
VII: Fraktion 4 (Sephacryl S-1000) von Lösung A, aufgefangen von 18–20 ml

Die Fraktionen IV–VII wurden unter Verwendung einer Konzentration von OD 558 = 0,35 getestet.
Ergebnisse
Test von Fraktionen, die von Sephacryl HR S-1000 aufgefangen wurden:
Schlussfolgerung
Diese Testergebnisse zeigen, dass Konjugate, die durch Koppeln von Antikörper in niedriger ionischer Stärke (Konjugat B), d. h. ohne (reversibles) Ausfällen der Reaktanden, hergestellt wurden, eine sehr mangelhafte Leistung im Vergleich zu Konjugaten ergeben, bei denen das Koppeln von Antikörper unter reversiblen Ausfällungsbedingungen (Konjugat A) durchgeführt wurde. Diese Ergebnisse stimmen mit der Tatsache überein, dass Konjugat B ein wesentlich geringeres Molekulargewicht aufweist als Konjugat A. Des Weiteren ist erkennbar, dass, wenn ein Konjugat zu Proben mit abnehmendem Molekulargewicht fraktioniert wird, die Leistung der Proben mit dem Molekulargewicht abnimmt, d. h. Konjugate mit einem hohen Molekulargewicht ergeben eine höhere Leistung.
BEISPIEL 7C
Standardtest der Leistung des lateralen Flusses mit verschiedenen "Dex-BSA-Farbstoff/a-CRP"- und "Dex-Farbstoff/a-CRP"-Konjugaten
Verschiedene "Dex-BSA-Farbstoff/a-CRP"- und "Dex-Farbstoff/a-CRP"-Konjugate wurden in dem Standardtest der Leistung des lateralen Flusses getestet. Alle Tests wurden wie in Beispiel 7A beschrieben durchgeführt.
Die Antikörperkonzentration, die für den Punkt verwendet wurde, das Volumen (μl) von Antikörper, das zum Ausbringen in Punktform auf den Nitrocellulosestreifen verwendet wurde, die Antigenkonzentration (CRP) und die Konjugatkonzentrationen unterscheiden sich von Test zu Test und werden daher separat für jeden Test beschrieben.
Test Nr. 1
Der Test der Leistung des lateralen Flusses wurde mit den "Dex-Remazol-Schwarz/a-CRP"-Konjugaten aus Beispiel 6A, Lösung A, B und C, durchgeführt.
Die Leistung der Konjugate würde mit einem Referenzkonjugat, "Dex-BSA-Rhodamin/a-CRP" aus Beispiel 4A, Lösung E, verglichen.

Die Tests der Leistung des lateralen Flusses erfolgten unter Verwendung der folgenden Bedingungen:
3 μl Antikörper in einer Konzentration von 1 mg/ml wurden für Punkte verwendet, als die "Dex-Remazol-Schwarz/a-CRP"-Konjugate getestet wurden, und 1 μl Antikörper in einer Konzentration von 0,1 mg/ml wurde verwendet, als die Referenz "Dex-BSA-Rhodamin/a-CRP"-Konjugat getestet wurde.

I: "Dex-Remazol-Schwarz/a-CRP, Konjugat A	OD 600 = 0,6
Π: "Dex-Remazol-Schwarz/a-CRP, Konjugat B	OD 600 = 0,6
III: "Dex-Remazol-Schwarz/a-CRP, Konjugat C	OD 600 = 0,6
IV: "Dex-BSA-Rhodamin/a-CRP", Bsp. 4A, Lösung E (Referenz)	OD 558 = 0,5

Ergebnisse
Die Testergebnisse zeigen die Ausführbarkeit der Verwendung von Remazol-Schwarz als eine Signalkomponente.
Test Nr. 2
Der Test der Leistung des lateralen Flusses wurde mit den "Dex-BSA-Uniblau-A/a-CRP"-Konjugaten aus Beispiel 4E, Lösung A und B, durchgeführt.
Die Leistung der Konjugate wurde mit einem Referenzkonjugat, "Dex-BSA-Rhodamin/a-CRP" aus Beispiel 4A, Lösung E, verglichen.

