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Hintergrund
der Erfindung
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Gebiet der Erfindung
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Die Erfindung bezieht sich auf Polymerteilchenreagentien,
die eine hohe Empfindlichkeit für
die Verwendung in Lichtstreuungs-Agglutinierungsassays besitzen,
und insbesondere auf Teilchenreagentien, die über eine funktionelle Gruppe
kovalent an Verbindungen von biologischem Interesse gebunden sind,
wobei die Teilchenreagentien mit einem Modifikator behandelt sind,
um Reaktivität
und Stabilität
zu erhöhen.
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Beschreibung
des Hintergrunds der Erfindung
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Teilchenreagentien werden in Assays
für den
quantitativen Nachweis von Bakterien, Zelloberflächenantigenen, Serumproteinen
oder anderen Analyten als Träger
für Haptene,
Proteine oder andere Verbindungen von biologischem Interesse verwendet,
so dass man eine erhöhte
Empfindlichkeit gegenüber
dem visuellen Nachweis von Agglutinierungsreaktionen oder der Hemmung
der Agglutinierung erhält.
Verschiedene Verfahren für
die Herstellung von Teilchenreagentien sind bekannt.
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Teilchenreagentien mit einem inneren
Polymerkern mit einem hohen Brechungsindex und einer äußeren Polymerhülle mit
funktionellen Gruppen, die direkt oder indirekt an Verbindungen
von biologischem Interesse gebunden sind, zur Verwendung bei empfindlichen
Lichtstreuungs-Immunoassays unter Verwendung von Agglutinierungsreaktionen
oder der Hemmung der Agglutinierung sind in den US-Patenten Nr.
4,401,765 und 4,480,042 beschrieben.
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Assays, bei denen Polymerteilchenreagentien
zum Nachweis der Gegenwart und Quantifizierung der Mengen verschiedener
Wirkstoffe in Serum oder anderen Flüssigkeiten durch Lichtstreuungstechniken
eingesetzt werden, sind kommerziell erhältlich. Es hat sich gezeigt,
dass diese Polymerteilchenreagentien, insbesondere solche mit funktionellen
Epoxidgruppen auf der äußeren Hülle des
Polymerteilchens, Aktivität
verlieren, wenn sie unter alkalischen Bedingungen erhitzt werden.
Diese Instabilität
wird sogar bei Lagerung bei tiefen Temperaturen und mäßigem pH-Wert
beobachtet und geht mit einem Verlust der Immunreaktivität einher. Es
besteht ein Bedürfnis
nach einem Verfahren zur Verstärkung
der Stabilität
der Polymerteilchenreagentien ohne Aktivitätsverlust. Es ist ein Ziel
der vorliegenden Erfindung, ein Teilchenreagens zur Verwendung in
Lichtstreuungs-Immunoassays mit erhöhter Stabilität und Immunoreaktivität bereitzustellen.
Es ist ein weiteres Ziel der Endung, ein Verfahren zur Herstellung
eines solchen Teilchenreagens bereitzustellen.
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Kurzbeschreibung
der Erfindung
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Die Ziele der vorliegenden Erfindung
werden erreicht durch ein Verfahren zur Verbesserung der Stabilität und Erhöhung der
Immunreaktivität
eines Teilchenreagens, das ein Polymerteilchen umfasst, das kovalent
an eine Verbindung von biologischem Interesse gebunden ist.
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Die vorliegende Endung stellt also
folgendes bereit:
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- (1) ein Verfahren zur Erhöhung der Aktivität und Stabilität eines
Teilchenreagens, wobei das Reagens ein Polymerteilchen umfasst,
das aktive funktionelle Oberflächengruppen
auf einer äußeren Schicht
desselben aufweist, die mit einer komplementären funktionellen Gruppe einer
Verbindung von biologischem Interesse reagieren können, wobei
das Teilchen kovalent an die Verbindung von biologischem Interesse
gebunden ist, wobei das Verfahren folgendes umfasst: den Schritt
des Inkubierens des Teilchenreagens bei einem vorbestimmten pH-Wert und einer Temperatur
mit einem Modifizierungsmittel, das β-Mercaptoessigsäure als anionisches Nucleophil
umfasst, welches eine negative Ladung auf die äußere Schicht des Polymerteilchens
bringen und nicht umgesetzte funktionelle Gruppen auf derselben
reduzieren kann;
- (2) ein Verfahren zur Messung von Verbindungen von biologischem
Interesse, das die folgenden Schritte umfasst:
- – Inkubieren:
- (1) eines Polymerteilchenreagens mit erhöhter Aktivität und Stabilität, das auf
einer äußeren Schicht
desselben folgendes umfasst:
- (a) eine aktive funktionelle Gruppe, die kovalent direkt oder über eine
proteinartige Verknüpfungsgruppe
an eine komplementäre
funktionelle Gruppe einer Verbindung von biologischem Interesse
gebunden ist; und
- (b) eine zweite funktionelle Gruppe, die β-Mercaptoessigsäure als
anionisches Nucleophil umfasst, das eine negative Ladung auf die äußere Schicht
des Polymerteilchens bringen und nicht umgesetzte funktionelle Gruppen
auf derselben reduzieren kann; mit
- (2) einer Flüssigkeit,
von der man annimmt, dass sie die Verbindung von biologischem Interesse
enthalten könnte;
und
- (3) einem Agglutinierungsmittel; und
- – Messen
der erhöhten
Teilchengröße durch
photometrische Einrichtungen;
- (3) ein Verfahren zur Herstellung eines Teilchenreagens, wobei
das Reagens folgendes umfasst:
- (1) ein Polymerteilchen mit einer äußeren Hülle, wobei die äußere Hülle eine
funktionelle Gruppe aufweist, die mit einer komplementären funktionellen
Gruppe einer Verbindung von biologischem Interesse reagieren kann; und
- (2) die Verbindung von biologischem Interesse, wobei das Verfahren
die folgenden Schritte umfasst:
- – Synthetisieren
von Teilchenreagentien durch kovalentes Binden von reaktiven funktionellen
Gruppen von Polymerteilchen an komplementäre funktionelle Gruppen von
Verbindungen von biologischem Interesse;
- – dann
Inkubieren der Polymerteilchenreagentien unter vorbestimmten pH-
und Temperaturbedingungen mit einem Modifizierungsmittel, das (β-Mercaptoessigsäure als
anionisches Nucleophil umfasst, während einer ausreichenden Zeit,
so dass das Modifizierungsmittel nicht umgesetzte funktionelle Gruppen
auf der Oberfläche
der äußeren Hülle der
Polymerteilchen reduzieren und sie mit einer negativen Ladung versehen
kann;
- (4) ein Teilchenreagens, das ein Polymerteilchen umfasst, das
eine äußere Schicht
aufweist, die eine funktionelle Gruppe aufweist, welche kovalent
direkt oder über
eine proteinartige Verknüpfungsgruppe
an eine komplementäre
funktionelle Gruppe einer Verbindung von biologischem Interesse
gebunden ist, wobei das Teilchenreagens nach einem Verfahren hergestellt
wird, das folgendes umfasst: Inkubieren:
