DE3722271A1 - Hochempfindlicher nachweis von antikoerpern, die eine aids-exposition anzeigen - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft den Nachweis bzw. die Bestimmung von Antikörpern gegen verschiedene Viren, die bekannt dafür sind, daß sie das erworbene Immunschwächesyndrom (AIDS) hervorrufen. Die Erfindung betrifft insbesondere die Analyse von Körperflüssigkeiten zur Bestimmung dieser Antikörper als Anzeichen für eine AIDS-Exposition.

Zu Beispielen für bekannte AIDS-assoziierte Viren gehören Human-T-Zellen-Leukemia-Virus-III (HTLV-III), Lymphadeno­ pathy Associated Virus (LAV) und Acquired Immune Deficiency Syndrome Related Virus (ARV). Tests zur Bestimmung der Anwesenheit von Antikörpern gegen diese Viren wurden bereits entwickelt als Ergebnis seroepidemiologischer Untersuchungen, die anzeigen, daß dort, wo nachweisbare Gehalte dieser Anti­ körper vorliegen, auch das Infektions-Virus vorhanden sein kann. In jedem Falle wird die Anwesenheit der Antikörper als Anzeichen für eine vorhergehende Exposition oder Infek­ tion mit dem Virus angesehen und sie lassen vermuten, daß das Virus oder das Virusgenom weiterhin vorhanden sind.

Die üblicherweise angewendeten Assays zum Nachweis des Antikörpers leiden daran, daß hohe Prozentsätze an falsch­ positiven und falsch-negativen Ergebnissen auftreten, darüber hinaus sind sie umständlich und zeitraubend. Es ist daher ein Assay mit einer verbesserten Zuverlässigkeit und Empfindlichkeit erforderlich sowie ein solcher, der innerhalb eines kürzeren Zeitraums beendet werden kann.

Bei den erfindungsgemäßen Assays handelt es sich um solche, die durchgeführt werden durch Kontaktieren einer Körper­ flüssigkeitsprobe (vorzugsweise einer Serum- oder Plasma­ probe) mit Antigenen eines AIDS-Virus, um AIDS-Antikörper in der Flüssigkeit hervorzurufen, die sich mit den Anti­ genen assoziieren und immunologische Komplexe bilden.

Jeder Komplex wird dann mit einem Signalerzeugungssystem assoziiert und der Signalpegel aus den assoziierten Syste­ men wird gemessen als Hinweis auf die Anwesenheit der Antikörper in der Probe. Das Virus wird im allgemeinen lysiert und elektrophoretisch in Fraktionen aufgetrennt, bevor der Assay durchgeführt wird.

Erfindungsgemäß wurde ein Assay-Kit entwickelt, das brauch­ bar ist für die Durchführung mehrerer Assays. Das Kit ent­ hält eine Reihe von Festphasen-Trägern, an denen vor dem Verpacken Virus-Antigene adsorbiert worden sind. Die adsor­ bierten Antigene sind vorzugsweise Western-Blots von Elektro­ pherogrammen des lysierten Virus. Das Kit enthält ferner eine Lösung eines Konjugats, das gebildet wird durch Asso­ ziieren eines Anti-Human-Ig-Antikörpers mit einem Signal­ erzeugungssystem. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Sig­ nalerzeugungssystem um ein Zwei-Komponenten-System, wie z.B. ein solches aus einem Enzym und einem Substrat, wo­ bei das Enzym die erste Komponente und das Substrat die zweite Komponente des Konjugats bilden, in einer getrennten Lösung. Die Western-Blots können zweckmäßig hergestellt werden als eine Reihe von identischen Streifen, die aus einem einzigen rechteckigen Blot in Richtung senkrecht zu den Banden herausgeschnitten werden. Das bei dieser Herstellung verwendete Blot kann das Ergebnis der Übertra­ gung von einem einzelnen Elektropherogramm mit einer läng­ lichen Transversaldimension sein und somit aus einer Reihe von langen parallelen Banden bestehen. Bevorzugte Kits enthalten auch Vergleichsmuster oder Reproduktionen davon, wie z.B. Photographien. Diese Muster sind die gleichen Träger mit identischen Antigen-Adsorptionsmustern nach der Inkubation mit bekannten positiven und negativen Proben und einer geeigneten Entwicklung mit dem gleichen Signaler­ zeugungssystem. Diese ermöglichen es dem Verwender des Kits, die vom Verwender untersuchten Testproben mit bereits untersuchten bekannten Proben zu vergleichen und dadurch eine einheitliche Interpretation der Testergebnisse zu erzielen.

