DE69215983T2

DE69215983T2 - Verfahren zur Messung der Konzentration eines Immuno-Reaktanden unter Verwendung von Elektrochemilumineszenz

Info

Publication number: DE69215983T2
Application number: DE1992615983
Authority: DE
Inventors: Shinji Kamiya; Akira Shibue; Masaru Tanaka
Original assignee: TDK Corp
Current assignee: TDK Corp
Priority date: 1991-07-10
Filing date: 1992-03-11
Publication date: 1997-05-22
Anticipated expiration: 2012-03-12
Also published as: DE69215983D1; EP0522677B1; EP0522677A1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

1. Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Konzentrationsmessung eines in einer Flüssigkeit vorliegenden Immunoreaktanten durch Verwendung von Elektrochemilumineszenz.

2. Beschreibung des Standes der Technik

Verfahren zur Konzentrationsmessung eines in einer Flüssigkeit vorliegenden Immunoreaktanten, wie Antigen oder Antikörper, durch Verwendung von Elektrochemilumineszenz sind bekannt. Beispielsweise ist ein Verfahren bekannt, bei dem ein zu einem in einer flüssigen Probe enthaltenen Antikörper komplementäres Antigen vorher mit einer elektrochemilumineszenten Substanz, wie Luminol, Pyren, usw., markiert wird. Das markierte Antigen wird zur Umsetzung mit dem Antikörper zu der flüssigen Probe gegeben, wodurch Chemilumineszenz auf Grundlage elektrochemischer Umsetzung (Elektrochemilumineszenz) der als Marker an dem Antigen gebundenen chemilumineszenten Substanz wegen der Immunreaktion unterdrückt wird. Unter Nutzyng der Unterdrückung wird die Konzentration an Antikörper in der flüssigen Probe durch Messung der Elektrochemilumineszenzmenge bestimmt.
Das Verfahren weist jedoch den Nachteil auf, daß die Änderung der Lumineszenzmenge aufgrund der Konzentrationsänderung von Antigen oder Antikörper gering ist und daher die Meßgenauigkeit gering ist.
Die Messung elektrochemilumineszenter Phänomena ist beispielsweise in WO 89/10552 beschrieben.