- (1) eines Polymerteilchens mit einer funktionellen Gruppe, die
mit einer komplementären
funktionellen Gruppe einer Verbindung von biologischem Interesse
reagieren kann; bei einem vorbestimmten pH-Wert und einer Temperatur
mit
- (2) einem Modifizierungsmittel, das (β-Mercaptoessigsäure als
anionisches Nucleophil umfasst, welches eine negative Ladung auf
die äußere Schicht des
Polymerteilchens bringen und nicht umgesetzte funktionelle Gruppen
auf derselben reduzieren kann;
- (5) ein Verfahren zur Erhöhung
der Aktivität
und Stabilität
eines Teilchenreagens, wobei das Reagens ein Polymerteilchen umfasst,
das aktive funktionelle Oberflächengruppen
auf einer äußeren Schicht
desselben aufweist, die mit einer komplementären funktionellen Gruppe einer
Verbindung von biologischem Interesse reagieren können, bei
der es sich um Phenobarbital handelt, und das kovalent an die Verbindung
von biologischem Interesse gebunden ist, wobei das Verfahren folgendes
umfasst:
den Schritt des Inkubierens des Teilchenreagens bei
einem vorbestimmten pH-Wert
und einer Temperatur mit einem Modifizierungsmittel, das Thiosulfat
als anionisches Nucleophil umfasst, welches eine negative Ladung auf
die äußere Schicht
des Polymerteilchens bringen und nicht umgesetzte funktionelle Gruppen
auf derselben reduzieren kann;
- (6) ein Verfahren zur Messung von Verbindungen von biologischem
Interesse, bei denen es sich um Phenobarbital handelt, wobei das
Verfahren die folgenden Schritte umfasst:
- - Inkubieren:
- (1) eines Polymerteilchenreagens mit erhöhter Aktivität und Stabilität, das auf
einer äußeren Schicht
desselben folgendes umfasst:
- (a) eine aktive funktionelle Gruppe, die kovalent direkt oder über eine
proteinartige Verknüpfungsgruppe
an eine komplementäre
funktionelle Gruppe einer Verbindung von biologischem Interesse
gebunden ist; und
- (b) eine zweite funktionelle Gruppe, die Thiosulfat als anionisches
Nucleophil umfasst, das eine negative Ladung auf die äußere Schicht
des Polymerteilchens bringen und nicht um gesetzte funktionelle Gruppen
auf derselben reduzieren kann; mit
- (2) einer Flüssigkeit,
von der man annimmt, dass sie die Verbindung von biologischem Interesse
enthalten könnte;
und
- (3) einem Agglutinierungsmittel; und
- – Messen
der erhöhten
Teilchengröße durch
photometrische Einrichtungen;
- (7) ein Verfahren zur Herstellung eines Teilchenreagens, wobei
das Reagens folgendes umfasst:
- (1) ein Polymerteilchen mit einer äußeren Hülle, wobei die äußere Hülle eine
funktionelle Gruppe aufweist, die mit einer komplementären funktionellen
Gruppe einer Verbindung von biologischem Interesse reagieren kann, bei
der es sich um Phenobarbital handelt; und
- (2) die Verbindung von biologischem Interesse, wobei das Verfahren
die folgenden Schritte umfasst:
- – Synthetisieren
von Teilchenreagentien durch kovalentes Binden von reaktiven funktionellen
Gruppen von Polymerteilchen an komplementäre funktionelle Gruppen von
Verbindungen von biologischem Interesse;
- – dann
Inkubieren der Polymerteilchenreagentien unter vorbestimmten pH-
und Temperaturbedingungen mit einem Modifizierungsmittel, das Thiosulfat
als anionisches Nucleophil umfasst, während einer ausreichenden Zeit,
so dass das Modifizierungsmittel nicht umgesetzte funktionelle Gruppen
auf der Oberfläche
der äußeren Hülle der
Polymerteilchen reduzieren und sie mit einer negativen Ladung versehen
kann; und
- (8) ein Teilchenreagens, das ein Polymerteilchen umfasst, das
eine äußere Schicht
aufweist, die eine funktionelle Gruppe aufweist, welche kovalent
direkt oder über
eine proteinartige Verknüpfungsgruppe
an eine komplementäre
funktionelle Gruppe einer Verbindung von biologischem Interesse
gebunden ist, bei der es sich um Phenobarbital handelt, wobei das
Teilchenreagens nach einem Verfahren hergestellt wird, das folgendes
umfasst: Inkubieren:
- (1) eines Polymerteilchens mit einer funktionellen Gruppe, die
mit einer komplementären
funktionellen Gruppe einer Verbindung von biologischem Interesse
reagieren kann; bei einem vorbestimmten pH-Wert und einer Temperatur
mit
- (2) einem Modifizierungsmittel, das Thiosulfat als anionisches
Nucleophil umfasst und eine negative Ladung auf die äußere Schicht
des Polymerteilchens bringen und nicht umgesetzte funktionelle Gruppen
auf derselben reduzieren kann.
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Die obigen Verfahren (1), (3), (5)
und (7) umfassen die Schritte des Synthetisierens des Polymerteilchenreagens
durch kovalentes Binden von reaktiven funktionellen Gruppen der
Polymerteilchen an komplementäre
funktionelle Gruppen von Verbindungen von biologischem Interesse,
dann des Inkubierens des Polymerteilchenreagens unter vorbestimmten
pH- und Temperaturbedingungen mit einem Modifizierungsmittel, das
eine negative Ladung auf die Teilchenoberfläche bringt.
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Nichteinschränkende Beispiele für funktionelle
Gruppen an dem Teilchen sind solche, die Epoxy-, Carboxy-, Hydroxy-,
Amino- und Aldehydgruppen umfassen. Die Verbindungen von biologischem
Interesse umfassen, wenn nichts anderes angegeben ist, Serum, Plasma,
Speichel-, Urin- oder Milchproteine; Wirkstoffe, Vitamine, Hormone,
Enzyme, Antikörper,
Polysaccharide, Bakterien, Protozoen, Pilze, Viren, Zell- und Gewebeantigene
und andere Blutzell- oder Blutflüssigkeitssubstanzen.
Die Verbindung kann direkt, über
einen synthetischen Spacer-Arm
oder über
ein proteinartiges Material mit der Polymerhülle verknüpft sein. Wenn die Verbindung
in den Ausführungsformen
(1) und (3) ein Wirkstoff ist, kann er aus der Gruppe ausgewählt werden,
die aus Chinidin, Phenobarbital und den Aminoglycosid-Antibiotika,
wie Vancomycin, Tobramycin und Gentamycin, besteht. Die Verbindung
von biologischem Interesse hat vorzugsweise ein Molekulargewicht
von weniger als 2000.
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Das Polymerteilchenreagens kann jedes
geeignete bekannte Teilchenreagens sein. Ein bevorzugtes Reagens
besteht aus (A) einem Polymerteilchen mit einem inneren Kern und
einer äußeren Hülle, wobei
es sich bei dem inneren Kern um ein Polymer mit einem bei der Wellenlänge der
Natrium-D-Linie gemessenen Brechungsindex von nicht weniger als
1,54 handelt und es sich bei der äußeren Hülle um ein Polymer aus einem
ethylenisch ungesättigten
Monomer handelt, das den Rest einer nucleophilen funktionellen Gruppe
aufweist, die mit einer komplementären funktionellen Gruppe einer
Verbindung von biologischem Interesse reagieren kann und die kovalent
an (B) eine Verbindung von biologischem Interesse gebunden ist.
