DE2557419A1

DE2557419A1 - Reagens zum nachweis von analyt- koerpern

Info

Publication number: DE2557419A1
Application number: DE19752557419
Authority: DE
Inventors: Diane Eaton; Tomas Hirschfeld
Original assignee: Block Engineering Inc
Current assignee: Block Engineering Inc
Priority date: 1974-12-20
Filing date: 1975-12-19
Publication date: 1976-06-24
Also published as: AU8770775A; NL7514864A; GB1533410A; JPS51106721A; DE2557419C2; FR2295426A2

Description

Reagens zum Nachweis von Analyt-Körpern

Zusatz zu Patent (Patentanmeldung P 24 26

Die Erfindung betrifft eine Verbesserung bzw. eine weitere Ausbildung der in dem Hauptpatent . ... ... (Patentanmeldung P 24· 26 519.8) beschriebenen Erfindung, nämlich analytische Systeme, die Heagentien verwenden, die molekular mit Strahlungsenergie emittierenden Materialien markiert sind, und insbesondere Reagentien, die zum Nachweis von Reaktionsteilnehmern des Antigen-Typs geeignet sind sowie ein 1/erfahren zur Anwendung des Reagens für den angegebenen Zweck.

Die Methode des Nachweises und des Klassifizierens von Reaktionsteilnehmern mit Hilfe einer hochspezifischen Reaktion, wie des Antigens bei einer Antigen-Antikörper-Reaktion durch Markieren eines der Reaktionsteilnehmer (beispielsweise der Antikörper) mit einem Strahlungsenergie emittierenden Material, ist an sich bekannt. Diese Methode hängt von der Fähigkeit des Beobachters ab, zwischen dem Produkt oder dem Komplex aus dem Antigen

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und dem markierten Antikörper und den nicht komplexierten markierten Antikörpern zu unterscheiden. Zu diesem Zweck können eine große Vielzahl von Instrumenten zum Nachweis von Strahlungsenergie verwendet werden, die ihrerseits von der Art des Energiestrahlers abhängen.

Die herkömmlichen Methoden zum Nachweis von Antigenen mit markierten Antikörpern leiden an einer Reihe von erheblichen Nachteilen, insbesondere der Schwäche der Signale, die bei geringen Antigenmengen vorliegt. So bleiben viele Fälle von durch Antigene verursachten ernsten Erkrankungen unbemerkt, was zu unnötigen Leiden und in gewissen lallen zum lode führen kann.

In Fällen, bei denen das Strahlungsenergie emittierende Material radioaktiv ist, stellt das den markierten Antikörper enthaltende Reagens eine potentielle Gefahr für die Hersteller des Reagens und das klinische Laborpersonal dar, die die Untersuchung mit dem Reagens durchführen. Weiterhin unterliegt der Transport solcher radioaktiver Reagentien zunehmend verschärften Bestimmungen. Die Fotoemission eines jeden radioaktiven Atoms ist natürlich sehr gering. Weiterhin nimmt, wenn die Halbwertzeit der radioaktiven Emission kurz ist, was häufig der Fall ist, die Signalstärke der radioaktiven Emission derart schnell ab, daß die Lagerfähigkeit des Reagens stark eingeschränkt ist.

In vielen Fällen erfolgt die Markierung des Antikörpers mit Hilfe eines gebundenen oder gekuppelten Fluoreszenzfarbstoffmoleküls, d. h. entweder mit einem Farbstoff, der eine Fluoreszenzemission mit annehmbar hoher Quantenausbeute liefert, wenn er direkt durch Strahlung in seinem Absorptionsband angeregt wird, oder mit einem fluorochromen Farbstoff, der,

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wenn er an den Antikörper gebunden ist, mit einer größeren Quantenausbeute fluoresziert als wenn er in Form eines freien Farbstoffmoleküles vorliegt. Typischerweise wurden Farbstoffe, wie Fluorescein, Rhodamin, Pyronin, Eosin, Acridin, Acriflavin, Safranin, Methylenblau und eine Vielzahl anderer Farbstoffe zusammen mit geeigneten fotometrischen Nachweisgeräten bei dieser herkömmlichen Technik angewandt. Die Signalstärke von in herkömmlicher Weise an Antikörper-Antigen-Komplexe gebundenen Fluoreszenzfarbstoffen ist im allgemeinen zu niedrig, um den Nachweis eines einzelnen Teilchens zu ermöglichen. Die bisherigen Versuche diese Empfindlichkeit durch Steigerung der Farbstoffbeladung (der Anzahl der an jeden Antikörper gebunden Farbstoffmoleküle) zu verbessern, führte zu einer Verminderung der Spezifität und der Empfindlichkeit der Antikörper-Antigen-Reaktion, wofür eine Reihe von Gründen postuliert werden können, nämlich:

1. Wenn genügend Farbstoffmoleküle an den Antikörper gebunden oder gekuppelt sind, sind einige von ihnen der Antigen-spezifischen BindungsstelIe so stark angenähert, daß eine teilweise sterische Abschirmung die Folge ist;

2. durch Veränderungen der Gesamthydrophilxtat und der sich ergebenden Ladung des gebildeten Farbstoff-Antikörper-Moleküles werden dessen Reaktivität und Löslichkeit verändert;

J. durch sterische und die Hydrophilität belastende Spannungen des Farbstoff-Antikörper-Moleküls als auch durch mögliche Veränderungen seines" Schwingungsverhaltens kann die Tertiärstruktur des Proteins und damit seine Spezifität gestört werden;

4. durch chemische Wechselwirkungen an der Farbstoff-Antikörper-Bindungsstelle kann eine Veränderung der Atombindungen in einem gewissen Abstand von der Bindungsstelle erfolgen, was möglicherweise die spezifische Bindungsstelle beeinflußt.

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Erfindungsgemäß werden diese Probleme des Standes der Technik durch ein neues und vorteilhaftes System gelöst, das die Anzahl der an das Antikörpermolekül gebundenen Fluoreszenzfarbstoffmolekül erhöht und dennoch die Antikörper-Antigen-Spezifität im wesentlichen unbeeinträchtigt läßt. Zu diesem Zweck wird erfindungsgemäß ein Reagens bereitgestellt, das ein Antikörpermolekül umfaßt, an das über ein Polymerisatgerüst, das längs seiner Kette reaktive, funktionelle Gruppen aufweist, eine große Anzahl von Fluoreszenzfarbstoffmolekülen kovalent gebunden sind. Somit wird durch die Tatsache, daß an einer einzigen Stelle des Antikörpers eine Polymerisatkette mit einer Vielzahl von fluoreszierenden Resten befestigt ist, die Stärke der I'luoreszenzemission (nach entsprechender Anregung) des kombinierten Moleküls sehr wesentlich gesteigert, wobei die Spezjfität der Reaktivität des Antikörpers mit seinem Antigen nur minimal beeinträchtigt wird. Somit ist es ein Hauptziel der Erfindung, die Farbstoffbeladung eines spezifischen Antikörper-lmmunofluoreszenzreagens zu erhöhen, ohne die Spezifität des Materials wesentlich zu beeinträchtigen.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, die Empfindlichkeit von Antikörper-Immunofluoreszenz-Techniken gegenüber dem Stand der Technik um mindestens zwei Größenordnungen zu steigern.

