DE2643208A1

DE2643208A1 - Immunologisches bestimmungsverfahren

Info

Publication number: DE2643208A1
Application number: DE19762643208
Authority: DE
Inventors: Roloff Dr Johannsen; Hans-Harald Dr Sedlacek; Friedrich-Robert Dr Seiler
Original assignee: Behringwerke AG
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics GmbH Germany
Priority date: 1976-09-25
Filing date: 1976-09-25
Publication date: 1978-04-06
Also published as: SE7710710L; NO773267L; FR2365800A1; ATA683877A; IT1154001B; NZ185242A; NL7710310A; AU513660B2; DK421977A; FR2365800B1; AU2900477A; AT358185B; ZA775700B; JPS5341422A; CA1093464A; US4166106A; BE859054A; CH634150A5; GB1592610A; JPS6120815B2

Description

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BEHRTNGWBRKE AIrPTENGESELLSCH/" ΓΤ , Mc rburcj/Lahn

Aktenzeichen: WOT. "6/Ti 021 Ma 285

Datum: 15. September 1976

Immunologisches Be stimmur.gs verfahr en

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur qualitativen oder quantitativen Bestimmung eines Partners einer immunologischen Reaktion unter Ausnutzung der bekannten Affinität von Antikörpern und 7mtigenen zueinander durch Verminderung unspezifischer Bindungen. Sie macht von der Tatsache Gebrauch, daß derartige Reaktionen mit Hilfe von bestimmten Identifizierungsmerkmalen deutlicher registrierbar gemacht werden können.

In immunologischen Reaktionen mit markierten Reaktionspartnern, werden grundsätzlich folgende Methoden unterschieden: der direkte Test und die indirekten Techniken.

Beim direkten Test wird der zu bestimmende Reaktionspartner, meist das Antigen, kenntlich gemacht durch Inkubation mit einem spezifischen gegen ihn gerichteten und markierten zweiten Reaktionspartner, meist einen Antikörper.

Bei indirekten Techniken wird der zu bestimmende Reaktionspartner mit einem spezifisch gegen ihn gerichteten zweiten Reaktioiispartner inkubiert und na^h Abt.-ennung und Entfernung der nicht gebundenen Menge des zweiten Reaktionspartners d?iS Reaktionsgeruisch mit einem spezifisch gegen den zweiten Reaktionspartner gerichteten dritten, meist markierten Reaktionspartner, inkubiert.

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Es ist dem Fachmann bekannt, daß sich der direkte Test au:;·- zeichnet durch eine hohe Spezifität. Sein Nachtoil ist die geringe Sensitivität. Andererseits sind die indirekten Techniken bekannt für ihre hohe Sensitivität, jedoch geringe Spezifität.

Als eine der wesentlichen Ursachen, die bei dem direkten Test und den indirekten Techniken die Spezifität beeinflussen, ist die unspezifische Bindung der Antikörper an das Antigen und dessen ihn umgebende Strukturen anzusehen.

Die unspezifische Bindung wird hauptsächlich verursacht durch Bereiche des sog. Fc-Teiles des Antikörper (=Immunglobulin)-MoIeküles. Das gilt auch für hoch spezifische Antikörper.

Die Bindungsaffinität der Fc-Teile des Antikörpers zu verschiedenen, in der Literatur als Fc-Peceptoren umschriebenen Strukturen von Zellen oder Geweben wird verstärkt, wenn sich im Antikörpermolekül eine Konformationsänderung vollzieht. Diese tritt auf bei der spontanen Aggregation von Antikörpeririolekülen in Antikörperpräparationen, bei der Bindung von /Antikörpern an ein Antigen (Inimunkomp] exe) oder bei der /«!sorption von Antikörpermolekülen an künstliche Flächen, z. B. Latexpartikel.

Bislang wurden verschiedene Methoden zur Verminderung der unspezifischen Bindung angewandt: z. B. Elimination von Aggregaten oder Immunkomplexen aus Antikörperpräparationeri durch Ultrazentrifugation, Zugabe von Albumin zu den Antikörperpräparationeri zur Proteinstabilisierung oder Verhinderung von Aggregatbildungen.