Gemäß einem anderen Aspekt betrifft die vorliegende Er­ findung ein Signalerzeugungssystem, das eine Kombination von alkalischer Phosphatase und einem Substrat umfaßt, das aus Nitroblue-Tetrazoliumchlorid und 5-Bromo-4-chloro­ 3-indolylphosphat (NBT/BCIP) besteht, das ungewöhnlich empfindlich ist, wenn es in Konjuktion mit einem Western- Blot in einem AIDS-Antikörper-Assay verwendet wird. Bei bevorzugten Ausführungsformen ist die alkalische Phospha­ tase konjugiert mit Ziegen- oder Kaninchen-Anti-Human-Ig, das sich an den Antikörper binden kann, dessen Anwesenheit nachgewiesen werden soll. Der Assay kann durchgeführt wer­ den durch Herstellung eines Western-Blot eines Elektrophero­ gramms des lysierten Virus, wobei der Hintergrund durch Milchproteine und ein Detergens blockiert ist. Das Blot wird dann zuerst mit einer Probe der Testflüssigkeit (vorzugs­ weise erum) und dann mit einer Lösung des Konjugats und schließlich mit einer Lösung des NBT/BCIP-Substrats inku­ biert.

Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Er­ findung eine Mehrfachbehälter-Schale für die Aufnahme der vorstehend beschriebenen Western-Blot-Streifen, jeweils einen in jedem Behälter, der vollständig in die Assay­ flüssigkeiten eingetaucht ist. Jeder Behälter weist Merkmale auf, die die vollständige Entfernung der Flüssigkeiten durch Absaugen erlauben, ohne daß ein Kontakt zwischen den Strei­ fen und irgendwelchen von außen zugeführten (und potentiell kontaminierenden) Materialien auftritt. Bei bevorzugten Ausführungsformen ist die Schale ferner mit einer entfern­ baren Auskleidung ausgestattet, die eng auf die Schale paßt und Vorsprünge aufweist, die sich in jeden der Behäl­ ter erstrecken. Der Zweck der Auskleidung besteht darin, einen Streifen in jedem Behälter für Versandzwecke fest­ zuhalten. Die Auskleidung wird vor Durchführung der Assays aus der Schale entfernt. Während des Assays wird in den Inkubationsstufen des Verfahrens ein festsitzender Deckel verwendet, der keine Vorsprünge aufweist, die sich in die Behälter hinein erstrecken.

Die Erfindung wird nachstehend unter Bezugnahme auf die beiliegenden Zeichnungen näher erläutert. Es zeigen:

Fig. 1 eine perspektivische Ansicht einer Multibehälter- Schale, die bestimmt ist für die gleichzeitige Durchführung einer Reihe von Assays gemäß der vorliegenden Erfindung;

Fig. 2 eine perspektivische Ansicht einer Versand-Aus­ kleidung für die Schale gemäß Fig. 1; und

Fig. 3 eine perspektivische Ansicht eines Deckels für die Schale gemäß Fig. 1 für die Verwendung während der Durchführung eines Assays.

AIDS-Viren, die geeignet sind zur Herstellung der erfin­ dungsgemäß verwendeten Assay-Materialien sind aus den verschiedensten Quellen allgemein erhältlich. Man kann HTLV-III beispielsweise von der Firma Organon Teknika Gorporation, Bionetics Laboratory Products Div., Charleston, South Carolina/USA; von der Firma Prototech Incorporated, St. Paul, Minnesota/USA; oder Ortho Pharma­ ceutical Corporation, Raritan, New Jersey/USA, erhalten. Alternativ kann man LAV von der Firma Genetic Systems, Seattle, Washington/USA, erhalten.

Man kann ferner auch ein anderes Isolat aus einem AIDS- Patienten verwenden, das so modifiziert worden ist, daß es in der Gewebekultur überlebt und gebildet wird. Vorzugs­ weise wird der Virus in lysierter Form verwendet. Dies kann nach konventionellen Verfahren erzielt werden, beispiels­ weise durch Verwendung von SDS in einer Pufferlösung.