Gegenstand der Erfindung ist daher ein Reagens zum Nachweis von Analyt-Körpern gemäß Hauptpatent (Patentanmeldung P 24 26 519-8), das gekennzeichnet ist durch Moleküle eines ersten Reaktionsteilnehmers, die jeweils ein Kettenmolekül mit einer Vielzahl von reaktiven Stellen darstellen, wobei eine der Stellen eine spezifische Reaktion mit dem Analyt-Körper eingehen kann, bei der eine Vielzahl der Moleküle an den Analyt-Körper gebunden werden; und

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eine Vielzahl von polyfunktionellen Folymerisatgerüsten, von denen mindestens eines kovalent an ein entsprechendes der genannten Moleküle an einer anderen, sterisch von der genannten Stelle entfernten Stelle gebunden ist, um die Spezifität der genannten Reaktion nicht wesentlich zu beeinträchtigen, wobei an jedes Folymerisatgerüst Fluoreszenzfarbstoffmoleküle in einer solchen Anzahl gebunden sind, daß die Spezifität der genannten Reaktion nicht wesentlich beeinträchtigt ist.

Die Ausdrücke"erster Reaktionsteilnehmer" und "zweiter Reaktionsteilnehmer" (im folgenden auch "Analyt" bezeichnet, wie sie hier verwendet werden, sind im breiten physikalischen Sinne zu verstehen. Der erste Reaktionsteilnehmer kann ein Antikörper oder irgendein Kettenmolekül sein, das zwei oder mehrere reaktive Stellen (oder funktionellen Gruppen) aufweist, die sterisch derart voneinander getrennt und derart angeordnet sind, daß eine der Stellen an das Trägerpolymerisat gebunden werden kann, ohne daß die spezifische Reaktivität der anderen Stellen gegenüber dem Analyt-Körper wesentlich beeinträchtigt wird. Typischerweise kann der erste Reaktionsteilnehmer biologisch, d. h. ein Blutserumprotein, dessen Bildung als Reaktion auf die Anwesenheit eines Analyts in Form eines Antigens biologisch vermittelt wird, oder nicht-biologisch sein, d. h. ein Ligand, der organische Sequestriermittel und Chelatbildner und dergleichen umfaßt. Analyte sind Substanzen, die, vorzugsweise mit hoher Spezifität, mit einem bestimmten ersten Reaktionsteilnehmer reagieren, wobei jedes Analyt-Teilchen oder jeder Analyt-Körper eine Vielzahl von reaktiven Stellen aufweist, so daß eine Kupplung mit einer Vielzahl von Molekülen des ersten Reaktionsteilnehmers erfolgt. Somit schließen Analyte definitionsgemäß biologische Antigene ein, die typischerweise komplizierte organische Moleküle mit hohem Molekulargewicht (beispielsweise ein Molekulargewicht von größer als

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10 000) einschließen, wie Enzyme, Toxine, Proteine, möglicherweise Polysaccharide und Lipoproteine, vollständige Mikroorganismen, wie Bakterien, Viren, Protozoen und dergleichen in sowohl lebendem als auch totem Zustand, und Haptene oder Substanzen, die mit einem Antikörper reagieren, jedoch ihrerseits nicht in der Lage sind, die biologische Bildung eines Antikörpers zu verursachen. Solche biologischen Analyte oder Antigene zeigen natürlich definitionsgemäß eine spezifische Reaktion mit den entsprechenden biologischen Antikörpern. Nicht-biologische Analyte, die mit entsprechenden Liganden reagieren, können einfach Metallionen, Molekülcluster oder dergleichen sein.

Das als Gerüst oder Rückgratmolekül gewählte Polymerisat besitzt reaktive Stellen, die längs der Länge der Kette angeordnet sind, und weist am Ende der Kette eine chemisch verschiedene reaktive Stelle auf. Dieser Träger-Polymerisatmolekül sollte entweder starr sein oder dazu neigen, sich in Wasser zu einer Kugelkonfiguration zusammenzufalten, so daß sterische Hinderungen als Folge des Auffaltens oder Verdrehens verhindert werden. Die Nettoionenladung (nach der Kombination mit an die Seitenketten oder Seitenbindungen befestigten Farbstoff molekül en) pro Einheitsvolumen sollte bei dem Arbeits-pH-Wert mindestens gleich dem des ersten Reaktionsteilnehmers sein, wenn dieser einen Antikörper darstellt. Die längs der Länge der Kette des Träger-Polymerisatmoleküls angeordneten reaktiven Stellen sollten eine geringe Affinität für den ersten Reaktionsteilnehmer aufweisen und die Fluoreszenz nicht stören. Vorzugsweise besitzt das Träger-Polymerisatmolekül eine ähnliche Hydrophilität wie der erste Reaktionsteilnehmer. Das Gerüst oder die Kette des Polymerisatmoleküls sollte kovalente Bindungsstellen aufweisen, die durch einen solchen Abstand voneinander getrennt sind, daß eine Störung der möglichen Spektraleigenschaften der Farbstoffreste vermieden

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wird, die durch Störungseffekte eines Farbstoffmoleküls, das durch den Raum hinweg mit einem anderen Färbstoffmolekül in eine Wechselwirkung eintreten kann, verursacht werden könnte.

Der Ausdruck "spezifisch", wie er hierin verwendet wird, dient zur Beschreibung einer Reaktion, bei der die Reaktionsteilnehmer im wesentlichen nur miteinander und in einem wesentlich geringeren oder vernachlässigbaren Ausmaß mit anderen Reaktionsteilnehmern reagieren, wobei ein Beispiel einer derartigen Reaktion insbesondere eine Antikörper-Antigen-Reaktion ist.

Erfindungsgemäß geeignete Polymerisatgerüstmoleküle sind FoIyäthylenimine, die geeigneterweise ein Molekulargewicht im Bereich von 1200 - 60 000 aufweisen, Polypeptide, wie PoIylysine, Polyamide wie Nylon-6, polymere Carbonsäuren mit niedrigem Molekulargewicht (100 - 10 000) und andere polymere Materialien, die sich wiederholende reaktive funktioneile Gruppen längs der Länge ihrer Kette aufweisen.