KURZDARSTELLUNG DER ERFINDUNG

Folglich ist es eine Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Messung der Konzentration eines Immunoreaktanten bereitzustellen, das eine starke Änderung in der Lumineszenzmenge aufgrund Konzentrationsänderung des zu messenden Immunoreaktanten liefert und daher eine verbesserte Meßgenauigkeit gewährleistet.
Vorstehende Aufgabe wird gemäß vorliegender Erfindung durch Herstellen einer Elektrode mit einem daran immobilisierten Immunoreaktanten, Binden eines mit einer chemilumineszenten Acridiniumverbindung markierten Immunoreaktanten an die Elektrode durch Immunreaktion, oder Antigen-Antikörper-Reaktion in einer flüssigen Probe, anschließend Ausführen elektrochemischer Reduktion mit der Elektrode als Arbeitselektrode, um Elektrochemilumineszenz auszulösen und Messen der Lumineszenzmenge, gelöst.
Die vorliegende Erfindung stellt daher ein Verfahren zur Messung der Konzentration eines Immunoreaktanten in einer flüssigen Probe bereit, umfassend die Schritte:
Zugeben eines mit dem Immunoreaktanten in der flüssigen Probe kompetitiven Immunoreaktanten zu der flüssigen, Immunoreaktanten-enthaltenden Probe, wobei der kompetitive Immunoreaktant zuvor mit einer chemilumineszenten Acridiniumverbindung markiert worden ist;
Herbeiführen einer Immunreaktion zwischen den unmarkierten und markierten Immunoreaktanten mit einem komplementären Immunoreaktant, der zur spezifischen Bindung mit den Immunoreaktanten befähigt ist und der auf einer Elektrode immobilisiert ist, um das Stattfinden einer kompetitiven Bindung der unmarkierten und markierten Immunoreaktanten auf der Elektrode zu ermöglichen;
Waschen der Elektrode, um Überschuß an Immunoreaktanten oder ungebundene, unmarkierte und markierte Immunoreaktanten zu entfernen, und
Unterwerfen von gelöstem Sauerstoff in einer elektrolytischen Lösung einer elektrochemischen Reduktion unter Verwendung der gewaschenen Elektrode als Arbeitselektrode zur Erzeugung von Lumineszenz, und
Messen der Lumineszenzmenge. (Dieses Verfahren wird nachstehend als "erste Erfindung" bezeichnet.)
Gemäß vorliegender Erfindung wird auch ein Verfahren bereitgestellt zur Messung der Konzentration eines Immunoreaktanten in einer flüssigen Probe, umfassend die Schritte:
Herbeiführen einer Immunreaktion zwischen dem Immunoreaktanten mit einem komplementären Immunoreaktanten, der zur spezifischen Bindung mit dem zu messenden Immunoreaktanten befähigt ist und der auf einer Elektrode immobilisiert ist, in der flüssigen Probe, um das Stattfinden einer Bindung des Immunoreaktanten in der flüssigen Probe auf der Elektrode zu ermöglichen;
Zugabe eines Überschusses des mit einer chemilumineszenten Acridiniumverbindung markierten, komplementären Immunoreaktanten zu der so erhaltenen Flüssigkeit, um eine Reaktion des gebundenen Immunoreaktanten mit dem markierten komplementären Immunoreaktanten zu ermöglichen;
Waschen der Elektrode, um den Überschuß an Immunoreaktanten oder ungebundenen markierten komplementären Immunoreaktanten zu entfernen, und
Unterwerfen gelösten Sauerstoffs in einer elektrolytischen Lösung einer elektrochemischen Reduktion unter Verwendung der gewaschenen Elektrode als Arbeitselektrode zur Erzeugung von Lumineszenz, und
Messen der Lumineszenzmenge. (Dieses Verfahren wird nachstehend als "die zweite Erfindung" bezeichnet.)
Die erfindungsgemäßen Verfahren sind zur Messung von Antigen- oder Antikörperkonzentrationen im Bereich von etwa 10&supmin;¹¹ bis etwa 10&supmin;&sup5; g/ml wirksam. Die erfindungsgemäßen Verfahren geben eine starke Änderung in der Lumineszenzmenge aufgrund Änderung in der zu messenden Antigen- oder Antikörperkonzentration, und bieten deutlich bessere Meßgenauigkeit, verglichen mit Verfahren des Standes der Technik.

KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Figur 1 ist eine schematische Darstellung der Schritte der ersten Erfindung.
Figur 2 ist ein Diagramm, das das Muster einer zur Berechnung des Antigengehalts aus der Elektrochemilumineszenzmenge in einer flüssigen Probe verwendeten Kalibrierkurve bei Ausführung des ersten erfindungsgemäßen Verfahren zeigt.
Figur 3 ist eine schematische Darstellung der Schritte der zweiten Erfindung.
Figur 4 ist ein Diagramm, das das Muster einer zur Berechnung des Antigengehalts aus der Elektrochemilumineszenzmenge in einer flüssigen Probe verwendeten Kalibrierkurve bei Ausführung des zweiten erfindungsgemäßen Verfahren zeigt.
Figur 5 ist ein Schema, das die Meßergebnisse in Beispiel 1, einem Arbeitsbeispiel der ersten Erfindung, zeigt.
Figuren 6 und 7 sind schematische Darstellungen, die die Ergebnisse der Messungen in Beispielen 2 bzw. 3 zeigen, die Arbeitsbeispiele der zweiten Erfindung sind.

GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

In der vorliegenden Erfindung bedeuten Immunoreaktanten Antigen oder Antikörper und komplementärer Immunoreaktant bedeutet Antikörper oder Antigen, der/das in der Lage ist, spezifisch an das Antigen oder den Antikörper zu binden. Typische, jedoch nicht einschränkende Beispiele des Immunoreaktanten und des komplementären Immunoreaktanten schließen nachstehende ein:
- Antigene: IgG, IgA, IgM, IgE, Albumin, HCG, AFP, Cardinolipinantigen, Blutgruppensubstanzen, Concanavalin A, DNT, Prostaglandin, CRP, HB, Humanwachstumshormone, Steroidhormone, CEA, IgD, usw.
- Antikörper: Antialbuminantikörper, Anti-HCG-Antikörper, Anti-IgG- Antikörper, Anti-IgA-Antikörper, Anti-IgM-Antikörper, Anti-IgE-Antikörper, Anti-IgD-Antikörper, Anti-AFP-Antikörper, Anti-DNT-Antikörper, Antiprostaglandinantikörper, Antihumangerinnungsfaktorantikörper, Anti-CRP-Antikörper, Anti-HB-Antikörper, Antihumanwachstumshormonantikörper, Antisteroidhormonantikörper, Seren, die vorstehend genannte Antikörper enthalten und monoklonale Antikörper.

Elektrode

In den erfindungsgemäßen Verfahren wird von einer Elektrode Gebrauch gemacht, auf der ein komplementärer Immunoreaktant, der in der Lage ist, mit einem zu messenden Immunoreaktanten spezifisch zu binden, immobilisiert ist. Die Immobilisierung des komplementären Immunoreaktanten an der Elektrode kann durch übliche Verfahren erreicht werden, beispielsweise durch Beschichten der Elektrode mit einem Silanhaftmittel oder mit Protein A, erhalten von Staphylococcus und anschließend Binden des komplementären Immunoreaktanten an die Beschichtung auf der Elektrode.
Die Elektrode, auf der der komplementäre Immunoreaktant immobilisiert wird, kann eine beliebige Elektrode sein, vorausgesetzt, daß wirksame Immobilisierung möglich ist. Im allgemeinen werden jedoch vorzugsweise Metallelektroden, wie Platinelektroden, Goldelektroden usw., Kohlenstoffelektroden, wie Graphit, Glaskohlenstoff usw., und Oxidelektroden, wie ITO-Elektroden usw., vorzugsweise verwendet.

