DE3152832C2 - Verfahren zur Bestimmung von Antigenen, Antikörpern und deren Komplexen - Google Patents

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur quantitativen und qualitativen Bestimmung von Antigenen, Antikörpern und deren Komplexen mittels Fluoreszein bzw. einem Derivat davon als chemolumineszierender Markierungssubstanz und einem Hypochlorit als Anregungsmittel hierfür unter Anwendung an sich bekannter heterogener Fest- oder Flussigphasenassays.

Es ist von großer Bedeutung, Antigene, Antikörper oder deren Komplexe in Sekreten, Exkreten und Körperflüssigkeiten von Wirbeltierorganismen sowie von Menschen zu messen. Auf diese Weise können u. a. diagnostische Aussagen gemacht werden.

Es ist bekannt, eine serologische Reaktion durch Markierung einer oder mehrerer Reaktionskomponenten mit einem radioaktiven Isotop, durch Konjugierung mit einem Enzym, einem Fluoreszenzfarbstoff oder einer chemolumineszierenden Substanz, wie Luminol oder Luciferin, nachzuweisen.

Das Radioimmunoassay wird in Journal Clinical Endocrinology 27 (1967), S. 973, und ibid. 28 (1968), S. 343, beschrieben. Der wesentliche Nachteil dieses Assays liegt in dem notwendigen Umgang mit strahlenemittierenden Isotopen und in der erforderlichen aufwendigen Ausrüstung zur Durchführung eines solchen Assays.

Bei der Markierung einer Reaktionskomponente mit einem Enzym besteht der Nachteil darin, daß diese Markierung kompliziert durchzuführen und das hergestellte Reaktionsprodukt schwierig aufzubewahren und zu gebrauchen ist. Darüber hinaus handelt es sich bei den einzusetzenden Enzymen um biologisch aktive Substanzen extrem komplexer Natur, auf die die erwähnten Schwierigkeiten zurückgehen. Die schließlich zum Nachweis des gebundenen Enzyms einzusetzenden Substrate sind darüber hinaus noch kanzerogen.

Das ist nachteilig. Das Enzym-Assay der beschriebenen Art wird in BuIL World Health Organ 53 (1976) abgehandelt

Bei der Fluoreszenztechnik wird ein Antigene und Antikörper enthaltendes Reaktionsprodukt durch Fluoreszen.7 unter Bestrahlung mit kurzwelligem Licht nachgewiesen. Hierbei muß das Anregungslicht vom emittierten Licht nachteiligerweise mit großem apparativem Aufwand abgetrennt werden.

Bei den bisher zur Chemolumineszenz herangezogenen chemolumineszierenden Substanzen handelt es sich um solche, die nur sehr schwer an die Reaktionspartner einer serologischen Reaktion zu binden sind und darüber hinaus bis zu 993% ihrer ursprünglichen Lumineszenz nach der Bindung verlieren. Das ergibt sich z. B.

aus Nature, VoL 299 (1979), S. 646-647. Des weiteren wird in Journal of Immunological Methods 21 (1978), S. 178—184, darüber berichtet, daß das chemolumineszierende Luminol aus diesem Grunde für klinische Routinelabortests ungeeignet ist

Dem stehen Angaben in der US-PS 41 93 983 entgegen. Dort wird gerade Luminol als eine besonders geeignete Verbindung für diesen Zweck angegeben. Als Anregungsmittel für die Chemolumineszenz sollen Wasserstoffperoxid oder Calciumhypochlorit in Betracht kommen. Des weiteren wird in dieser US-Patentschrift Fluoreszeinisothiocyanat für ein homogenes Fluoreszenz-Assay erwähnt.

Trotz intensiver Bemühungen war es bisher nicht möglich, ein Verfahren der eingangs beschriebenen Art bezüglich Aufwand und Effizienz zufriedenstellend durchzuführen. Das gilt zum Beispiel auch für das in der US-PS 42 38 195 beschriebene Assay. Dort werden Markierungssubstanzen in Form von Fluoreszein und dessen Derivaten vorgeschlagen, die mittels besonders energiereicher Produkte angeregt werden sollen. Diese Produkte werden durch eine sehr komplexe Reaktion zwischen Oxalsäurederivaten, u. a. Oxalylchlorid, und Wasserstoffperoxid.hergestellt. Ihre Herstellung erfordert einen hohen Arbeitsaufwand. Darüber hinaus sind derartige Produkte nicht unbedenklich, da sie unter Umständen das giftige Phosgen entwickeln können.

