CH634150A5

CH634150A5 - Immunologisches bestimmungsverfahren.

Info

Publication number: CH634150A5
Application number: CH1160177A
Authority: CH
Inventors: Hans-Harald Dr Sedlacek; Roloff Dr Johannsen; Friedrich-Robert Dr Seiler
Original assignee: Behringwerke Ag
Priority date: 1976-09-25
Filing date: 1977-09-22
Publication date: 1983-01-14
Also published as: AU513660B2; NO773267L; DE2643208C2; GB1592610A; IT1154001B; AU2900477A; DK421977A; FR2365800A1; NL7710310A; US4166106A; JPS6120815B2; FR2365800B1; CA1093464A; ZA775700B; AT358185B; DE2643208A1; BE859054A; SE7710710L; NZ185242A; ATA683877A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur qualitativen oder quantitativen Bestimmung eines Partners einer immunologischen Reaktion unter Ausnutzung der bekannten Affinität von Antikörpern und Antigenen zueinander durch Verminderung unspezifischer Bindungen. Sie macht von der Tatsache Gebrauch, dass derartige Reaktionen mit Hilfe von bestimmten Identifizierungsmerkmalen deutlicher registrierbar gemacht werden können.

In immunologischen Reaktionen mit markierten Reaktionspartnern werden grundsätzlich folgende Methoden unterschieden: der direkte Test und die indirekten Techniken.

Beim direkten Test wird der zu bestimmende Reaktionspartner, meist das Antigen, kenntlich gemacht durch Inkubation mit einem spezifischen gegen ihn gerichteten und markierten zweiten Reaktionspartner, meist einen Antikörper.

Bei indirekten Techniken wird der zu bestimmende Reaktionspartner mit einem spezifisch gegen ihn gerichteten zweiten Reaktionspartner inkubiert und nach Abtrennung und Entfernung der nicht gebundenen Menge des zweiten Reaktionspartners das Reaktionsgemisch mit einem spezifisch gegen den zweiten Reaktionspartner gerichteten dritten, meist markierten Reaktionspartner, inkubiert.

Es ist dem Fachmann bekannt, dass sich der direkte Test auszeichnet durch eine hohe Spezifität. Sein Nachteil ist die geringe Sensitivität. Andererseits sind die indirekten Techniken bekannt für ihre hohe Sensitivität, jedoch geringe Spezifität.

Als eine der wesentlichen Ursachen, die bei dem direkten Test und den indirekten Techniken die Spezifität beeinflussen, ist die unspezifische Bindung der Antikörper an das Antigen und dessen ihn umgebende Strukturen anzusehen.

Die unspezifische Bindung wird hauptsächlich verursacht durch Bereiche des sog. Fc-Teiles des Antikörpers (=Immung-lobin)-MoIeküles. Das gilt auch für hoch spezifische Antikörper.

Die Bindungsaffinität der Fc-Teile des Antikörpers zu verschiedenen, in der Literatur als Fc-Rezeptoren umschriebenen Strukturen von Zellen oder Geweben wird verstärkt, wenn sich im Antikörpermolekül eine Konformationsänderung vollzieht. Diese tritt auf bei der spontanen Aggregation von Antikörpermolekülen in Antikörperpräparationen, bei der Bindung von Antikörpern an ein Antigen (Immunkomplexe) oder bei der Adsorption von Antikörpermolekülen an künstliche Flächen, z.B. Latexpartikel.

Bislang wurden verschiedene Methoden zur Verminderung der unspezifischen Bindung angewandt: z.B. Elimination von Aggregaten oder Immunkomplexen aus Antikörperpräparationen durch Ultrazentrifugation, Zugabe von Albumin zu den Antikörperpräparationen zur Porteinstabilisierung oder Verhinderung von Aggregatbildungen.

In dem direkten Test und in den indirekten Techniken wurden zusätzlich erfolgreich Antikörperpräparationen benutzt, deren Fc-Teil durch bekannte Methoden abgespalten worden war, ohne die immunologische Reaktionsweise des Restfragments F(ab)i oder F(ab)2 wesentlich zu beeinträchtigen.

