NO773267L - Immunologisk bestemmelsesfremgangsmaate - Google Patents
Immunologisk bestemmelsesfremgangsmaateInfo
- Publication number
- NO773267L NO773267L NO773267A NO773267A NO773267L NO 773267 L NO773267 L NO 773267L NO 773267 A NO773267 A NO 773267A NO 773267 A NO773267 A NO 773267A NO 773267 L NO773267 L NO 773267L
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- antibody
- immunoglobulin
- fragment
- receptors
- fragments
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 42
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 title description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 38
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 38
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 37
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 claims description 19
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 claims description 19
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 18
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 claims description 18
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 claims description 18
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 18
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 claims description 17
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 claims description 17
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 14
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 12
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 claims description 8
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 claims description 7
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 claims 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 claims 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 20
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 19
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 14
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 12
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 10
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 4
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 2
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 2
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 229920000831 ionic polymer Polymers 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 2
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 2
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 2
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241001556449 Garrha rubella Species 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 201000005505 Measles Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 206010029719 Nonspecific reaction Diseases 0.000 description 1
- 102000019040 Nuclear Antigens Human genes 0.000 description 1
- 108010051791 Nuclear Antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- -1 complement factors) Proteins 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 108010074605 gamma-Globulins Proteins 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 230000029983 protein stabilization Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000007086 side reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 229920003176 water-insoluble polymer Polymers 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/563—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving antibody fragments
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2474/00—Immunochemical assays or immunoassays characterised by detection mode or means of detection
- G01N2474/20—Immunohistochemistry assay
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/962—Prevention or removal of interfering materials or reactants or other treatment to enhance results, e.g. determining or preventing nonspecific binding
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/80—Fluorescent dyes, e.g. rhodamine
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/805—Optical property
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
Immunologisk bestemmelsesfremgangsmåte.
Oppfinnelsen vedrørér en fremgangsmåte til kvalitativ eller kvantitativ bestemmelse av en partner av en immunologisk reaksjon under utnyttelse av den kjente affinitet av antilegemer og antigener til hverandre ved nedsettelse av uspesifikke bindinger. Den gjør bruk av det faktum at slike reaksjoner kan gjøres tydelig registrerbare ved hjelp av bestemte identifiseringstrekk.
I immunologiske reaksjoner med markerte reaksjons-deltagere adskilles prinsippielt følgende metoder: den direkte' prøve og de indirekte teknikker.
Ved den direkte prøve synliggjøres den.reaksjonsdeltager som skal bestemmes, for det meste antigenet, ved inku-basjon med en spesifikk mot det rettet og markert annen reaksjonsdeltager, for det meste antilegemet.
Ved indirekte teknikker inkuberes .den reaksjonsdeltager som skal bestemmes med en spesifikk mot en rettet annen reaksjonsdeltager og ett.er adskillelse og fjerning av den ikke bundne mengde av den annen reaksjonsdeltager inkuberes reaksjonsblandingen med en spesifikk mot den annen reaksjonsdeltager rettet tredje, for det meste markert reaksjonsdeltager.
Det er kjent.for fagfolk at den direkte prøve ut-merker seg ved en høy spesifitet. Dens ulempe er den lille sensitivitet. På den annen side er den indirekte teknikk kjent for sin høye sensitivitet, imidlertid lille spesifitet.
Som en av de vesentlige årsaker, som ved den direkte prøve og den indirekte teknikk påvirker spesifiteten er
■ det å anse den uspesifikke binding av antilegemet til antigenet og dets strukturer som omgir det.
Den uspesifikke binding forårsakes hovedsakelig ved områder av såkalt Pc-deler av antilegemet (= immunglobulin)-molekylet. Det gjelder også for høyspesifikke antilegemer.
Bindingsaffiniteten av Fc-delene av antilegemet
til forskjellige, i litteraturen som Fc-reseptorer omtalte strukturer av celler eller vevnader forsterkes, når det i antilegememolekylet fullfører seg en konformasjonsendring.
Denne opptrer med den spontane aggregasjon av antilegememole-kyler i antilegemepreparater, ved binding av antilegemer til et antigen (immunkompleks) eller ved adsorpsjonen av antilegeme-molekyler til kunstige flater, f.eks. latekspartikler.