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Das mit dem Verfahren der vorliegenden
Erfindung hergestellte Polymerteilchenreagens kann in Lichtstreuungs-Immunoassays
zur Messung von Verbindungen von biologischem Interesse verwendet
werden; dazu gehören
insbesondere Substanzen in biologischen Flüssigkeiten oder Zell- und Gewebeextrakten,
für die ein
immunologischer Gegenreaktant hergestellt werden kann.
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Das obige Teilchenreagens gemäß (4) und
(8) umfasst ein Polymerteilchen, wobei in der äußersten Schicht des Teilchens
die oberflächenaktiven
funktionellen Gruppen zunächst
mit einer komplementären
funktionellen Gruppe einer Verbindung oder eines Analogons eines
Moleküls
von biologischem Interesse umgesetzt wurden. Die restlichen oberflächenaktiven
funktionellen Gruppen wurden anschließend mit β-Mercaptoessigsäure oder
Thiosulfat umgesetzt, die bzw. das nach dem oben beschriebenen Verfahren
zur Erhöhung der
Immunoassayaktivität
und der Stabilität
hergestellt wurde.
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Die obigen Verfahren zur Messung
von Verbindungen von biologischem Interesse gemäß Ausführungsform (2) und (6) umfassen
die Schritte des Inkubierens (1) eines Teilchenreagens mit negativer
Ladung auf der äußeren Hülle der
Teilchen- oberfläche und
einer funktionellen Gruppe, die direkt oder über eine proteinartige Verknüpfungsgruppe
kovalent an eine komplementäre
funktionelle Gruppe einer Verbindung von biologischem Interesse
gebunden ist, mit (2) einer Flüssigkeit,
von der man annimmt, dass sie die Verbindung von biologischem Interesse
enthalten könnte,
und (3) einem Agglutinierungsmittel, und des Messens der Erhöhung der
Teilchengröße durch
photometrische Einrichtungen. Die Verbindung von biologischem Interesse
in Ausführungsform
(2) kann ein Wirkstoff sein, zum Beispiel solche Wirkstoffe, die
aus der Gruppe ausgewählt
sind, die aus Chinidin, Phenobarbital und Aminoglycosid-Antibiotika,
wie Vancomycin, Tobramycin und Gentamycin, besteht. Das Polymerteilchen
wird nach dem Kopplungsinkubationsschritt mit einem Modifikator
behandelt, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus β-Mercaptoessigsäure und
Thiosulfat besteht.
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Kurzbeschreibung der Zeichnungen
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Die erhöhte Stabilität des nach
dem Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellten Teilchenreagens
wird in den Vergleichsgraphiken gezeigt:
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1A zeigt
die Stabilität
eines Vancomycin-Reagens, das mit β-Mercaptoessigsäure in Borat
behandelt und bei 35°C
aufbewahrt wurde;
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1B zeigt
die Stabilität
eines unbehandelten Vancomycin-Reagens, das bei 35°C aufbewahrt
wurde;
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1C zeigt
die Stabilität
eines Vancomycin-Reagens, das in Borat allein behandelt und bei
35°C aufbewahrt
wurde; und
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2 zeigt
die unerwartete Erhöhung
der Aktivität
des Vancomycin-Reagens, das mit β-Mercaptoessigsäure und
Borat behandelt wurde.
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Ausführliche
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
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Die vorliegende Erfindung stellt
ein Verfahren bereit, das nicht nur das Ziel der Verbesserung der
Stabilität
von Polymerteilchenreagentien mit funktionellen Gruppen auf der äußeren Hülle des
Polymerteilchens erreicht, sondern auch ganz unerwartet die Immunreaktivität dieser
Reagentien erhöht.
Das Verfahren umfasst im Allgemeinen den Schritt der Behandlung
des Teilchenreagens, nachdem das Polymerteilchen kovalent an eine
Verbindung von biologischem Interesse gebunden wurde, mit einem
Modifikator, der eine negative Ladung zu der Polymeroberfläche hinzufügt, bei
geeigneten pH- und Temperaturbedingungen. So behandelte Teilchenreagentien
zeigen sowohl eine größere Stabilität als auch
eine erhöhte
Immunreaktivität
als unbehandelte Teilchenreagentien. Bei der Inkubation des Polymerteilchenreagens
mit dem Modifikator (β-Mercaptoessigsäure oder
Thiosulfat werden anionische Gruppen auf die Polymerteilchenoberfläche gebracht,
während gleichzeitig
die restlichen reaktiven Gruppen reduziert werden, was überraschenderweise
sowohl zu einer verstärkten
Aktivität
als auch zu einer verbesserten Stabilität führt. Unerwarteterweise wurde
gefunden, dass nicht alle Agentien, die man einst für geeignet
hielt, um restliche reaktive Stellen auf einem Teilchenreagens zu
blockieren, beide Ziele der Erfindung erreichen. Das US-Patent Nr.
4,480,042 sagt zum Beispiel, dass Mercaptoethanol, Mercaptopropionsäure, Cystein
oder ein lösliches
Polymer mit aminofunktionellen Gruppen als Blockiermittel verwendet
werden kann, um nicht besetzte Stellen auf der Teilchenoberfläche zu binden
und zu blockieren. Es wurde jedoch gefunden, dass die Behandlung
mit Mercaptoethanol bei einigen Teilchenreagentien die Stabilität verbessert,
aber nicht die Immunreaktivität
verbessert, und in manchen Fällen
sogar eine Abnahme der Aktivität
eines Teilchenreagens verursachen kann.
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Die Polymerteilchenreagentien, die
den Gegenstand der vorliegenden Erfindung bilden, sind solche, die
für Lichtstreuungsmessungen
der Agglutinierung geeignet sind. Es gibt mehrere Arten von Lichtstreuungsmessungen
der Agglutinierung. Dazu gehören
turbidimetrischer Nachweis, nephelometrischer Nachweis, Teilchenzählung, quasielektrische
Lichtstreuung, Autokorrelationsspektroskopie und Messungen der Lichtstreuungsdissymmetrie
oder Polarisation durch Teilchen. Jede Art von Messsystem bedeutet
unterschiedliche Einschränkungen
für die
Teilchenreagentien. Die Lichtstreuungseigenschaften von Teilchensuspensionen
hängen von
Variablen wie der Teilchengröße, den
Brechungsindices des Teilchens und des Suspensionsmediums und der
für die
Messung verwendeten Lichtwellenlänge
ab. Bei allen Arten von Messungen gilt: Je höher der Brechungsindex von
Teilchen bei der gewählten
Wellenlänge,
desto höher
ist das Lichtstreuungssignal. Bei der visuellen Beobachtung von
Agglutinierungsreaktionen werden Wellenlängen zwischen etwa 400 und
650 nm verwendet. Während
der Agglutinierungsreaktion nimmt die effektive Teilchengröße zu. Kleine
Teilchen mit hohem Brechungsindex und Nachweis bei kurzer Wellenlänge sind
für eine
hohe Empfindlichkeit beim turbidimetrischen Nachweis bevorzugt.