Diese Methoden sind durch die Herstellung von F(ab)i-bzw. F(ab)2-Fragmenten der jeweiligen Antikörper jedoch aufwendig, zum Teil, insbesondere bei der Verwendung von Anti-serien in indirekten Techniken, nur sehr schwierig durchzuführen.

Mit vorliegender Erfindung wird nun die direkte und indirekte Technik zur Immunreaktion mit markierten Reaktionspartnern in einfacher Weise derartig verändert, dass auch bei Verwendung von nativen Antikörpern bzw. derartige Antikörper enthaltenden Seren die bekanntermassen hohe Sensitivität voll erhalten bleibt, während die bekanntermassen hohe Unspe-zifität auf ein Minimum reduziert wird.

Der Erfindung liegt der Gedanke zugrunde, dass im direkten Test und in indirekten Techniken eine Fc-vermittelte unspezifische Bindung nativer Antikörper vermieden werden kann, wenn die mit dem Fc-Teil reagierenden Strukturen der unterschiedlichen Antigene (im allgemeinen Sinne Fc-Rezeptoren) durch Immunglobulinfragmente, welche Bindungsaffinitäten zu diesen Fc-Rezeptoren im allgemeinen Sinne haben, vorher abgesättigt worden sind. Hierbei sollten die Immunoglobulin-fragmente möglichst von Immunglobulinen einer Spezies stammen, von welcher auch der Antikörper (direkter Test) bzw. der Erstantikörper (indirekte Techniken) stammen. Alle eingesetzten Antikörper dürfen andererseits keine Spezifität gegen dieses Immunglobulinfragment besitzen. Sofern es dem Test nach erforderlich ist, dürfen die verwendeten Immunglobulinfragmente des weiteren kein Komplement binden.

Eine aus möglicherweise sterischen Gründen bedingte Hemmung der spezifisch immunologischen Reaktion, wie sie vergleichsweise bei Verwendung von nativen Immunglobulinen oder Immunglobulinaggregaten anstelle von Immunglobulinfragmenten auftritt, ist bei Anwendung von Immunglobulinfragmenten mit Affinitäten zu Fc-Rezeptoren nicht zu finden.

Des weiteren erlaubt die Verwendung von Immunglobulinfragmenten, beispielsweise von Fc-Fragmenten von unterschiedlichen Immunglobulinklassen, dass Antikörper, gerichtet gegen Teile von Immunglobulinen, z.B. deren leichte Ketten, gegen das Bruchstück Fd oder gegen F(ab)-Fragmente der jeweiligen Immunglobulinklassen in dem direkten oder indirekten Test eingesetzt werden können, ohne mit dem Fc-Fragment immunologisch zu reagieren.

Gegenstand der Erfindung ist demnach ein Verfahren zur qualitativen oder quantitativen Bestimmung eines Partners einer immunologischen Reaktion im direkten Test oder in indirekten Techniken dadurch gekennzeichnet, dass das im allgemeinen Sinne Fc-Rezeptoren tragende Antigen vorab in Kontakt gebracht wird mit einem Immunglobulinfragment, welches Bindungsaffinitäten zu Fc-Rezeptoren im allgemeinen Sinne besitzt und dass nachfolgend Antikörper eingesetzt werden, die keine Spezifität gegen das Immunglobulinfragment besitzen. Dies führt zu einer bedeutenden Verbesserung des Ergebnisses der immunologischen Bestimmung durch Verminderung unspezifischer Nebenreaktionen.