Die Tests der Leistung des lateralen Flusses erfolgten unter Verwendung der folgenden Bedingungen:
1 μl Antikörper in einer Konzentration von 0,1 mg/ml wurde für Punkte verwendet, als die "Dex-BSA-Uniblau-A/a-CRP"-Konjugate und die Referenz "Dex-BSA-Rhodamin/a-CRP"-Konjugat getestet wurde.

I: "Dex-Remazol-Uniblau-A/a-CRP", Konjugat A	OD 595 = 0,5
II: "Dex-Remazol-Uniblau-A/a-CRP", Konjugat B	OD 595 = 0,5
III: "Dex-BSA-Rhodamin/a-CRP", Bsp. 4A, Lösung E (Referenz)	OD 558 = 0,5

Ergebnisse
Die Testergebnisse zeigen die Ausführbarkeit der Verwendung von Uniblau A als eine Signalkomponente.
Test Nr. 3
Der Test der Leistung des lateralen Flusses wurde mit dem "Dex-Remazol-Brilliant-Rot/a-CRP"-Konjugat aus Beispiel 6B durchgeführt.
Die Leistung des Konjugats wurde mit einem Referenzkonjugat "Dex-BSA-Rhodamin/a-CRP" aus Beispiel 4A, Lösung E, verglichen.
Die Tests der Leistung des lateralen Flusses erfolgten unter Verwendung der folgenden Bedingungen:
3 μl Antikörper in einer Konzentration von 1 mg/ml wurden für Punkte verwendet, als die "Dex-Brilliant-Rot/a-CRP"-Konjugate getestet wurden, und 1 μl Antikörper in einer Konzentration von 0,1 mg/ml wurde verwendet, als die Referenz "Dex-BSA-Rhodamin/a-CRP"-Konjugat getestet wurde.

I: "Dex-Remazol-Brillian-Rot/a-CRP", Konjugat A OD 530 = 1,0

II: "Dex-BSA-Rhodamin/a-CRP", Bsp. 5A, Lösung E (Referenz) OD 558 = 0,5
Ergebnisse
Die Testergebnisse zeigen die Ausführbarkeit der Verwendung von Remazol Brilliant Rot als eine Signalkomponente.
Aus den angegebenen Beispielen kann abgeleitet werden, dass reversible Ausfällungsbedingungen Konjugate ergeben, die, mit und ohne Spacerkomponente, mit Antikörper und Farbstoff gekoppelt sind, die eine bessere Leistung in Teststreifen mit lateralem Fluss zeigen als Konjugate, die ohne reversible Ausfällungsbedingungen hergestellt wurden.