Für die
Messung von Proben in Serum, wobei Proteine und andere Komponenten
Licht absorbieren, ist eine zweckmäßige Wellenlänge größer als
etwa 320 nm. Beim nephelometrischen Nachweis hängt die optimale Empfindlichkeit
nicht nur von Teilchengröße und Wellenlänge, sondern
auch vom Messwinkel ab.
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Das Polymerteilchenreagens, für das die
Erfindung gilt, ist ein Polymerteilchen, das einen inneren Kern
mit einem hohen Brechungsindex haben kann und eine äußere Hülle hat,
die kovalent an einer Verbindung von biologischem Interesse einschließlich Antigenanaloga
oder dagegen gerichteten Antikörpern
gebunden ist. Das Antigenanalogon der Verbindung von biologischem
Interesse ist für
die Zwecke dieser Erfindung eine beliebige Substanz oder Gruppe
von Substanzen, die gemeinsame antigene Determinanten haben und sich
daher in Bezug auf Bindungsspezifität des Antikörpers gegenüber der Verbindung von biologischem
Interesse im Wesentlichen genauso verhalten wie die Verbindung von
biologischem Interesse.
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Der innere Kern des Polymerteilchens
kann aus einer großen
Gruppe von Materialien mit hohem Brechungsindex ausgewählt werden.
Diejenigen Materialien, die durch Emulsionspolymerisation hergestellt
werden können,
sind wegen der Möglichkeit,
Gleichmäßigkeit
und Größe der Teilchen
zu steuern, bevorzugt. Wegen der Wichtigkeit des Brechungsindex
für Lichtstreuungs-Agglutinierungsassays,
wie turbidimetrischen Nachweis, müssen die Kernmaterialien für die gewünschte Assayempfindlichkeit
annehmbare Signaländerungen
erzeugen. Für
Analyten in hohen Konzentrationen (im μg/ml-Bereich) ist die Wahl nicht
entscheidend, aber für
Analyten im Nanogramm/ml-Bereich sind Teilchen mit einem hohen Brechungsindex
notwendig. Der Brechungsindex ist eine Funktion der Wellenlänge. Die
Wellenlänge
der Messung beeinflusst daher die Streuungseigenschaften. Der Brechungsindex
ist bei kürzeren
Wellenlängen
im Allgemeinen größer. Vorzugsweise ist
der innere Kern ein Polymer mit einem bei der Wellenlänge der
Natrium-D-Linie, 569 nm, gemessenen Brechungsindex von nicht weniger
als 1,54. Kernpolymere mit hoher Aromatizität und Substituenten mit hohem Atomgewicht
sind gegenüber
aliphatischen Polymeren bevorzugt. Die Kernmonomere werden aus denjenigen ausgewählt, die
neben Substituenten, wie Halogeniden, aromatischen, heterocyclischen,
ungesättigten
oder carbocyclischen Gruppen, die ein hohes Brechungsvermögen verleihen,
auch Vinyl- oder Allylgruppen enthalten.
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Die äußere Hülle ist ein Polymer aus einem
ethylenisch ungesättigten
Monomer, das durch Polymerisation in Gegenwart des inneren Kerns
gebildet wird, und weist funktionelle Gruppen auf, die mit einer
komplementären
funktionellen Gruppe einer Verbindung von biologischem Interesse
reagieren können.
Die äußere Hülle kann
gegebenenfalls noch andere ethylenisch ungesättigte Monomere in einer ausreichenden
Menge aufweisen, um wasserunlösliche
Polymerteilchen zu erzeugen. Zu den Hüllenmonomeren, die zum Beispiel eine
Epoxygruppe enthalten, gehören
Glycidylmethacrylat, Glycidylacrylat, Vinylglycidylether und Methallylglycidylether.
Nach der Synthese des Polymerteilchens wird die Verbindung von biologischem
Interesse kovalent an das Polymerteilchen gebunden, wobei das gewünschte Teilchenreagens
entsteht. Die Polymerteilchenreagentien, für die die Erfindung gilt, können nach
den Verfahren hergestellt werden, die in den US-Patenten Nr. 4,401,765
und 4,480,042 dargelegt sind.
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Vermutlich erfolgt die bisher beobachtete
Aktivitätsabnahme
bei Teilchenreagentien während
der Lagerung aufgrund einer sekundären Bindung zwischen der Verbindung
von biologischem Interesse und nicht besetzten Epoxid-Bindungsstellen
auf der Oberfläche
des Polymers. In dem Verfahren der vorliegenden Erfindung wird das
oben beschriebene Polymerteilchenreagens während einer Zeit und unter
Bedingungen, die einer Reduktion der restlichen Epoxidgruppen und
dem Hinzufügen
einer negativen Ladung, zum Beispiel durch Einführung von Carboxygruppen auf
der Polymeroberfläche,
zuträglich
sind, mit β-Mercaptoessigsäure oder Thiosulfat
inkubiert. Der pH-Wert der Reaktion wird gemäß bekannten Einschränkungen,
die der an das Polymerteilchen gebundenen Verbindung von biologischem
Interesse inhärent
sind, variieren. Eine Anleitung zur Auswahl des optimalen pH-Werts
für Reaktionen
mit Verbindungen von biologischem Interesse findet man bei J. F.
King, R. Rathore, J. Y. L. Lamb, Z. R. Guo und D. F. Klassen, "pH
Optimization of Nucleophilic Reactions in Water", Journal of the
American Chemical Society, Vol. 114, S. 3028–33 (1992).
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Die Temperatur der Reaktion muss
unterhalb der Temperatur, die bewirkt, dass die Verbindung von biologischem
Interesse Aktivität
verliert, und oberhalb der Temperatur, bei der sie gefriert, liegen.
Bevorzugte Temperaturen liegen zwischen 4 und 100°C, besonders
bevorzugt oberhalb Raumtemperatur und am meisten bevorzugt zwischen
etwa 40 und 70°C.
Die Reaktion verläuft
jedoch bei Raumtemperatur, d. h. bei etwa 20°C, ausreichend und läuft in manchen
Fällen
auch bei 100°C.
Wie gesagt, hängen
die Einschränkungen
bezüglich Temperatur
und pH-Wert von der besonderen Verbindung von biologischem Interesse,
die an das Polymerteilchen gebunden ist, ab und variieren mit dieser.
Die Temperaturen und pH-Werte, bei denen solche Verbindungen Aktivität verlieren,
sind bekannt oder können
relativ leicht mit wohlbekannten Techniken bestimmt werden. Die β-Mercaptoessigsäure und
das Thiosulfat tragen funktionelle Gruppen und werden während des
Schritts der Inkubation mit dem Teilchenreagens gepuffert, um den
pH-Wert oberhalb des pKa der reaktiven funktionellen
Gruppe des Modifikators zu halten.
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Die Reaktion wird im folgenden anhand
eines aminfunktionellen Wirkstoffs erläutert. Zuerst wird das Polymerteilchen
kovalent an die Verbindung von biologischem Interesse, in diesem
Fall einen Wirkstoff mit Aminfunktionalität, gebunden.