Chemilumineszenter Stoff

In dem erfindungsgemäßen Verfahren wird eine chemilumineszente Acridiniumverbindung zur Markierung eines Immunoreaktanten oder eines komplementären Immunoreaktanten verwendet.
Chemilumineszente Acridiniumverbindungen sind unter Bereitstellung einer Markierung mit Chemilumineszenzvermögen hoher Spezifität unter milden Bedingungen zur kovalenten Bindung an Antikörper oder Antigen in der Lage.
Die chemilumineszenten Acridiniumverbindungen schließen beispielsweise ein Acridiniumacylchlorid mit der folgenden Formel (1):
wobei A ein Anion ist, und einen Acridiniumester mit der folgenden Formel (2):
wobei A ein Anion ist und R ein aliphatischer oder alicyclischer Rest mit 1-12 Kohlenstoffatomen, die substituiert oder unsubstituiert sein können, oder ein aromatischer Rest mit 6-12 Kohlenstoffatomen, die substituiert oder unsubstituiert sein können, ist, wobei die Reste eine reaktive Gruppe aufweisen können, ein.
In den vorstehenden Formeln (1) und (2) kann das Anion A durch Anionen von Tetrafluoroborat, Perchlorat, Halogenen, wie Chlor und Brom, Sulfaten, wie Fluorsulfat, Alkylsulfonaten, wie Ethylsulfonat, Arylsulfonat, wie Phenylsulfonat, beispielhaft angegeben werden. Von den für R in Formel (2) geeigneten Resten schließen die aliphatischen Reste beispielsweise Alkylreste, wie Methyl, usw.; die alicyclischen Reste, beispielsweise Cycloalkylreste, wie Cyclohexyl usw., und die aromatischen Reste, beispielsweise Arylreste, wie Phenyl, Naphthyl usw., und Aralkylreste, wie Benzyl, Phenylethyl usw., ein. Die reaktiven Reste, die an den vorstehend genannten aliphatischen, alicyclischen oder aromatischen Resten vorliegen können, schließen beispielsweise Aminogruppen, Carbonylgruppen und Succinimidylgruppen ein. Insbesondere schließen typische Beispiele der Acridiniumester der Formel (2) Acridinium-I, das heißt 4-(2-Succinimidyloxycarbonylethyl)phenyl-10-methylacridinium-9-carboxylatfluorsulfat ein. Neben den vorstehend genannten Acridiniumverbindungen können auch die in Japanischer vorgeprüfter Patentveröffentlichung (KOKAI) Nr.63-57572 (1988) und Japanischer vorgeprüfter Patentveröffentlichung (KOKAI) Nr. 1-261461 (1989) beschriebenen chemilumineszenten Acridiniumverbindungen und die beispielsweise in US-A- 4 123 496, US-A-3 352 791, GB-A-1 316 363 und 1 461 877 und Japanischer vorgeprüfter Patentveröffentlichung (KOKAI) Nr.62-61969 (1984) beschriebenen chemilumineszenten Acridiniumester, verwendet werden.
Die Markierung des Immunoreaktanten oder komplementären Immunoreaktanten mit vorstehend genannter chemilumineszenter Acridiniumverbindung kann leicht ausgeführt werden, beispielsweise durch Zugabe der chemilumineszenten Acridiniumverbindung zu einer verdünnten wässerigen Alkalilösung eines Antikörpers oder Antigens unter Umsetzung der Acridiniumverbindung mit dem Antikörper oder Antigen. Die Umsetzung kann unter milden Bedingungen ausgeführt werden. Beispielsweise kann Rühren des Reaktionsgemisches bei einer Temperatur von 0ºC bis etwa Raumtemperatur die Reaktion unter Bereitstellung eines markierten Immunoreaktanten oder komplementären Immunoreaktanten zufriedenstellend verlaufen lassen. Es ist von Vorteil, daß die an den Antikörper oder das Antigen gebundene chemilumineszente Acridiniumverbindung als Marker eine äußerst hohe Lumineszenzintensität aufweist, wobei die Intensität einige Zehnmal dessen beträgt, das beispielsweise mit Luminol, unterstützt durch Peroxidaseverstärker, erreicht wird. Der Mechanismus der Lumineszenz der Acridiniumverbindungen ist bekannt und es ist ebenfalls von Vorteil, daß die Lumineszenz in Gegenwart von Wasserstoffperoxid ohne speziellen Katalysator stattfindet.