Die Polymerisatgerüstsubstanz wird mit Farbstoffen markiert, indem man sie mit Fluoreszenzfarbstoffmolekülen reagieren läßt, die ihrerseits jeweils eine reaktive Gruppe aufweisen, so daß sie eine kovalente Bindung mit den sich wiederholenden funktionellen Gruppen des polymeren Materials eingehen können. Vor der Reaktion mit dem Fluoreszenzfarbstoffmolekül werden die reaktiven Endgruppen des Polymerisatmoleküls vorübergehend blockiert oder chemisch geschützt, beispielsweise durch Reaktion mit einer Carbonylverbindung. Zu diesem Zweck geeignete Carbonylverbindungen sind beispielsweise Benzaldehyd, Glutaraldehyd etc..

Im funktionalisierten Zustand für die Erfindung geeignete Fluoreszenzfarbstoffe sind die in der folgenden Aufstellung,

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die keine abschließende Aufstellung darstellt, angegebenen:

Säure-Violett 4BL Acridxnbrxlliantorange Acridinorange Acridingelb Acriflavin Auramin-0 Auropho sphin-G Benzoflavin Berberinsulfat Brilliantphosphin Brillxantsulfoflavxn Chrysoidin Coerulein-S Coriphosphin-0 Coripho spb.infuch.sin Euchrysin-2G Euchrysin-3EX I1avophosphin-E Fluorescein Geranin-G Methylenblau Morin

Neutralrot Orange-G Phosphin-3R Frimulin Pyronin-GS (Pyronin extra) Rhodulinorange Rhodulinviolett Eosolrot-B Safranin

CI. Nr.	42575
CI. Nr.	46005
CI. Nr.	46005
CI. Nr.	56025
CI. Nr.	46000
CI. Nr.	41000
CI. Nr.	46035
CI. Nr.	46035
CI. Nr.	75160
CI. Nr.	46035
CI. Nr.	56205
CI. Nr.	11270
CI. Nr.	45510
CI. Nr.	46020
C.I. Nr.	42755
CI. Nr.	46040
CI. Nr.	46005
CI. Nr.	46035
CI. Nr.	4535O
CI. Nr.	14930
CI. Nr.	52015
CI. Nr.	75660
CI. Nr.	50040
CI. Nr.	16230
CI. Nr.	46045
CI. Nr.	49OOO
CI. Nr.	45OO5
CI. Nr.	460Θ5
CI. Nr.	29IOO
CI. Nr.	438OO
CI. Nt,	50210

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C.I. Nr	. 26105
C.I. Nr	. 45100
C.I. Nr	. 19140
C.I. Nr	. 14780
Cl. Nr	. 19540
C.I. Nr	. 49OIO

Scharlach-fi

Suforhodamin-B

Tartrazin-0

Thiazinrot-R

Thiazolgelb

Thioflavin-S

Thionin C.I. Nr. 52000

Nachdem die Farbstoffmoleküle über die reaktiven Seitengruppen des Polymerisats gekuppelt oder gebunden sind, werden zwei geringfügig verschiedene Verfahrensweisen zum Blockieren der reaktiven Endgruppen des Polymerisats angewandt, die davon abhängen, ob man hierzu einen Monoaldehyd oder einen PoIyaldehyd einsetzt. Wenn als schützendes Mittel ein Monoaldehyd, wie Benzaldehyd, verwendet wird, wird nach dem Ankuppeln des Farbstoffs an das Polymerisat der Benzaldehydrest durch Hydrolyse entfernt, um die Endstellung zu reaktivieren. Sie wird dann in eine funktioneile Gruppe überführt, um. die kovalente Bindung an das Antikörpermolekül zu ermöglichen.

Wenn alternativ ein Polyaldehyd, wie Glutaraldehyd, (Propandial) als schützendes Mittel für die endständige reaktive Stelle des Polymerisats verwendet wird (wozu man vorzugsweise einen großen Überschuß anwendet), muß der schützende Glutaraldehydrest nicht entfernt werden, sondern kann als verbindendes Mittel zur kovalenten Befestigung des Polymerisats an dem Antikörper oder einem anderen ersten Reaktionsteilnehmer dienen.

Der Farbstoff/Polymerisat-Komplex wird dann an den ersten Reaktionsteilnehmer, beispielsweise einen Antikörper, gekuppelt oder gebunden, so daß man einen Farbstoff/Polymerisat/ Antikörper-Komplex erhält. Erforderlichenfalls wird das Reagens

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gepuffert, so daß die Farbstoff/Polymerisat/Antikörper-Moleküle vorzugsweise elektrisch neutral sind, da die Neutralität die Beeinträchtigung der spezifischen Reaktivität des ersten Reaktionsteilnehmers mit dem Analyt, insbesondere bei einer Antikörper-Antigen-Reaktion, auf einem Minimum hält. Man kann den pH-Wert des Reagens mit bekannten Puffern in dem Bereich zwischen den pH-Werten variieren, bei denen bei Reaktionen des Antikörper/Antigen-Typs eine Proteindenaturierung erfolgen kann, d. h. innerhalb eines Bereiches von einem pH-Wert von etwa 4 bis etwa 10. Somit sollten irgendwelche auf den Reagenzmolekülen vorhandene überschüssige Ladungen durch schwach ionisierte Gruppen verursacht sein, wie Carboxygruppen oder Aminogruppen, deren pK-Wert zwischen etwa 4- und etwa 10 liegt.

Der Farbstoff/Polymerisat/Antikörper-Komplex oder das Farbstoff/Polymerisat/Antikörper-Reagens wird, wenn es mit einer Lösung vermischt wird, die das für den Antikörper in dem Komplex vorhandene spezifische Antigen enthält, mit dem Antigen kuppeln oder sich damit verbinden. Da der Analyt-Körper, für den das erfindungsgemäße Reagens reaktiv ist, mehrere Bindungsstellen aufweisen kann, kann sich jeder Analyt-Körper mit zwei oder mehreren Reagensmolekülen verbinden. Beobachtet man einen fließenden Strahl geringen Querschnitts (oder wendet man eine andere bekannte Technik zum Trennen der Moleküle voneinander an), der mit Licht einer Wellenlänge, die in dem Absorptionsband des Farbstoffs des Komplexes liegt, bestrahlt wird, so kann man die Fluoreszenz eines jeden Reagensmoleküls in dem strömenden Strahl nachweisen, die nacheinander die Bestrahlungsstelle passieren. Durch Anwendung eines Schwellenwertes bezüglich der Amplitude eines jeden nachgewiesenen Fluoreszenzimpulses kann man ohne weiteres zwischen jeder Punktquelle, die als Folge einfacher ungebundenerBeagensmoleküle