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Dann wird das Reagens mit dem Modifikator
umgesetzt, der unten als X bezeichnet ist.
wobei R ein Wirkstoff oder
Wirkstoffanalogon ist, zum Beispiel Vancomycin, und X eine bifunktionelle
Verbindung mit niedrigem Molekulargewicht ist, die eine funktionelle
Gruppe, die eine negative Ladung trägt, und eine andere funktionelle
Gruppe, die gegenüber
dem Teilchen reaktiv ist, aufweist.
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Die obigen Reaktionen zeigen ein
komplementäres
Paar von allgemeinen Reaktanten (Amine, die mit Epoxiden reagieren),
das geeignet ist, um die Verbindung von biologischem Interesse mit
Latexteilchen zu verknüpfen.
Weitere komplementäre
Paare, die geeignet sind, um Verbindungen von biologischem Interesse
an Epoxide zu koppeln, gehören
unter anderem Sulfhydryle, Imide und Phenole. Weitere komplementäre Paare von
Reaktanten, die geeignet wären,
um Verbindungen von biologischem Interesse an Teilchen zu koppeln, sind
wohlbekannt; dazu gehören
zum Beispiel unter anderem Aldehyde und Amine, Aldehyde und Thiole, Chlormethylphenylgruppen
und Amine, Vinylsulfone und Thiole, Amine und aktivierte Carboxygruppen.
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Experimente wurden mit verschiedenen
Wirkstoffen durchgeführt.
Es folgen die Synthese und das Testen von Teilchenreagentien unter
Verwendung des Aminoglycosidantibiotikums Vancomycin sowie Phenobarbital
und Chinidin.
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Beispiele
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Beispiel 1
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Reagensmodifikation mit
Aminoglycosid-Antibiotikum (Vancomycin)
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Materialien und Verfahren:
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Die für die Teilchenreagenssynthese
verwendeten Materialien wurden von Aldrich Co. erhalten, mit Ausnahme
des Vancomycin-Hydrochlorids und des Fraktion-V-Rinderserumalbumins (BSA), die von der
Sigma Co. erhalten wurden, Ibex EP-110, ein Tensid, das von der Rhône-Poulenc
Co. erhalten wurde, und Mikrobeninhibitoren, die von der Supelco
Co. erhalten wurden. Underivatisierter Epoxid-Hülle/Kern-Latex
(Epoxidlatex) wurde nach einem zuvor veröffentlichten Verfahren hergestellt,
das im US-Patent Nr. 4,480,042 dargelegt ist. Der zum Testen verwendete
Antikörper
wurde von einer Maus-Hybridomzelllinie erhalten, die durch Fusion
von Milzzellen von Mäusen
erhalten wurden, die mit einem Vancomycin-Glutaraldehyd-Schlitzschnecken-Hämocyanin-Immunogen
immunisiert worden waren. Der Antikörper war ein Antikörper des
Anti-Vancomycin-IgG1-Typs.
Er wurde in Mäusen
produziert und durch Protein-A-Affinitäts reinigung isoliert. Das Antikörper-Verdünnungsmittel
war eine 100 nM Lösung
von Natriumphosphat mit pH 5,5, die 150 mM Natriumchlorid und 1%
Fraktion-V-BSA enthielt.
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Eine Diafiltration wurde unter Verwendung
einer kommerziell erhältlichen
Hohlfaser-Diafiltrationskartusche durchgeführt. Eine Zentrifugation wurde
unter Verwendung einer DuPont-Sorval®-RC28S-Zentrifuge durchgeführt. Die
Immunoassaytests wurden unter Verwendung eines Cobas-Bio-Analyseautomaten
von der Roche Diagnostics Co. durchgeführt. Der Analysator wurde so
programmiert, dass er bei 37°C
arbeitete. Die Nachweiswellenlänge
betrug 340 nm. Er gab zuerst ein Gemisch aus 51 μl Wasser und anschließend 150 μl eines Gemischs
von Teilchenreagens und Assaypuffer zusammen. Der Assaypuffer war
ein Gemisch von 25 mM Borax, 172 mM Borsäure, 600 mM Natriumchlorid
und 1% eines anionischen Tensids. Dann wurden eine Probe von 3 μl Eichsubstanz
und anschließend
20 μl Wasser
hinzugefügt,
und dieses Gemisch wurde 30 Sekunden lang inkubiert. Eichsubstanzen
wurden aus Lösungen
bekannter Mengen von Vancomycin in gepooltem Humanserum hergestellt.
Eine Ablesung der optischen Dichte, die als "Hilfsablesung" identifiziert
und in Extinktionseinheiten (AU, wobei ein AU gleich der Extinktion
ist, die bewirkt, dass Licht auf einer logarithmischen Skala um
einen Faktor 10 verringert wird) gemessen wird, wurde vorgenommen,
und dann wurden 10 μl
einer Antikörperlösung hinzugefügt, um die
Reaktion einzuleiten. Nachdem die Reaktion eingeleitet war, wurden
Ablesungen vier Minuten lang in Abständen von 10 Sekunden vorgenommen.
Die Assayreaktion auf die Eichsubstanzen wurde nach einer von zwei
Methoden berechnet; entweder (i) durch Subtraktion der Hilfsablesung
von der endgültigen
Ablesung, was eine Vier-Minuten-Endpunktmessung ergibt, oder (ii)
durch Berechnung der Anfangsraten aus der Änderung der optischen Dichte
während
der ersten 10 Sekunden der Reaktion nach der ersten Ablesung, was
eine Ratenmessung ergibt.
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Reagentiensynthese
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a. Synthese des Teilchenreagens
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Bei der Synthese wurden zwei Puffer
verwendet. Der erste ist ein Kopplungspuffer (ungefähr pH 9,2), bei
dem es sich um 50 mM Natriumtetraborat-Decahydrat (19,05 g/l) mit
2,0% EP-110 handelte (66,7 ml des Produkts, wie es vom Hersteller
erhalten wurde, pro Liter Endgemisch). Bei dem zweiten Puffer handelte
es sich um Reagensvorratspuffer, und zwar 15 mM, pH 7,8, Phosphatpuffer
mit 1,2% EP-110.
Dieser wurde hergestellt, indem man 2,07 g NaH2PO4·H2O, 13,1
ml 1 N NaOH und 40,0 ml EP-110 mit Wasser mischte, so dass man 1,0
l erhielt.
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50 ml eines 65-nm-Epoxidlatex mit
20% Feststoffen wurde mit 46 ml Kopplungspuffer gemischt. Zu dieser
Suspension wurde unter Rühren
eine Lösung
von 400 mg Vancomycin-Hydrochlorid in 4 ml Wasser gegeben. Dieses
Gemisch wurde 22 Stunden lang bei 40°C in einem zirkulierenden Wasserbad
erhitzt. Das Produkt wurde durch Diafiltration unter Verwendung
einer H1MPO1-43-Hohlfilterkartusche gereinigt, wobei man einen Arbeitsdruck
von 10 psi und ein Arbeitsvolumen von 150–190 ml Latex verwendete. Waschpuffer,
der aus einem 1 : 1-Gemisch aus Kopplungspuffer und Vorratspuffer,
die oben beschrieben sind, bestand, wurde mit derselben Geschwindigkeit
zugeführt,
wie abfließende
Lösung
aufgefangen wurde. Nachdem 2 labfließende Lösung aufgefangen worden war,
wurde der Auffüllpuffer
von Waschpuffer zu reinem Vorratspuffer gewechselt. 600 ml Vorratspuffer
wurden eluiert, bevor der Vorgang gestoppt wurde. Der gereinigte
Latex wurde konzentriert, die Diafiltrationskartusche wurde mit
Vorratspuffer gespült,
und das Endvolumen des Konzentrats und der Spüllösungen wurde auf 200 ml gebracht.