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Als indirekte Techniken im Sinne der Erfindung gelten alle Reaktion gebracht. Nach Entfernung der nicht gebundenen Teste, bei welchen der gesuchte Reaktionspartner durch mehr Menge Komplements wird das am Antigen bzw. am Antigen-als nur einen weiteren Reaktionspartner nachgewiesen wird. Antikörperkomplex gebundene Komplement mit einem mar-Zu indirekten Techniken im Sinne der Erfindung zählen somit kierten, spezifisch gegen Komplement gerichteten Antikörper insbesondere der Antiglobulin test, der indirekte Test mit Kom- 5 nachgewiesen.

plement und der Sandwichtest. Es steht dem Fachmann selbstverständlich frei, im Rahmen

Diese Methoden sind ausführlich in J.H. Humphrey R.G. der vorliegenden Erfindung die ihm bekannten Identifizie-White, kurzes Lehrbuch der Immunologie, Thieme-Verlag Stut- rungsmerkmale zu verwenden, wie beispielsweise die Markie-gart, 1975 Seite 257-260, in D.M. Weir, Handbook of Experimen- rung mit Fluoreszenzfarbstoffen, die radioaktive Markierung tal Immunology, Blackwell, Oxford, 1973, Seite 18.14-18.16 und io oder die Enzym-Markierung.

von G. Wiek (1972) in «Wiener klinische Wochenschrift», 84.1, Die erfindungsgemässe Anwendung von Immunglobulin-Seite 2-7, unter Zugrundelegung von Fluoreszenzfarbstoffen fragmenten mit Bindungsaffinitäten zu Fc-Rezeptoren im allge-als Identifizierungsmerkmal beschrieben. meinen Sinne ist im folgenden Beispiel für den direkten Test

Die Methodik der indirekten Techniken kann derart erwei- und den Antiglobulintest kurz beschrieben.

tert werden, dass alle verwendeten Antikörper markiert sind is Beim Nachweis bzw. der Bestimmung eines Antigens ent-und/oder dass zusätzlich zu einem dritten Reaktionspartner sprechend der Erfindung bringt man die zu untersuchende weitere, spezifisch gegen den vorhergehenden Reaktionspart- Probe oder eine Verdünnungsserie davon mit unterschiedli-ner gerichtete Reaktionspartner benutzt werden. chen Mengen, beginnend mit beispielsweise 1 mg, eines

Ferner gehören demnach zu indirekten Techniken alle Ver- Immunoglobulin-Fragmentes in Kontakt, welches Bindungsaffini-fahren, wonach die Inkubation mit markierten Antikörpern 20 täten zu Fc-Rezeptoren im allgemeinen Sinne besitzt, z.B. das mehrmals durchgeführt wird. Fc-Fragment von IgG nach Papain-Spaltung. Danach lässt man

Es ist literaturbekannt, dass zu Fc-Rezeptoren im allgemei- das Gemisch 20 Minuten bis 20 Stunden, vorzugsweise etwa 30 nen Sinne bestimmte Bereiche des Fc-Teiles der Immunglobu-, Minuten bei einer Temperatur zwischen 4-30 °C, vorzugsweise line eine hohe Affinität haben. Es ist weiterhin bekannt, dass etwa 20°C in Wasserdampf-gesättigter Atmosphäre stehen. Antikörper-Moleküle (Immunglobulin-Moleküle) durch proteo- 25 Sodann wird nichtgebundes Fc-Fragment vom Reaktions-lytische Enzyme in eine Anzahl von Fragmenten zerlegt wer- gemisch abgetrennt. Dies kann beispielsweise durch mehrmaligen. So spalten die Proteinasen Plasmin oder Papain das ges Waschen (in der Regel 2 x ) des Reaktionsgemisches, vor-Immungobulin-Molekül in zwei F(ab)i-Fragmente und ein Fe- zugsweise mit einer polyionischen, isotonischen wäSjprigen Fragment. Pepsin greift das Molekül an einer anderen Stelle an Lösung erfolgen. Nachfolgend bringt man das Reaktionsge-und führt danach zu einem bivalenten sog. F(ab)2-Fragment und 30 misch in Kontakt mit einer bekannten Menge des markierten zu weiteren kleineren Peptiden, z.B. zu pFc. Diese als Fc-Frag- Antikörpers, der spezifisch gegen das Antigen gerichtet ist mente oder pFc bezeichneten proteolytischen Abbauprodukte (direkter Test) bzw. mit einem Antiserum oder einem unmar-des Antikörper-Moleküls sind beispielsweise im Sinne der kierten Antikörper (Antiglobulin-Test) und lässt danach das Erfindung als Immunglobulinfragmente mit Affinitäten zu Fe- Gemisch 20 Minuten bis 20 Stunden, vorzugsweise etwa 30 Rezeptoren im allgemeinen Sinne einsetzbar. 35 Minuten bei einer Temperatur zwischen 4-30 °C in Wasser-