Die ältere DE-OS 31 32 491 beschreibt ein Verfahren der eingangs beschriebenen Art, wobei jedoch als Anregungsmittel Natriumhypochlorit eingesetzt wird. Natriumhypochlorit existiert nicht in fester Form, was eine genaue Einstellung der Konzentration an Natriumhypochlorit in der Anregungslösung ausschließt. Es wird daher auf den Gehalt an aktivem Chlor abgestellt. Dieser Chlorgehalt ändert sich jedoch fortwährend, so daß es oft erforderlich ist, vor Durchführung des Assays diesen wieder neu zu bestimmen. Gegenüber dem erfindungsgemäß verwendeten Calciumhypochlorit ist das ein schwerwiegender Nachteil. Bei Calciumhypochlorit handelt es sich nämlich um ein definiertes festes Salz, das zur Herstellung der gewünschten Konzentration der Anregungslösung lediglich eingewogen und in ein definiertes Lösungsvolumen gebracht werden muß. Darüber hinaus hat es sich im Rahmen der nachfolgend beschriebenen Erfindung gezeigt, daß Calciumhypochlorit insbesondere bezüglich des wichtigen Redoxpotentials dem Natriumhypochlorit überlegen ist, was nicht zu erwarten war.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, aus der

Vielzahl der bekannten chemolumineszierenden Markierungssubstanzen und Anregungsmittel solche Kombinationen derselben aufzufinden, die es gestatten, das eingangs beschriebene Verfahren so zu verbessern, daß es gefahrlos, einfach und mit hoher Effizienz durchführbar ist

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe dadurch gelöst, daß als Anregungsmittel Calciumhypochlorit verwendet wird.

Wenn im Zusammenhang mit der Erfindung von Antigenen und Antikörpern gesprochen wird, so sollen diese Begriffe weitestgehend verstanden werden. Bei Antigenen handelt es sich um Stoffe, die nach Einführung in den Organismus von Menschen und Tieren die Bildung von Antikörpern hervorrufen. Als Antigene wirken artfremde Eiweißstoffe tierischer und pflanzlicher Herkunft, besonders diejenigen von Infektionserregern, sowie viele Stoffe komplizierter Natur mit fett-, saccharid- (bzw. zucker-), amin- und azoartiger Struktur. So kann es sich dabei um Substanzen, z. B. Proteide, Proteine, Polysaccharide, Lipide oder Nucleinsäuren handeln, die im Organismus von Wirbeltieren sowie von Menschen die Bildung von Antikörpern hervorrufen und spezifisch mit diesen reagieren. Auch sollen hierzu ganz allgemein Haptene gezählt werden, zu denen man auch »unvollständige Antigene« sagt, die wegen ihrer geringen Größe allein keine Bildung von Antikörpern bewirken, jedoch mit den entsprechenden Antikörpern eine spezifische Bindung eingehen können. Antigene können z. B. Viren, Bakterien oder Pilze oder Teile von diesen sein. Darüber hinaus sind z. B. auch bestimmte Hormone, Vitamine, Enzyme oder bestimmte Medikamente dem Begriff »Antigen« unterzuordnen. Zur Definition der Begriffe »Antigene« und »Antikörper« sei auf Kabat »Einführung in die Immunchemie und Immunologie«, Springer Verlag, 1971, S. 9-25 und S. 143—197, verwiesen.

Im Sinne der Erfindung handelt es sich bei Antikörpern um spezifische Produkte der Immunantwort, die im Wirbeltier- bzw. im menschlichen Organismus nach einem Antigenkontakt gebildet werden und spezifisch mit dem Antigen reagieren können. Neben die Antikörper sollen ausdrücklich bestimmte Bindeproteine gestellt werden, die sich spezifisch an ein oder mehrere Substanzen, wie z. B. Antikörper, binden können. Ein Beispiel hierfür ist das Protein A. Von besonderer Bedeutung sind die Antikörper, die den Immunglobulinen der Klasse IgG, IgM, IgA und IgE unterzuordnen sind. Diese werden im einzelnen in Kabat »Einführung in die Immunchemie und Immunologie«, Springer Verlag, 1971, S. 143-197, beschrieben.