Elektrochemilumineszenz

In der vorliegenden Erfindung wird der vorstehend beschriebene markierte Immunoreaktant oder komplementäre Immunoreaktant an der vorstehend genannten Elektrode durch Immunreaktion oder Antigen-Antikörper- Reaktion immobilisiert und elektrochemische Reduktion von gelöstem Sauerstoff in einer elektrolytischen Lösung wird mit der Elektrode als Arbeitselektrode (Kathode) ausgeführt, wodurch Chemilumineszenz hervorgerufen wird. Das heißt, die elektrochemische Reduktion des gelösten Sauerstoffs liefert Wasserstoffperoxid an der Arbeitselektrode und das Wasserstoffperoxid kommt mit dem an der Arbeitselektrode immobilisierten markierten Immunoreaktanten oder komplementären Immunoreaktanten (der nachstehend einfach als "markierter Reaktant" bezeichnet werden kann) unter Hervorrufen von Lumineszenz in Kontakt.
Die elektrolytische Lösung zur Verwendung in dem vorliegenden Verfahren sollte unbedingt gelösten Sauerstoff enthalten und die Menge an gelöstem Sauerstoff sollte hoch genug sein, um ausreichende Mengen an Wasserstoffperoxid zur Auslösung der Lumineszenz des an der Elektrode markierten, immobilisierten Reaktanten (markiert mit der chemilumineszenten Acridiniumverbindung) auszulösen. Gewöhnlich werden diese Bedingungen erfüllt. Wenn die Menge an gelöstem Sauerstoff unzureichend werden könnte, können Luft oder ein Sauerstoff enthaltendes Gas bei nicht weniger als einem bestimmten Partialdruck in die elektrolytische Lösung vor der Messung eingeführt werden, wodurch eine ausreichende Menge an gelöstem Sauerstoff gewährleistet werden kann.
Im allgemeinen wird als elektrolytische Lösung gewöhnliche Phosphatpuffer-Salzlösung (PBS) verwendet.
Das zur Lumineszenz auf Basis elektrochemischer Reduktion von gelöstem Sauerstoff erforderliche Potential der Arbeitselektrode hängt von den Eigenschaften der elektrolytischen Lösung und des verwendeten Elektrodenmaterials, den Umgebungsbedingungen usw. ab.
Wenn beispielsweise PBS pH 7 bis 7,4 als elektrolytische Lösung verwendet wird, wird eine Platinelektrode als Elektrode (Antigen- oder Antikörperelektrode) bei Raumtemperatur verwendet, ein Potential von -1,5 bis - 0,2 V gegen Ag/AgCl kann geeignet sein.
Elektroden, die als Gegenelektrode (Anode) verwendet werden können, schließen beispielsweise Elektroden aus Metall, wie Platin, Gold und dergleichen, Elektroden aus Kohlenstoff, wie Graphit, Glaskohlenstoff und dergleichen, und Oxidelektroden, wie ITO-Elektroden, ein.
Die wie vorstehend erzeugte Lumineszenzmenge wird beispielsweise mit einem Photodetektor, wie einer Photovervielfacherröhre usw., gemessen.
Die Lumineszenzmenge hängt von der Menge an der Elektrode gebundenen markierten Reaktanten und die Menge an gebundenen, markierten Reaktanten hängt von der Konzentration des in der flüssigen Probe zu messenden Immunoreaktanten ab. Nachdem die Lumineszenzmengen für eine Vielzahl von flüssigen Proben, die einen Immunoreaktanten in bekannten Konzentrationen enthalten, gemessen wurden und eine Kalibrierkurve erstellt wurde, kann daher die Konzentration an Immunoreaktanten in einer gegebenen flüssigen Probe durch Messen der Lumineszenzmenge für die gegebene flüssige Probe berechnet werden.
Die erste Erfindung und die zweite Erfindung werden nun im einzelnen genauer erläutert. Der Einfachheit halber werden nachstehende Erläuterungen in bezug auf den Fall ausgeführt, daß der in einer flüssigen Probe vorliegende, zu messende Immunoreaktant ein Antigen ist und der komplementäre Immunoreaktant dazu ein komplementärer Antikörper ist.