Dieses Reagens wird in den anschließenden Abschnitten von Beispiel
1 als Reagens 1A identifiziert.
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b. Postsynthetische chemische
Modifikation
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Zwei 10-ml-Aliquote von Reagens 1A
wurden eine Stunde lang mit 28 000 U/min zentrifugiert, was einen
klaren Überstand
ergab, der dekantiert und verworfen wurde. Das Latexteilchensediment
von einer Probe wurde unter Rühren
in Kopplungspuffer resuspendiert, und das andere wurde in Kopplungspuffer
(Borat), der 100 mM Natriumβ-mercaptoacetat
(BMA) (11,4 g/l) enthielt, resuspendiert. Beide Latices wurden 18
Stunden lang bei 40°C
inkubiert und dann wie oben zentrifugiert, mit Vorratspuffer auf
dasselbe Volumen resuspendiert, ein zweites Mal zentrifugiert und
ein zweites Mal mit Vorratspuffer auf dasselbe Volumen resuspendiert.
Diese Produkte werden in den anschließenden Abschnitten von Beispiel
1 als Reagens 2A bzw. 2B identifiziert.
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Reagenstests
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c. Vergleichende Tests auf
Aktivität
des Reagens
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Die Teilchenreagentien wurden jeweils
1/45 in Assaypuffer verdünnt.
Diese Konzentration des Reagens ergab eine optische Dichte von ungefähr 1 AU
mit einer Weglänge
von 1 cm, wenn mit dem Cobas-Bio-Analyseautomaten gemessen wurde.
Die in dem Antikörperreagens
verwendete Konzentration des Antikörpers betrug 111 μg/ml. Die
Reagentien 1A, 2A und 2B wurden unter Verwendung der oben beschriebenen
Assaybedingungen auf den Geschwindigkeitsmodus des Nachweises getestet.
Die erhaltenen Standardkurven sind unten in Tabelle 1 gezeigt: Tabelle
1
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2 zeigt
die verbesserte Aktivität
des mit BMA behandelten Reagens. Die obere Kurve stellt das Teilchenreagens
nach der Behandlung mit BMA in Boratpuffer dar. Die zweite Kurve
stellt das unbehandelte Reagens dar, und die untere Kurve stellt
das mit Boratpuffer allein behandelte Reagens dar. Das erwartete
Ergebnis ist die bei Behandlung mit Boratpuffer erhaltene Aktivität. Das unerwartete
Ergebnis wird durch die obere Kurve dargestellt: die Aktivitätserhöhung bei
Reagentien, die mit BMA behandelt wurden. Ein Aktivitätsverlust
wird erwartet, da sich Vancomycin bekanntermaßen unter den Bedingungen der
Reaktion umlagert. Das mit BMA in Vorratspuffer behandelte Vancomycin-Reagens
zeigte eine erhöhte
Aktivität.
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d. Vergleichende Tests auf
Stabilität
des Reagens
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Von den oben beschriebenen Reagentien
1A, 2A und 2B wurden jeweils Proben bei 35°C gelagert, während alle
anderen Reagentien bei 4°C
gelagert wurden. Proben wurden entnommen und in Assays für Vancomycin,
wie sie oben beschrieben sind, verwendet. In diesem Fall wurden
die Daten bei dem Vergleich unter Verwendung des oben beschriebenen
Vier-Minuten-Endpunktsassay-Reaktionsmodells genommen. Die Assays
wurden an den Tagen 0, 1, 4, 7 und 11 durchgeführt, nachdem die Teilchenreagentien
bei 35°C
gelagert worden waren. Das Ziel des Assays besteht darin, zu bestimmen,
ob die Agglutinierungsreaktion an den nachfolgenden Tagen mit derselben
Geschwindigkeit fortschreitet wie am Tag 0. Die Reaktion jedes der
Reagentien ist in den 1A, 1B und 1C gezeigt. In dieser Reihe von Graphiken
ist die Assayreaktion in mAU für
jeden Tag des Tests gezeigt. Die Figuren zeigen die erhöhte Stabilität des mit
BMA behandelten Vancomycin-Reagens
im Vergleich zu den unbehandelten Vancomycin-Reagentien. Die Aktivität des mit
BMA behandelten Vancomycin-Reagens war an den Tagen 1, 4, 7 und
11 dieselbe wie am Tag 0, was die Stabilität des Reagens im Laufe der
Zeit beweist, wenn es bei einer kühlen Temperatur gelagert wird. 1B zeigt den Aktivitätsverlust im
Laufe der Zeit, wenn das Vancomycin-Reagens unbehandelt ist. Die
bei 4°C
gelagerten Proben der unbehandelten Reagentien (?) schienen nach
11 Tagen noch stabil zu sein, aber die bei 35°C gelagerte Probe (?) verlor
in derselben Zeit etwa 20% ihrer Aktivität. Die Aktivität des nur
mit Boratpuffer behandelten Vancomycin-Reagens nahm bei einem mAU
von bis zu 640 am Tag 0 ebenfalls mit der Zeit ab und nahm bei einem
mAU von 850 am Tag 0 mit der Zeit zu. Zunahmen oder Abnahmen der
Aktivität
sind unerwünscht.
Die Aktivität
des Teilchenreagens sollte unabhängig
von einer Lagerung im Laufe der Zeit konstant bleiben. Die postsynthetische
Modifikation des Teilchenreagens durch Behandlung mit einem Modifikator,
wie BMA, ergibt sowohl die gewünschte
Stabilität
als auch eine erhöhte
Immunreaktivität.
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Beispiel 2
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Chinidin-Assay
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a. Synthese des Teilchenreagens
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Chinidin-Teilchenreagens wurde durch
die Kopplung eines Chinidinderivats an ein Kern/Hülle-Latexteilchen
synthetisiert. Das Kern/Hülle-Latexteilchen
besteht aus einem Polystyrolkern mit hohem Brechungsindex und einer
Hülle aus
Glycidylmethacrylat, das mit Ethylenglycoldimethacrylat vernetzt
ist. Funktionelle Epoxidgruppen auf der Teilchenoberfläche können mit
nucleophilen Struktureinheiten reagieren. Das verwendete Chinidinderivat
war ein aminohaltiges Addukt zwischen 11-(2-Carboxyethylthio)dihydrochinidin
(QAD) und einer Spacergruppe (2,2'-(Ethylendioxy)diethylamin).
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QAD wird durch die radikalische Addition
von 3-Mercaptopropionsäure
an die Chinidin-Doppelbindung hergestellt, wobei 2,2'-Azobis(isobutyronitril)
als Starterradikalquelle verwendet wird.