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Signale geringerer Stärke aussendet und den Signalen größerer Amplitude unterscheiden, die sich durch die Vielzahl der an einem einzelnen Analyt-Körper gebundenen Reagensmoleküle ergeben, so daß in dieser Weise die Anwesenheit des Analytes identifiziert werden kann. Ersichtlich kann diese Technik nicht zwischen einer Gruppe von Reagensmolekülen unterscheiden," die an einem einzigen Analyt-Körper oder an eine Gruppe von vernetzten Reagensmolekülen gebunden sind. Aus diesen Gründen ist es "bei der Herstellung des erfindungsgemäßen Reagens von Bedeutung, eine Vernetzung mit Hilfe geeigneter Mittel, die temporär die reaktiven Gruppen blockieren, zu verhindern, wobei man das Reagens vor der Verwendung vorzugsweise einem Trennverfahren unterwirft, beispielsweise durch Chromatografie über Kieselgel, um im wesentlichen sämtliche vernetzten Reagensmoleküle abzutrennen. In Fällen, bei denen nach der Reaktion des Reagens mit dem Analyt das nicht-umgesetzte Reagens physikalisch abgetrennt werden kann, wird der Nachweis des an einzelne Reagensmoleküle gebundenen Analyts möglich.

Viele, funktionelle Gruppen aufweisende Farbstoffe, wie Fluorescein-isothiocyanat, sind im Handel erhältlich. Typischerweise wird das Fluorescein in üblicher Weise mit funktionellen Gruppen versehen, indem man zunächst eine zusätzliche, nicht-chromophore Aminogruppe in das Fluoresceinmolekül einführt, beispielsweise durch Nitrieren des Fluoresceins mit Salpetersäure und Reduzieren des Nitrats mit naszierendem Wasserstoff, der durch die Zugabe von Zink und Chlorwasserstoffsäure gebildet wird. Dann bildet man das Isothiocyanat durch Zugabe von Thiophosgen. Natürlich sind auch andere Verfahrensweisen zur Herstellung von funktionellen Gruppen aufweisenden Farbstoffen bekannt, indem man sie beispielsweise in die Isothiocyanate überführt oder indem man andere Gruppen einführt, wie Sulfonylchloridgruppen oder eine 2-Bromäthyl-Seitenkette.

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Jeder im Handel erhältliche Antikörper wird vorzugsweise fraktioniert, "beispielsweise über Sepharose, umIinmunoglobin M von ^-Globulin zu trennen. Die letztere Fraktion wird mit dem gefärbten Polymerisat vermischt, wonach die Reaktion beendet wird, beispielsweise mit Äthanolamin oder Trimethylaminomethan-hydrochlorid, wobei man in geeigneter Weise puffert. Diese letztere Reaktion ist eine Amino-Aldehyd-Reaktion, die eine weitere Bindung zwischen dem gefärbten Polymerisat und anderen Antikörpern unterbindet. Die Mischung muß dann fraktioniert werden, beispielsweise über eine mit Sephadex beschickte Säule, um die Antikörper/Polymerisat/ Färbstoff-Moleküle entsprechend der Anzahl der an jedes Antikörpermolekül gebundenen Polymerisatmoleküle zu trennen. Die Fraktionen, die lediglich den Antikörper oder den mit zwei oder mehreren Polymerisaten verbundenen Antikörper enthalten, werden verworfen, da erstere mangels Markierung nicht geeignet sind und letztere eine geringere Spezifität und Empfindlichkeit als die ausgewählte Fraktion aufweisen.

Zum Binden eines primäre Aminogruppen aufweisenden polyfunktionellen Polymerisatgerüstes an einen Antikörper sind Dialdehyde besonders vorteilhaft, da die Reaktion des Aldehyds eine weitere andersartige funktioneile Gruppe in das Polymerisat einführt, so daß der Fluoreszenzfarbstoff selektiv mit den anderen funktionellen Gruppen der Polymerisatkette umgesetzt werden kann, worauf zu einem späteren Zeitpunkt der ungebundene Aldehydrest an einen Antikörper gebunden werden kann.

Der Dialdehyd dient daher sowohl als Blockierungsgruppe oder Schutzgruppe als auch als Gruppe zur Einführung von funktionellen Gruppen für die spätere Reaktion.

Bei der Durchführung der Erfindung läßt man das primäre Aminogruppen aufweisende Polymerisatgerüst mit dem mit funktionellen

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Gruppen versehenen Fluoreszenzfarbstoff reagieren, so daß kovalente Bindungen mit den sich wiederholenden funktioneilen Gruppen des polymeren Materials ausgebildet werden können. Vor der Reaktion mit dem mit funktioneilen Gruppen versehenen Fluoreszenzfarbstoffmolekül setzt man das primäre Amin der polymeren Substanz mit einem Dialdehyd um, um die reaktive endständige Aminogruppe des Polymerisats zu blockieren und gleichzeitig eine funktionelle Gruppe für die spätere kovalente Bindung an den Antikörper einzuführen. Glutaraldehyd stellt den hierfür bevorzugten Dialdehyd dar.

Das folgende Keaktionsschema verdeutlicht die Methode der Bildung eines geeigneten Reagens zum Nachweis von Antigenen, das ein Polyäthylenamin-Gerüst aufweist:

[NCH₂CH₂I_nNIlCH₂CH₂NH₂ + OHC (CH₂) ,CHO

OHC(CH₂),HC = NCH₂CH₂[NCHpCH₂J_nNHCH₂

OHC(CH₂),HC =

N-H

C=S

NCS
+ Antikörper

1
N-H

C=S

(Antikörper)-N=CH(CH₂),HC=NCH₂CH₂N

worin: R=H oder

^R1 ^{= H};

F = Fluorescein

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Die Herstellung der erfindungsgemäßen Reagentien wird durch die Reaktion von Polyäthylenimin 200 (Molekulargewicht = 20 000) mit Glutaraldehyd in Gegenwart von Natriumkakodylat, durch Reaktion des gebildeten Imins mit Fluorescein-isothiocyanat und Umsetzen des mit dem Farbstoff markierten Polymerisates mit dem Anti-Echo-12-Virus-Antiserum verdeutlicht.

Typische Antigene, die erfindungsgemäß verwendet werden können, sind Hepatitis-B-Antigen, Echo-12-Virus-Antigen, Maul- und Klauenseuche-Virus-Antigen und Schweinebläschenkrankheit-Virus-Antigen. Es versteht sich jedoch, daß die Erfindung nicht auf den Nachweis der spezifisch genannten Antigene beschränkt ist, sondern auf alle Antigene angewandt werden kann, für die ein geeigneter Antikörper zur Verfügung steht.