In dem direkten Test und in den indirekten Techniken wurden zusätzlich erfolgreich Antikörperpräparationen benutzt, deren Fc-Teil durch bekannte Methoden abgespalten worden war ohne die immunologische Reaktionsweise des Restfragments F (ab)., oder F(ab)2 wesentlich zu beeinträchtigen.

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Diese Methoden sind durch die Herstellung von F (ab)..™ bzw. F(ab)„- Fragmenten der jeweiligen Antikörper jedoch aufwendig, zum Teil, insbesondere bei der Verwendung von Antiseren in indirekten Techniken, nur sehr schwierig durchzuführen.

Mit vorliegender Erfindung wird nun die direkte und indirekte Technik zur Iiraiuinreaktion mit markierten Reaktionspartnern in einfacher Weise derartig verändert, daß auch bei Verwendung von nativen Antikörpern bzw. derartige Antikörper enthaltenden Seren die bekanntermaßen hohe Sensitivität voll erhalten bleibt, während die bekanntermaßen hohe Unspezifität auf ein Minimum reduziert wird.

Die Erfindung liegt der Gedanke zugrunde, daß im direkten Test und in indirekten Techniken eine Fc-vermittelte unspezifische Bindung nativer Antikörper vermieden werden kann, wenn die mit dem Fc-Teil reagierenden Strukturen der unterschiedlichen Antigene (im allgemeinen Sinne Fc-Receptoren) durch Immunglobulinfragmente, welche Bindungsaffinitäten zu diesen Fc-Receptoren im allgemeinen Sinne haben, vorher abgesättigt worden sind. Hierbei sollten die Immunglobulinfragmente möglichst von Immunglobulinen einer Spezies stammen, von welcher auch der Antikörper (direkter Test) bzw. der Erstantikörper (indirekte Techniken) stammen. Alle eingesetzten Antikörper dürfen andererseits keine Spezi fität gegen dieses Immunglobulinf racjment besitzen. Sofern es dem Test nach erforderlich ist, dürfen die verwendeten Immunglobulinfragmente desweiteren kein Komplement binden.

Eine aus möglicherweise sterischen Gründen bedingte Hemmung der spezifisch immunologischen Reaktion, wie sie vergleichsweise bei Verwendung von nativen Immunglobulinen oder Immunglobulinaggregaten anstelle von Immunglobulinfragmenten auftritt, ist bei Anv/endung von Immunglobulinfragmenten mit Affinitäten zu Fc-Receptoren nicht zu finden.

Desweiteren erlaubt die Verwendung von Immunglobulinfragmenten, beispielsweise von Fc-Fragmenten von unterschiedlichen Immunglobulinklassen, daß Antikörper, gerichtet gegen Teile von

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- Jr-

Immunglobulinen, ζ. B. deren leichte Ketten, gegen das Bruchstück" Fd oder gegen F(ab)-Fragmente der jeweiligen Immunglobulinklassen in dem direkten oder indirekten Test eingesetzt werden können, ohne mit dem Fc-Fragment immunologisch zu reagieren.

Gegenstand der Erfindung ist demnach ein Verfahren zur qual.i Lativen oder quantitativen Bestimmung eines Partners einer immunologischen Reaktion im direkten Test oder in indirekten Techniken dadurch gekennzeichnet, daß das im allgemeinen Sinne Fc-Reccptoren tragende Antigen vorab in Kontakt gebracht wird mit einem Immunglobulinfragment, welches Bindungsaffinitäten zu Fc~Receptoren im allgemeinen Sinne besitzt und daß nachfolgend Antikörper eingesetzt werden, die keine Spezifität gegen das Immunglobulinfra gment besitzen. Dies führt zu einer bedeutenden Verbesserung des Ergebnisses der immunologischen Bestimmung durch Verminderung unepezifischer Nebenreaktionen.

Als indirekte Techniken im Sinne der Erfindung gelten alle Teste, bei welchen der gesuchte Reaktionspartner durch mehr als nur einen weiteren Reaktionspartner nachgewiesen wird. Zu indirekten Techniken im Sinne der Erfindung zählen somit insbesondere der Antiglobulintest, der indirekte Test mit Komplement und der Sandwichtest.

