DE19828378A1 - Farbe entwickelndes Verfahren, Enzym-Immunoassay, der das Farbe entwickelnde Verfahren anwendet und Immunochromatographie, die den Enzym-Immunoassay einarbeitet - Google Patents

Farbe entwickelndes Verfahren, Enzym-Immunoassay, der das Farbe entwickelnde Verfahren anwendet und Immunochromatographie, die den Enzym-Immunoassay einarbeitet

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DE19828378A1 DE19828378A DE19828378A DE19828378A1 DE 19828378 A1 DE19828378 A1 DE 19828378A1 DE 19828378 A DE19828378 A DE 19828378A DE 19828378 A DE19828378 A DE 19828378A DE 19828378 A1 DE19828378 A1 DE 19828378A1
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Description

Fachgebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren der Farbentwicklung unter Anwendung der Reaktion eines Indolyl-Derivats als Farbe entwickelndes Substrat mit einem Enzym in Gegenwart einer Verbindung mit freiem Radikal und/oder einer Chelat-Verbindung, auf einen Enzym-Immunoassay (nachfolgend EIA abgekürzt), der das Verfahren der Farbentwicklung ausnützt, und auf eine Immunochromatographie, die den Enzym-Immunoassay einbaut.
Stand der Technik
Ein Indolyl-Derivat wurde als Farbe entwickelndes Substrat beim Immunblotting oder bei der Immunochromatographie (siehe Methods in Enzymology, Bd. 121, S. 497-509 (1986) und JP-A-9- 133681, die der EP-A-0 762 123 entspricht; der Ausdruck "JP-A", wie er hier verwendet wird, bezeichnet eine "ungeprüfte, veröffentlichte japanische Patentanmeldung") verwendet. Bei diesen Techniken wird die Aktivität eines Enzyms, das durch Immunreaktion an einer Nitrozellulose-Membran inaktiviert ist, durch die Verwendung eines Indolyl-Derivats bestimmt. Das Indolyl-Derivat reagiert mit dem immobilisierten Enzym unter Bildung eines Indigo-Farbstoffs, der sich im Laufe der Zeit an der Membran unter Sichtbarmachung des Reaktionsproduktes abscheidet.
Ein Immunblotting erfordert vom Beginn der Reaktion zwischen einem Indolyl-Derivat und einem Enzym bis zum Farbnachweis 20 bis 60 min; es wurde nach einer Verkürzung der Reaktionszeit verlangt. Bei einer Immunochromatograhie nimmt es mindestens 10 min, üblicherweise 15 min bis mehrere Stunden in Anspruch, um eine Probe punktförmig auf der Membran aufzutragen, eine Entwicklung mit einer Entwicklerlösung, die ein Indolyl-Derivat enthält, durchzuführen und die entwickelte Farbe im Nachweisbereich unter Erhalt eines Resultats zu messen. Um den ganzen Vorteil der Einfachheit, die für die Immunochromatographie charakteristisch ist, bei einer dringenden Untersuchung zu nutzen, wurde gewünscht, die Untersuchungszeit weiter zu verkürzen.
Eine erste Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung eines verbesserten Farbe entwickelnden Verfahrens unter Verwendung der Reaktion eines Indolyl-Derivats mit einem Enzym in Gegenwart einer Verbindung mit freiem Radikal und/oder einer Chelat-Verbindung.
Eine zweite Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Enzym-Immunoassays, der das oben genannte Farbe entwickelnde Verfahren ausnützt.
Eine dritte Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung einer Immunochromatographie, die den oben genannten Enzym-Immunoassay einbaut.
Als Resultat ausgedehnter Untersuchungen zur Lösung der oben beschriebenen Aufgaben haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung festgestellt, daß die Zeit, die zur Farbentwicklung erforderlich ist, durch die Reaktion eines Indolyl-Derivats mit einem Enzym in Gegenwart einer spezifischen Verbindung mit freiem Radikal und/oder einer spezifischen Chelat-Verbindung verringert werden kann.
Das heißt, die vorliegende Erfindung stellt ein Farbe entwickelndes Verfahren bereit, das Umsetzen eines Indolyl-Derivats, das durch die Formel (I) dargestellt wird:
worin R1 eine enzymatisch ablösbare Gruppe darstellt;
und R2 und R3 jeweils ein Wasserstoffatom oder ein Halogenatom darstellen;
und eines Enzyms, in Gegenwart einer Verbindung mit freiem Radikal, die durch die Formel (II) dargestellt wird:
worin A eine substituierte oder unsubstituierte Methylenkette mit 2 oder 3 Kohlenstoffatomen, die in ihrer Kette ein Sauerstoffatom oder eine Carbonyl-Gruppe enthalten kann, darstellt; und R4, R5, R6 und R7 jeweils ein Wasserstoffatom oder eine Alkyl-Gruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen darstellen;
und/oder einer Chelat-Verbindung, die zwischen einem Diamin-Derivat, das durch die Formel (III) dargestellt wird:
worin R8 eine Ethylen-Gruppe oder eine Cyclohexan-1,2- diyl-Gruppe darstellt,
und einem Metall, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Eisen, Kupfer, Zink, Kobalt, Indium, Neodym, Mangan und Europium, gebildet wird, umfaßt.
Die vorliegende Erfindung stellt auch einen Enzym-Immunoassay bereit, umfassend Messen der Enzymaktivität eines mit Enzym markierten Antikörpers oder Antigens durch Verwendung der Reaktion des Indolyl-Derivats, das durch die Formel (I) dargestellt wird, mit einem Enzym, wobei die Reaktion in Gegenwart der Verbindung mit freiem Radikal, die durch die Formel (II) dargestellt wird, und/oder der Chelat-Verbindung, die zwischen den Diamin-Derivat, das durch die Formel (III) dargestellt wird, und einem Metall, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Eisen, Kupfer, Zink, Kobalt, Indium, Neodym, Mangan und Europium, gebildet wird, durchgeführt wird.