Der Festphasen-Träger kann irgendein inertes Festpha­ sen-Material sein, das die Virus-Proteine immobilisieren kann. Bevorzugte Träger sind saugfähige Membranen, wie z.B. solche aus Nitrocellulose, Aminobenzyloxymethyl (ABM)-Papier, 2-Aminophenylthioäther (APT)-Papier, Nylon, durch elektrostatische Aufladung modifiziertem Nylon, Diazobenzyloxymethyl (DBM)-Papier, 2-Diazophenylthioäther (DPT)-Papier und Diethylaminoethyl (DEAE)-Cellulose. Nitrocellulose ist besonders bevorzugt.

Die Virus-Proteine werden aufgetrennt in diskrete Berei­ che oder Banden, die in einem vorher festgelegten Muster räumlich angeordnet sind zur Immobilisierung auf dem Träger. Die Trennung wird zweckmäßig erzielt durch elektrophoreti­ sche Fraktionierung der Proteine in einem Plattengel, wie z.B. Agarose oder Polyacrylamid, wobei Polyacrylamid be­ vorzugt ist. Die räumliche Anordnung entspricht somit der­ jenigen des resultierenden Elektropherogramms. Die Immobili­ sierung der Banden auf dem Träger kann erzielt werden durch direkte Übertragung von dem Gel. Diese kann erzielt werden durch Diffusionsübertragung (Southern-Blotting) oder durch elektrophoretische Übertragung (Western-Blotting). Letztere ist bevorzugt. Die Immobilisierung wird erzielt durch Oberflächenadsorption beim Kontakt, vorzugsweise ohne Vermittlung eines bindenden Agens.

Um die Einheitlichkeit von einem Test zum nächsten zu ver­ bessern und das Auftreten von falsch-positiven Testergeb­ nissen minimal zu halten, ist es bevorzugt, daß etwa gleiche Konzentrationen jedes Virus-Proteins in jedem einzelnen Blot vorliegen. Es ist selten, daß die Viren selbst solche Konzentrationsgehalte ergeben und es ist daher zweckmäßig, daß bestimmte Banden während des Banden­ trennverfahrens verkleinert oder vergrößert werden. Dies kann erzielt werden durch Anwendung der HPLC- oder Affini­ täts-Chromatographie zum Konzentrieren oder Auslöschen ge­ eigneter Banden. Wenn beispielsweise eine Virusprobe eine überschüssige Menge an p24-Protein enthält, kann die Probe durch eine Lectin-Kolonne geschickt werden, in der alle Proteine mit Ausnahme des p24-Proteins zurückgehalten werden. Die gebundenen Proteine werden dann selektiv eluiert und das p24-Protein wird in einem geeigneten Mengenanteil in die Mischung zurückgeführt. Als ein weiteres Beispiel können Virus-Proben mit einem Mangel an p41-Protein durch reines p41-Protein ergänzt werden, das erhalten wurde durch HPLC aus einem anderen Virus oder einer Proteinquelle in einer ausgewählten Konzentration.

Ein Blockierungsmittel ist im allgemeinen darin enthalten, um eine nicht-spezifische Bindung zu verhindern. Wenn ein­ mal die Immobilisierung der Virus-Proteine erfolgt ist. Milch-Proteine und Detergentien sind besonders wirksame Blockierungsmittel, die im allgemeinen in wäßriger Lösung zusammen mit einem Antischäumungsmittel verwendet werden. Eine typische Milchprotein-Konzentration liegt innerhalb des Bereiches von etwa 1 Gew.-% bis etwa 10 Gew.-%.

In dem erfindungsgemäßen Kit können die verschiedenen Kompo­ nenten, die erforderlich sind zur gleichzeitigen Durchführung mehrerer Assays gemäß der vorstehenden Beschreibung kombi­ niert sein. Zu den Kit-Komponenten gehört eine Reihe von im wesentlichen identischen Streifen aus dem Festphasen- Material, von denen jeder die auf einer Seite desselben und in Abständen entlang seiner Länge immobilisierten Virus- Proteine aufweist. Die Streifen können zweckmäßig aus einer Western-Blot-Membran ausgeschnitten werden, die von einem einzelnen Plattengel übertragen wurde. Die Streifen sind daher identisch in bezug auf die Typen, Mengen und Positionen der Virus-Proteine. Die Streifen werden vorzugs­ weise markiert, um die Seite anzugeben, an welche die Pro­ teine gebunden sind, und um die geeignete Orientierung anzu­ zeigen, wodurch sichergestellt wird, daß alle Banden in der gleichen Reihenfolge vorliegen.