Diese Methoden sind ausführlich in J.II. Humphrey, R. G. White, Kurzes Lehrbuch der Immunologie, Thieme-Verlag Stuttgart, 1975, Seite 257-260, in D.M. Weir, Handbook of Experimental Immunology, Blackwell, Oxford, 1973, Seite 18.14 - 18.16 und von G. Wick (1972) in "Wiener klinische Wochenschrift", 84.1, Seite 2-7, unter Zugrundelegung von Fluoreszenzfarbstoffen als Identifizierungsmerkmal beschrieben.

Die Methodik der indirekten Techniken kann derart erweitert werden, daß alle verwendeten Antikörper markiert sind und/oder daß zusätzlich zu einem dritten Reaktionspartner weitere, spezifisch gegen den vorhergehenden Reaktionspartner gerichtete Reaktionspartner benutzt werden.

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Ferner gehören demnach zu indirekten Techniken alle Vorfahren. wonach die Inkuhation r.d t nnrkierfco.n Antikörpern mehrmals durchgeführt wird.

Es ist literaturbekannt, daß zu Fc-Reeeptoren irri allgemeinen Sinne bestimmte Bereiche des Fc-Teiles der Immunglobuline eine hohe Affinität haben. Es ist weiterhin bekannt, daß Antikörper-Moleküle (Immuncjlobulin-Moleküle) durch proteolyticche Enzyme in eine Anzahl von Fragmenten zerlegt v/erden. So spalten die Proteinasen Plasmin oder Papain das Immunglobulin-Molekül in zwei F(ab)..-Fragmente und ein Fc-Fragment. Pepsin greift das Molekül an einer anderen Stelle an und führt danach zu einem bivalenten, sog. F(ab)„-Fragment und zu weiteren kleineren Peptiden, z. B. zu pFc- Diese als Fc-Fragmente oder pFc bezeichneten proteolytischen Abbauprodukte des Antikörper-Moleküls sind beispielsweise im Sinne der Erfindung als Immunglobulinfragmente mit Affinitäten zu Fc-Receptoren im allgemeinen Sinne einsetzbar.

Beispiele der Herstellung von Fc-Fragment oder pFc finden sich bei Porter, R.P. (1959), Biochem. J. 13_, 119; Hershgoid, E.J. et al, (1963) Nature 199, 284 und Haupt, H. (1969), Klin. Wschr. £7_, 270.

Die Methodik des direkten Tests und" der indirekten Techniken ist in folgender Weise beispielhaft kürz dargestellt:

Beim direkten Test wird das Antigen enthaltende Substrat mit einem markierten Reaktionspartner, in der Regel mit einem spezifischen Antikörper, in Kontakt gebracht. Hierbei kommt es zur Bindung des Antikörpers an das korrespondierende Antigen. Das Antigen wird dadurch direkt nachgewiesen.

Bei indirekten Techniken wird der gesuchte Reaktionspartner (beispielsweise das Antig-j'.i) du. cn mehr als nur einen weiteren Reaktionspartner nachgewiesen.

Beispielsweise wird im Antiglobulintest das Antigen enthaltende Substrat mit einem, gegebenenfalls markierten, spezifischen Antikörper zur Reaktion gebracht, aus dem Reaktionsgemisch der

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überschüssige Antikörper durch Waschen entfernt und das Reaktionsgemisch mit einem zweiten markierten /Antikörper, der spezifisch gegen den zuerst eingesetzten Antikörper gerichtet ist, zur Reaktion gebracht und nachfolgend die Menge nicht gebundenen Antikörpers entfernt.

Beim Sandwichtest wird ein Antikörper, mit dem spezifisch gegen ihn gerichteten Antigen zur Reaktion gebracht, die nicht gebundene Menge des Antigens entfernt und das Reaktionogemisch mit einem markierten, wiederum spezifisch gegen das Antigen gerichteten Antikörper umgesetzt und die nicht gebundene Menge des Antikörpers entfernt;

Beim indirekten Test mit Komplement bindet das antigene Substrat entweder direkt Komplement, oder es wird mit einem komplemcntbindenden spezifisch gegen das Antigen gerichteten Antikörper umgesetzt, nicht gebundener Antikörper wird entfernt und das Reaktionsgemisch wird mit Komplement zur Reaktion gebracht. Nach Entfernung der nicht gebundenen Menge Komplements wird das am Antigen bzw. am Antigen-Antikörperkomplex gebundene Komplement mit einem markierten, spezifisch gegen Komplement cjerichteten Antikörper nachgewiesen.