Die vorliegende Erfindung liefert außerdem eine Immunochromatographie, die Messen der Enzymaktivität eines durch Enzym markierten Antikörpers oder Antigens, der (das) in einen Nachweisbereich an eine festen Phase gebunden ist, durch Verwendung der Reaktion des Indolyl-Derivats, das durch die Formel (I) dargestellt wird, mit einem Enzym, wobei die Reaktion in Gegenwart der Verbindung mit freiem Radikal, die durch die Formel (II) dargestellt wird, und/oder der Chelat-Verbindung, die zwischen dem Diamin-Derivat, das durch die Formel (III) dargestellt wird, und einem Metall, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Eisen, Kupfer, Zink, Kobalt, Indium, Neodym, Mangan und Europium, gebildet wird, durchgeführt wird, umfaßt.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG
Fig. 1 ist ein Diagramm der Farbintensität, die bei einer geänderten AAQ-2-Konzentration entwickelt wird.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Das Farbe entwickelnde Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung ist dadurch charakterisiert, daß die Verbindung mit freiem Radikal der Formel (II) und/oder die Chelat-Verbindung in dem Farbe entwickelnden System vorliegen, in welchem die ablösbare Gruppe R1 des Indolyl-Derivats der Formel (I) durch die Wirkung eines Enzyms freigesetzt wird und zwei Moleküle des Restes unter Bildung eines Indigo-Farbstoffs kondensiert werden. Nach einer vorgeschriebenen Reaktionszeit kann der produzierte Indigo-Farbstoff mit dem bloßen Auge oder mit Hilfe von Geräten nachgewiesen werden.
Die Verbindung mit freiem Radikal und/oder die Chelat-Verbindung können der Reaktionslösung, die das Indolyl-Derivat enthält, üblicherweise eine Pufferlösung, die das Indolyl-Derivat enthält, zu einer Gesamtkonzentration von vorzugsweise zwischen etwa 0,1 und 100 mmol, bevorzugter zwischen etwa 1 und 20 mmol zugesetzt werden. Die Reaktion wird vorzugsweise in einem Puffer durchgeführt. Beispiele für geeignete Puffer umfassen einen Diethanolamin-HCl-Puffer, Aminomethylpropandiol-HCl-Puffer, einen Carbonat-Puffer, einen Glycin-Puffer, einen CHES-NaOH-Puffer (CHES: N- Cyclohexyl-2-aminoethansulfonsäure), einen CAPSO-NaOH-Puffer CAPSO: N-Cyclohexyl-2-hydroxy-3-aminopropansulfonsäure) und einen CAPS-NaOH-Puffer (CAPS: N-Cyclohexyl-3- aminopropansulfonsäure). Wenn gewünscht können Salze wie z. B. Magnesiumchlorid dem Puffer zugesetzt werden.
Die Verbindung mit freiem Radikal der Formel (II), die in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden kann, ist eine cyclische Amin-Verbindung, die ein freies N-Oxyl-Radikal hat. In der Formel (II) ist A eine substituierte oder unsubstituierte Methylenkette mit 2 oder 3 Kohlenstoffatomen. Die Methylenkette kann in ihrer Kette ein Sauerstoffatom oder eine Carbonyl-Gruppe enthalten. Beispiele für A beinhalten -CH2)3-, -(CH2)2-, -CH2-O-CH2- und -CH2-CO-CH2-. Substituenten an der Methylkette umfassen eine Hydroxyl-Gruppe, eine Carboxyl-Gruppe, eine Carbamoyl-Gruppe (z. B. Carbamoyl, Methylcarbamoyl, Ethylcarbamoyl, Propylcarbamoyl oder Phenylcarbamoyl) und eine Amino-Gruppe. R4, R5, R6 und R7, die gleich oder verschieden sein können, stellen jeweils ein Wasserstoffatom oder eine Alkyl-Gruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen wie z. B. Methyl, Ethyl, n-Propyl oder Isopropyl dar. Vorzugsweise stellt mindestens eine der Gruppen R4 bis R8 eine Alkyl-Gruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen dar, und bevorzugter stellen R4 bis R8 jeweils eine Alkyl-Gruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen dar. Wo das zu dem ringbildenden Stickstoffatom benachbarte Kohlenstoffatom mit einer Alkyl-Gruppe substituiert ist, ist das freie Radikal stabilisiert.
Die Verbindung mit freiem Radikal der Formel (II) ist einfach erhältlich und beinhaltet N-Oxyl-2,2,6,6- tetramethylpiperidin, N-Oxyl-4-hydroxy-2,2,6,6- tetramethylpiperidin, N-Oxyl-4-carboxy-2,2,6,6- tetramethylpiperidin, N-Oxyl-4-carbamoyl-2,2,6,6- tetramethylpiperidin, N-Oxyl-4-amino-2,2,6,6- tetramethylpiperidin, N-Oxyl-2,2,6,6-tetramethylmorpholin, N- Oxyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidin, N-Oxyl-3-hydroxy-2,2,5,5- tetramethylpyrrolidin, N-Oxyl-3-carboxyl-2,2,5,5- tetramethylpyrrolidin, N-Oxyl-3-carbamoyl-2,2,5,5- tetramethylpyrrolidin und N-Oxyl-4-oxo-2,2,6,6- tetramethylpiperidin (AAQ-2).
In der Formel (III) umfaßt R8 eine Ethylen-Gruppe und eine Cyclohexan-1,2-diyl-Gruppe.