Hittil ble forskjellige metoder anvendt for nedsettelse av den uspesifikke binding: f.eks. eliminering av aggregater eller immunkomplekser av antilegemepreparater ved ultrasentrifugering, tilsetning av albumin til antilegemepreparater til proteinstabilisering eller hindring av aggregatdannelse.
I den direkte prøve og i de indirekte teknikker
ble det i tillegg med resultat benyttet antilegemepreparater, hvis Fc-del var blitt avspaltet ved kjente metoder uten vesentlig å påvirke den immunologiske reaksjonsmåte av restfragment F(ab)1eller F(ab)2.
Disse metoder er ved fremstilling av F(ab)-^- resp. F(ab)2_fragmenter av de eventuelle antilegemer imidlertid om-stendelige, delvis bare meget vanskelig å gjennomføre spesielt ved''anvendelse av antiserer i indirekte teknikker.
Med foreliggende oppfinnelse endres nå den direkte og indirekte teknikk til immunreaksjon med markerte reaksjons-deltagere på enkel måte, således at også ved anvendelse av native antilegemer resp. sera som inneholder slike antilegemer, som som kjent.fullt ut bibeholder høy sensitivitet, mens den til en viss grad kjente høy uspesifitet reduseres til.et minimum.
Til grunn for oppfinnelsen ligger den tanke at i den direkte prøve og i indirekte teknikker kan det unngås en Fc-formidlet uspesifikk binding av native antilegemer, når de med Fc-delen reagerende strukturer av de forskjellige antigener (på vanlig måte Fc-reseptorer) ved immunglobulinfragmenter, som har bindingsaffiniteter på vanlig måte til disse Fc-reseptorer på forhånd har blitt avmettet. Hertil bør immunglobulinfragmentene mest mulig stamme fra immunglobuliner av en type, hvorfra også antilegemet (direkte prøve) resp. første antilegeme (indirekte teknikker) stammer. Alle anvendte antilegemer bør på
den annen side ikke ha spesifitet mot dette immunglobulinfragment. Hvis det ifølge prøven er nødvendig bør de anvendte immunglobulin-
fragmenter videre ikke binde komplement.
En av muligens steriske grunner betinget hemming av den spesifikke immunologiske reaksjon,.slik den sammenlig-ningsmessig opptrer ved anvendelse av native immunglobuliner eller immunglobulinaggregater istedenfor immunglobulinfragmenter er ikke å finne ved anvendelsen av immunglobulinfragmenter med affiniteter til Fc-reseptorer.
Videre muliggjør anvendelse av immunglobulinfragmenter, eksempelvis av Fc-fragmenter av forskjellige immunglobulinklasser at antilegemer rettet mot deler av immunglobuliner, f.eks. deres lette kjeder, kan anvendes mot bruddstykket Fd eller mot F(ab)-fragmenter av de eventuelle immunglobulinklasser i den direkte eller indirekte prøve uten å reagere immunologisk med Fc-fragmentet.
Oppfinnelsens gjenstand er følgelig en fremgangsmåte til kvalitativ eller kvantitativ bestemmelse av en deltager av en immunologisk reaksjon i direkte prøve eller i indirekte teknikker, idet fremgangsmåten erkarakterisert vedat på vanlig .måte bringes Fc-reseptoreholdige antigener på forhånd i kontakt med et immunglobulinfragment,.som har bindingsaffiniteter til Fc-reseptorer på vanlig måte og at deretter anvendes antilegemer som ikke har spesifitet mot immunglobulinfragmenter. Dette fører til en betydelig forbedring av resultatene av den immunologiske bestemmelse ved nedsettelse av uspesifikke bireaksjoner.
Som indirekte teknikker innen•oppfinnelsens ramme gjelder alle prøver hvor den søkte reaksjonsdeltager påvises ved mer enn bare en ytterligere reaksjonsdeltager. Til de indirekte teknikker innen oppfinnelsens ramme regnes således spesielt antiglobulinprøven, den indirekte prøven med komplement og sandwichprøven.