Beispiele der Herstellung von Fc-Fragment oder pFc finden dampf-gesättigter Atmosphäre stehen.

sich bei Porter, R.P. (1959), Biochem. J. 73,119; Hershgold, E.J. Nichtgebundene Antikörper werden durch mehrmaliges et al. (1963), Nature 199,284 und Haupt, H. (1969), Klin. Wschr. Waschen (in der Regel 2-6x) des Reaktionsgemisches, vor-47,270. zugsweise mit einer polyionischen isotonischen wässrigen

Die Methodik des direkten Tests und der indirekten Techni- 40 Lösung, von diesem abgetrennt. Nachfolgend wird im Falle des ken ist in folgenderweise beispielhaft kurz dargestellt: Antiglobulintests das Reaktionsgemisch in Kontakt gebracht

Beim direkten Test wird das Antigen enthaltende Substrat mit mit einer bekannten Menge eines markierten Antikörpers, der einem markierten Reaktionspartner, in der Regel mit einem spezifisch gegen den ersten Antikörper gerichtet ist und darspezifischen Antikörper, in Kontakt gebracht. Hierbei kommt aufhin unkubiert und gewaschen unter Bedingungen, wie für es zur Bindung des Antikörpers an das korrespondierende 45 den zuerst verwendeten Antikörper beschrieben.

Antigen. Das Antigen wird dadurch direkt nachgewiesen. Anschliessend wird j e nach Art des verwendeten Antigens

Bei indirekten Techniken wird der gesuchte Reaktionspart- das Reaktionsgemisch entweder auf einen Objektträger aufge-ner (beispielsweise das Antigen) durch mehr als nur einen wei- strichen (z.B. Zellsuspension) oder es ist bereits auf einem Träteren Reaktionspartner nachgewiesen. ger fixiert (z.B. histologischer Schnitt).

Beispielsweise wird im Antiglobulintest das Antigen enthal- 50 Die Untersuchung erfolgt mit Hilfe von dem Fachmann tende Substrat mit einem, gegebenenfalls markierten, spezifi- bekannten und von einschlägigen Firmen angebotenen qualita-schen Antikörper zur Reaktion gebracht, aus dem Reaktionsge- tiven und quantitativen Mess- und Beobachtungsgeräten wie misch der überschüssige Antikörper durch Waschen entfernt Fluoreszenzmikroskopen mit Auflicht- oder Durchlichtanre-und das Reaktionsgemisch mit einem zweiten markierten Anti- gung und Fluoreszenzphotometern, Photometern oder Strah-körper, der spezifisch gegen den zuerst eingesetzten Antikör- 55 lungsmessgeräten.

per gerichtet ist, zur Reaktion gebracht und nachfolgend die Die zur Verhinderung der unspezifischen Bindung optimale

Menge nicht gebundenen Antikörpers entfernt. Menge des Immunglobulinfragments mit Bindungsaffinitäten

Beim Sandwichtest wird ein Antikörper mit einem spezi- zu Fc-Rezeptoren, z.B. des Fc-Fragmentes, kann für jedes spezifisch gegen ihn gerichteten Antigen zur Reaktion gebracht, die fische Antigen durch einen Vorversuch unschwer ermittelt nicht gebundene Menge des Antigens entfernt und das Reak- 60 werden.

tionsgemisch mit einem markierten, wiederum spezifisch gegen Als Antigene kommen in Frage z.B. virale Antigene (z.B. das Antigen gerichteten Antikörper umgesetzt und die nicht Röteln-Antigen, Masern-Antigen, Hepatitis-Antigen), bakte-gebundene Menge des Antikörpers entfernt. rielle Antigene (z.B. Salmonella-Antigene, Escherichia coli-