Eine zweite Komponente des Kits ist eine Lösung eines Konju­ gats aus einem Antikörper, der spezifisch ist für die Proben- Antikörper, die an die Virus-Proteine gebunden werden, wobei es sich bei der anderen Komponente des Konjugats um ein geeignetes Enzym, vorzugsweise alkalische Phosphatase, handelt. Der Konjugat-Antikörper ist ein Anti-Human-Immuno­ globulin, wie z.B. Anti-Human-IgG, IgM, IgA oder ein an­ derer Antikörper, der ein Klassen- oder Subklassen-spezifi­ scher Antikörper ist. Anti-Human-IgG ist bevorzugt.

Die verwendete Konjugatmenge ist eine Menge, die im Über­ schuß gegenüber dem erwarteten Bereich der Menge der Proben- Antikörper in jedem Assay vorliegt, so daß alle Proben-Anti­ körper auf dem Träger gebunden werden unter Bildung von Komplexen. Die Konzentration des Konjugats in der Lösung wird ausgewählt auf der Basis der Empfindlichkeit. Im all­ gemeinen wird die niedrigste Konzentration angewendet, die sichtbare Ergebnisse auf einer Standardprobe ergibt. Bei den meisten Anwendungszwecken fällt diese in den Bereich der Verdünnungen von 1 : 500 bis 1 : 3000.

Eine dritte Komponente ist eine Lösung des Substrats, auf die das Enzym einwirkt, vorzugsweise die NBT/BCIP-Kombination in etwa äquimolaren Mengen. Die verwendete Substratmenge ist eine Menge, die ausreicht, um als Folge der Einwirkung des Enzyms eine nachweisbare Änderung hervorzurufen. Für NBT/BCIP liegt diese im allgemeinen innerhalb des Berei­ ches von etwa 1 × 10^-4 bis etwa 10 × 10^-4 Mol/l für jede Komponente. Es kann auch eine Waschlösung, die das Blok­ kierungsmittel enthält, darin enthalten sein. Außerdem sind vollständig entwickelte Vergleichsstreifen, die bekannte positive und bekannte negative Proben darstellen, als Anlei­ tung für den Operator darin enthalten. Diese Streifen können in Form von Photographien in einem Instruktions-Manual vorliegen oder sie können aktuelle Streifen sein. Außerdem sind Behälter darin enthalten für die Aufnahme der einzel­ nen Teststreifen und zum Eintauchen derselben in die Proben, Reagentien und Waschlösungen zum Zweck der Inkubation und des Bewegens bzw. Rührens, während man sie die Flüssigkeit in den verschiedenen Stufen des Assay-Verfahrens ansaugen läßt.

Eine beispielhafte Ausführungsform einer für die praktische Durchführung der Erfindung geeigneten Multibehälter-Schale 11 ist in der Fig. 1 dargestellt. Die Schale enthält eine Reihe von länglichen Behältern oder Trögen 12, die parallel zueinander angeordnet sind und jeweils eine ausreichende Länge haben, um einen Streifen aus dem Festphasen-Trägerme­ dium aufzunehmen, und die eine ausreichende Breite haben, so daß der Streifen mit der Oberfläche nach oben liegen kann. An einem Ende jedes Behälters ist eine Rückhaltesperre vorge­ sehen, die aus einem Paar Vorsprüngen 13, 14 besteht, die den Streifen (nicht dargestellt) von der einen Stirnwand 15 jedes Behälters fernhalten, durch die eine Vertiefung 16 begrenzt wird, in die ein Ansaugrohr (nicht dargestellt) eingeführt werden kann, um Flüssigkeiten abzuziehen, ohne den Streifen zu berühren. Die Vorsprünge 13, 14 sind durch einen Spalt 17 voneinander getrennt, der, obgleich er nicht breit genug ist, um die Passage des Streifens zu erlauben, die Flüssigkeit hindurchströmen läßt, so daß die gesamte Flüssigkeit in jedem Behälter in die Vertiefung 16 abfließen kann für die Entfernung durch Absaugen.