Disse metoder er utførlig omtalt i J.H.•Humphrey, R.G. White, Kurzes Lehrbuch der Immunologie, Thieme-Verlag Stuttgart, 1975, side 257-260, i D.M. Weir, Handbook of Experi-mental Immunology, Blackwell, Oxford, 1973, side 18.14 - 18.16 og av G.Wick (1972) i "Wiener klinische Wochenschrift", 84.1, side 2-7>under tilgrunnleggelse av fluoressensfarvestoffer som identifiseringstrekk.
Metodikken for de indirekte teknikker kan utvides således at alle anvendte antilegemer er markert og/eller at i tillegg til en tredje reaksjonsdeltager benyttes ytterligere spesifikt mot den foregående reaksjonsdeltager rettet reaksjonsdeltager.
Videre hører det følgelig til de indirekte teknikker alle fremgangsmåter, ifølge hvilke inkubasjonen gjennom-føres flere ganger med markerte antilegemer.
Det .er kjent fra litteraturen at til Fc-reseptorer i vanlig betydning har bestemte områder av Fc-delen av immunglobulin en høy affinitet. Det er videre kjent at antilegememolekylet (immunglobulin-molekylet) ved proteolytiske enzymer spaltes i et antall fragmenter. Således spalter proteinasene plasmin eller papain immunglobulin-molekylet i to F(ab^-fragmenter og et Fc-fragment. Pepsinet angriper molekylet et annet sted og fører deretter til et bivalent, såkalt F(ab)2-fragment og til ytterligere mindre peptider, f.eks. til pFc. Disse som Fc-fragmenter eller pFc-betegnede proteolytiske avbygningspro-dukter av antilegememolekylet er eksempelvis innen oppfinnelsens ramme anvendbar som immunglobulinfragmenter med affiniteter til Fc-reseptorer i vanlig betydning.
Eksempler for fremstilling av Fc-fragment eller
pFc befinner seg hos Porter, R.P. (1959), Biochem. J. 73, 119; Hershgold, E.J. et al. (1963) Nature 199, 284 og Haupt, H.
(1969), Klin. Wschr. 47, 270.
Metodikken av den direkte prøve og av de indirekte teknikker er eksempelvis kort vist på følgende måte:-
Ved den direkte prøve bringes det antigenholdige substrat i kontakt med en markert reaksjonsdeltager, vanligvis med et spesifikt antilegeme. Hertil kommer det til binding av antilegemet til'det korresponderende antigen. Antigenet påvises derved direkte.
Ved indirekte teknikker påvises den søkte reaksjonsdeltager (eksempelvis antigenet) ved flere enn bare en ytterligere reaksjonsdeltager.
Eksempelvis bringes i antiglobulinprøven antigenholdige substrat til reaksjon med et eventuelt markert, spesifikt antilegeme, fjernes fra reaksjonsblandingen av overskytende antilegeme ved vasking og reaksjonsblandingen bringes til reaksjon med et annet markert antilegeme som er rettet spesifikt mot det først anvendte antilegeme og deretter fjernes mengden ikke-bundet antilegeme.
Ved sandwichprøven bringes et antilegeme til reaksjon med det spesifikt mot det rettede antigen, den ikke bundne mengde av antigenet fjernes og reaksjonsblandingen om-settes med et markert, igjen spesifikt mot antigenet rettet antilegeme og den ikke bundne mengde antilegeme fjernes.
Ved den indirekte prøve med komplement binder
det antigene substrat enten direkte komplement eller det om-settes med et komplementbindende spesifikt mot antigenet rettede antilegeme, ikke bundet antilegeme fjernes og reaksjonsblandingen bringes til reaksjon med komplement. Etter fjerning av den ikke bundne mengde komplement påvises det til antigenet resp. til antigen-antilegemekomplekset bundede komplement med et markert, spesifikt mot komplementet rettede antilegeme.
Det står selvsagt fagfolk fritt innen rammen av foreliggende oppfinnelse å anvende de for han kjente identifiseringstrekk, som eksempelvis markering med fluoressensfarvestoffer, den radioaktive markering eller enzym-markering.
Anvendelsen ifølge oppfinnelsen av immunglobulinfragmenter med bindingsaffiniteter til Pc-reseptorer på vanlig måte er i det følgende eksempel kort omtalt for den direkte prøve og antiglobulinprøven.