Claims

Verfahren zur Herstellung eines wasserlöslichen, vernetzten Konjugats, das Einheiten von mindestens einer Trägerkomponente, Einheiten von mehr als einer Verbindungskomponente, Einheiten von mindestens einer Signalkomponente, Einheiten von mindestens einer primären Zielkomponente und gegebenenfalls Einheiten von mindestens einer Spacerkomponente umfasst, wobei die Signalkomponente durch die Verbindungskomponente kovalent an die Trägerkomponente gebunden ist und/oder die Signalkomponente kovalent an die Spacerkomponente gebunden ist und die Spacerkomponente durch die Verbindungskomponente kovalent an die Trägerkomponente gebunden ist, wobei das Verfahren umfasst: a) Umsetzen eines wasserlöslichen Zwischenproduktkonjugats, das Einheiten von mindestens einer Trägerkomponente, Einheiten von mehr als einer Verbindungskomponente, Einheiten von mindestens einer Signalkomponente und gegebenenfalls Einheiten von mindestens einer Spacerkomponente umfasst, wobei die Signalkomponente durch die Verbindungskomponente kovalent an die Trägerkomponente gebunden ist und/oder die Signalkomponente kovalent an die Spacerkomponente gebunden ist und die Spacerkomponente durch die Verbindungskomponente kovalent an die Trägerkomponente gebunden ist, durch Umsetzen von nicht umgesetzten reaktiven Einheiten, die von der Verbindungskomponente abgeleitet sind, mit mindestens einer primären Zielkomponente in einer wässrigen Lösung, wobei die Bedingungen so sind, dass ein reversibler Niederschlag gebildet wird; b) Wiederauflösen des reversiblen Niederschlags, der das wasserlösliche, vernetzte Konjugat umfasst, in einem wässrigen Medium; und c) gegebenenfalls Unterziehen des wasserlöslichen, vernetzten Konjugats einem Reinigungsschritt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Schritt der Niederschlagsbildung a) durch Aussalzen mittels eines lyotropen Salzes, das in einer Konzentration von mindestens 1,25 M vorhanden ist, durchgeführt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei das lyotrope Salz ausgewählt ist aus Sulfaten, Phosphaten, Citraten und Tartraten von Lithium, Natrium, Kalium, Calcium, Ammonium, und Gemischen davon.
Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der Schritt der Niederschlagsbildung a) bei einem pH-Wert von mehr als 6 durchgeführt wird.
Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Trägerkomponente ausgewählt ist aus Dextranen, einschließlich Carboxymethyldextranen; Stärken, einschließlich Hydroxyethylstärken und Hydroxypropylstärken; Glycogen; Agarosederivaten; Cellulosederivaten, wie Hydroxyethyl- und Hydroxypropylcellulosen; natürlichen Gummis und Gemischen davon.
Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei die Trägerkomponente Dextran ist.
Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Verbindungskomponente aus Divinylsulfon und Epichlorhydrin ausgewählt ist.
Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Verbindungskomponente Divinylsulfon ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Spacerkomponente aus Proteinen und Polypeptiden ausgewählt ist.
Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei die Spacerkomponente aus BSA, Ovalbumin und Globulin ausgewählt ist.
Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Signalkomponente ein Farbstoff ist.
Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das wasserlösliche, vernetzte Konjugat bei 25°C eine Wasserlöslichkeit von mindestens 10 mg trockenes Konjugat pro ml Wasser aufweist.
Verfahren zur Herstellung eines wasserlöslichen, vernetzten Konjugatkomplexes, der ein nach einem der vorstehenden Ansprüche hergestelltes Konjugat, einen Liganden und eine sekundäre Zielkomponente umfasst, wobei der Ligand kovalent an die sekundäre Zielkomponente gebunden ist, und der Ligand an die primäre Zielkomponente des Konjugats durch nichtkovalente Bindungen gebunden ist, wobei das Verfahren umfasst: I) Herstellen eines wasserlöslichen, vernetzten Konjugats nach einem der vorstehenden Ansprüche; II) Umsetzen des gegebenenfalls gereinigten wasserlöslichen, vernetzten Konjugats mit einem Liganden, wobei der Ligand kovalent an eine sekundäre Zielkomponente gebunden ist, in einer wässrigen Lösung; III) Beenden der Reaktion.