Somit umfaßt die Erfindung auch ein Verfahren zur Herstellung eines diagnostischen Reagens zum Nachweis von Antigenen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man das primäre Aminogruppen enthaltende polyfunktionelle Polymeristtgerüst mit einem Dialdehyd umsetzt, das geschützte polyfunktionelle Polymerisatgerüst mit mit funktionellen Gruppen versehenen Fluoreszenzfarbstoffmolekülen unter Bildung eines Färbstoffmarkierten Polymerisates umsetzt und schließlich das mit dem Farbstoff markierte Polymerisat mit einem geeigneten Antikörper zur Reaktion bringt.

Diese Methode wird durch ein Antigen-Nachweisreagens verdeutlicht, bei dem als mit funktionellen Gruppen versehenes Fluoreszenzfarbstoffmolekül Fluorescein-isothiocyanat, als Dialdehyd Glutaraldehyd, als primäre Aminogruppen aufweisendes polyfunktionelles Polymerisatgerüst Polyäthylenimin mit einem Molekulargewicht von 20 000 verwendet wird, wobei die Anzahl der Fluoreszenzfarbstoffmoleküle etwa 120 beträgt.

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Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zum Nachweis von Antigenen in biologischen Fluiden bzw. Flüssigkeiten und Geweben, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man ein diagnostisches Reagens der oben beschriebenen Art mit einer Probe des biologischen Fluides oder Gewebes vermischt, wobei das erfindungsgemäße Verfahren besonders geeignet ist zum Nachweis von Hepatitis-B-Antigen in Blutproben.

Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung.

Beispiel 1

Man bereitet einen Polymerisat/Farbstoff-Komplex wie folgt: Zu einer Lösung von 2 mg Polyäthylenimin-200 (Molekulargewicht * 20 000) in 1 ml einer o,1m Natriumkakodylatlösung mit einem pH-Wert von 7*0 gibt man 0,1 ml einer 25 %igen wäßrigen Lösung von Glutaraldehyd unter heftigem Rühren. Man rührt die erhaltene Reaktionsmischung während etwa 5 Minuten und trennt dann den überschüssigen Glutaraldehyd durch Überführen der Reaktionsmischung durch eine mit Sephadex-G-25 (0,9 x 15 cm, Kieselgel) gefüllte Säule ab. Die Säule wird mit einer 0,1m wäßrigen Natriumkakodylat-Pufferlösung mit einem pH von 7»2 eluiert, wonach man das Eluat mit 50 mg Fluorescein-isothiocyanat versetzt, das man in 1,5 ml einer 0,5M wäßrigen Natriumcarbonat-Pufferlösung mit einem pH von 9,5 verwendet. Man rührt die Mischung ununterbrochen während der Zugabe und setzt das Rühren während etwa 16 Stunden fort, wobei man die Mischung von einer Lichteinwirkung fernhält. Der überschüssige Farbstoff wird durch Überführen der Mischung durch eine mit Sephadex-G-25 (Kieselgel) gefüllte Säule (0,9 x 30,0 cm) und anschließendes Eluieren der Säule mit einer o,1m wäßrigen Natriumkakodylat-Lösung mit einem pH-Wert von 7,0 entfernt. Hierbei werden 2-ml-Fraktionen aufgefangen.

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Der erhaltene Polymerisat/Farbstoff-Komplex wird mit Hilfe der Folin-Ciocaulteau-Proteinmethode analysiert. Diese Untersuchung sm et ho de ergibt bei Polyäthylenimin eine gerade Kurve und ist daher für die Bestimmung der vorhandenen Polymerisatmenge geeignet. Der Extinktionskoeffizient von Fluoresceinisothiocyanat bei 495 um beträgt 73 x 10 und nimmt nach der Bindung auf 75 % dieses Wertes ab. Durch Bestimmen des in einer gegebenen Probe des Komplexes vorhandenen Polymerisates als auch des dort vorhandenen Farbstoffes kann man das Ausmaß der Färbstoffbindung abschätzen. Dieses Maß der Bindung hängt von der Färbstoffkonzentration in der ursprünglichen Reaktionsmischung ab. Durch Gelfiltration kann man eine beschränkte Fraktionierung erreichen. Der nach diesem Beispiel bereitete Komplex enthält etwa 70 Farbstoffmoleküle pro Polyäthyleniminmolekül.

Beispiel 2

Man wiederholt die Verfahrensweise des Beispiels 1, wobei man jedoch das Molverhältnis von Farbstoff zu Polyäthylenimin progressiv verändert, so daß man Polymerisat/Farbstoff-Komplexe erhalt, die etwa 65 bis 80 Farbstoffmoleküle pro Molekül des Polyäthylenimins-200 enthalten.

Beispiel 3

Man wiederholt die Verfahrensweise des Beispiels 1, wobei man jedoch 0,1 ml einer 25 %igen Lösung von Benzaldehyd in Dioxan anstelle des Glutaraldehyds zur Herstellung eines Polymerisat/ Farbstoff-Komplexes verwendet, der demjenigen des Beispiels 1 mit dem Unterschied ähnlich ist, daß die endständigen reaktiven Gruppen jeden Polyäthyleniminmoleküls mit einem Benzaldehydrest gekuppelt sind.

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Beispiel 4

Wenn man die Verfahrensweise des Beispiels 1 wiederholt, jedoch das Polyäthylenimin-200 durch Polyäthylenimin-600 (Molekulargewicht = 60 000) ersetzt, so enthält der erhaltene Polymerisat/Farbstoff-Komplex etwa 1JO Farbstoffmoleküle pro Folyäthyleniminmolekül.

Beispiel 5

Man wiederholt die Verfahrensweise des Beispiels 1 unter Anwendung ähnlicher Bedingungen, setzt jedoch anstelle von Polyäthylenimin Polylysin (Molekulargewicht = 8000 bis 20 000) und anstelle von Fluorescein-isothiocyanat das Isothiocyanat von Lissamin-Rhodamin-B ein, wobei man einenPolylysin/Rhodamin-Komplex erhält, der an jedes Gerüstmolekül des Komplexes eine Vielzahl von gebundenen Farbstoffmolekülen aufweist. Lissamin-Rhodamin-B besitzt die Struktur, die auf Seite 379 des Buches "Dyeing and Cehmical Technology of Textile Fibres", Trotman, 45. Auflage, C. Griffin & Co., London, beschrieben ist.

Beispiel 6

Verwendet man bei dem Verfahren des Beispiels 5 Sulfonylchlorid von Lissamin-Rhodamin-B, so erhält man ebenfalls den entsprechenden Rhodamin/Polymerisat-Komplex.