Ved påvisning resp. bestemmelse av et antigen tilsvarende oppfinnelsen bringer man prøven som skal.undersøkes eller en fortynnings serie herav i kontakt med forskjellige mengder, begynnende med eksempelvis 1 mg av et immunglobulinfragment,
som har bindingsaffiniteter til Fc-reseptorer på vanlig måte, f.eks. Fc-fragmentet av IgG etter papainspaltning. Deretter lar man blandingen stå 20 minutter til 20 timer, fortrinnsvis ca.
30 minutter ved en temperatur mellom 4-30°C, fortrinnsvis ca.
20°C i vanndampmettet atmosfære.
Deretter adskilles ikke-bundet Fc-fragment fra reaksjonsblandingen. Dette kan eksempelvis foregå ved flere gangers vasking (vanligvis 2 ganger) av reaksjonsblandingen, fortrinnsvis med en polyionisk isotonisk vandig oppløsning, deretter bringer man reaksjonsblandingen i kontakt med en kjent mengde av det markerte antilegeme som er rettet spesifikt mot antigenet (direkte prøve) resp. med et antiserum eller et umar-kert antilegeme (antiglobulinprøven) og lar deretter blandingen stå 20 minutter til 20 timer, fortrinnsvis ca. 30 minutter ved en temperatur mellom 4 og 30 C i vanndampmettet atmosfære.
Ikke bundet antilegeme adskilles ved flere gangers vasking (vanligvis 2-6 ganger) av reaksjonsblandingen, fortrinnsvis med en polyionisk isotonisk vandig oppløsning fra denne. Deretter bringes i tilfellet antiglobulinprøven av reaksjonsblandingen i kontakt med en kjent.mengde av et markert antilegeme som er rettet spesifikt mot første antilegeme og derpå inkuberes og vaskes under betingelser som omtalt for det først anvendte antilegeme.
Deretter blir alt etter typen av det anvendte antigen reaksjonsblandingen enten- påstrøket på en objektbærer (f.eks. cellesuspensjon) eller det er allerede fiksert på en bærer (f.eks. histologisk snitt).
Undersøkelsen foregår ved hjelp, av for fagfolk kjente og fra firmaer tilbudte kvalitative og kvantitative måle- og iakttagelsesapparater, som fluoressensmikroskoper med pålys- eller gjennomlysenergisering og fluoressensfotometere, fotometere eller strålingsmåleapparater.
Den til å hindre den uspesifikke binding optimale mengde av immunglobulinfragmentet med bindingsaffiniteter til Pc-reseptorene, f.eks. av Pc-fragmentet, kan lett fastslås for hvert spesifikt antigen ved hjelp av et forforsøk..
Som antigener kommer det på tale f.eks. virale antigener (f.eks. røde hunder-antigen, mesling-antigen, hepa-titis-antigen), bakterielle antigener (f.eks. Sålmonella-antigener, Escherichia coli-antigener, Staphylokokk-antigener), karbohydratantigener (f.eks. blodgruppestoffer), protein-antigener (f.eks. plasmaproteiner, som immunglobuliner, komplement-faktorer), glykoprotein-antigener (f.eks. a-^-antitrypsin, coeruloplasmin) og lipoprotein-antigen (f.eks. ct-^-lipoprotein).
De kan isoleres, oppløses, suspenderes, være bundet på bærer, eksempelvis vannuoppløselige polymere som kjemisk tverrnettdannede karbohydrater eller forekomme i resp. på celler eller være tilstede i histologiske vevnadssnitt.
De for fremstillingen av immunglobulinfragmentene med bindingsaffiniteter til Fc-reseptorer i vanlig forstand nødvendige immunglobuliner utvinnes på i og for seg kjent måte av blod resp. serum fra mennesker eller dyr. Imidlertid er det innen oppfinnelsens ramme også tenkelig anvendelsen av syntetiske immunglobulinfragmenter.
Nedsettelsen av den uspesifikke binding av spesifikke antilegemer ved uendret følsomhet i den direkte og indirekte teknikk ved anvendelsen ifølge oppfinnelsen av immunglobulinfragmenter med bindingsaffiniteter til Fc-reseptorer, eksempelvis Fc-fragmenter anskueliggjør følgende f©rsøk, hvis . resultater delvis er oppstillet tabellarisk.