Verfahren gemäß Anspruch 13, wobei Schritt III) durch Zugabe von freiem Ligand durchgeführt wird.
Wasserlösliches, vernetztes Konjugat, erhältlich durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei der Schritt der Niederschlagsbildung a) der Bildung des Konjugats durch Aussalzen mittels eines lyotropen Salzes, das in einer Konzentration von mindestens 1,25 M vorhanden ist, durchgeführt wird.
Wasserlöslicher, vernetzter Konjugatkomplex, erhältlich durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 14, wobei der Schritt der Niederschlagsbildung a) zur Bildung des Konjugats durch Aussalzen mittels eines lyotropen Salzes, das in einer Konzentration von mindestens 1,25 M vorhanden ist, durchgeführt wird.
Vorrichtung mit lateralem Fluß zum Bestimmen der Anwesenheit oder Abwesenheit mindestens einer zu bestimmenden Komponente in einer flüssigen Probe, wobei die Vorrichtung mit lateralem Fluß umfasst: I) einen Teststreifen, der einen Aufbringungsteil, einen Ablagerungsteil und einen Detektionsteil umfasst und so angeordnet ist, dass die flüssige Probe von dem Aufbringungsteil durch den Ablagerungsteil zu dem Detektionsteil fließen kann; II) eine trockene Ablagerung, die sich in dem Ablagerungsteil des Teststreifens befindet, von mindestens einem Konjugat nach Anspruch 15, oder eine trockene Ablagerung von mindestens einem Konjugatkomplex nach Anspruch 16, oder ein Gemisch davon; und III) mindestens eine Zielkomponente, die selektiv an eine oder mehrere zu bestimmende Komponenten, die in der flüssigen Probe vorhanden sind, binden kann oder selektiv damit reagieren kann, wobei die Zielkomponente auf dem Detektionsteil des Teststreifens immobilisiert ist.
Verfahren zum Bestimmen der Anwesenheit oder Abwesenheit mindestens einer zu bestimmenden Komponente in einer flüssigen Probe, wobei das Verfahren umfasst: I) Zugeben der flüssigen Probe zum Aufbringungsteil einer Vorrichtung mit lateralem Fluß nach Anspruch 17; II) gegebenenfalls Zugeben eines Waschpuffers zum Aufbringungsteil der Vorrichtung mit lateralem Fluß; III) Abwarten einer ausreichenden Zeitdauer, sodass die aufgebrachte Flüssigkeit und, falls zutreffend, der Waschpuffer vom Aufbringungsteil durch den Ablagerungsteil zum Detektionsteil fließen kann; und IV) Bestimmen der Anwesenheit oder Abwesenheit eines Signals in dem Detektionsteil.
Verfahren gemäß Anspruch 18, wobei das Signal direkt durch das bloße Auge bestimmbar ist.
Verfahren gemäß Anspruch 19, wobei das Signal durch das bloße Auge nach Zugabe eines Reagenzes zum Detektionsteil bestimmbar ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 18 bis 20, wobei die flüssige Probe biologischer Herkunft ist.
Verfahren gemäß Anspruch 21, wobei die flüssige Probe eine Blutprobe, eine Serumprobe, eine Plasmaprobe, eine Urinprobe, eine Samenprobe oder Gemische davon ist.
Verwendung eines wasserlöslichen, vernetzten Konjugats nach Anspruch 15 für immunochemische Assaytechniken, einschließlich enzymatischer Immunoassays (EIA), wie ELISA, Radioimmunoassays (RIA), nephelometrischer und turbidimetrischer Immunoassays, immunohistochemischer Verfahren, cytochemischer Verfahren, Flusscytometrie, In-situ-Hybridisierungstechniken, Membranhybridisierungstechniken, einschließlich Southern and Northern Blotting, Biosensoren, Vorrichtungen mit lateralem Fluß oder Verfahren, die auf Lectin/Kohlenhydratwechselwirkungen beruhen.
Verwendung eines wasserlöslichen, vernetzten Konjugatkomplexes nach Anspruch 16 für immunochemische Assaytechniken, einschließlich enzymatischer Immunoassays (EIA), wie ELISA, Radioimmunoassays (RIA), nephelometrischer und turbidimetrischer Immunoassays, immunohistochemischer Verfahren, cytochemischer Verfahren, Flusscytometrie, in situ Hybridisierungstechniken, Membranhybridisierungstechniken, einschließlich Southern and Northern Blotting, Biosensoren, Vorrichtungen mit lateralem Fluß oder Verfahren, die auf Lectin/Kohlenhydratwechselwirkungen beruhen.