Es steht dem Fachmann selbstverständlich frei, im Rahmen der vorliegenden Erfindung die ihm bekannten Identifizierungsmerkmale zu verwenden, wie beispielsweise die Markierung mit Fluoreszenzfarbstoffen, die radioaktive Markierung oder die Enzym-Markierung.

Die erfindungsgemäße Anwendung von Immunglobulxnfragmenten mit Bindungsaffinitäten zu Fc-Receptoren im allgemeinen Sinne ist im folgenden Beispiel für den direkten Test und den Antiglobulintest kurz beschrieben.

Beim Nachweis, bzw. der Bestimmung eines Antigens entsprechend der Erfindung bringt man die zu untersuchende Probe oder eine Verdünnungsserie davon mit unterschiedlichen Mengen, beginnend mit beispielsweise 1 mg, eines Immunglobulin-Fragmentes in Kontakt,

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welches Bindungsaffinitäten zu Fc-Receptoren im allgemeinen Sinne besitzt, z.B. das Fc-Fragraent von IgG nach Papain-Spaltung. Danach läßt man das Gemisch 20 Minuten bis 20 Stunden, vori?u:jsv;;i ne etwa 30 Minuten bei einer Temperatur zwischen 4-30⁰C, vorzugsweise etwa 20⁰C in Wasserdampf-gesättigtor Atmosphäre stehen.

Sodann wird nichtgebundenes Fc-Tragment vom Reaktionsgemisch abgetrennt. Dies kann beispielsweise durch mehrmaliges Waschen (in der Regel 2 x) des Reaktion.sgemisclies, vorzugsweise mit einer polyionischon, isotonischen wässrigen Lösung erfolgen. Kachfolgend bringt man das Reaktionsgemi sch in Kontakt mit einei. bekannten Menge des markierten Antikörpers, der spezifisch gegen das Antigen gerichtet ist (direkter Tent) bzw. mit einem Antisera™. oder einem unmnrkierten Antikörper (Antiglobulin-'fest) und läßt danach das Gemisch 2 0 Minuten bis 20 Stunden, vorzugsweise etwa 30 Minuten bei einer Temperatur zwischen 4 - 30⁰C in Wasserdoi.ipfgesättigter Atmosphäre stehen.

Nichtgebundene Antikörper werden durch mehrmaliges Waschen (in der Regel 2 - 6 x) des Reaktionsgemisches, vorzugsweise mit einer polyionischen isotonischen wässrigen Lösung, von diesem abgetrennt. Nachfolgend wird im Falle des Antiglobulintesls das Reaktbnsgemisch in Kontakt gebracht mit einer bekannten Menge eines markierten Antikörpers, der spezifisch geg'en den ersten Antikörper gerichtet ist und daraufhin inkubiert tmd gewaschen unter Bedingunyen, wie für den zuerst verwendeten Antikörper beschrieben.

Anschließend wird je nach Art des verwendeten Antigens das Reaktionsgemisch entweder auf einen Objektträger aufgestrichen (z.B. Zeil suspension) oder es ist bereits auf einem Träger fixiert (z. B. Histologischer Schnitt).

Die Untersuchung erfolgt mit Hilfe von dem Fachmann bekannterund von einschlägigen Firmen angebotenen qualitativen und quantitativen Meß- und Beobachtungsgeräten, wie Fluoreszenzmikroskopen mit Auflicht- oder Durchlichtanregung und Fluoreszenzphotometern, Photometern oder Strahlungsmeßgeräten.

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Die zur Verhinderung der unspezifischen Bindung optimale Menge des Irnmunglobulinfragments mit Bindungsaffinitäten zu Fo-Receptoren, z. B. des Fc-Fragmentes, kann für jedes spezifische Antigen durch einen Vorversuch unschwer ermittelt werden.