Die Chelat-Verbindung, die in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden kann, beinhaltet Komplexe, in denen Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), trans-1,2- Diamincyclohexan-N,N,N',N'-tetraessigsäure, usw. koordinativ an ein Zentralatom wie z. B. Eisen, Kupfer, Zink, Kobalt, Indium, Neodym, Mangan und Europium gebunden sind. Spezifische Beispiele für die Chelat-Verbindungen sind EDTA-Eisen, EDTA-Kupfer, EDTA-Zink, EDTA-Kobalt, EDTA-Indium, EDTA-Mangan, EDTA-Europium, trans-1,2-Diamincyclohexan- N,N,N',N'-tetraessigsäure-Eisen und trans-1,2- Diamincyclohexan-N,N,N',N'-tetraessigsäure-Kupfer.
In der Formel (I), die das als Substrat verwendete Indolyl-Derivat darstellt, ist R1 eine ablösbare Gruppe, die durch die Wirkung eines Enzyms zersetzt und abgelöst wird. Beispiele für eine derartige enzymatisch ablösbare Gruppe umfassen eine Gruppe, die durch -PO3 2-.2M⁺ (worin M ein Wasserstoffatom, eine Alkalimetall oder Toluidin ist), eine β-D-Galactopyranosyl-Gruppe und eine β-D-Glucopyranosyl- Gruppe.
Das Indolyl-Derivat, das als Substrat für eine Phosphatase verwendet wird, wird durch die Formel (Ia):
worin R2, R3 und M wie oben definiert sind, dargestellt;
das für β-D-Galactosidase wird durch die Formel (Ib):
worin R2 und R3 wie oben definiert sind; und Gal eine β-D- Galactopyranosyl-Gruppe darstellt; dargestellt;
und das für β-D-Glucosidase wird durch die Formel (Ic) dargestellt:
worin R2 und R3 wie oben definiert sind; und Glu eine β-D- Glucopyranosyl-Gruppe darstellt.
Das Halogenatom, das durch R2 und R3 dargestellt wird, umfaßt Chlor, Brom und Jod. Es ist bevorzugt, daß das Halogenatom als R2 oder R3 an die 4- oder 5-Position des Indolingerüsts gebunden ist.
Das Alkalimetall in dem Indolyl-Derivat der Formel (Ia) umfaßt Natrium und Kalium. Spezifische Beispiele für die Indolyl-Derivate der Formel (Ia) sind 3-Indolylphosphorsäure, 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphorsäure, 5-Brom-6-chlor-3- indolylphosphorsäure, Dinatrium-3-indolylphosphat, Dinatrium- 5-brom-4-chlor-3-indolylphosphat, Dinatrium-5-brom-6-chlor-3- indolylphosphat, p-Toluidin-5-brom-4-chlor-3-indolylphosphat und p-Toluidin-5-brom-6-chlor-3-indolylphosphat.
Spezifische Beispiele für das Indolyl-Derivat der Formel (Ib) sind 3-Indolyl-β-D-galactopyranosid, 5-Brom-4-chlor-3- indolyl-β-D-glactopyranosid und 5-Brom-6-chlor-3-indolyl-β-D- galactopyranosid.
Spezifische Beispiele für das Indolyl-Derivat der Formel (Ic) sind 3-Indolyl-β-D-glucopyranosid, 5-Brom-4-chlor-3-indolyl­ β-D-glucopyranosid und 5-Brom-6-chlor-3-indolyl-β-D- glucopyranosid.
Das Farbe entwickelnde Verfahren der vorliegenden Erfindung kann in einem EIA unter Verwendung eines mit Enzym markierten Reagenzes, Immunoblotting, Phosphatase-Isoenzymanalyse durch Elektrophorese, Gewebefärben und genetischer Analyse an DNA oder RNA unter Verwendung eines Enzyms als markierende Substanz ausgenutzt werden.
EIA kann mit einem Set, das eine geeignete Kombination eines mit Enzym markierten Reagenzes (ein Antigen oder Antikörper, das (der) mit dem oben genannten Enzym markiert ist) und ein Festphasenreagens (ein an einem Träger immobilisiertes Antigen oder immobilisierter Antikörper) in üblicher Weise durchgeführt werden. Das mit Enzym markierte Reagenz kann durch Binden des Enzyms an ein Antigen oder einen Antikörper durch kovalente oder nicht-kovalente Bindung hergestellt werden. Verfahren zur Bindung durch kovalente Bindung beinhalten ein Glutaraldehyd-Verfahren, ein Perdjodsäure-Verfahren, ein Maleinimid-Verfahren, ein Pyridyl-Disulfid-Verfahren sowie ein Verfahren unter Verwendung verschiedener bekannter Vernetzungsagenzien (z. B. ein Maleinimid-Reagens) (siehe Protein, Nucleic Acid and Enzyme, Specialausgabe Nr. 31, Seiten 37-45 (1987)). Ein Binden durch nicht-kovalente Bindung kann durch physikalische Adsorption des Enzyms an einen Antikörper oder ein Antigen erfolgen.
Das Festphasenreagens wird hergestellt, indem ein Antikörper oder ein Antigen an einen festen Träger, der üblicherweise bei verschiedenen EIA-Techniken verwendet wird, gebunden wird. Verwendbare feste Träger umfassen ein Kunststofftestrohr, eine Kunststoff-Mikrotiterplatte, Latexpartikel (z. B. Polystyrol), Glasperlen, Kunststoffperlen, eine Membran aus Cellulose, Nitrocellulose usw., sowie magnetische Partikel. Das Festphasenreagens kann durch Umsetzung mit einem Antigen oder einem Antikörper unter Verwendung der oben beschriebenen Verfahren zur kovalenten oder nicht-kovalenten Bindung hergestellt werden.