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b. Postsynthetische chemische
Modifikation
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Eine Probe des nach dem in Abschnitt
a von Beispiel 2 beschriebenen Verfahren synthetisierten Chinidin-Teilchenreagens
wurde als Kontrolle beiseite gestellt. Teilchenreagentien mit inaktiviertem
Oberflächen-Epoxid
wurden nach dem folgenden Löschverfahren
hergestellt. Proben von Chinidin-Teilchenreagens (5,0 ml) wurden
zentrifugiert, und der Überstand
wurde verworfen. Der Feststoff wurde in Löschpuffer (5 ml, 50 mM Natriumcarbonatlösung, pH
9,0) resuspendiert. Anschließend
wurde der Modifikator (Natriummercaptoessigsäure, 43 mg, oder Natriumthiosulfat-Pentahydrat,
48 mg) hinzugefügt.
Der pH-Wert jeder Reaktion wurde auf 9,5 eingestellt. Die Gemische
wurden gemischt und dann 16 Stunden lang bei 70°C inkubiert. Dann wurden die
verschiedenen Chinidin-Teilchenreagentien durch Zentrifugation und
Resuspension (3 ×)
in Teilchenwaschpuffer (15 mM Phosphatpuffer, 1,0% eines anionischen
Tensids, pH 7,4) gereinigt. Die endgültigen Sedimente wurden in
Teilchenvorratspuffer (15 mM Phosphatpuffer, 0,5% anionisches Tensid)
resuspendiert und mit Ultraschall behandelt, bis das Extinktionsverhältnis A340/A600 über 10,0
lag.
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c. Assayanalyse
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Das resultierende Teilchen wurde
in Phosphatassaypuffer (105 mM, pH 7,0, 0,4% eines anionischen Tensids,
0,002% Thimerosal) verdünnt
(1 : 50, was eine Extinktion bei 340 nm von 1 AU ergab). Das Antikörperreagens
war eine Aszitesprobe von monoklonalem Antikörper (5 mg/ml, 1 : 45 verdünnt in 50
mM Natriumphosphatpuffer, 75 mM Natriumchlorid, 0,1% Natriumazid,
0,05% Thimerosal bei pH 6,7). Chinidin-Eichsubstanzen für den aca® Discrete
Clinical Analyzer von DuPont wurden verwendet, um die Standardkurven
zu erzeugen. Turbidimetrische Immunoassays wurden mit einem klinischen
Analysegerät
des Typs Cobas Bio von Roche Diagnostics Co. bei 37°C durchgeführt, wobei
man den in Beispiel 1 beschriebenen Endpunkt-Messungstyp verwendete,
der wie folgt modifiziert wurde: Teilchenreagens (240 μl), Probe
(4 μl) und
Wasser (14 μl)
wurden inkubiert (30 s). Die Reaktion wurde mit Anti-Chinidin (20 μl, mit 20 μl Wasser
nachgespült)
eingeleitet. Die Reaktionsgeschwindigkeit wurde berechnet, indem
man die ursprüngliche
Hilfsablesung über
ein Intervall von 220 Sekunden von dem Endpunkt subtrahierte. Aggregationsreaktionen
auf verschiedene Eichniveaus der Chinidin-Teilchenreagens-Kontrolle
gegenüber
einem über
BMA modifizierten Reagens sind in Tabelle 2 gezeigt.
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Tabelle
2
Chinidin-Assayergebnisse für die Kontrolle und für BMA-behandelte
Teilchenreagentien
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Die Ergebnisse zeigen, dass Reagentien,
die nach der Reagenssynthese mit β-Mercaptoessigsäure behandelt
wurden, eine gegenüber
der Kontrolle merklich verbesserte Aktivität aufweisen. Das erhöhte Agglutinierungssignal
wird als immunspezifisch bestätigt,
da eine reduzierte Antikörperkonzentration
erneut zu einer Eichstandardkurve führt, die gleich derjenigen
der Kontrollteilchenprobe ist.
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Beispiel 3
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Phenobarbital-Assay
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a. Synthese des Teilchenreagens
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Kopplungspuffer (164 ml, 20 mM Boratpuffer,
0,3% IBEX EP-110, 0,005% Thimerosal, pH 8,0), Phenobarbital/PEPA-Konjugat
(12 ml einer 10%igen DMSO-Lösung,
Addukt zwischen Phenobarbital-3-(5-valeriansäure) und Polyethylen-Polyamin-Linker) und Teilchenrohmaterial
(24 ml mit 20% Feststoffen, 70 nm Polystyrol/Polyglycidylmethacrylat-Kern/Hülle-Latexteilchen)
wurden nacheinander in ein Reaktionsgefäß gegeben. Der pH-Wert wurde
auf 8,0 eingestellt. Die Lösung
wurde sechs Stunden lang auf 70°C
erhitzt. Dann wurde der pH-Wert auf 6,5 eingestellt. Diese Teilchenlösung wurde
dann durch Lösungsmittel-Diafiltration
(2 l eines 20 mM Boratpuffer, 0,30% Ibex EP-110, 0,005% Thimerosal,
pH 8,0) über
eine Hohlfasersäule
(Amicon, 0,10-μm-Kartusche)
gereinigt. Dann erfolgte eine zweite Diafiltration in den Teilchenvorratspuffer
(1,2 l eines 5 mM Citratpuffers, 0,30% Ibex EP-110, pH 5,5). Der
resultierende Teilchenrückstand
wurde in dem Teilchenvorratspuffer auf 200 ml gebracht.
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Phenobarbital-3-(5-valeriansäure) kann
durch eine Substitutionsreaktion zwischen Phenobarbital und Ethyl-5-bromvalerat
und anschließende
Hydrolyse des Esters hergestellt werden. Diese Arten von Reaktionen sind
beschrieben in J. March, "Advanced Organic Chemistry", 5. 357, 349
(McGraw-Hill Publishers, 1977). Der Polyethylen-Polyamin-Linker
wurde bereits im US-Patent Nr. 4,581,337 (W. A. Frey und D. M. Simons)
beschrieben.
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b. Postsynthetische chemische
Modifikation
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In jedes Reaktionsgefäß wurden
nacheinander Wasser (0,5 ml), Phenobarbital-Teilchenreagens (2,0 ml) und Löschpuffer
(2,5 ml, 100 mM Phosphatpuffer, 2% Ibex EP-110, pH 6,5) gegeben.
In diesem Stadium des Experiments wurde eine Kontrolle beiseite
gestellt. Die zu löschenden
Proben wurden weiterhin mit (i) BMA (57 mg) oder (ii) Natriumthiosulfat-Pentahydrat
(124 mg) oder (iii) einem Gemisch von 5,5-Dithiobis(2-nitrobenzoesäure) (DTNB)
(50 mg) und Dithiothreit (DTT) (19 mg) oder (iv) einem Gemisch von
DTNB (50 mg) und DTT (19 mg) sowie β-Mercaptoethanol (2ME) (9 μl) behandelt.
Der pH-Wert jeder Reaktion wurde auf 6,5 eingestellt. Die Gemische
wurden gerührt
und dann 1,5 Stunden bei 70°C
inkubiert. Dann wurden die verschiedenen Phenobarbital-Teilchenreagentien
durch Zentrifugation und Resuspension (3x) in Teilchenvorratspuffer gereinigt.
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c. Assayanalyse
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Turbidimetrische Immunoassays wurden
mit einem Dimension® Clinical Analyzer von
DuPont durchgeführt.