Als Antigene kommen in Frage z. B. virale Antigene (z.B. Röteln-Antigen, Masern-Antigen, Hepatits-Antigen) , bakterielle /antigene (z.B. Salmonella-Antigene, Escherichia coli-Antigene, Staphylokokken-Antigene) , Kohlenhydrat-Antigene (z.B. Blutgruppensubstanzen), Protein-Antigene (z.B. Plasmoproteine, wie Immunglobuline, Komplementfaktoren), Glykoprotein-Antigene (z.B.^l .-Antitrypsin, Coeruloplasinin) und Lipoprotein-Antigene (z. B.'cL ₁ -Lipoproteine)

Sie können isoliert, gelöst, suspendiert, an Träger, beispielsweise wasserunlösliche Polymere wie chemisch quervernetzte Kohlenhydrate gebunden sein oder in bzw. auf Zellen vorkommen oder in histologischen Gewebsschnitten vorhanden sein.

Die für die Herstellung von Immunglobulin-Fragmenten mit Bindungsaffinitäten zu FcrReceptoren im allgemeinen Sinne erforderlichen Immunglobuline werden in an sich bekannter Weise aus Blut bzw. Serum von Mensch oder Tier gewonnen. Jedoch ist im Sinne der Erfindung auch der Einsatz synthetischer Immunglobulin-Fragmente denkbar. -

Die Verminderung der unspezifischen Bindung von spezifischen Antikörpers bei unveränderter Empfindlichkeit in der direkten und indirekten Technik durch die erfindurigsgemäße Verwendung vcn Immunglobulin-Fragmenten mit Bindungsaffinitäten zu Fc-Receptoren beispielsweise Fc-Frcigmenten verdeutlichen folgende Versuche, deren Ergebnisse zum Teil tabellarisch zusammengestellt sind.

In Tabelle 1 sind Ergebnisse dargestellt, die den Einfluß von Fc-Fragmenten von humanem IgG auf die unspezifische Bindung von Kaninchen- /"'-Globulin an die Oberfläche von Lymphozyten zweier Spender (Spalte A und B) sowie dessen Abhängigkeit von einer Vorinkubation der Lymphozyten mit Neuraminidase (Spalte C und D) zeigen. Neuraminidasebehandlung von Lymphozyten erhöht,

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wie bereits beschrieben (Seiler et al. (1974) Behring In.vf;, Mitt. No. ^5_, 258) den Anteil an Fc-RecepLorem tragenden Znllo.n.

Wie aus Tabelle 1 (Spalte B und D) hervorgeht, wird die unspezifische Bindung von Kani nchen-_{/'"'-Globulin in der Doppalantikörperrnethode an Lymphozyten durch Vorbeihand lung mit Fc-Fragmenten im Vergleich zu' nicht mit Fc-Fragmenten behandelten Zellen (Spalte A und C) wesentlich reduziert.

Werden als weiteres Beispiel Gefrierschnitte verschiedener Orange, z.B. Leber oder Niere von Maus, Ratte, Kaninchen oder Mensch, auf Glasobjektträger nach bekannter Methodik aufgesogen, ir.it etwa 0,1 ml einer 1 % oder 0,1 %igen Lösung von Fc-Fragmenten von humanem IgG in einer feuchten Kammer 30 Minuten bei 20⁰C inkubiert, nachfolgend leicht in isotonischer Salzlösung gewaschen und anschließend ein Doppelantikörpertest in bekannter Weise (indirekte Methode) , (G. Wick (1972) Wien. klin. Wschr. 84_, 2-7) unter Verwendung von menschlichen Antiseren als ersten Antikörper und einem zweiten Antikörper, der nicht mit dem Fc-Fragment kreuzreagiert duchgeführt, so ergibt sich eine geringere unspezifische Bindung der Antikörper an den Gefrierschnitt als bei einem nicht in obicjer Weise mit Fc-Fragmenten vorbehandelten Gefrierschnitt.

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Tabelle 1

Behinderung der unspezifischen Bindung von normalem Kaninchen-/^- Globulin an menschliche periphere Lyrnphozyten. in der indirekten Methode durch Fc-Fragmente von humanem IgG

	VCN	A	-	B	-	-	C	+	+	D	0	+
	Fc	-	I ⁺ ^	10	100	+	T	1			100
		-				-			2
Spender I	1⁺⁾		3	1	1		5		2	5
Kaninchen-c/^-Globulin	4	8⁺⁺⁾	4	2	1	55	4			3
		6				34			5
Spender II	1⁺⁾		2	3	3		4		3	5
Kaninchen-^ -Globulin	4	11	2	6	1	12	14		0	17
	16	5	6	2	8	17	12	1		7
	4		9

VCN = Vibrio cholerae meuraminidase 25 ü/5 χ 10 Zellen, 30 min, 37°C Fc = Fc-Fragment von humanem IgG, 1 % Starnmlösung. 0,1 ml jeder Verdünnung auf 5 χ 10 Zellen (Sediment) für 30 min bei Raumtemperatur, nachfolgend 2 Waschungen.