In der Fig. 22 ist eine Auskleidung 21 für die Schale ge­ mäß Fig. 1 dargestellt. Die Auskleidung besteht aus einem dünnen transparenten Material und hat die gleiche Kontur wie die obere Oberfläche der Schale 11. Sie weist somit eine Reihe von rechteckigen Vorsprüngen 22 auf, die sich nach un­ ten erstrecken und welche die gleiche Gestalt haben wie die Behälter 12. Bei der gezeigten Ausführungsform verjüngen sich die Vorsprünge 22 sowie die Behälter 12 in Richtung auf den Boden etwas, so daß die Vorsprünge leicht in die Behälter passen, wenn die Auskleidung auf die Schale gelegt wird. Die Auskleidung hat eine Funktion während des Ver­ sands, insbesondere wenn die Schale verpackt wird mit einem Teststreifen, der in jedem Behälter liegt. Die Auskleidung hält die Streifen an Ort und Stelle während des Transports und während der Handhabung der Schale und sie wird vor Durchführung des Assays entfernt.

Das Testkit kann auch einen Deckel 31, wie er in der Fig. 3 dargestellt ist, umfassen. Der dargestellte Deckel be­ steht aus einem dünnen transparenten Material ähnlich der Auskleidung 21 der Fig. 2, jedoch ohne die Vorsprünge 22. Die Seitenwände 23, 32 sowohl der Auskleidung als auch des Deckels verjüngen sich jeweils nach oben, um die Vereini­ gung aller Teile zu erleichtern. Der Deckel wird während des Assays selbst verwendet und dient dazu, Testfluids und Streifen in den Behältern während des Rührens bzw. Bewegens, das in der Regel während der Inkubationsstufen des Assays durchgeführt wird, zurückzuhalten. Das Rühren bzw. Bewegen kann aus einem leichten Schütteln der Schale bestehen.

Die Erfindung wird durch das folgende Beispiel erläutert, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein.

Beispiel I. Herstellung eines Elektropherogramms auf Nitrocellulose

Der HTLV-III-Virus ist erhältlich von der Firma Organon Teknika. Der Virus wird desaktiviert mit 0,5% Detergens, nachdem er durch Zellenlysis aus H9-Zellen extrahiert worden ist, die vorher mit dem Virus infiziert worden sind.

Der Virus wird verdünnt und lysiert in einer Pufferlösung auf 10 mg pro 50 ml Endlösung und fraktioniert durch Elektro­ phorese auf einem 10%igen Polyacrylamid-Plattengel in Gegenwart von Natriumdodecylsulfat. Die auf dem Gel erhal­ tenen Proteinbanden werden elektrophoretisch auf eine Platte bzw. Folie aus Nitrocellulose übertragen. Die Seite der Platte bzw. Folie, welche die Proteinbanden trägt, wird dann mit einer Linie entlang der Kante, die der Oberseite des Elektropherogramms entspricht, markiert. Die Platte bzw. Folie wird dann wiederholt in 0,3% Tween 20 in einer mit Phosphat gepufferten Kochsalzlösung und 0,1% Natrium­ azid in entionisiertem Wasser gewaschen, dann zu 32 Strei­ fen einer Größe von 11 cm × 0,34 cm zerschnitten. Die beiden Endstreifen werden zur Qualitätskontrolle zurückge­ halten. Mit diesen Endstreifen werden unter Verwendung positiver und negativer Kontrollseren Standard-Immuno­ assays durchgeführt, um die Anwesenheit von Virus-Pro­ teinen zu bestätigen.

II. Reagens-Herstellung

Eine Wasch/Verdünnungsmittel-Lösung wird hergestellt durch Kombinieren der nachstehend angegebenen Bestandteile in entionisiertem Wasser (bezogen auf ein Endvolumen von 24 l):

TRIS 580,9 g fettfreie Trockenmilch   1,2 kg Antifoam A   7,7 ml Tween 20 720 ml NaCl1120 g NaN₃  24 g HCl bis auf pH 7,5  24 g

Unter Verwendung eines Konjugats aus Anti-Human-IgG und alkalischer Phosphatase, erhältlich von der Firma Bio-Rad Laboratories, Inc., Chemical Division, Richmond, Kalifor­ nien/USA, wird eine Enzym-Konjugat-Lösung hergestellt durch Kombinieren von 2,05 Volumenteilen der obengenannten Wasch/- Verdünnungsmittel-Lösung mit 18,45 Volumenteilen entioni­ siertem Wasser und Zugabe des Konjugats in einer vorher festgelegten Menge, die ausreicht, um nachweisbare Ergeb­ nisse zu erzielen. Die Menge kann vorher festgelegt werden auf der Basis der Endpunktbestimmung unter Verwendung von Reihenverdünnungen.