Obgleich in der obigen Beschreibung über EIA ein Antikörper oder ein Antigen als ein Immunreaktant bezeichnet wurde, der mit einem Enzym gekennzeichnet wird oder an einem festen Träger immobilisiert wird, soll die Terminologie "Antikörper" oder "Antigen", wie sie her verwendet wird, Substanzen, die zu einer Antigen-Antikörper-Reaktion unter Bildung eines Immunkomplexes fähig sind, wie z. B. ein polyklonaler Antikörper, ein monoklonaler Antikörper, Fragmente dieser Antikörper (z. B. Fab, Fab', F(ab')2) und ein Hapten umfassen.
EIA, der das oben genannten Festphasenreagens und das mit Enzym markierte Reagens verwendet, kann durchgeführt werden, indem eine Antigen-Antikörper-Reaktion gemäß einem nicht­ kompetitiven Bindungsassay, Sandwich-Technik genannt (einschließlich Einschritt-Technik, verzögerte Einschritt-Technik und Zweischritt-Technik), einem kompetitiven Bindungsassay, usw. oder einer Kombination derselben verursacht wird und die Aktivität entweder des Enzyms in gebundener Form oder des Enzyms in freier Form bestimmt wird.
Der EIA, der das erfindungsgemäße Farbe entwickelnde Verfahren ausnützt, ist auf die Immunochromatographie anwendbar, welche z. B. eine Membran als Festphase verwendet. In diesem Fall kann die Zeit für die Farbe entwickelnde Reaktion zwischen dem Enzym, das an eine Nachweisstelle gebunden ist, und dem Indolyl-Derivat der Formel (I) verkürzt werden, so daß die zu untersuchende Substanz in kurzer Zeit auch in kleiner Menge bestimmt werden kann. Die Verbindung mit freiem Radikal oder die Chelatverbindung können der Membran oder einer Entwicklerlösung zugesetzt werden. Da das Indolyl-Derivat der Formel (I), das als Substrat verwendet wird, einen wasserunlöslichen Indigo-Farbstoff als Resultat der enzymatischen Reaktion liefert, wird das Farbe entwickelnde Verfahren in geeigneter Weise unter Verwendung einer Membran auf Immunochromatographie und Immunoblotting angewendet. Eine Messung des Farbstoffs, der auf diese Weise nach einer vorgeschriebenen Reaktionszeit produziert wird, kann durch Vergleich mit einer Standardfarbskala mit bloßem Auge oder für mehr Genauigkeit durch Geräte wie z. B. ein Gerät zur Messung der Farbdifferenz, ein Kolorimeter, ein Absorptionsspektrometer und dgl. durchgeführt werden.
Insbesondere bei der Immunochromatographie unter Verwendung einer Membran ist der Farbstoff, der durch Reaktion zwischen dem Enzym und dem Indolyl-Derivat der Formel (I) produziert wird, vorzugsweise ein wasserlöslicher Indigo-Farbstoff.
Substanzen, die durch EIA gemäß der vorliegenden Erfindung analysiert werden können, umfassen Substanzen, die im lebenden Körper vorhanden sind, Arzneimittel, und dgl. Beispiele für die Substanzen umfassen Arzneimittel wie z. B. Theophyllin, Phenytoin und Valprosäure; niedermolekulare Hormone wie z. B. Thyroxin, Östrogen und Östradiol; Tumormarker wie z. B. carcinoembryonales Antigen (CEA), α-Fetoproteine (AFP) und Hämoglobin in den Fäces (FOBT: Fecal Occult Blood Test); Viren wie z. B. humaner Immundefizienzvirus (HIV), humaner T-Zellen-Leukämievirus (HTLV), Hepatitis B-Virus (HVB) und Hepatitis C-Virus (HCV); Protozoon wie z. B. Treponema pallidum; hochmolekulare Hormone wie z. B. die Schilddrüse-stimulierendes Hormon (TSH) und Indulin; Zytokine wie z. B. IL-1, IL-2 und IL-6;
Wachstumsfaktoren wie z. B. epidermaler Wachstumsfaktor (EGF) und von Blutplättchen stammender Wachstumsfaktor (PDGF); und DNA, RNA, usw. der oben beschriebenen Viren; mit Entzündungen in Verbindung stehende Proteine wie z. B. C-reaktives Protein (CRP); sowie Antikörper gegen diese Antigene. Proben, die untersucht werden sollen, umfassen Körperflüssigkeiten wie z. B. Vollblut, Serum, Plasma, Urin und Lymphflüssigkeit sowie Fäzesextrakt.
Die vorliegende Erfindung wird nun anhand von Referenzbeispielen und Beispielen detaillierter erläutert.
REFERENZBEISPIEL 1 Herstellung von mit alkalischer Phosphatase markiertem TP17 Antigen
Zu 0,12 mg rekombinantem TP17 Antigen wurden 100 nmol 2-Iminothioran gegeben. Das System wurde für 30 min bei 30°C stehen gelassen, um eine Thiol-Gruppe in das Antigen einzuführen. Zu 3 mg alkalischer Phosphatase wurden 300 nmol N-Succinimidyl-4-maleinimidbutyrat (GMBS, hergestellt von Dojindo Laboratories) gegeben, worauf 60 min bei 30°C stehen gelassen wurde, um eine Maleinimid-Gruppe in das Enzym einzuführen. Danach wurden 100 µg des Thiol-haltigen TP17 Antigens und 2,5 mg der Maleinimid-haltigen alkalischen Phosphatase zur Verursachung einer Kupplungsreaktion bei 4°C für einen Tag vermischt. Das Reaktionsprodukt wurde durch Gelfiltration gereinigt und die Fraktion, die die Aktivität des markierten Enzyms aufwies, wurde unter Erhalt eines mit alkalischer Phosphatase markierten rekombinanten TP17 Antigens (im nachfolgenden als mit alkalischer Phosphatase markiertes TB17 Antigen bezeichnet) gesammelt.