+) = Reziproker Titer der Antikörper- oder Fc-Verdünnung.

++) = Unspezifisch gefärbte Lymphozyten in %

Daß die Absättigung von Fc-Receptoren auf Lymphozyten, beispielsweise mit Hilfe von Fc-Fragmenten, im Gegensatz zur Verwendung von Immunglobulinaggregaten nicht zur sterischen Behinderung von in der Nachbarschaft gelegenen Antigenstrukturen führt, zeigt das in Tabelle 2 aufgeführte Beispiel:

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Al

Hier wurden lyinphoblant.O-i.de Kulturzellen dos Lymphozytentyps B (RPMI 1788) mit einem /mtiserum (Serum 196602) inkubiert, welches die sogenannte gemischte Lymphozytenkultur (MLC) hemmt. Infolge der Übe?:einstiir:nung von antigencn Strukturen von Lymphozyten des Typs B in der MLC und dc3: lyinphoblastoiden Kulturzelle binden sich Antikörper dieses Antiserums an die lymphoblastoide Zelle. Diese können dxirch einen gegen den Erstantikörper gerichteten und markierten Zweitantikörper (FITC-Anti-IgM oder FITC-Anti-k + Anti-1) nachgewiesen werden. Es ist bekannt, daß hierbei unspezifische Reaktionen durch das Fc-Teil der Immun-Aggregate oder Immunkomplexe, vorhanden in den Antikörperpräparationen, zu falsch-positiven Ergebnissen führen können. Eine vorherige Absättigung der sogenannten Fc-Receptoren auf den Zellen mit Hilfe von Aggregaten von Immunglobulin G hat, wie aus Spalte C ersichtlich und ebenso literaturbekannt, zur Folge, daß praktisch alle Antikörper, möglicherweise durch sterische Behinderung, sich nicht mehr an die. Zelle binden können. Bei Verwendung von Fc-Fragmente? ι anstelle von Iminunglobulinaggregaten tritt eine Behinderung der Antikörper nicht mehr auf (Spalte D), obwohl Fc-Fragmente die Fc-Receptoren absättigen,"da nachfolgend eingesetzte Immunglobulinaggregate sich nicht mehr an die Zelle binden können (Spalte E).

Das erfindungsgemäße Verfahren ist aufgrund des vorher Gesagten somit besonders geeignet zur Verbesserung einer immunologischen Reaktion durch Verminderung unspezifischer Bindungen beim Kachweis von cytoplasit'.atischen, Zellmembran- (insbesondere von MLC-Determinanten) oder von Zcllkern-Antigenen, von Antigenen im Gewebe, von /vntigenen auf Trägern oder von Antikörpern, die gelöst sind.

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Tabelle 2

Inhibition der Bindung von aggregiertem IcjG durch Fc-Fragmente von IgG.

Zielzelle: KPMI 1788

FITC FITC
Spalte Fc IgG-Aggr. Serum 196602 Anti-IgM Anti-k + Anti-1

+) % angefärbte Lynvphoblasten

22⁺⁾

B + 28 40

C - + + 0 0

D + - + 35 43

E + + + 31 40

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Die Erfindung wird irn nachfolgenden Beispiel des Nachweises von zellmembrangebundencn MLC-Determinanten auf Lymphozyten näher erläutert: '