Beispiel 7

Zur Bildung eines erfindungsgemäßen Reagens (d. h. eines Farbstoff/Polymerisat/Antikörper-Komplexes) löst man Anti-Echo-Virus-Antiserum (2,5 Mg) in einer 0,1m wäßrigen Natriumkakodylatlösung mit einem pH-Wert von 7»0 und gibt unter Rühren 1,1 mg des Polymerisat/Farbstoff-Komplexes von Beispiel 1 zu. Man rührt die erhaltene Mischung während 10 Minuten und versetzt dann mit 1 mg Tris/Chlorid (Tris(hydroxymethyl)-aminomethanhydrochlorid), um eine Vernetzung der Antikörpermoleküle zu verhindern. Man rührt während weiterer 35 Minuten und trägt

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die Mischung dann auf eine mit Sephadex-G-200 gefüllte Säule (0,9 x 60 cm) (Kieselgel) auf, die mit einem 0,1m Tris/Chlorid-Puffer (Tris(hydroxymethyl)-aminomethan-hydrochlorid) mit einem pH-Wert von 8,5 ins Gleichgewicht gebracht worden ist. Man eluiert die Säule mit dem gleichen Puffer und fängt 2-ml-Fraktionen mit Reagens auf.

Die optische Dichte des Reagens und der Fraktionen wird bei 280 nm und bei 495 um bestimmt. Durch Differenz spektralanalyse wird die Menge des Antikörpers in jeder Fraktion bestimmt und die Menge des pro Antikörpermoleküls gebundenen Farbstoffs abgeschätzt. Kennt man die Anzahl der Farbstoffmoleküle pro Polymerisatmolekül, so kann man die mittlere Anzahl der folymerisatmoleküle pro Antikörpermolekül berechnen. Bei dieser Untersuchung wurde ermittelt, daß an jedes Antikörpermolekül 1,2 bis 1,3 Polymerisatmoleküle gebunden sind.

Die immunologische Aktivität des Farbstoff/Polymerisat/Antikörper-Kompexes wird durch Hämagglutination gemessen. Bei dieser Untersuchung zeigt sich, daß der Farbstoff/Polymerisat/ Antikörper-Komplex 70 % der Aktivität des nicht-kombinierten Antikörpers beibehalten hat.

Die Fluoreszenz des Farbstoff/Polymerisat/Antikörper-Komplexes wird unter Verwendung eines Fluoreszenzmeßgerätes (Aminco Bowan) bestimmt. Die Fluoreszenz wird im Vergleich zu Standardlösungen von Fluorescein-isothiocyanat mit Konzentrationen von 0,001 bis 1,0 ml gemessen. Die Anregung wird bei 4-95 und die Emission bei 526 nm bestimmt. Die Komplexe werden verdünnt, so daß sie die gleiche optische Dichte bei 4-95 besitzen, wie die bekannten Verdünnungen von Fluoresceinisothiocyanat. Die Quantenausbeute ergibt sich bei dem Komplex, der Polyäthylenimin mit 80 Färb stoff molekül en enthält, zu 4 %,

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während zu Vergleichszwecken freies Fluorescein-isothiocyanat eine Quantenausbeute von 100 % besitzt.

Das in dieser Weise bereitete Reagens wird durch eine mit Sephadex beschickte Säule geführt, wobei sämtliche Fraktionen mit Ausnahme derjenigen verworfen werden, die das Reagens enthalten, bei dem an einen Antikörper nur ein Polymerisatmolekül gebunden ist. Wenn man diesesFraktion mit einer Lösung vermischt, die Anti-Echo-Virus als Analyt enthält, so erfolgt eine Antikörper-Antigen-Reaktion, bei der jedes Virusteilchen sich mit zwei oder mehr Antikörper-Komplexen verbindet.

Beispiel 8

Zur Herstellung eines weiteren erfindungsgemäßen Reagens trennt man den Benzaldehyd-Anteil des Komplexes nach Beispiel 3 durch milde Hydrolyse in 1 ml einer 1 %igen Chlorwasserstoffsäurelösung unter Kühlen während etwa 3 Stunden ab, wonach man die überschüssige Säure durch Dialyse der Lösung entfernt. Anschließend zieht man das Wasser durch Eindampfen der Lösung unter vermindertem Druck ab und löst den erhaltenen Polymerisat/Farbstoff-Komplex in heißem Aceton. Zu der Acetonlösung gibt man 10 Äquivalente Thiophosgen und zusätzliches Aceton, wonach man die Mischung während A- Stunden zum Sieden am Rückfluß erhitzt. Dann verdampft man das Aceton unter Bildung eines funktionelle Gruppen aufweisenden Polymerisat/Farbstoff-Komplexes.

Man löst den mit funktionellen Gruppen versehenen Polymerisat/ Farbstoff-Komplex in Wasser, puffert mit einer 0,5m Natriumcarbonatlösung auf einen pH-Wert von 9»5 und gibt etwa 2,5 mg Anti-Echo-Virus-Antiserum zu. Man rührt die Mischung während etwa 16 Stunden, wobei man das Material von jeglicher Lichteinwirkung fernhält. Dann trennt man den überschüssigen Farbstoff ab, indem man das Material durch eine mit Sephadex gefüllte

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Säule führt, wobei man die Säule mit einer 0,1m wäßrigen Natriumkakodylatlösung mit einem pH-Wert von 7,0 eluiert. Es werden 2-ml-Fraktionen aufgefangen, die den Polymerisat/ Farbstoff/Antikörper-Komplex enthalten, der ein Polymerisat/ Antikörper-Verhältnis von 1 : 1 aufweist.

Beispiel ff

Man bereitet ein weiteres erfindungsgemäßes Reagens, das zum Nachweis der Anwesenheit eines mehrwertigen Metalls, hier insbesondere Nickel, geeignet ist, unter Verwendung eines für dieses Metall geeigneten Liganden.

Zu einer Lösung, die 10 mg des nach Beispiel 1 bereiteten Polymerisat/Farbstoff-Komplexes enthält, gibt man 0,1 mg eines Liganden, in diesem Fall Benzyl-p-aminobenzyl-diisonitroäthan (d. h. Benzyl-p-aminoglyoxim), und rührt die Mischung während einer Minute. Man beendet die Reaktion durch Zugabe von 100 mg Äthanolamin, das man mit Carbonat auf einen pH-Wert von 9 gepuffert hat. Man dialysiert die Mischung zur Abtrennung des überschüssigen Äthanolamins und des überschüssigen Benzylglyoxims. Trägt man das erhaltene Reagens auf eine eingetrocknete Schicht eines nickelhaltigen Fluids auf einem Objektträger auf, so werden etwa 4- Moleküle des Polymerisat/Farbstoff/ Liganden-Komplexes an jedes Nickelatom gebunden. Der Objektträger wird dann geringfügig mit Wasser gewaschen, um das überschüssige Reagens zu entfernen. Bei der mikroskopischen Untersuchung des Objektträgers, der mit Licht mit einer Wellenlänge im Bereich des Absorptionsbandes von Fluorescein beleuchtet wird, zeigt sich die Anwesenheit von Nickelatomen durch eine Fluoreszenzamplitude an jeder Stelle, bei der eine Gruppe von gebundenen Komplexen vorliegt.