I tabell 1 er det vist resultater som viser inn-virkning av Fc-fragmenter avhhumant IgG på den uspesifikke binding av kaninpy-globulin på overflaten av lymfocyter av to donatorer (spalte A og B) samt dets avhengighet av en forinkubasjon av lymfocyter med neuraminidase (spalte C og D). Neuraminidasebe-handlingen av lyififocyter øker som allerede omtalt (Seiler et al.
(1974) Behring Inst. Mitt. No. 55, 258) andelen av Fc-reseptor-bærende celler.
Som det fremgår av tabell 1 (spalte B og D) reduseres vesentlig den uspesifikke "binding av kanin-y-globulin i dobbeltantilegememetoden til lymfocyter ved forbehandling med Fc-fragmenter sammenlignet til ikke'med Fc-fragmenter behandlede celler (spalte A og C).
Opptrekkes som ytterligere eksempel frysesnitt av forskjellige organer, f.eks. lever eller nyre fra mus, rotte, kanin eller menneske, på glassobjektbærer etter kjent. metodikk inkuberes med ca. 0,1 ml av en 1% eller 0,1%-ig oppløsning av Fc-fragmenter av human IgG i et fuktig kammer 30 minutter ved 2 0°C, vaskes deretter lett i isotonisk saltoppløsning og deretter gjennomføres en dobbeltantilegemeprøve på kjent.måte (indirekte metode), (G. Wick (1972) Wien. klin. Wschr. 84, 2-7) under anvendelse av menneskelig antisera som første antilegeme og.et annet antilegeme som ikke kryssreagerer med Fc-fragmentet, så fremkommer en mindre uspesifikk binding av antilegemet til fryse-snittet enn ved et ikke på overnevnte måte med Fc-fragmenter forbehandlet frysesnitt.
At avmetningen av Fc-reseptorer på lymfocyter, eksempelvis ved hjelp av Fc-fragmenter, i motsetning til anvendelse av immunglobulinaggregater ikke fører til sterisk hindring av i naboskap plasserte antigenstrukturer viser det i tabell 2 oppførte eksempel: Her ble lymfoblastoide kulturceller av lymfocyt-typen B (RPMI 1788) inkubert med et antiserum (Serum 196602), som hemmer den såkalte blandede lymfocytkultur (MLC). På grunn av overensstémmelseaav antigenstrukturer av lymfocyter av typen B i MLC og lymfoblastoidkulturcellene binder antilegemer av dette antiserum seg til de lynffoplastoide celler. Disse kan påvises ved hjelp av et mot første antilegeme rettet og markert annet antilegeme (FITC-anti-IgM eller FITC-anti-k + anti-1). Det er kjent at hermed kan uspesifikke reaksjoner ved Fc-delen av immunaggregatene eller immunkomplekset tilstede i antilegeme-preparatene føre til falsk-positive resultater. En foregående avmetning av de såkalte Pc-reseptorer på cellene ved hjelp av aggregater av immunglobulin G har, som det fremgår av spalte C og som det likeledes er kjent fra litteraturen til følge at praktisk talt alle antilegemer muiigvis på.grunn av sterisk hindring ikke mere kan binde seg til cellen. Ved anvendelse av Pc-fragmenter istedenfor immunglobulinaggregater opptrer ikke mer en hindring av antilegemene (spalte D), enskjønt Fc-fragmenter avmetter Fc-reseptorene, da nedenfor anvendte immunglobulinaggregater ikke mere kan binde seg til cellene, (spalte
E).
Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er på grunn av det overnevnte således spesielt egnet til forbedring av en immunologisk reaksjon til nedsettelse av uspesifikke betingelser ved påvisning av cytoplasmatiske, cellemembran- og spesielt av MLC-determinanter) eller av cellekjerne-antigener, av antigener i vevnad, av antigener på bærere eller av antilegemer som er oppløst.
Oppfinnelsen forklares nærmere ved hjelp av følg-ende eksempel for påvisning av cellemembranbundede MLC-determinanter på lymfocyter:
Eksempel.