Beim indirekten Test mit Komplement bindet das antigene Antigene, Staphylokokken-Antigene), Kohlenhydrat-Antigene Substrat entweder direkt Komplement, oder es wird mit einem es (z.B. Blutgruppensubstanzen), Protein-Antigene (z.B. Plasmo-komplementbindenden spezifisch gegen das Antigen gerichte- sproteine, wie Immunglobine, Komplementfaktoren), Glyko-ten Antikörper umgesetzt, nicht gebundener Antikörper wird protein-Antigene (z.B. ai-Antitrypsdin, Coeruloplasmin) und entfernt und das Reaktionsgemisch wird mit Komplement zur Lipoprotein-Antigene (z.B. ai-Lipoprotein).

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Sie können isoliert, gelöst, suspendiert, an Träger, beispielsweise wasserunlösliche Polymere wie chemisch quervernetzte Kohlenhydrate gebunden sein oder in bzw. auf Zellen vorkommen oder in histologischen Gewebsschnitten vorhanden sein.

Die für die Herstellung von Immunglobulin-Fragmenten mit Bindungsaffinitäten zu Fc-Rezeptoren im allgemeinen Sinne erforderlichen Immunglobuline werden in an sich bekannter Weise aus Blut bzw. Serum von Mensch oder Tier gewonnen. Jedoch ist im Sinne der Erfindung auch der Einsatz synthetischer Immunglobulin-Fragmente denkbar.

Die Verminderung der unspezifischen Bindung von spezifischen Antikörpern bei unveränderter Empfindlichkeit in der direkten und indirekten Technik durch die erfindungsgemässe Verwendung von Immunglobulin-Fragmenten mit Bindungsaffinitäten zu Fc-Rezeptoren beispielsweise Fc-Fragmenten verdeutlichen folgende Versuche, deren Ergebnisse zum Teil tabellarisch zusammengestellt sind.

In Tabelle 1 sind Ergebnisse dargestellt, die den Einfluss von Fc-Fragmenten von humanem IgG auf die unspezifische Bindung von Kaninchen- y-Globulin an die Oberfläche von Lymphozypten zweier Spender (Spalte A und B) sowie dessen Abhängigkeit von einer Vorinkubation der Lymphozyten mit Neuraminidase (Spalte C und D) zeigen. Neuraminidasebe-handlung von Lymphozyten erhöht, wie bereits beschrieben (Seiler et al. (1974), Behring Inst. Mitt. Nr. 55,258) den Anteil an Fc-Rezeptoren tragenden Zellen.

Wie aus Tabelle 1 (Spalte B und D) hervorgeht, wird die unspezifische Bindung von Kaninchen-y-Globulin in der Doppelantikörpermethode an Lymphozyten durch Vorbehandlung mit Fc-Fragmenten im Vergleich zu nicht mit Fc-Fragmenten behandelten Zellen (Spalte A und C) wesentlich reduziert.

Werden als weiteres Beispiel Gefrierschnitte verschiedener Organe, z.B. Leber oder Niere von Maus, Ratte, Kaninchen oder Mensch, auf Glasobjektträger nach bekannter Methodik aufgezogen, mit etwa 0,1 ml einer 1% oder 0,l%igen Lösung von Fc-Fragementen von humanem IgG in einer feuchten Kammer 30 Minuten bei 20 °C inkubiert, nachfolgend leicht in isotonischer Salzlösung gewaschen und anschliessend ein Doppelantikörpertest in bekannter Weise (indirekte Methode) (G. Wiek (1972), Wien. klin. Wschr. 84,2-7) unter Verwendung von menschlichen Antiseren als ersten Antikörper und einem zweiten Antikörper, der nicht mit dem Fc-Fragment kreuzreagiert durchgeführt, so ergibt sich eine geringere unspezifische Bindung der Antikörper an den Gefrierschnitt als bei einem nicht in obiger Weise mit Fc-Fragmenten vorbehandelten Gefrierschnitt.

VCN = Vibrio cholerae meuraminidase 25 U/5xl07 Zellen, 30 min, 37 °C.

FC = Fc-Fragment von humanem IgG, 1% Stammlösung.