Von besonderer Bedeutung ist das erfindungsgemäße Verfahren zum Nachweis von Antigenen und Antikörpern bei viralen und bakteriellen Erkrankungen. Dabei ist der Nachweis des Oberflächenantigens des Hepatitis-B-Virus von ganz besonderer Bedeutung. Mit besonderem Vorteil gelingt auch der Nachweis von Antikörpern gegen die Herpes- oder Toga-Viren.

Bei der Verwendung von Fluoreszein oder Fluoreszeinderivaten hat es sich gezeigt, daß sie sich besonders gut an Proteine bzw. Proteide binden lassen. Das bedeutet, daß Fluoreszein mit einer oder mehreren Gruppen substituiert ist, die dessen Affinität im Hinblick auf die Kopplung mit den erwähnten Antigenen und Antikörpern begünstigen. Als besonders vorteilhaft haben sich dabei die Isothiocyanat- und Isocyanatgruppe als die Kopplung vermittelnde bzw. begünstigende Substituenten erwiesen. Eine besonders bevorzugte Stellung der Isothiocyanatgruppe ergibt sich aus der nachfolgenden Formel (FITC).

SCN

COOH

HO

Die Kopplungsfähigkeit des Fluoreszeins, das gegebenenfalls neben den die Kopplung begünstigenden bzw. vermittelnden Substituenten auch noch mit nicht koppelnden Substituenten versehen sein kann, kann hervorgerufen bzw. verbessert werden, indem ein geeignetes Reagens hinzugegeben wird, das eine Kopplungsreaktion bzw. eine Brückenbildung zwischen dem Fluoreszeingrundkörper und dem jeweiligen Antigen bzw. Antikörper oder deren Äquivalente hervorruft.

Wenn im Sinne der Erfindung von »Kopplungsfähigkeit« gesprochen wird, so soll auch diese Eigenschaft weitestgehend verstanden werden. In keinem Fall soll damit ausdrücklich auf eine ganz bestimmte Bindungsart abgestellt werden. Vielmehr soll nur zum Ausdruck gebracht weröen, daß durch eine Wechselwirkung zwischen der Markierungssubstanz und dem Partner einer serologischen Reaktion in irgendeiner Form ein bindender bzw. ein bindendes komplexartiges Gebilde entsteht.

In Einzelfällen ist es denkbar, daß das zu markierende Antigen nicht oder nicht in ausreichendem Maße mit der jeweils herangezogenen chemolumineszierenden Markierungssubstanz reagieren kann. In solchen Fällen werden dem Fachmann geläufige Proteine oder Proteide verwendet, die zunächst an das Antigen gebunden werden, so daß nachfolgend die Markierungssubstanz an das Protein des entstandenen Reaktionsproduktes gebunden wird. Hierbei kann auch umgekehrt verfahren werden, indem die Markierungssubstanz zunächst an das Protein bzw. Proteid gebunden wird und ein derartiges chemolumineszierendes Konjugat mit dem fraglichen Antigen in Wechselwirkung gebracht wird. Im übrigen hat es sich gezeigt, daß die Empfindlichkeit der vorliegenden Assays ganz beachtlich gesteigert werden kann, wenn bei der Herstellung des chemolumineszierenden Konjugats die chemolumineszierende Markierungssubstanz in Form von Fluoreszein bzw. dessen Derivaten an ein Protein, insbesondere ein Immunglobulin, gebunden wird.

Das erfindungsgemäß einzusetzende Anregungsmittel reagiert grundsätzlich mit der mit dem Antigen, dem Antikörper oder deren Komplexen gekoppelten chemolumineszierenden Markierungssubstanz in der Weise, daß letztere Photonen aussendet.