Humane perifere lymfocyter isoleres etter kjente metoder fra venøst fullblod. Den således dannede lymfocytsus-pensjon består av en celleblanding, overveiende av lymfocyter av typen B ogtypen T. Ved hjelp av kjente metoder adskilles cellene av typen T best mulig og kasseres. De gjenblivende lymfocyter anriket med celletype B vaskes to ganger i en isotonisk koksaltoppløsning. Et antall av cellesedimenter, hver gang 1 x 10 lymfocyter, resuspenderes i hver gang 0,1 ml av en l$-ig oppløsning av Fc-fragment av IgG (denne mengde har i for-utgående forsøk vist seg som optimal) og inkuberes 30 minutter ved værelsestemperatur. Blandingene vaskes deretter to ganger med isotonisk koksaltoppløsning. Hver blanding (cellesediment) resuspenderes med 0,1 ml av et menneskelig serum som skal under-søkes og inkuberes ved værelsestemperatur. I foreliggende eksempel kommer det til anvendelse 9' prøvesera og et negativt kontrollserum (AB). Deretter vaskes reaksjonsblandingen tre ganger i en isotonisk koksaltoppløsning.
Sedimentet resuspenderes med 0,05 ml av en fluor-eszeinmarkert antilegeme av kaniner, rettet mot de lette kjeder av menneskelig immunglobulin, (1%-ig proteinoppløsning) inkuberes 30 minutter ved værelsestemperatur og vaskes deretter tre ganger i en isotonisk koksaltoppløsning.
Deretter resuspenderes sedimentet i 0,05 ml storfeserumalbuminoppløsning ( 2%<w>/v) og suspensjonen utstrykes på en objektbærer, lufttørkes og innleires etter kjent metode, med glycerol.
Ved hjelp av fluoressensmikroskopet uttelles mengden fluoresserende celler av samlede celler og angis i prosent.
Resultat: Antall positive celler etter behandling med Pc-fragment er angitt i spalte II i tabell 3. Det er tydelig at sammenlignet til verdier oppnådd med de samme antilegemer var uten behandling med Pc-fragmentet (spalte I) er det å på-treffe en avtagning av de positive celler. Denne nedgang er forskjellig fra serum til serum. En differensiering mellom positive og negative sera er således bedre mulig.
Tabell 3.
Reduksjon av uspesifikk bindingav antigener til lymfocyter ved Pc-fragment-forinkubasjon.
Claims (5)
1. Fremgangsmåte til kvalitativ eller kvantitativ bestemmelse av en deltager av en immunologisk reaksjon i direkte prøve eller i indirekte teknikkerjkarakterisert ved at antigenet på forhånd bringes i kontakt med et immunglobulinfragment som har bindingsaffiniteter til Fc-reseptorer i vanlig forstand og at deretter anvendes antilegemer som ikke harnoen spesifitet mot dette immunglobulinfragment.
2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det anvendes en mengde av immunglobulinfrag mentene som er ekvivalente til mengden av Fc-reseptorer som skal avmettes.
3. Fremgangsmåte ifølge krav 1-2, karakterisert ved at det som immunglobulinfragment som har bindingsaffiniteter til Fc-reseptorer i vanlig forstand anvendes Fc-fragmentet eller pFc-fragmentet av immunglobuliner.
4. Fremgangsmåte ifølge krav 1-3, karakterisert ved at det bestemmes i cytoplasma, i cellemembran, i cellekjerne, i vevnader befinnende antigener, spesielt MLC-determinanter.