Eine Substratlösung wird hergestellt durch Kombinieren von 3,12 Gewichtsteilen 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphat und 6,25 Gewichtsteilen Nitroblue-Tetrazoliumchlorid mit 0,1 M Tris-Puffer, Natriumazid, Dimethylformamid und entionisiertem Wasser, wobei der pH-Wert mit Chlorwasserstoffsäure auf 9,5 + 0,1 eingestellt wird.

III. Assay

Es wird eine Schale verwendet, die 10 Behälter, wie in der Zeichnung dargestellt, enthält. In jeden Behälter wird ein Streifen gelegt mit den Linienmarkierungen nach oben und alle auf eine Seite. Dann wird eine Wasch/Verdünnungsmittel- Lösung in einer Menge von 3 ml in jeden Behälter eingeführt, um jeden Streifen zu sättigen. Jedem Behälter wird eine Patientenprobe in einer Menge von 30 µl pro Probe zugegeben und die Schale wird schwach geschüttelt (inkubiert) für 30 Minuten bei Raumtemperatur.

Die Behälter werden dann durch Ansaugen evakuiert und jedem Behälter werden 5 ml Wasch/Verdünnungsmittel-Lösung zugesetzt, woran sich eine 10-minütige Inkubation anschließt. Das Ansau­ gen und Waschen wird dann wiederholt. Nach dem Ansaugen wird 3 ml Enzym-Konjugat-Lösung in jeden Behälter gegeben und die Inkubation wird wieder 30 Minuten lang durchgeführt. Die Behälter werden leergesaugt und das Waschen wird wiederholt. Dann wird Substratlösung in einer Menge von 3 ml pro Behälter zugegeben, woran sich eine 10-minütige Inkubation und ein Absaugen anschließen. Jeder Behälter wird dann mit 5 ml entionisiertem Wasser zweimal mit einer jeweils 5-minütigen Inkubation dazwischen gewaschen, dann abgesaugt und die Streifen werden untersucht. Es treten gefärbte Banden in einem Muster auf, das durch das Elektropherogramm bestimmt ist, welche die Anwesenheit von Antikörpern gegen AIDS­ assoziierte Viren in jeder Probe anzeigen.

Die Erfindung wurde zwar vorstehend unter Bezugnahme auf spezifische bevorzugte Ausführungsformen näher erläutert, es ist jedoch für den Fachmann selbstverständlich, daß sie darauf keineswegs beschränkt ist, sondern daß zahlreiche Abänderungen und Modifikationen durchgeführt werden können, ohne daß dadurch der Rahmen der vorliegenden Erfindung verlassen wird.

Claims (27)

1. Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit von Antikörpern mit einer Spezifität für Antigen-Zentren an einem AIDS-assoziier­ ten Virus in einer Körperflüssigkeitsprobe, dadurch gekennzeichnet, daß es die folgenden Stufen umfaßt:

• a) Inkontaktbringen der Probe mit Antigenen, die ausgewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus dem AIDS-assoziier­ ten Virus und Fraktionen desselben zur Bildung von Komple­ xen der Antikörper mit den Antigenen;
• b) das Assoziieren eines Signalerzeugungssystems mit jedem der Komplexe, das umfaßt:
  • (i) Konjugat aus alkalischer Phosphatase und einem zweiten Antikörper mit einer Affinität für diese Komplexe und
    (ii) eine Mischung von Nitroblue-Tetrazoliumchlorid und 5-Bromo-4-chloro-3-indolylphosphat in Mengen, die ausreichen, um beim Kontakt mit der alkalischen Phosphatase eine Farbänderung hervorzurufen; und
• c) die Bestimmung des Signalpegels der assoziierten Signal­ erzeugungssysteme als Anzeichen für die Anwesenheit der Antikörper in der Probe.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem zweiten Antikörper um Anti-Human-Ig handelt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Nitroblue-Tetrazoliumchlorid und das 5-Bromo-4-chloro­ 3-indolylphosphat in etwa äquimolaren Mengen verwendet werden.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch ge­ kennzeichnet, daß es sich bei den Antigenen um ein Lysat ei­ nes AIDS-assoziierten Virus handelt.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Antigenen um ein Lysat von HTLV-III handelt.