Beispiel 10

Zur Untersuchung der Reaktivität des erfindungsgemäßen Farbstoff/Polymerisat/ Antikörper-Komplexes bereitet man eine

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—8
Lösung von 3 »44 χ ΊΟ Mol des australischen Antigens

(auch als Hepatitis-B-Antigen bekannt) in einem 0,1m Tris-Amin hydrochlorid-Puffer ({Dris(hydroxymethyl)-aminomethan-hydrochlorid). Man bereitet den Parbstoff/Polymerisat/Antikörper-Komplex nach der Verfahrensweise des Beispiels 7 unter Verwendung von Polyäthylenimin-200 als Gerüst, Fluorescein-isothiocyanat als Farbstoff und eines im Handel erhältlichen Antikörpers für das australische Antigen. Die Mengenverhältnisse werden derart eingestellt, daß der Komplex etwa 70 Farbstoffmoleküle pro Polyäthyleniminmo1ekül aufweist. Die Fraktion mit
einem Verhältnis von Polyäthyleniminmolekülen zu Antikörper
von 1 : 1 wird mit Hilfe einer mit Sephadex beschickten Säule abgetrennt. Die erhaltene Fraktion zeigt eine Proteinkonzentration von 340 mg/ml, d. h. sie enthält 2,2 χ 10 ' Mol des
markierten Antikörpers. Man vermischt die Fraktion mit Antigen unter Anwendung von Antikörper/Antigen-Molverhältnissen von
100 : 1, 10 : 1 und 1 : 1 und bestrahlt die Mischung mit einer die Fluoreszenz anregenden Strahlung. Die Mischung mit dem
Verhältnis von 100 : 1 zeigt etwa dieselben Fluoreszenzeigenschaften wie der markierte Antikörper als solcher, wobei
lediglich Emissionen sehr geringer Intensität beobachtet
werden. Die Mischung mit dem Verhältnis von 10 : 1 zeigt
größere Emissionsquellen, während die Mischung mit einem
Verhältnis von 1:1 noch hellere Stellen zeigt. Im allgemeinen nimmt mit zunehmendem Antigenanteil die Anzahl der Quellen höherer Helligkeit zu, wobei angenommen wird, daß diese letzte-

an

ren Quellen Antigene darstellen, die/eine Vielzahl von Antikörpern gebunden sind.

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Claims

Patentansprüche

T.) Reagens zum Nachweis von Analyt-Körpern gemäß Hauptpatent (Patentanmeldung P 24 26 519.8),

gekennzeichnet durch:

Moleküle eines ersten Reäktionsteilnehmers, die jeweils ein Kettenmolekül mit einer Vielzahl von reaktiven Stellen darstellen, wobei eine der Stellen eine spezifische Reaktion mit dem Analyt-Körper eingehen kann, bei der eine Vielzahl der Moleküle an den Analyt-Körper gebunden werden; und

eine Vielzahl von polyfunktionellen Polytnerisatgerüsten, von denen mindestens eines kovalent an ein entsprechendes der genannten Moleküle an einer anderen, sterisch von der genannten Stelle entfernten Stelle gebunden ist, um die Spezifität der genannten Reaktion nicht wesentlich zu beeinträchtigen, wobei an jedes Polymerisatgerüst Fluoreszenzfarbstoffmoleküle in einer solchen Anzahl gebunden sind, daß die Spezifität der genannten Reaktion nicht wesentlich beeinträchtigt ist.

2. Reagens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der erste Reaktionsteilnehmer ein Proteinmolekül ist.

5. Reagens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Analyt-Körper ein Antigen und der erste Reaktionsteilnehmer ein Antikörper sind.

4. Reagens nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Analyt-Körper um ein mehrwertiges Metall und bei dem ersten Reaktionsteilnehmer um einen Liganden handelt,

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5. Reagens nach Anspruch 3> dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper derjenige ist, der für Hepatitis-B-Antigen spezifisch ist.

6. Reagens nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß es als Liganden Dibenzylglyoxim enthält.

7. Reagens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es als Fluoreszenzfarbstoff Fluorescein enthält.

8. Reagens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es als Fluoreszenzfarbstoff Lissamin-Rhodamin-B enthält.

9. Reagens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es als Polymerisatgerüst ein Polyäthylenimin mit einem Molekulargewicht im Bereich von 1200 bis 60 000 umfaßt.

10. Reagens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es als Polymerisatgerüst ein Polyäthylenimin mit einem Molekulargewicht von im wesentlichen 1200 umfaßt.

11. Reagens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es als Polymerisatgerüst ein Polyäthylenimin mit einem Molekulargewicht von etwa 20 000 enthält.

12. Reagens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es als Polymerisatgerüst ein Polyäthylenimin mit einem Molekulargewicht im Bereich von 1200 bis 60 000 und als Fluoreszenzfarbstoff Fluorescein enthält.

3. Verfahren zur Herstellung eines Reagens zum Nachweis eines Analyt-Körpers, dadurch gekennzeichnet, daß man: ein polyfunktionelles Polymerisat mit einer Carbonylverbindung umsetzt, um eine oder mehrere reaktive Stellen an den Enden des Polymerisatgerüstes zu blockieren und in dieser Weise

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ein geschütztes Polymerisat zu bilden; mit funktioneilen Gruppen versehene Moleküle eines Fluoreszenzfarbstoffs mit den reaktiven Stellen an dem Polymerisatgerüst des geschützten Polymerisates umsetzt, um in dieser Weise ein Farbstoff-markiertes Polymerisat zu bilden; und

durch kovalente Bindung das Farbstoff-markierte Polymerisat über eine der endständigen reaktiven Stellen mit einem Reaktionsteilnehmermolekül kuppelt, das eine spezifische Reaktion mit dem Analyt-Körper eingeht.

14. Verfahren nach Anspruch 13» dadurch gekennzeichnet, daß man als Carbonylverbindung einen Fionoaldehyd einsetzt und die kovalente Kupplung dadurch bewirkt, daß man zunächst den Fionoaldehyd durch milde Hydrolyse von der endständigen Stelle abspaltet, um diese endständige Stelle zu reaktivieren, und dann die reaktivierte endständige Stelle mit dem Reaktionsteilnehmermolekül umsetzt.