Calciumhypochlorit, das als Anregungsmittel im Falle der Verwendung von Fluoreszeinisocyanat herangezogen wird, zeigt, insbesondere in wäßriger Lösung, verschiedene beachtliche Vorteile. So läßt sich das Assay außergewöhnlich exakt reproduzieren. Die im Einzelfall gewünschte exakte Konzentration des Anregungsmittels läßt sich ohne weiteres festlegen. Allgemein kann gesagt werden, daß eine etwa 0,1- bis 2Ogew.-°/oige und insbesondere eine 0,2- bis 10gew.-°/oige Calciumhypochloritlösung zu vorteilhaften Ergebnissen führt. Ganz besonders bevorzugt wird eine etwa 1,0- bis

4,Ogew.-°/oige Lösung, wobei sich eine 2gew.-°/oige Lösung als ganz besonders günstig erweist

Das erfindungsgemäße Verfahren kann, wie bereits einleitend angedeutet, auf der Grundlage an sich bekannter heterogener Assays durchgeführt werden. Derartige Verfahren werden in vielfältiger Weise in der Literatur beschrieben. Hierzu soll zum Beispiel verwiesen werden auf die US-PS 42 38 ISo (siehe insbesondere Sp. 7 bis 11, Z. 15).

Das erfindungsgemäße Verfahren läßt sich demzufolge in vielfältiger Weise, was dem Fachmann ohne weiteres erkennbar ist, verwirklichen. Grundsätzlich muß zunächst, was in an sich bekannter Weise geschieht, der Antigen/Antikörper-Komplex aufgrund einer serologischen Reaktion gebildet werden. Dies kann auf verschiedene Weise erfolgen, indem zunächst entweder das Antigen und der Antikörper in Lösung vorliegen oder ein Partner, & h. das Antigen oder der Antikörper an einer festen Phase gebunden ist Hierbei spricht man entweder von einem Flüssigphase!"·- oder einem Festphasen-Assay. Nach Abschluß der serologischen Reaktion wird in beiden Fällen der Antigen/Antikörper-Komplex von dem verbleibenden Reaktionsmedium abgetrennt Bei dem Festphasen-Assay kann das in einfacher Weise dadurch geschehen, daß die überstehende Flüssigkeit, gegebenenfalls nach Zentrifugieren, dekantiert wird. Beim Flüssigphasen-Assay erfolgt die Trennung zum Beispiel durch Zentrifugieren mit anschließendem Dekantieren bzw. Filtrieren, insbesondere durch Ultrafiltration, Chromatographieren und dergleichen. Der in der geschilderten oder einer ähnlichen Weise isolierte Antigen/Antikörper-Komplex wird anschließend mit einem flüssigen Medium in Kontakt gebracht, welches das damit in Wechselwirkung zu bringende chemolumineszierende Konjugat enthält.

Das chemolumineszierende Konjugat enthält die vorgenannte chemolumineszierende Markierungssubstanz neben dem Antigen oder Antikörper (bzw. Protein). Aus dem chemolumineszierenden Konjugat und dem Antigen/Antikörper-Komplex bildet sich ein neuer chemolumineszierender Komplex, der zum Beispiel anhand einer oder mehrerer der vorgenannten Separationsmethoden isoliert wird. Dabei kann er bereits in der Meßküvette vorliegen bzw. darin entstanden sein oder wird in eine solche überführt. In jedem Fall wird vor Durchführung der Messung das jeweilige Anregungsmittel hinzugegeben, bei dem es nicht wesentlich ist, in welcher Art von Lösungsmittel, sofern erforderlich, es vorliegt. Bevorzugt wird ein wäßriges Medium, insbesondere ein alkalisches, in dem das Anregungsmittel enthalten ist.

Oben wurde ein Vorgehen geschildert, bei dem »indirekt« die chemolumineszierende Markierungssubstanz an den jeweiligen Reaktionspartner eine·· serologischen Reaktion gebunden wird. Daneben besteht aber auch noch die Möglichkeit ein »direktes« Assay anzuwenden. Dabei wird entweder ein Antigen oder ein Antikörper vorgegeben. In Abhängigkeit vom Vorgabematerial wird ein Antikörper- bzw. Antigen-Konjugat (mit der chemolumineszierenden Markierungssubstanz) hinzugegeben und ein chemolumineszierender Komplex gebildet, der anschließend isoliert wird. Danach folgt die Chemolumineszenzmessung nach Zugabe des Anregungsmittels.