Erste Erfindung

Die Schritte des Meßverfahrens gemäß der ersten Erfindung sind schematisch in Figur 1 dargestellt.
In Schritt (A), dargestellt in Figur 1, wird zunächst ein komplementärer Antikörper 2 für ein in einer flüssigen Probe zu bestimmendes Antigen an einer Elektrode 1 immobilisiert. Die Elektrode 1 mit dem daran immobilisierten komplementären Antikörper 2 wird dann als "Antikörperelektrode" bezeichnet.
Danach wird in Schritt (b) ein markiertes Antigen 5, das mit einer chemilumineszenten Acridiniumverbindung 4 markiert ist, zu einer flüssigen, ein unmarkiertes, zu messendes Antigen 3 enthaltende flüssige Probe gegeben und die erhaltene Flüssigkeit mit der Antikörperelektrode 1 in Kontakt gebracht.
Die chemilumineszente Acridiniumverbindung 4, die hier als Markierung oder als Marker verwendet wird, liefert, wie vorstehend beschrieben, Chemilumineszenz in Gegenwart von Wasserstoffperoxid, wobei die Intensität der Lumineszenz sehr hoch ist. Im allgemeinen wird, wie üblicherweise bei der kompetitiven Technik ausgeführt, die Menge des zu der flüssigen Probe zuzugebenden markierten Antigens, hinsichtlich der Menge an immobilisiertem Antikörper an der Elektrode im Überschuß eingeregelt. Wenn die Menge an markiertem Antigen 5 viel zu hoch oder zu gering ist, kann die Lumineszenzmenge aufgrund der Konzentrationsänderung an unmarkiertem Antigen zu gering sein, um zufriedenstellende Meßgenauigkeit zu liefern.
Außerdem werden in Schritt (C) das unmarkierte Antigen 3 und das markierte Antigen 5 in der Flüssigkeit kompetitiv an die Antikörperelektrode 1 durch eine Immunreaktion oder durch Antigen-Antikörper-Reaktion gebunden und dann der Überschuß an freiem unmarkiertem Antigen 3 und markiertem Antigen 5 fortgewaschen.
Die Immunreaktion ist eine kompetitive Reaktion des unmarkierten Antigens 3 und des markierten Antigens 5 mit dem immobilisierten Antikörper 2 an der Elektrode 1, so daß die Menge an markiertem Antigen 5, die an der Antikörperelektrode 1 gebunden ist, von der Konzentration des unmarkierten Antigens 3 in der flüssigen Probe abhängt. Das heißt, je höher die Konzentration an unmarkiertem, zu messendem Antigen 3, desto geringer ist die Menge an gebundenem, markiertem Antigen 5, je geringer die Konzentration an zu messendem, unmarkiertem Antigen 3, desto höher ist die Menge an gebundenem, markiertem Antigen 5.
Das Fortwaschen des ungebundenen oder freien, unmarkierten Antigens 3 und des markierten Antigens 5 nach Abschluß der Immunreaktion wird durch Herausnahme der Antikörperelektrode 1 aus der flüssigen Probe und Waschen der Elektrode mit einer Reinigungsflüssigkeit ausgeführt. Die Reinigungsflüssigkeit kann eine beliebige Flüssigkeit sein, vorausgesetzt, daß die Flüssigkeit keine schädliche Wirkung auf das markierte, an den immobilisierten Antikörper 2 gebundene Antigen 5 ausübt. Im allgemeinen wird vorzugsweise Phosphatpuffer-Salzlösung (PBS) verwendet.
Anschließend wird in Schritt (D) durch Verwendung von Elektrode 1 Elektrolumineszenz bewirkt. Wie vorstehend genauer angegeben, wird Elektrochemilumineszenz durch elektrochemische Reduktion von gelöstem Sauerstoff in einer elektrolytischen Flüssigkeit mit Elektrode 1 als Arbeitselektrode (Kathode) ausgeführt. Das heißt, die Reduktion von Sauerstoff ruft die Erzeugung von Wasserstoffperoxid an der Arbeitselektrode (Kathode) hervor, welches die Chemilumineszenz der Acridiniumverbindung 4, die an dem an der Elektrode gebundenen, markierten Antigen 5 gebunden ist, auslöst.
Die Lumineszenzmenge schwankt im Verhältnis zur Menge an gebundenem, markiertem Antigen 5. Je höher die Konzentration an unmarkiertem Antigen 3 in der flüssigen Probe, desto geringer ist die Lumineszenz, je geringer die Konzentration an unmarkiertem Antigen 3, desto höher ist somit die Lumineszenz. Folglich weist jede gemäß dem Verfahren der ersten Erfindung erhaltene Kalibrierkurve das in Figur 2 dargestellte Muster auf. Die Konzentration eines Antigens in einer flüssigen Probe wird aus der gemessenen Lumineszenzmenge auf Grundlage der Kalibrierkurve ermittelt.