Beispiel

Humane periphere Lymphozyten werden nach bekannter Methode aus venösem Vollblut isoliert. Die so erhaltene Lymphozytensuepsnsicn besteht aus einem Zellgemisch, vorwiegend von Lymphozyten des Typs B und des Typs T. Mit Hilfe bekannter Methoden v/erden die Zellen des Typs T bestmöglich abgetrennt und verworfen. Die verbleibenden Lymphozyten, angereichert mit dem Zelltyp B_f werden 2 χ in einer isotonischen Kochsalzlösung gewaschen. Eine Anzahl von Zellsedimenten, jeweils 1x10 Lymphozyten, werden in je 0,1 ml einer 1 %igen Lösung von Fc-Fragment von IgG (diese Menge hat sich in vorausgegangenen Versuchen als optimal erwiesen) resuspendiert und 30 min bei Zimmertemperatur inkubiert. Die Ansätze werden nachfolgend 2 χ mit isotonischer Kochsalzlösung gewaschen. Jeder Ansatz (Zellsediment) wird mit 0,1 ml eines zu prüfenden menschlichen Serums resuspendiert und bei Raumtemperatur inkubiert. In dem vorliegenden Beispiel kommen 9 Prüfseren und ein negatives Kontrollserum (AB) zum Einsatz. Nachfolgend wird das Reaktionsgemisch in einer isotonischen Kochsalzlösung 3 χ gewaschen . .

Das Sediment wird mit 0.05 ml eines fluoreszeinmarkierten Antikörpers vom Kaninchen, gerichtet gegen die leichten Ketten von menschlichen Immunglobulinen, (1 %ige Proteinlösung) resuspendiert, 30 min. bei Raumtemperatur inkubiert und nachfolgend 3 χ in einer isotonischen Kochsalzlösung gewaschen.

Anschließend wird das Sediment in 0,05 ml Rinderserumalbuminlösung (2 % /v) resuspendiert und die Suspension auf einen Objektträger ausgestrichen, luftgetrocknet und nach bekannter Art mit Glycerin eingebettet.

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Mit Hilfe eines Fluoreszenz)".· kroskopes wird der Anteil fluoreszeierender Zellen an den Gesamtzellen ausgezählt und in Prozent angegeben.

Ergebnis: Die Anzahl positiver Zellen nach Behandlung mit Fc-Fragment sind in der Spalte II der Tabelle 3 angegeben. Es ist offensichtlich, daß im Vergleich zu den Vierten, erhalten mit den gleichen /Antikörpern nur ohne Behandlung mit Pe—Fragment (Spalte I) eine Abnahme der positiven Zellen anzutreffen ist. Diese /Abnahme ist von Serum zu Serum unterschiedlich. Eine Differenzierung zwischen positiven und negativen Seren ist somit besser möglich.

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Tabelle 3

Reduktion der unspezifischen Bindung von Antigenen an Lymphozyten durch. Fc-Fragment—Vorinkubation

Seren	ohne Fc	mxt Fc
20075	23⁺	12
20138	19	14
2033Q	26	11
2Q376	2Q	10
20377	18	17
2Q379	23	9
20380	27	12
20381	17	10
2063Q	13	11
AB	11	6

+ % positiver Lymphozyten

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Claims

HOE 76/B 021 -VeT- Patentansprüche

1. Verfahren zur qualitativen oder quantitativen Ro.^tiniruarKi eine.-Partners einer immunologischen Reaktion im direkten T;isu ooer i\: indirekten Techniken, dadurch gekennzeichnet, Cnß das 2-ntiivon vorab in Kontakt gebracht wird mit einem Iimtmnglobulinfragman L, welches Bindungsaffinitäten zu Fc-Reeeptoren im allgemeinen Sinne besitzt und daß nachfolgend Antikörper eingesetzt werden, die keine Spezifität gegen dieses Immunglobulinf'ragment besitzen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine Menge von Immunglobulinfragmenten eingesetzt wird, die äquivalent ist zu der Menge abzusättigender Fc-Receptoroü.

3. Verfahren nach Anspruch 1-2, dadurch gekennzeichnet, daß als Immunglobulxnfragment, welches Bindungsaffinitäten zu Fc-Receptoren im allgemeinen Sinne besitzt, d£is Fc-Fragment oder das pFc-Fragment von Immunglobulinen eingesetzt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß in Zytoplasma, in der Zellmembran, -im Zellkern, in Geweben befindliche Antigene, insbesondere - MLC-Determinanten, bestinuat werden.

5. Verfahren nach Anspruch 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß Antikörper in Lösung bestimmt werden,

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ORIGINAL INSPECTED