5. Fremgangsmåte ifølge krav 1-3, karakterisert ved at antilegemer bestemmes i oppløsning.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE2643208A DE2643208C2 (de) | 1976-09-25 | 1976-09-25 | Immunologisches Bestimmungsverfahren |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO773267L true NO773267L (no) | 1978-03-29 |
Family
ID=5988821
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO773267A NO773267L (no) | 1976-09-25 | 1977-09-23 | Immunologisk bestemmelsesfremgangsmaate |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4166106A (no) |
| JP (1) | JPS5341422A (no) |
| AT (1) | AT358185B (no) |
| AU (1) | AU513660B2 (no) |
| BE (1) | BE859054A (no) |
| CA (1) | CA1093464A (no) |
| CH (1) | CH634150A5 (no) |
| DE (1) | DE2643208C2 (no) |
| DK (1) | DK421977A (no) |
| FR (1) | FR2365800A1 (no) |
| GB (1) | GB1592610A (no) |
| IT (1) | IT1154001B (no) |
| NL (1) | NL7710310A (no) |
| NO (1) | NO773267L (no) |
| NZ (1) | NZ185242A (no) |
| SE (1) | SE7710710L (no) |
| ZA (1) | ZA775700B (no) |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4326027A (en) * | 1978-03-28 | 1982-04-20 | Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University | Antiglobulin control cells |
| US4292403A (en) * | 1978-08-24 | 1981-09-29 | Akzona Incorporated | Detection and/or determination of IgM, IgA, IgD and IgE immunoglobulins |
| US4298593A (en) * | 1979-08-21 | 1981-11-03 | Abbott Laboratories | Reagents and methods utilizing labeled Fab bound to antigens |
| AU556548B2 (en) * | 1980-03-03 | 1986-11-06 | Milton David Goldenberg | Tumor localization and therapy with labeled antibodies and antibody fragments specific to tumor-associated markers |
| US4399229A (en) * | 1980-04-14 | 1983-08-16 | Immutron, Inc. | Rapid radioimmunoassay product and method of making and using same |
| US4481298A (en) * | 1981-04-13 | 1984-11-06 | Amf Incorporated | Pre-precipitated double antibody immunoassay method |
| US4434227A (en) | 1982-02-08 | 1984-02-28 | Abbott Laboratories | Immunoassay for class specific immunoglobulin antibodies |
| EP0109861A3 (en) * | 1982-11-23 | 1986-05-14 | Bio-Response Inc. | Method for isolating cells |
| GB2166709B (en) * | 1984-10-24 | 1987-10-28 | Vaal Reefs Expl & Mining | Mine cage |
| DE3717401A1 (de) * | 1987-05-23 | 1988-12-08 | Behringwerke Ag | Einschritt-immuntest zur bestimmung von antigen-spezifischen antikoerpern aus einer der immunglobulin-klassen a, m, d oder e und dazu geeignetes mittel |
| DE3720983A1 (de) * | 1987-06-25 | 1989-01-05 | Hoechst Ag | Immunometrisches bestimmungsverfahren |
| CA2093494A1 (en) * | 1992-04-17 | 1993-10-18 | Keisuke Iwata | Method for the elimination of non-specific reactions in immuno-assays |
| US5487975A (en) * | 1993-11-15 | 1996-01-30 | Ventana Medical Systems, Inc. | Biotin/avidin formulation |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2322562C2 (de) * | 1972-11-06 | 1984-03-29 | Pharmacia AB, Uppsala | Verfahren zur Bestimmung von Antigenen in einer Probe |
| DE2322533C2 (de) * | 1972-11-06 | 1986-08-28 | Pharmacia AB, Uppsala | Verfahren zum Binden von Immunoglobulin und Hilfsmittel zur Durchführung des Verfahrens |
-
1976
- 1976-09-25 DE DE2643208A patent/DE2643208C2/de not_active Expired
-
1977
- 1977-09-20 NL NL7710310A patent/NL7710310A/xx unknown
- 1977-09-22 CH CH1160177A patent/CH634150A5/de not_active IP Right Cessation
- 1977-09-22 AU AU29004/77A patent/AU513660B2/en not_active Expired
- 1977-09-22 US US05/835,789 patent/US4166106A/en not_active Expired - Lifetime
- 1977-09-23 DK DK421977A patent/DK421977A/da unknown
- 1977-09-23 AT AT683877A patent/AT358185B/de active
- 1977-09-23 ZA ZA00775700A patent/ZA775700B/xx unknown
- 1977-09-23 NO NO773267A patent/NO773267L/no unknown
- 1977-09-23 CA CA287,375A patent/CA1093464A/en not_active Expired