Eine Bestätigung der Aktivität des mit alkalischer Phosphatase markierten TP17 Antigens wurde wie folgt durchgeführt. Eine 5 mm breite und 30 mm lange Nitrocellulose-Membran (hergestellt von Millipore Corp.) wurde 15 mm unter dem oberen Ende mit 3 µl rekombinanten TP17 Antigen betüpfelt und für 30 min bei 37°C getrocknet, wobei ein Teststreifen hergestellt wurde. Filterpapier mit einer Breite von 10 mm, einer Länge von 15 mm und einer Dicke von 1 mm (Whatman WF 1,5, hergestellt von Whatman Ltd.) wurde am oberen Ende des Teststreifens mit 5 mm Überlappung befestigt. Ein 25 µl-Aliquot jeder Fraktion, die durch Gelfiltration erhalten worden war, und 25 µl TP-Antikörper positives Serum wurden in einem Teströhrchen miteinander vermischt; dann wurde das untere Ende des mit TP17 Antigen betüpfelten Teststreifens für 5 min in das Gemisch getaucht. Der Teststreifen wurde dann in ein Teströhrchen, das 250 µl einer 0,05%igen Lösung von 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphorsäure (im nachfolgenden als BCIP abgekürzt, erhältlich von Boehringer Mannheim Biochemica) enthielt, übergeführt und 10 min stehen gelassen. Wo die Fraktion das mit alkalischer Phosphatase markierte TP17 Antigen enthielt, entwickelte der mit Antigen betüpfelte Bereich eine blaue Farbe.
BEISPIEL 1 Herstellung eines Teststreifens zur Bestimmung von Anti-TP17-Antikörper gegen TP-Antigen
Rekombinantes TP17-Antigen wurde in einer Reihe 15 mm unter dem oberen Ende auf eine 5 mm breite und 50 mm lange Nitrocellulose-Membran (hergestellt von Millipore Corp.) mit Hilfe eines Applikators (Shot Master, hergestellt von Musashi Engineering Co., Ltd.) aufgetüpfelt und zur Fixierung des Antigens (Nachweisbereich) getrocknet. Filterpapier mit einer Breite von 10 mm und einer Länge von 20 mm (WF Wine Filter 1,5, hergestellt von Whatman Ltd.) wurde als Absorptions-Pad am oberen Ende der Membran mit einer Überlappung von 5 mm befestigt. Eine PVA-Folie ("BELL-ETA", hergestellt von Kanebo, Ltd.), die auf eine Breite von 5 mm und einer Länge von 5 mm geschnitten war, wurde mit 20 µl der Lösung von mit alkalischer Phosphatase markiertem TP17-Antigen, die in Referenzbeispiel 1 hergestellt worden war, betüpfelt und getrocknet; die resultierende Folie (Pad mit markierter Substanz) wurde auf die Membran gelegt, und zwar 25 mm unter dem oberen Ende der Membran. Diese Folie dient als Bereich, auf den eine Probe aufgetüpfelt wird.
Filterpapier mit einer Breite von 5 mm und einer Länge von 20 mm (AP25, hergestellt von Millipore Corp.) wurde mit 10 mm Überlappung an dem unteren Ende der Nitrocellulose-Membran befestigt, wobei ein Substrat-Pad zum Auftüpfeln und Entwickeln einer Substratlösung bereitgestellt wurde. Das Substrat-Pad wurde mit 5 µl einer 20 mg/ml BCIP-Lösung betüpfelt. Das Substrat-Pad wurde ferner mit 10 µl 50 mM EDTA-Cu, 5 µl 100 mM EDTA-Fe, 10 µl 50 mM EDTA-Co oder 10 µl 50 mM EDTA-Nd betüpfelt. Auf diese Weise wurde ein Teststreifen zur Bestimmung eines Antikörpers gegen TP 17-Antigen hergestellt.
Zur Kontrolle wurde ein Teststreifen hergestellt, der keine Chelat-Verbindung in seinem Substrat-Pad enthielt.
BEISPIEL 2 Bestimmung von Antikörpern auf TP17-Antigen
Das Pad mit markierter Substanz des Teststreifens, der in Beispiel 1 hergestellt worden war, wurde mit 15 µl einer auf Antikörper gegen TP Antigen positiven Probe (TPPA-Titer: 20, 40 oder 80) betüpfelt, dann wurden 200 µl 100 mM CHES-Puffer (pH 10,5, enthielt 1 mM Magnesiumchlorid) auf das Substrat-Pad getüpfelt, absorbiert und unter Beginn der Reaktion ausgebreitet. Die Zeit bis zur Feststellung einer positiven Reaktion mit dem bloßen Auge wurde aufgezeichnet. Die erhaltenen Resultate sind in Tabelle 1 angegeben.
TABELLE 1
Durchschnittliche Nachweiszeit (s)
REFERENZBEISPIEL 2 Herstellung eines mit alkalischer Phosphatase markierten Antikörpers
In 4 ml Phosphatpuffer (50 mM, pH 4,7) wurden 30 mg Antikörper gegen Hasen-IgG aufgelöst; dann wurde eine Lösung von 30 mg pro ml p-Chinon in Ethylalkohol zugesetzt und das Gemisch 2 h lang in einem dunklen Raum bei Raumtemperatur reagieren gelassen. Nach der Reaktion wurde der Puffer der Reaktionslösung mit PD-10 (hergestellt von Pharmacia), das mit 150 mM Natriumchlorid äquilibriert war, versetzt. Zu der resultierenden Lösung des IgG/p-Chinon-Adduktes wurden 30 mg alkalische Phosphatase (erhältlich von Oriental; 2500 IU/mg) gegeben, das System wurde 18 h lang in einem Kühlschrank (4 bis 10°C) reagieren gelassen. Nach Beendigung der Reaktion wurde das Produkt mit Superdex-100 (hergestellt von Pharmazia) unter Erhalt eines mit alkalischer Phosphatase markierten Antikörpers gereinigt.