0,1 ml jeder Verdünnung auf 5x 106 Zellen (Sediment) 5 für 30 min bei Raumtemperatur, nachfolgend 2

Waschungen.

* = Reziproker Titer der Antikörper- oder

Fc-Verdünnung.

** = Unspezifisch gefärbte Lymphozyten in %.

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Dass die Absättigung von Fc-Rezeptoren auf Lymphozyten, beispielsweise mit Hilfe von Fc-Fragmenten, im Gegensatz zur Verwendung von Immunglobulinaggregaten nicht zur steri-schen Behinderung von in der Nachbarschaft gelegenen Anti-15 genstrukturen führt, zeigt das in Tabelle 2 aufgeführte Beispiel: Hier wurden lymphoblastoide Kulturzellen des Lymphozyten-typs B (RPMI1788) mit einem Antiserum (Serum 196602) inkubiert, welches die sogenannte gemischte Lymphozytenkultur (MLC) hemmt. Infolge der Übereinstimmung von antigenen 2o Strukturen von Lymphozyten des Typs B in der MLC und der lymphoblastoiden Kulturzelle binden sich Antikörper dieses Antiserums an die lymphoblastoide Zelle. Diese können durch einen gegen den Erstantikörper gerichteten und markierten Zweitantikörper (FITC-Anti-IgM oder FITC-Anti-k + Anti-1) 25 nachgewiesen werden. Es ist bekannt, dass hierbei unspezifische Reaktionen durch das Fc-Teil der Immunaggregate oder Immunkomplexe, vorhanden in den Antikörperpräparationen, zu falsch-positiven Ergebnissen führen können. Eine vorherige Absättigung der sogenannten Fc-Rezeptoren auf den Zellen 30 mit Hilfe von Aggregaten von Immunglobulin G hat, wie aus Spalte C ersichtlich und ebenso literaturbekannt, zur Folge,

dass praktisch alle Antikörper, möglicherweise durch sterische Behinderung, sich nicht mehr an die Zelle binden können. Bei Verwendung von Fc-Fragmenten anstelle von Immunglobulin-35 aggregaten tritt eine Behinderung der Antikörper nicht mehr auf (Spalte D), obwohl Fc-Fragmente die Fc-Rezeptoren absättigen, da nachfolgend eingesetzte Immunglobulinaggregate sich nicht mehr an die Zelle binden können (Spalte E).

Das erfindungsgemässe Verfahren ist aufgrund des vorher «io Gesagten somit besonders geeignet zur Verbesserung einer immunologischen Reaktion durch Verminderung unspezifischer Bindungen beim Nachweis von cytoplasmatischen, Zellmembran- (insbesondere von MLC-Determinanten) oder von Zellkern-Antigenen, von Antigenen im Gewebe, von Antigenen 45 auf Trägern oder von Antikörpern, die gelöst sind.

Tabelle 1

Behindert der unspezifischen Bindung von normalem Kaininchen-y-Globulin an menschliche periphere Lymphozyten in der indirekten Methode durch Fc-Fragmente von humanem IgG

Ä B C D

VCN -Fe

Spender I

Kaninchen-Y-Globulin 1* 8**

4 6

Spender II

Kaninchen-y-Globulin 1* 11

4 5

16 4

Tabelle 2

Inhibition der Bindung von aggregiertem IgG durch Fc-Fragmente von IgG Zielzelle: RPMI 1788

Spalte

Fe

IgG-Aggr.

Serum 196602

FITC Anti-IgM

FITC Anti-k + Anti-1

A

_

18*

22*

B

-

+

28

40

C

+

0

D

•

-

+

35

43

E

+

31

40

* % angefärbte Lymphoblasten

Die Erfindung wird im nachfolgenden Beispiel des Nachweises von zellmembrangebundenen MLC-Determinanten auf Lymphozyten näher erläutert:

- - - + + + + 1* 10 100 - 1 10 100

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5 2

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14 3

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12 10

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Beispiel Mit Hilfe eines Fluoreszenzmikroskopes wird der Anteil