- 1977-09-23 SE SE7710710A patent/SE7710710L/xx unknown
- 1977-09-23 IT IT27905/77A patent/IT1154001B/it active
- 1977-09-23 GB GB39832/77A patent/GB1592610A/en not_active Expired
- 1977-09-23 NZ NZ185242A patent/NZ185242A/xx unknown
- 1977-09-24 JP JP11396177A patent/JPS5341422A/ja active Granted
- 1977-09-26 BE BE181201A patent/BE859054A/xx not_active IP Right Cessation
- 1977-09-26 FR FR7728920A patent/FR2365800A1/fr active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU513660B2 (en) | 1980-12-11 |
| CH634150A5 (de) | 1983-01-14 |
| DE2643208C2 (de) | 1985-09-05 |
| GB1592610A (en) | 1981-07-08 |
| IT1154001B (it) | 1987-01-21 |
| AU2900477A (en) | 1979-03-29 |
| DK421977A (da) | 1978-03-26 |
| FR2365800A1 (fr) | 1978-04-21 |
| NL7710310A (nl) | 1978-03-29 |
| US4166106A (en) | 1979-08-28 |
| JPS6120815B2 (no) | 1986-05-23 |
| FR2365800B1 (no) | 1984-05-25 |
| CA1093464A (en) | 1981-01-13 |
| ZA775700B (en) | 1978-08-30 |
| AT358185B (de) | 1980-08-25 |
| DE2643208A1 (de) | 1978-04-06 |
| BE859054A (fr) | 1978-03-28 |
| SE7710710L (sv) | 1978-03-26 |
| NZ185242A (en) | 1980-03-05 |
| ATA683877A (de) | 1980-01-15 |
| JPS5341422A (en) | 1978-04-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Saccomani et al. | Characterization of gastric mucosal membranes. X. Immunological studies of gastric (H++ K+)-ATPase. | |
| US4292403A (en) | Detection and/or determination of IgM, IgA, IgD and IgE immunoglobulins | |
| Grauballe et al. | Optimized enzyme‐linked immunosorbent assay for detection of human and bovine rotavirus in stools: Comparison with electron‐microscopy, immunoelectro‐osmophoresis, and fluorescent antibody techniques | |
| EP0185870B2 (en) | Immunoassays for denatured protein analytes, particularly HB Alc, and monoclonal antibodies thereto | |
| Kurstak | Enzyme immunodiagnosis | |
| Dougherty et al. | Identification of the 90 kDa substrate of rat liver type II casein kinase with the heat shock protein which binds steroid receptors | |
| Olins et al. | The antigenic structure of the polypeptide chains of human γ-globulin | |
| CZ294954B6 (cs) | Chromatografické zkušební zařízení pro detekci přítomnosti analyzované složky v krevním vzorku | |
| NO773267L (no) | Immunologisk bestemmelsesfremgangsmaate | |
| JP2517187B2 (ja) | アナライト変異体分析 | |
| US20080254440A1 (en) | Anti-Sars Virus Antibody, Hybridoma Producing the Antibody and Immunoassay Reagent Using the Antibody | |
| IE47031B1 (en) | Carrier-bound immunoglobulin fission product and its use in immunologic analyses | |
| JP3833358B2 (ja) | 被検体の亜集団の測定のための均一検出方法 | |
| EP0008473A1 (en) | Method for the detection and/or determination of an antigen specific immunoglobulin, immuno-reagents to be used in said method and test kit for said determination | |
| US6686167B2 (en) | Test device for detecting semen and method of use | |
| US5187063A (en) | Measuring non-dystrophin proteins and diagnosing muscular dystrophy | |
| KR910700463A (ko) | 암과 관련된 헵토글로빈 | |
| JP3978226B2 (ja) | アルコール中毒患者を同定しアルコール消費を監視するためのイムノアッセイ | |
| Minden et al. | False positive radio-immunoautograph lines associated with immunoglobulins from normal sera | |
| Herrmann et al. | Detection of antibodies after immune complex splitting in serum of patients with bullous pemphigoid and systemic lupus erythematosus | |
| JP2553159B2 (ja) | 赤血球凝集アッセイ | |
| US7713515B2 (en) | Methods and compositions for use in diagnosing and characterizing diseases involving abnormal apoptosis | |
| US6767709B1 (en) | Immunoassay of human medullasin and diagnosis of multiple sclerosis using the same | |
| Ranjan et al. | Immunochemical detection of glycated lens crystallins and their circulating autoantibodies in human serum during aging | |
| Sartore | Immunological cross-reactivity between chicken slow skeletal and ventricular muscle myosin |