BEISPIEL 3 Messung der Farbentwicklungszeit in Gegenwart einer Chelat­ verbindung oder einer Verbindung mit freiem Radikal
Der mit alkalischer Phosphatase markierte Antikörper (IgG-ALP), der in Referenzbeispiel 2 hergestellt worden war, wurde mit Tris-HCl-Puffer (100 mM, pH 7,5; enthaltend 0,1 mM Zinkchlorid) auf 50 ng/ml, 100 ng/ml oder 150 ng/ml verdünnt.
Eine 5 mm breite und 20 mm lange Nitrocellulose-Membran (hergestellt von Millipore Corp.) wurde in einer Linie 15 mm unter dem oberen Ende mit jeder der Lösungen des markierten Antikörpers unter Zuhilfenahme eines Applikators (Shot Master, hergestellt von Usashi Engineering Co., Ltd.) betüpfelt und zur Absorption und Fixierung des markierten Antikörpers getrocknet. Ein Absorptions-Pad und ein Substrat-Pad wurden in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 jeweils am oberen und unteren Ende jeder Membran befestigt, wobei drei Membranen mit unterschiedlicher Konzentration des markierter Antikörpers hergestellt wurden.
Das Substrat-Pad jeder Membran wurde mit 5 µl einer 20 mg/ml BCIP-Lösung und dann mit 5 µl 100 mM EDTA-Cu, 50 mM EDTA-Fe, 100 mM EDTA-Zn oder 100 mM-N-Oxyl-4-oxo-2,2,6,6- tetramethylpiperidin (AAQ-2, hergestellt von Dojindo Laboratories) betüpfelt und unter Herstellung eines Teststreifens 10 min bei 37°C getrocknet. Das Substrat wurde verteilt, indem 200 µl CHES-Puffer (100 mM, pH 10,5; enthielt 1 mM Magnesiumchlorid) auf das Substrat-Pad getropft wurden; die Zeit, die zur Bestätigung einer Farbentwicklung mit dem bloßen Auge erforderlich war, wurde aufgezeichnet. Zur Kontrolle wurde derselbe Test unter Verwendung eines Teststreifens, der weder eine Chelat-Verbindung noch eine Verbindung mit freiem Radikal im Substrat-Pad enthielt, durchgeführt. Die erhaltenen Resultate sind in Tabelle unten angegeben.
TABELLE 2
Durchschnittliche Nachweiszeit (s)
BEISPIEL 4 Messung der Farbentwicklungszeit bei zugesetztem EDTA-Fe
In der gleichen Weise wie in Beispiel 3 wurden fünf Teststreifen hergestellt, auf die 150 ng/ml mit alkalischer Phosphatase markierter Antikörper aufgetragen war. Der Substrat-Pad aller Teststreifen wurde mit einer Lösung von 20 mg/ml BCIP betüpfelt. Der Substrat-Pad der fünf Teststreifen wurde außerdem mit 2 µl oder 5 µl 10 mM EDTA-Fe oder 1 µl, 2 µl oder 5 µl 100 mM EDTA-Fe betüpfelt und 10 min lang bei 37°C getrocknet. Auf das Substrat-Pad wurden zur Entwicklung des Substrats 200 µl 100 mM CHES-Puffer (pH 10,5; enthielt 1 mM Magnesiumchlorid) getropft. Die Zeit, die zur Feststellung einer Farbentwicklung mit dem bloßen Auge erforderlich war, wurde aufgezeichnet. Die erhaltenen Resultate sind in Tabelle 3 angegeben.
TABELLE 3
Nachweiszeit (s)
BEISPIEL 5 Herstellung eines Teststreifens zur Bestimmung von HBs-Antigen
Ein Antikörper auf das HBs-Antigen (2,86 µg), der mit einem Phosphatpuffer versetzt war, wurden in einem Punkt auf eine 5 mm breite und 50 mm lange Nitrocellulose-Membran (Hi-Flow Membrane, hergestellt von Millipore Corp.) 15 mm unter dem oberen Ende aufgetragen und getrocknet. Ein Pad für die markierte Substanz und ein Substrat-Pad wurden mit 0,16 µg eines mit alkalischer Phosphatase markierten Antikörpers auf HBs-Antigen (hergestellt von Scantibodies; durchschnittliches Molekulargewicht 350 000), der mit Phosphatpuffer versetzt war, bzw. 0,125 mg BCIP (hergestellt von Boehringer Mannheim Biochemica) betüpfelt und anschließend getrocknet. Als Entwicklerlösung wurden eine 100 mM CHES-Puffer (pH 10,5; enthaltend 1 mM Magnesiumchlorid), den 500 mM AAQ-2 (hergestellt von Dojindo Laroratories) zu einer Endkonzentration von 5 mM zugesetzt waren, verwendet. Die Membran, das Substrat-Pad, das Pad für die markierte Substanz und ein Absorption-Pad wurden in einem Kunststoffgehäuse angeordnet, das einen Topf für die Entwicklerlösung, ein Fenster zum Zutropfen einer Probe und ein Fenster zur Detektion enthielt, um so einen Teststreifen zu Bestimmung von HBs-Antigen herzustellen.
Zur Kontrolle wurde ein Teststreifen in der gleichen Weise hergestellt, außer daß ein 100 mM CHES-Puffer (pH 10,5; enthaltend 1 mM Magnesiumchlorid), der kein AAQ-2 enthielt, als Entwicklerlösung verwendet wurde.