Mit großem Vorteil läßt sich das erfindungsgemäße Verfahren auch auf der Grundlage eines Sandwich-Assays durchführen. Ein Sandwich-Assay kann grundsätzlich sowohl im Rahmen eines Flüssigphasen- aber auch eines Festphasenassays angewandt werden. Das wesentliche Kennzeichen eines im Verläufe eines Sandwich-Assays gebildeten chemolumineszierenden Konjugats ist darin zu sehen, daß in dein bezüglich der Chemolumineszenz gemessenen Komplex der nachzuweisende Reaktionspartner in Form eines Antigens oder eines Antikörpers sowohl mit seinem konjugierten als auch mit seinem nicht-konjugierten Reaktionspartner reagiert hat Bei Außerachtlassung der gekoppelten

Markierungssubstanz handelt es sich also um einen symmetrisch aufgebauten Komplex, bei dem die zentrale Reaktionskomponente das Antigen oder der Antikörper ist die nachzuweisen ist. Der vorgegebene Reaktionspartner bzw. die vorgegebene Reaktionskomponente tritt an zwei Seiten dieser zentralen Reaktionskomponenten damit in Wechselwirkung.

Dem erfindungsgemäßen Gedanken sollen jedoch auch übliche kompetitive Bindungsassays untergeordnet werden. Bei einem derartigen Assay liegt ein Reaktionspartner einer serologischen Reaktion einerseits markiert und andererseits nicht markiert vor. Diese beiden Reaktionspartner treten mit einem entsprechenden anderen Reaktionspartner in Wechselwirkung. So kann es sich bei dem ersten Reaktionspartner (markiert oder unmarkiert) um ein Antigen handeln. Dann ist der zweite Reaktionspartner ein Antikörper. Erster markierter Reaktionspartner und zweiter Reaktionspartner (Antigen bzw. Antikörper) sind mengenmäßig vorgegeben. Nach Ablauf der serologischen Reaktion wird entweder der nicht gebundene Teil des markierten ersten Reaktionspartners oder der gebildete Komplex in üblicher Weise nach Zugabe des Anregungsmittels gemessen. Diese Technik ist allgemein bekannt (siehe US-PS 42 38 195 a.a.O.). Ihre Variationen sind demzufolge dem Fachmann geläufig.

Die Chemolumineszenz kann mit handelsüblichen Photometern gemessen werden. Dabei läßt sich so vorgehen, daß mit vorgegebenen bekannten Mengen an Antigen und Antikörper eine Eichkurve ermittelt wird.

Mit einer unbekannten Substanz (sei es ein Antigen oder ein Antikörper) ermittelte Werte werden dann quantitativ unter Zugrundelegung der Eichkurve ausgewertet.

Des weiteren ist es auch möglich, wenngleich dieses unter halbquantitativen Gesichtspunkten zu sehen ist, einen Vergleich bezüglich der Empfindlichkeit mit anderen bekannten Assays zu ziehen. Der bisher als besonders nachweisempfindlich angesehene Radioimmunoassay, mit den vorstehend geschilderten Nachteilen behaftet, liegt in der Mehrzahl der Anwendungsgebiete bezüglich der Empfindlichkeit weit unter derjenigen des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Die mit der Erfindung erzielbaren Vorteile sind insbesondere darin zu sehen, daß die j ewei's verwendete chemolumineszierende Markierungssubstanz außerordentlich einfach an einen Reaktionspartner einer serologischen Reaktion, nämlich in Form von Antigenen und Antikörpern bzw. Bindeproteinen, zu binden ist. Zudem sind die erfindungsgemäß in Betracht kommenden Markierungssubstanzen wie auch das Anregungsmittel einfach aufgebaut und für das mit dem erfindungsgemäßen Verfahren befaßte Personal, insbesondere bezüglich der Freisetzung von giftigen Verbindungen, unbedenklich. Die damit hergestellten Konjugate bzw. Komplexe sind relativ stabil, was für die Verfahrensführung von Vorteil ist.

Der mit der Erfindung erzielbare technische Erfolg muß als außergewöhnlich überraschend angesehen wer-

den. So zeigt das Fluoreszein bzw. dessen Derivate nach der Bindung an einen der Reaktionspartner einer serologischen Reaktion eine wesentlich höhere Empfindlichkeit als die entsprechende ungebundene Verbindung. Die Zahl der ausgesandten Photonen des chemolumineszierenden Komplexes ist etwa lOOOmal höher als die Zahl der Photonen, die von der jeweils ungebundenen Substanz ausgesandt werden. In diesem Zusammenhang ist es von Bedeutung, daß in Journal of Physical Chemistry, Vol. 78, Nr. 17, S. 1681-1683 (1979), ausdrücklich darauf hingewiesen wird, daß zur Erzielung einer meßbaren Photonenausbeute eine unverhältnismäßig große Menge an Fluoreszein oder Fluoreszeinisothiocyanat eingesetzt werden muß. Dieses hat die Fachwelt bisher davon abgehalten, Fluoreszein bzw. seine Derivate im praktischen Rahmen zur Durchführung serologischer Assays auf der Qrundlage einer Chemolumineszenzmessung heranzuziehen.