15« Verfahren nach Anspruch 14-, dadurch gekennzeichnet, daß man als Reaktionsteilnehmermolekül Polyäthylenimin einsetzt,

16. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß man als Reaktionsteilnehmermolekül einen polyvalenten Metall-Liganden verwendet.

17. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß man als Carbonylverbindung Benzaldehyd, als Farbstoff Fluorescein-isothiocyanat und als Polymerisat Polyäthylenimin einsetzt.

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18. Verfahren zum Nachweis von Analyt-Körpern, dadurch gekennzeichnet, daß man diese Körper mit einem Reagens vermischt, das Moleküle eines Reaktionsteilnehmers enthält, der mit den Analyt-Körpern eine spezifische Reaktion eingeht, wobei diese Moleküle kovalent an ein polyfunktionelles Polymerisatgerüst gebunden sind, das seinerseits mit einer Vielzahl von Fluoreszenzfarbstoffmolekülen gekuppelt ist, die in einer solchen Anzahl vorhanden sind, daß die Spezifität der Reaktion der Analyt-Körper mit dem Reaktionsteilnehmer nicht wesentlich beeinträchtigt wird.

19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß als Analyt-Körper Antigene und als Reaktionsteilnehmer Antikörper eingesetzt werden.

20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß man die Antigene und den Antikörper unter solchen Bedingungen miteinander vermischt, unter denen der Farbstoff/ Polymerisat/Antikörper-Komplex des Reagens im wesentlichen elektrisch neutral ist.

21. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß man die Mischung aus den Analyt-Körpern und dem Reagens mit einer Strahlung belichtet, deren Wellenlänge im Absorptionsband des Farbstoffs liegt.

22. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß man als Analyt-Körper ein mehrwertiges Metall und als Reaktionsteilnehmer einen Liganden einsetzt.

23· Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß man die Amplitude der Fluoreszenzemission von jeder Emissionsquelle bei der Belichtung der Farbstoffmoleküle beobachtet und nur Jene Emissionen auswählt, deren Amplituden oberhalb eines ausgewählten Schwellenwertes liegen.

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24. Antigen-Nachweisreagens zum Nachweis von in Flüssigkeiten, biologischen Fluiden und Geweben vorhandenen Antigenen, gekennzeichnet durch

einen für das nachzuweisende Antigen spezifischen Antikörper, der eine primäre Aminogruppe aufweist; ein eine primäre Aminogruppe aufweisendes, polyfunktionelles Polymerisatgerüst, das kovalent an den Antikörper gebunden ist; und

eine Vielzahl von an das Gerüst gebundenen Fluoreszenzfarbstoffmolekülen, wobei die Anzahl der Fluoreszenzfarbstoffmoleküle so weit eingeschränkt ist, daß die Bildung eines Komplexes des mit deren Gerüst verbundenen Antikörpers mit dem Antigen nicht verhindert wird, und wobei das polyfunktionelle Polymerisatgerüst und der Antikörper mit Hilfe eines Dialdehyds verbunden sind, der kovalent sowohl an die primäre Aminogruppe des polyfunktionellen Polymerisatgerüstes als auch an die primäre Aminogruppe des Antikörpers gebunden ist.

25. Reagens nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß es als polyfunktionelles Polymerisatgerüst Polyäthylenimin oder Polylysin, als Fluoreszenzfarbstoff Fluorescein-isothiocyanat oder das Sulfonylchlorid von Lissamin-Rhodamin-B und als Dialdehyd Glutaraldehyd enthält.

26. Reagens nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß es als polyfunktionelles Polymerisatgerüst Polyäthylenimin, als Fluoreszenzfarbstoff Fluorescein und als Dialdehyd Glutaraldehyd enthält.

27. Reagens nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß es als polyfunktionelles Polymerisatgerüst ein Polyäthylenimin mit einem Molekulargewicht von etwa 20 000, als Fluoreszenzfarbstoffmoleküle Fluorescein-isothiocyanat, das über kovalente Bindungen an das Polyäthyleniminmolekül

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in einem Verhältnis von etwa 65 : 1 "bis 120 : 1 gebunden als Dialdehyd Glutaraldehyd umfaßt.

28. Reagens nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß es als Farbstoffmoleküle Fluoresceinmoleküle enthält.

29· Reagens nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß es als polyfunktionellesPolymerisatgerüst ein Polyäthylenimin mit einem Molekulargewicht im Bereich von 1200 bis 60 aufweist.

JO. Reagens nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß es als polyfunktionelles Polymerisatgerüst ein Polyäthylenimin mit einem Molekulargewicht von 1200 enthält.

31· Reagens nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß es als polyfunktionelles Polymerisatgerüst ein Polyäthylenimin mit einem Molekulargewicht von 20 000 enthält.

32. Reagens nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß es als polyfunktionelles Polymerisatgerüst ein Polylysin
enthält.

33· Reagens nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß es als Antikörper den Antikörper enthält, der für Hepatitis-B-Antigen spezifisch ist.

34. Reagens nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß es als Antikörper den Antikörper enthält, der für Anti-Echo-Virus spezifisch wirkt.

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35· Reagens nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß es als Antikörper den Antikörper enthält, der für AntiEcho-Virus spezifisch wirkt, als polyfunktionelles Polymerisatgerüst ein Polyäthylenimin mit einem Molekulargewicht von 20 000 und als Fluoreszenzfarbstoffmolekül Fluorescein enthält, wobei die Anzahl der Fluoreszenzfarbstoffmoleküle, die an jedes Gerüstmolekül gebunden sind, etwa 120 beträgt.

36. Verfahren zur Herstellung eines diagnostischen Reagens zum Nachweis von Antigenen, dadurch gekennzeichnet, daß man

ein Polyäthylenimin mit einem Molekulargewicht von etwa 20 000 mit Glutaraldehyd umsetzt, um ein geschütztes polyfunktionelles Polymerisatgerüst zu bilden, die polyfunktionellen Gruppen aufweisenden Fluoresceinisothiocyanat-Moleküle mit dem geschützten polyfunktionellen Polymerisatgerüst unter Bildung eines Farbstoff-markierten Polymerisats umsetzt, das pro Polymerisatgerüst etwa 120 gebundene Farbstoffmoleküle aufweist, und das Farbstoff-markierte Polymerisat mit einem geeigneten Antikörper umsetzt.

37· Verfahren zum Nachweis von Antigenen in Flüssigkeiten, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Probe der Flüssigkeit mit einem diagnostischen Reagens nach Anspruch 24 vermischt.

38. Verfahren nach Anspruch 37 > dadurch gekennzeichnet, daß man eine Probe der Flüssigkeit mit einem diagnostischen Reagens nach Anspruch 27 vermischt.

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