Eine allgemeine Vorschrift beinhaltet die Suspension von Phenobarbital-Teilchenreagens
(40 μl,
1 : 5 in Teilchenverdünnungsmittel
verdünnt)
und Wasser (40 μl)
in Assaypuffer (150 μl,
200 mm Phosphatpuffer, 0,64% anionisches Tensid, etwa 0,01% antimikrobieller
Konservierungsstoff, pH 7,0). Die Reaktion wird durch die Zugabe
von monoklonalem Anti-Phenobarbital-Antikörper (ungefähr 10 μg/Assay in 40 μl eines 10
mM Phosphatpuffers, 1 M Natriumchlorid, etwa 0,01% antimikrobieller
Konservierungsstoff, 1% BSA) und Wasser (40 μl) eingeleitet. Die Reaktionsgeschwindigkeit
wurde unter Verwendung des Endpunktverfahrens der Messung in mAU
pro 240 Sekunden berechnet.
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Die Ergebnisse der turbidimetrischen
Immunoassays für
eine Kontrolle und ein Phenobarbital-Teilchenreagens, wobei das
Epoxid entweder mit BMA oder mit Thiosulfat behandelt wurde, sind
in Tabelle 3 angegeben. Die in Tabelle 3 dargelegten Ergebnisse
zeigen, dass sowohl die postsynthetische chemische Modifikation
mit BMA als auch mit Thiosulfat die Aktivität des Phenobarbitalreagens
erhöhte.
Die Behandlung mit Thiosulfat ergab für das Phenobarbital-Teilchenreagens
bessere Ergebnisse als die Behandlung mit BMA.
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Tabelle
3
Phenobarbital-Assayeraebnis:
Kontrolle gegenüber BMA-
oder Thiosulfat-Behandlung
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Anmerkung: Phenobarbital-Teilchen
wurden nach Standard-Beladungsverfahren hergestellt, und danach
erfolgte ein Löschschritt
zur Beseitigung von aktiven Epoxidgruppen auf der Oberfläche mit
Hilfe von BMA oder Thiosulfat.
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Die Ergebnisse der turbidimetrischen
Immunoassays für
eine Kontrolle und ein Phenobarbital-Teilchenreagens, wobei das
Epoxid entweder mit Gemischen von DTNB und DTT oder von DTNB, DTT
und 2ME behandelt wurde, sind in Tabelle 4 angegeben. Diese Ergebnisse
zeigen, dass auch andere negativ geladene Modifikatoren die Aktivität verbessern.
In getrennten Tests hat sich jedoch gezeigt, dass eine Behandlung
mit 2ME allein die Aktivität
nicht verbessert.
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Tabelle
4
Phenobarbital-Assayergebnisse:
Kontrolle gegenüber mit
DTNB/DTT oder DTNB/DTT/2ME gelöschten
Teilchen bei identischer Antikörperkonzentration
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Anmerkung: Phenobarbital-Teilchen
wurden nach Standard-Beladungsverfahren hergestellt, und danach
erfolgte ein Löschschritt
zur Beseitigung von aktiven Epoxidgruppen auf der Oberfläche mit
Hilfe von Gemischen von DTNB, DTT und 2ME.
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Die Werte der Thiosulfataktivität in Tabelle
3 sind für
die Eichwerte 0, 10 und 20 hoch. Um zu zeigen, dass die Werte auf
die Thiosulfatbehandlung und nicht auf eine unspezifische Aggregation
zurückzuführen sind,
wurde die Assaystöchiometrie
reoptimiert. Standardkurven mit erhöhten Signalen wurden durch
weitere Verdünnung
des Antikörperreagens
in dem Assay erhalten. Die Ergebnisse der Optimierung der Standardkurve
für das
mit Thiosulfat behandelte Teilchen sind in Tabelle 5 gezeigt. Ähnlich sind
die Ergebnisse der Optimierung der Standardkurve für die mit
DTNB/DTT und die mit DTNB/DTT/2ME behandelten Teilchen in Tabelle 6
gezeigt.
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Tabelle
5
Ergebnisse der Assay-Standardkurvenoptimierung für Thiosulfatteilchen
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Anmerkung: Mit Thiosulfat behandelte
Teilchen mit einem verstärkten
Standardkurvensignal wurden durch weitere Verdünnung des Antikörperreagens
reoptimiert, so dass man eine normale Standardkurvenform erhielt.
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Tabelle
6
Ergebnisse der Assay-Standardkurvenoptimierung für mit DTNB/DTT
oder DTNB/DTT/2ME behandelte Teilchen
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Anmerkung: Sowohl mit DTNB/DTT als
auch mit DTNB/DTT/2ME behandelte Teilchen mit verstärkten Standardkurvensignalen
wurden durch weitere Verdünnung
des Antikörperreagens
reoptimiert, so dass man eine normale Standardkurvenform erhielt.
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Die verschiedenen Proben wurden bei
35°C gelagert
und so, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist, auf Stabilität getestet.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 aufgeführt.
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Tabelle
7
Beschleunigte Eichstabilität für Phenobarbital-Teilchenreagentien
-
Die Stabilitätswerte in Tabelle 7 stellen
die prozentuale Verschiebung gegenüber 0 dar. Wie oben in Bezug
auf die 1A, B und C gesagt
wurde, sollte ein stabiles Reagens keine Aktivitätsänderung aufweisen, was eine
Veränderung
von 0% ergeben würde.
Aktivitätserhöhungen werden
durch positive Zahlen dargestellt. Aktivitätsabnahmen werden durch negative
Zahlen dargestellt. Die unverarbeitete Kontrollprobe in Tabelle
7 stellt die Grundlinie dar. Bei den Reagentien, die mit den Modifikatoren
behandelt wurden, die in Tabelle 7 oberhalb der Kontrolle identifiziert
sind, nimmt man an, dass sie sich besser als die Kontrolle verhalten.
Die Reagentien, die mit Modifikatoren unterhalb der Kontrolle behandelt
wurden, waren weniger stabil als die Kontrolle. Eine Behandlung
von Teilchenreagentien in Tabelle 7 mit 2ME und Monothioglycerin
allein erhöhte
die Stabilität
der Reagentien. Die Ergebnisse von Assays zum Vergleich der Aktivität der mit
2ME und der mit Monothioglycerin behandelten Reagentien mit dem
unbehandelten Kontrollrea gens zeigten keine signifikante Aktivitätsänderung.
Nur eine postsynthetische Modifikation mit BMA oder Thiosulfat erhöhte also
sowohl die Stabilität
im Laufe der Zeit als auch die Aktivität der Phenobarbital-Teilchenreagentien.
Durch BMA- oder
Thiosulfat-Behandlung wird der Polymeroberfläche eine negative Ladung hinzugefügt. Bei
einer Behandlung mit 2ME und Monothioglycerin unter den Bedingungen
der hier definierten Reaktion ist dies nicht der Fall.
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Die postsynthetische Modifikation
von Teilchenreagentien mit BMA erhöhte die Stabilität und verbesserte überraschenderweise
auch die Immunaktivität
bei allen getesteten Teilchenreagentien. Die Thiosulfat-Behandlung
verbesserte die Aktivität
des Chinidin-Teilchenreagens nicht, verbesserte jedoch die Aktivität und Stabilität des Phenobarbital-Teilchenreagens.