Nachfolgend soll die Erfindung noch näher anhand von Beispielen erläutert werden.

Beispiel 1

Bestimmung der Nachweisgrenzen von reinem
Fluoreszeinisothiocyanat (FITC) und Bestimmung der Nachweisgrenze eines FITC-Konjugats

Um die Nachweisgrenze von reinem FITC zu bestimmen, wurde 1 mg FITC in 10 ml destilliertem Wasser aufgelöst Anschließend wurde die Extinktion einer 1:100-Verdünnung bei 495 nm im Photometer gemessen. Von der Ausgangslösung wurden weiterhin 10 Verdünnungen (5er Schritte) angelegt und jeweils 20 μΐ davon in einem handelsüblichen Photometer gemessen. Zu Beginn der Messung wurden 100 μΐ einer 2gew.-%igen Calciumhypochloritlösung in die zu messende Probe injiziert. Das Ergebnis der Meßreihen ergibt sich aus der folgenden Zahlreihe.

Menge an FiTC in ng/ml

Gemessene Photonen/sec

18 101

8 485

2 748

735

394 Der Leerwert des Geräts bei Messungen ohne FITC lag unter diesen Bedingungen im Höchstfall bei 380 Photonen/sec. Daher liegt die Nachweisgrenze für reines FITC bei 32 ng/ml.

Um die Nachweisgrenze von an Protein gebundenem FITC zu bestimmen, wurde das FITC an Immunglobulin G von der Ziege nach der Methode von B. T. Wood, S. H. Thomson und G. Goldstein, beschrieben in Journal of Immunology 95 (1964), S. 225, gebunden. Von dem derartig hergestellten chemolumineszierenden Konjugat wurde ebenfalls die Extinktion bei 495 nm im Photometer gemessen und so die Menge an gebundenem FITC bestimmt. Anschließend wurde ebenfalls eine Verdünnungsreihe von 10 Verdünnungen angelegt und die Chemolumineszenz einer 20-μ1-ΡΓοοε jeder Verdünnung gemessen. Das Ergebnis der Meßreihe ist in der folgenden Zahlenreihe dargestellt.

Menge an FITC in ng/ml

Gemessene Photonen/sec

1,6
0,32
0,064
0,0128

982 895 683 914 835 513 822 378

Die Nachweisgrenze für das FITC-Protein-Konjugat lag demzufolge bei 0,064 ng/ml. Daraus ergibt es sich, daß die FITC-Konjugate außergewöhnlich gut für den Nachweis von Antigenen, Antikörpern bzw. deren Komplexen über eine serologische Reaktion mittels Chemolumineszenz geeignet sind.

40

45

Claims (7)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur quantitativen und qualitativen Bestimmung von Antigenen, Antikörpern und deren Komplexen mittels Fluoreszein bzw. einem Derivat davon als chemoluniineszierender Markierungssubstanz und einem Hypochlorit als Anregungsmittel hierfür unter Anwendung an sich bekannter heterogener Fest- oder Flussigphasenassays, dadurch gekennzeichnet, daß als Anregungsmittel Calciumhypochlorit verwendet wird

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Sandwichassay angewandt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß in einem wäßrigen Medium gearbeitet wird.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Chemolumineszenz in einem wäßrigen Medium gemessen wird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß Calciumhypochlorit in einer 0,2- bis 10gew.-%igen wäßrigen Lösung bei der Messung der Chemolumineszenz verwendet wird.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß als Fluoreszeinderivat Fluoreszeinisothiocyanat und/oder Fluoreszeinisocyanat verwendet werden.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß ein Hepatitis-B-Antigen oder Antikörper gegen Herpes- oder Toga-Viren bestimmt werden.