BEISPIEL 6 Bestimmung von HBs-Antigen
HBs-Antigen wurde unter Verwendung der in Beispiel 5 hergestellten Teststreifen bestimmt. Eine Serum-Probe (25 µl), die ein HBs-Antigen in unterschiedlichen Konzentrationen (18,5 U/ml, 8,5 U/ml, 4,2 U/ml, 2,2 U/ml oder 1,1 U/ml) enthielt, wurde auf die Proben auf Tüpfelzone getropft. Unmittelbar danach wurde der Topf der Entwicklerlösung zur Verteilung der Entwicklerlösung durch die Membran gedrückt; dann wurde die Zeit bis zum Nachweis einer positiven Reaktion gemessen. Für jede Probe wurde drei Messungen unter Erhalt einer Durchschnittszeit für den Nachweis durchgeführt. Die erhaltenen Resultate sind in Tabelle 4 aufgeführt.
BEISPIEL 7 Herstellung eines Teststreifens zur Bestimmung von Antikörper gegen HBs-Antigen
Eine 5 mm breite und 50 mm lange Cellulose-Membran (hergestellt von Millipore Corp.) wurde 15 mm unter dem oberen Ende mit 0,7 µg HBs-Antigen (hergestellt von Meiji Milk Products Co., Ltd.), das mit einem Phosphatpuffer versetzt war, betüpfelt und getrocknet. HBs-Antigen und alkalische Phosphatase wurden nach dem Maleinimid-Hinge-Verfahren (siehe Ishikawa Eiji, Koso Hyoshikiho, Seite 1, Gakkai Shuppan Center) aneinander gebunden, wobei ein mit alkalischer Phosphatase markiertes HBs-Antigen erhalten wurde (durchschnittliches Molekulargewicht etwa 3 000 000). Das markierte Antigen wurde mit einem Phosphatpuffer versetzt und 0,025 µg wurden auf ein Pad für markierte Substanz getüpfelt und getrocknet. Das Substrat-Pad wurde mit 0,1 mg BCIP betüpfelt und getrocknet. Good's Puffer wurde als Entwicklerlösung, der 500 mM AAQ-2 (hergestellt von Dojindo Laboratories) zu einer Endkonzentration von 5 mM zugesetzt waren, verwendet. Die Membran, das Substrat-Pad, das Pad für die markierte Substanz und ein Absorptions-Pad wurden in dasselbe Gehäuse, wie es in Beispiel 5 verwendet wurde, gegeben, wobei ein Teststreifen zur Bestimmung eines Antikörpers gegen HBs-Antigen hergestellt wurde.
Zur Kontrolle wurde ein Teststreifen in der gleichen Weise wie oben beschrieben, außer daß ein AAQ-2-freier 100 mM CHES-Puffer (pH 10,5; enthielt 1 mM Magnesiumchlorid) als Entwicklerlösung verwendet wurde, hergestellt.
BEISPIEL 8 Bestimmung von Antikörper gegen HBs-Antigen
Es wurden die in Beispiel 7 hergestellten Teststreifen verwendet. Eine Serumprobe (25 µl), die einen Antikörper gegen HBs-Antigen in unterschiedlichen Konzentrationen (30 mU/ml, 19,0 mU/ml, 9,6 mU/ml, 5,0 mU/ml, 2,5 mU/ml oder 1,2 mU/ml) enthielt, wurde auf den Proben-Tüpfelbereich getropft. Unmittelbar danach wurde der Topf der Entwickler-Lösung gedrückt, um die Entwickler-Lösung durch die Membran auszubreiten, und es wurde die Zeit bis zum Nachweis einer positiven Reaktion gemessen. Für jede Probe wurden drei Messungen durchgeführt, wobei eine Durchschnittszeit für die Detektion erhalten wurde. Die erhaltenen Resultate sind in Tabelle 5 aufgeführt.
BEISPIEL 9 Messung der Farbintensität bei verschiedenen AAQ-2-Konzentrationen
Eine 5 mm breite und 50 mm lange Nitrocellulose-Membran (hergestellt von Milipore Corp.) wurde 15 mm unter dem oberen Ende mit 80 ng eines mit alkalischer Phosphatase markierten Antikörpers (durchschnittliches Molekulargewicht 300 000) betüpfelt und getrocknet. Als Entwicklerlösung wurden ein 100 mM CHES-NaOH-Puffer (enthielt 0,1 mM Magnesiumchlorid), der AAQ-2 in verschiedenen Konzentrationen (1,25 mM, 2,5 mM, 5 mM, 10 mM oder 20 mM) enthielt, verwendet. Ein Substrat-Pad wurde mit 0,1 mg BCIP betüpfelt und getrocknet. Der Entwicklertopf wurde gedrückt, um die Entwicklerlösung zu verteilen. Nach einer Reaktionszeit von 15 min wurde die Intensität der Farbe, die sich am Punkt des mit Enzym markierten Antikörpers entwickelt hatte, mit einem Farbdifferenzmeßgerät (hergestellt von Minolta) gemessen. Zum Vergleich wurde derselbe Test unter Verwendung einer AAQ-2- freien Entwickler-Lösung durchgeführt. Die erhaltenen Resultate sind in Tabelle 1 aufgeführt.
Die Indigo-Farbstoff bildende Reaktion eines Indolyl-Derivats mit einem Enzym kann durch das Vorliegen einer Verbindung mit freiem Radikal und/oder einer Chelat-Verbindung beschleunigt werden; dadurch kann die zur Detektion erforderliche Zeit reduziert werden. So erzielt ein EIA, der das Farbentwicklungssystem der vorliegenden Erfindung verwendet, eine Verkürzung der Analysenzeit und macht es auch möglich, eine Spurensubstanz mit hoher Empfindlichkeit nachzuweisen. Obgleich die Erfindung detailliert und anhand spezifischer Ausführungsformen beschrieben wurde, wird es dem Fachmann auf diesem Gebiet klar sein, daß verschiedene Veränderungen und Modifikationen durchgeführt werden können, ohne den Geist und Schutzumfang der Erfindung zu verlassen.