Humane periphere Lymphozyten werden nach bekannter fluoreszierender Zellen an den Gesamtzellen ausgezählt und in Methode aus venösem Vollblut isoliert. Die so erhaltene Lym- Prozent angegeben.

phozytensuspension besteht aus einem Zellgemisch, vorwie- Ergebnis: Die Anzahl positiver Zellen nach Behandlung mit gend von Lymphozyten des Typs B und des Typs T. Mit Hilfe s Fc-Fragment sind in der Spalte II der Tabelle 3 angegeben. Es bekannter Methoden werden die Zellen des Typs T bestmög- ist offensichtlich, dass im Vergleich zu den Werten, erhalten lieh abgetrennt und verworfen. Die verbleibenden Lymphozy- mit den gleichen Antikörpern nur ohne Behandlung mit Feten, angereichert mit dem Zelltyp B, werden 2x in einer isotoni- Fragment (Spalte I) eine Abnahme der positiven Zellen anzusehen Kochsalzlösung gewaschen. Eine Anzahl von Zellsedi- treffen ist. Diese Abnahme ist von Serum zu Serum unter-menten, jeweils 1 x 106 Lymphozyten, werden in je 0,1 ml einer io schiedlich. Eine Differenzierung zwischen positiven und negati-1 %igen Lösung von Fc-Fragment von IgG (diese Menge hat ven Seren ist somit besser möglich.

sich in vorausgegangenen Versuchen als optimal erwiesen)

resuspendiert und 30 min bei Zimmertemperatur inkubiert. Die Tabelle 3

Ansätze werden nachfolgend 2 x mit isotonischer Kochsalzlö- Reduktion der unspezifischen Bindung von Antigenen an sung gewaschen. Jeder Ansatz (Zellsediment) wird mit 0,1 ml is Lymphozyten durch Fc-Fragment-Vorinkubation eines zu prüfenden menschlichen Serums resuspendiert und bei Raumtemperatur inkubiert. In dem vorliegenden Beispiel kommen 9 Prüfseren und ein negatives Kontrollserum (AB) zum Einsatz. Nachfolgend wird das Reaktionsgemisch in einer isotonischen Kochsalzlösung 3 x gewaschen.

Das Sediment wird mit 0,05 ml eines fluoreszeinmarkierten Antikörpers vom Kaninchen, gerichtet gegen die leichten Ketten von menschlichen Immunglobulinen (l%ige Proteinlösung)

resuspendiert, 30 min bei Raumtemperatur unkubiert und nachfolgend 3 x in einer isotonischen Kochsalzlösung gewaschen.

Anschliessend wird das Sediment in 0,05 ml Rinderserumal-buminlösung (2% w/v) resuspendiert und die Suspension auf einen Objektträger ausgestrichen, luftgetrocknet und nach bekannter Art mit Glycerin eingebettet.

3o * % positiver Lymphozyten

Seren ohne Fe mit Fe

20075

23*

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20138

19

14

20330

26

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18

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27

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AB

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Claims

634150 PATENTANSPRÜUCHE

1. Verfahren zur qualitativen oder quantitativen Bestimmung eines Partners einer immunologischen Reaktion im direkten Test oder in indirekten Techniken, dadurch gekennzeichnet, dass das Antigen vorab in Kontakt gebracht wird mit einem Immunglobulinfragment, welches Bindungsaffinitäten zu Fc-Rezeptoren im allgemeinen Sinne besitzt und dass nachfolgend Antikörper eingesetzt werden, die keine Spezifität gegen dieses Immunglobulinfragment besitzen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass eine Menge von Immunglobulinfragmenten eingesetzt wird, die äquivalent ist zu der Menge abzusättigender Fc-Rezeptoren.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass als Immunglobulinfragment, welches Bindungsaffinitäten zu Fc-Rezeptoren im allgemeinen Sinne besitzt, das Fc-Frag-ment oder das pFc-Fragment von Immunglobulinen eingesetzt wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass im Zytoplasma, in der Zellmembran, im Zellkern, in Geweben befindliche Antigene, insbesondere MLC-Determinanten, bestimmt werden.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass Antikörper in Lösung bestimmt werden.