Zweite Erfindung

Die zweite Erfindung ist im wesentlichen der ersten Erfindung gleich, mit der Ausnahme, daß ein markierter Immunoreaktant an einer Elektrode durch zwei Immunreaktionen (Antigen-Antikörper-Reaktion) gebunden wird. Die Schritte des Meßverfahrens der zweiten Erfindung sind schematisch in Figur 3 erläutert.
Zunächst wird in Figur 3 in Schritt (A) ein komplementärer Antikörper 2 für Antigen 3 in einer flüssigen, zu messenden Probe an Elektrode 1 unter Bildung einer Antikörperelektrode, in gleicher Weise wie in der ersten Erfindung immobilisiert.
Dann wird in Schritt (B) Antikörperelektrode 1 in die zu messende, Antigen 3 enthaltende, flüssige Probe getaucht und eine erste Immunreaktion bewirkt. Durch die erste Immunreaktion wird in der flüssigen Probe enthaltenes Antigen 3 im wesentlichen vollständig an den Antikörper 2 der Antikörperelektrode 1 gebunden.
Anschließend wird in Schritten (C) und (D) ein mit einer Chemilumineszenz-Acridiniumverbindung 4 markierter Antikörper 5 zu der flüssigen Probe gegeben und eine zweite Immunreaktion findet zwischen dem markierten Antikörper 5 und dem an die Elektrode gebundenen Antigen 3 statt. Somit ist in der zweiten Erfindung der markierte Antikörper 5 an die Elektrode 1 durch das zu messende Antigen 3 gebunden. Folglich ist die Menge des an Elektrode 1 gebundenen, markierten Antikörpers 5 proportional der Konzentration des Antigens 3 in der flüssigen Probe.
In der zweiten Erfindung werden die Antikörperelektrode 1 und der markierte Antikörper 5, übrigens durch Verwendung von entsprechenden Antikörpern, die vorzugsweise monoklonale Antikörper sind, welche jeweils in der Lage sind, an eine andere Antigendeterminante zu binden, hergestellt. Des weiteren wird der markierte Antikörper 5 vorzugsweise im Überschuß, bezogen auf die Menge des immobilisierten, nichtmarkierten Antikörpers 2 an der Elektrode 1 zugegeben, um mit dem Gesamten an den immobilisierten Antikörpern 2 an Elektrode 1 gebundenen Antigen 3 zu reagieren.
Wie in der ersten Erfindung wird außerdem ungebundener oder freier markierter Antikörper 5 fortgewaschen. In Schritt (E) wird Elektrochemilumineszenz unter Verwendung einer Arbeitselektrode (Kathode) der Elektrode mit dem daran gebundenen markierten Antikörper 5 durchgeführt und die Lumineszenzmenge wird gemessen, woraus die Konzentration des Antigens 3 in der flüssigen Probe berechnet wird.
Die Menge des gebundenen markierten, Lumineszenz erzeugenden Antikörpers 5 ist proportional der Konzentration des in den flüssigen Proben zu bestimmenden Antigens 3. Deshalb sind Kalibrierkurven in diesem Verfahren, wie in Figur 4 gezeigt, die Umkehrmuster zu jenen der ersten Erfindung (siehe Figur 2) wiedergeben.

Flüssige Probe

Flüssige Proben, auf die die Verfahren der vorliegenden Erfindung angewendet werden, schließen beispielsweise verschiedene biologische Flüssigkeiten, wie Blut, Lymphe, Hirn- und Rückenmarksflüssigkeiten, Urin, Schweiß, Tränen, Nasenflüssigkeit, transzelluläre Flüssigkeit und Metabolitenflüssigkeiten, die, falls erforderlich, verdünnt werden können, ein.

BEISPIELE

Immobilisierung von Anti-Human-IgG-Antikörper an eine Elektrode

Nach ausreichendem Waschen einer ITO-Elektrode mit Wasser, wurde das Wasser unter Verwendung von Aceton entfernt. Die Elektrode wurde dann in eine 2%-ige Acetonlösung von γ-Aminopropyltriethoxysilan getaucht und 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen lassen. Die so silanbehandelte Elektrode wurde einige Male mit destilliertem Wasser gewaschen und dann in eine 5%-ige wässerige Glutaraldehyd-(GA)-Lösung getaucht und 3 Stunden bei Raumtemperatur stehen lassen. Nach Entfernen von GA wurde die GA-behandelte Elektrode mit PBS gewaschen, bis der Aldehydgeruch entfernt war.
Die so behandelte Elektrode wurde in eine wässerige Lösung, die eine überschüssige Menge an Anti-Human-IgG (etwa 10 bis 20 µg/ml) enthielt, getaucht und bei Raumtemperatur 1 Stunde reagieren lassen. Die Elektrode wurde dann einige Male mit PBS gewaschen und mit 1 %-igem Ethanolamin für etwa 30 bis 60 Minuten zur Blockierung der aktiven, auf der Oberfläche der Elektrode verbleibenden Gruppen behandelt.