Claims (11)

1. Farbe entwickelndes Verfahren, umfassend Umsetzen eines Indolyl-Derivats, das durch die Formel (I) dargestellt wird:
worin R1 eine enzymatisch ablösbare Gruppe darstellt;
und R2 und R3 ein Wasserstoffatom oder ein Halogenatom darstellen;
und eines Enzyms, wobei das Umsetzen in Gegenwart einer Verbindung mit freiem Radikal, die durch die Formel (II) dargestellt wird:
worin A eine substituierte oder unsubstituierte Methylenkette mit 2 oder 3 Kohlenstoffatomen, die in ihrer Kette ein Sauerstoffatom oder eine Carbonyl-Gruppe enthalten kann, darstellt; und R4, R5, R6 und R7 jeweils ein Wasserstoffatom oder eine Alkyl-Gruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen darstellen;
und/oder einer Chelat-Verbindung, die zwischen einem Diamin-Derivat, das durch die Formel (III) dargestellt wird:
worin R8 eine Ethylen-Gruppe oder eine Cyclohexan-1,2-diyl-Gruppe darstellt;
und einem Metall, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Eisen, Kupfer, Zink, Kobalt, Indium, Neodym, Mangan und Europium, gebildet wird, durchgeführt wird.
2. Farbe entwickelndes Verfahren nach Anspruch 1, wobei R4, R5, R6 und R7 jeweils eine Alkyl-Gruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen darstellen.
3. Farbe entwickelndes Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Substituent an der substituierten Methylenkette mit 2 oder 3 Kohlenstoffatomen aus der Gruppe, bestehend aus einer Hydroxyl-Gruppe, einer Carboxyl-Gruppe, einer Carbamoyl-Gruppe und einer Amino-Gruppe, ausgewählt wird.
4. Farbe entwickelndes Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Diamin-Derivat Ethylendiamintetraessigsäure oder trans- 1,2-Diamincyclohexan-N,N,N',N'-tetraessigsäure ist.
5. Farbe entwickelndes Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Enzym Phosphotase ist, und R1 eine -PO3 2-.2M⁺-Gruppe ist, in der M ein Wasserstoffatom, ein Alkalimetall oder Toluidin ist.
6. Farbe entwickelndes Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Enzym β-D-Galactosidase ist und R1 eine β-D-Galactopyranosyl-Gruppe ist.
7. Farbe entwickelndes Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Enzym β-D-Glucosidase ist, und R1 eine β-D-Glucopyranosyl-Gruppe ist.
8. Enzym-Immunoassay umfassend Messen der Enzymaktivität eines mit Enzym markierten Antikörpers oder Antigens durch Verwendung der Reaktion eines Indolyl-Derivats, das durch die Formel (I) dargestellt wird:
worin R1 eine enzymatisch ablösbare Gruppe darstellt;
und R2 und R3 jeweils ein Wasserstoffatom oder ein Halogenatom darstellen;
mit einem Enzym, wobei die Reaktion in Gegenwart einer Verbindung mit freiem Radikal, die durch die Formel (II) dargestellt wird:
worin A eine substituierte oder unsubstituierte Methylenkette mit 2 oder 3 Kohlenstoffatomen, die in ihrer Kette ein Sauerstoffatom oder eine Carbonyl-Gruppe enthalten kann, darstellt; und R4, R5, R6 und R7 jeweils ein Wasserstoffatom oder eine Alkyl-Gruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen darstellen;
und/oder einer Chelat-Verbindung, die zwischen einem Diamin-Derivat, das durch die Formel (III) dargestellt wird:
worin R8 eine Ethylen-Gruppe oder eine Cyclohexan-1,2-diyl-Gruppe darstellt;
und einem Metall, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Eisen, Kupfer, Zink, Kobalt, Indium, Neodym, Mangan und Europium, gebildet wird, durchgeführt wird.
9. Enzym-Immunoassay nach Anspruch 8, in dem das Enzym an einer festen Phase in Form eines Immunkomplexes immobilisiert ist.
10. Immunochromatographie, umfassend Messen der Enzymaktivität eines mit Enzym markierten Antikörpers oder Antigens, das an einen Nachweisteil an einer festen Phase gebunden ist, durch Verwendung der Reaktion eines Indolyl-Derivats, das durch die Formel (I) dargestellt wird:
worin R1 eine enzymatisch ablösbare Gruppe darstellt;
und R2 und R3 ein Wasserstoffatom oder ein Halogenatom darstellen;
mit einem Enzym, wobei die Reaktion in Gegenwart einer freien Radikalverbindung, die durch die Formel (II) dargestellt wird:
worin A eine substituierte oder unsubstituierte Methylenkette mit 2 oder 3 Kohlenstoffatomen, die in ihrer Kette ein Sauerstoffatom oder eine Carbonyl-Gruppe enthalten kann, darstellt; und
R4, R5, R6 und R7 jeweils ein Wasserstoffatom oder eine Alkyl-Gruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen darstellen;
und/oder einer Chelat-Verbindung, die zwischen einem Diamin-Derivat, das durch die Formel (III) dargestellt wird:
worin R8 eine Ethylen-Gruppe oder eine Cyclohexan-1,2-diyl-Gruppe darstellt;
und einem Metall, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Eisen, Kupfer, Zink, Kobalt, Indium, Neodym, Mangan und Europium, gebildet wird, durchgeführt wird.
11. Immunochromatographie nach Anspruch 10, wobei die feste Phase eine Membran ist.
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