6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Antigenen um ein Lysat von LAV handelt.

7. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Antigenen um ein Lysat von ARV handelt.

8. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Antigene elektrophoretisch fraktioniert und auf ein Fest­ phasen-Trägermedium übertragen werden.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Festphasen-Trägermedium um Nitrocellulose handelt.

10. Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit von Antikörpern mit einer Spezifität für Antigenzentren an einem AIDS-assozi­ ierten Virus in einer Probe eines Humanserums, dadurch gekenn­ zeichnet, daß es die folgenden Stufen umfaßt:

• a) Eintauchen eines Festphasen-Trägers mit einem daran ad­ sorbierten Elektropherogramm von Proteinfraktionen eines lysierten AIDS-assoziierten Virus in die Probe unter Bil­ dung von immobilisierten Komplexen der Antikörper mit den Proteinfraktionen;
• b) Inkubieren der immobilisierten Komplexe mit einer Lösung eines Überschusses eines Konjugats von Anti-Human-Ig und alkalischer Phosphatase, um das Konjugat an die immo­ bilisierten Komplexe zu binden;
• c) Abtrennen der an das Konjugat gebundenen immobilisierten Komplexe von dem übrigen Konjugat in der Lösung; und
• d) Inkubieren der abgetrennten, an das Konjugat gebundenen immobilisierten Komplexe mit einer Lösung von Nitroblue- Tetrazoliumchlorid und 5-Bromo-4-chloro-3-indolylphosphat, um eine nachweisbare Farbänderung hervorzurufen, welche die Anwesenheit der Antikörper in der Probe anzeigt.

11. Diagnostisches Test-Kit zum Analysieren von Körperflüs­ sigkeitsproben zur Bestimmung der Anwesenheit von Antikörpern mit einer Spezifität für Antigenzentren an einem AIDS-assozi­ ierten Virus, dadurch gekennzeichnet, daß es umfaßt: eine Vielzahl von Festphasen-Trägern, an denen jeweils Antige­ ne des AIDS-assoziierten Virus in diskreten Bereichen adsor­ biert sind, die in einem vorgegebenen Muster angeordnet sind, wodurch sowohl das vorgegebene Muster als auch die Dichte je­ des adsorbierten Antigens im wesentlichen identisch sind von einem der Festphasen-Träger zum nächsten;
eine Lösung eines Konjugats der ersten Komponente eines Zwei- Komponenten-Signalerzeugungssystems mit einem zweiten Anti­ körper mit einer Bindungsaffinität für Komplexe des Antigens mit den Antikörpern in einer Menge, die für alle diese Fest­ phasen-Träger ausreicht; und
eine Lösung der zweiten Komponente des Zwei-Komponenten-Sig­ nalerzeugungssystems in einer Menge, die für alle diese Festphasen-Träger ausreicht.

12. Kit nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Zwei-Komponenten-Signalerzeugungssystem um ein System handelt, das eine visuell sichtbare Veränderung her­ vorruft, wenn die beiden Komponenten miteinander kombiniert werden.

13. Kit nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der ersten Komponente um ein Enzym handelt, das auf die zweite Komponente einwirken kann unter Bildung eines nachweisbaren Signals.

14. Kit nach einem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekenn­ zeichnet, daß es sich bei der ersten Komponente um alkalische Phosphatase und bei der zweiten Komponente um ein Substrat handelt, das beim Kontakt mit der alkalischen Phosphatase eine nachweisbare Veränderung erfährt.

15. Kit nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der zweiten Komponente um eine Mischung von Nitro­ blue-Tetrazoliumchlorid und 5-Bromo-4-chloro-3-indolylphos­ phat in Mengen, die ausreichen, um eine Farbänderung beim Kontakt mit der alkalischen Phosphatase hervorzurufen, handelt.

16. Kit nach einem der Ansprüche 11 bis 15, dadurch gekenn­ zeichnet, daß es außerdem eine Lösung eines Blockierungsmit­ tels zur Verminderung der nicht-spezifischen Bindung an dem Festphasen-Träger enthält.

17. Kit nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß das Blockierungsmittel aus Milchproteinen besteht.

18. Kit nach einem der Ansprüche 11 bis 17, dadurch gekenn­ zeichnet, daß es sich bei dem vorgegebenen Muster um ein Elektropherogramm handelt, das von einem elektrophoretischen Trennmedium auf den Festphasen-Träger übertragen worden ist.

19. Kit nach einem der Ansprüche 11 bis 18, dadurch gekenn­ zeichnet, daß es sich bei dem Festphasenträger um Nitrocellu­ lose handelt.

20. Kit nach einem der Ansprüche 11 bis 19, dadurch gekenn­ zeichnet, daß es sich bei dem vorgegebenen Muster um ein Western-Blot eines Elektropherogramms der Antigene handelt.

21. Kit nach einem der Ansprüche 11 bis 20, dadurch gekenn­ zeichnet, daß es außerdem einen Behälter für die Aufnahme des in die Probelösung(en) eingetauchten Festphasen-Trägers umfaßt.

22. Diagnostisches Test-Kit zum Analysieren einer Vielzahl von Human-Körperflüssigkeitsproben zur Bestimmung der Anwe­ senheit von IgG-Antikörpern mit einer Spezifität für Antigen­ zentren an einem AIDS-assoziierten Virus, dadurch gekennzeich­ net, daß es umfaßt:
eine Vielzahl von Streifen, die ausgeschnitten worden sind aus einem Feststoffträger, an dem durch Western-Blotting ein Elek­ tropherogramm von Antigenen des AIDS-assoziierten Virus in länglichen Banden quer zu den Streifen adsorbiert worden ist; eine Lösung eines Konjugats aus Anti-Human-IgG und alkalischer Phosphatase;
eine Lösung von Nitroblue-Tetrazoliumchlorid und 5-Bromo-4­ chloro-3-indolylphosphat in etwa äquimolaren Mengen; eine Lösung von Milchproteinen; und
eine Schale, die eine Vielzahl von Flüssigkeitsrückhalte-Ab­ teilen aufweist, von denen jedes eine ausreichende Größe hat, um einen der in die Flüssigkeit vollständig eingetauchten Feststoffträger aufzunehmen.

23. Schale zum Inkubieren von Streifen aus dem Festphasen- Material in Reagenzflüssigkeiten, gekennzeichnet durch eine Vielzahl von länglichen Flüssigkeitsrückhalte-Abteilen, von denen jedes so dimensioniert ist, daß es einen der voll­ ständig in die Flüssigkeit eingetauchten Streifen aufnehmen kann, und
eine Sperre in jedem der länglichen Flüssigkeits­ rückhalte-Abteile, um einen der Streifen in einem Abstand von einer Stirnwand desselben zu halten, während die Flüs­ sigkeit hindurchströmen gelassen wird.

24. Schale nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß die Sperre aus einem Vorsprung besteht, der sich von der Basis nach oben in jedem der länglichen Flüssigkeits­ rückhalte-Abteile erstreckt.

25. Schale nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß die Sperre besteht aus einem Paar von Vorsprüngen, die sich von der Basis nach oben in jedem der länglichen Flüssigkeitsrückhalte-Abteile erstrecken, wobei das Paar durch einen Spalt voneinander getrennt ist, der enger ist als die Breite jedes Streifens.

26. Vorrichtung zur Aufnahme von Streifen aus einem Fest­ phasen-Material für die Inkubation in Reagensflüssigkeiten, gekennzeichnet durch

• a) eine Schale, die eine Vielzahl von länglichen Flüssig­ keitsrückhalte-Abteilen aufweist, von denen jedes so dimensioniert ist, daß es einen vollständig in die Flüs­ sigkeit eingetauchten Streifen aufnehmen kann, wobei jedes Abteil eine Sperre enthält, die so angeordnet ist, daß sie den einen Streifen in einem Abstand von einer Stirnwand desselben hält, während Flüssigkeit hindurchströmen gelassen wird; und
  eine entfernbare Auskleidung, die so konturiert ist, daß sie auf die obere Oberfläche der Schale mit den Vorsprüngen, die sich in jedes der länglichen Flüssigkeits­ rückhalte-Abteile erstrecken, paßt, um die Position je­ des Streifens zu stabilisieren.

27. Vorrichtung nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß sie außerdem einen Deckel aufweist, der so konturiert ist, daß er jedes der länglichen Flüssigkeitsrückhalte-Ab­ teile so verschließt, daß genügend Platz darin verbleibt zum Rühren bzw. Bewegen der darin angeordneten Reagensflüssigkeiten.