Markieren von Human-IgG-Antigen mit Acridiniumverbindung

Human-IgG wurde in 0,25M Natriumcarbonatpuffer (pH 9,0, hergestellt durch Vermischen von 0,25M Natriumcarbonat und Natriumhydrogencarbonat) gelöst und die Lösung wurde mit einem Verdünnungsmittel auf eine Human-IgG-Konzentration von 20 mg/ml verdünnt.
Zu der verdünnten Lösung wurde 4-(2-Succinimidyloxycarbonylethyl)phenyl-10-methylacridinium-9-carboxylatfluorsulfat als Acridiniumverbindung in einer Menge von 0,05 g pro 1 mg Human-IgG zugegeben und unter mäßigem Rühren bei Raumtemperatur 3 Stunden reagieren lassen.
Freie nicht an das Antigen gebundene Acridiniumverbindung wurde durch Fraktionierung unter Verwendung einer Sephadex G-25-Säule (Handelsname, Produkt von Pharmacia), äquilibriert mit PBS, entfernt. Bei der Fraktionierung wurde PBS als Elutionslösung verwendet.
Die rohe Fraktion von Human-IgG wurde über Nacht an einer Affinitätssäule bei 4ºC zirkulieren lassen. Anschließend wurde die an der Säule adsorbierte Acridiniumverbindung mit einem PBS mit pH 7,4 fortgewaschen. Danach wurde aktives Acridinium-markiertes Antigen mit einem Glycin-HCl- Puffer von pH 2,3 eluiert, gefolgt von Neutralisation mit NaOH und Dialyse gegen ein PBS von pH 7,4. Somit wurde ein Acridinium-markiertes Antigen hergestellt.

Beispiel 1

Zu einem PBS, enthaltend ein Human-IgG, das in einer bekannten Konzentration zu messen war, wurde die wie vorstehend hergestellte, markierte Antigenlösung (markierte Antigenkonzentration: 1 µg/ml) in einer Menge von 1 ml pro ml PBS gegeben, wodurch ein flüssiges Gemisch hergestellt wurde. In das flüssige Gemisch wurde die wie vorstehend hergestellte Antikörperelektrode zur Durchführung einer Antigen-Antikörper-Reaktion 2 Stunden eingetaucht, wodurch das unmarkierte Antigen und das markierte Antigen in dem flüssigen Gemisch an den immobilisierten Antikörper der Elektrode binden können. Die Elektrode wurde dann aus dem flüssigen Gemisch herausgenommen und dreimal mit PBS zur Abtrennung von freien unmarkierten und markierten Antigenen gewaschen.
Mit der so behandelten Elektrode als Arbeitselektrode und einer Platinelektrode als Gegenelektrode, wurde Elektrochemilumineszenz durch Anlegen eines Potentials von -1,3 V gegenüber Ag/AgCl als Arbeitselektrode für 30 Sekunden bewirkt. Für diese Lumineszenz wurde ein PBS mit pH 7,4 als Elektrolytlösung verwendet. Die Menge der Lumineszenz für den Zeitraum von 30 Sekunden wurde gemessen und durch ein Photozählverfahren integriert.
Die vorstehende Messung wurde für verschiedene PBS mit entsprechenden bekannten Antigenkonzentrationen wiederholt, um die Beziehung zwischen Antigenkonzentration und integrierter Lumineszenzmenge zu bestimmen. Die Ergebnisse werden in dem Diagramm, gezeigt in Figur 5, wiedergegeben.
Des weiteren wurde die Menge an Lumineszenz für einige flüssige Proben mit unbekannten Human-IgG-Konzentrationen in der gleichen Weise wie vorstehend gemessen und die Antigenkonzentrationen wurden aus dem Diagramm (Kalibrierkurve) von Figur 5 bestimmt. Die gemessenen Werte waren in guter Übereinstimmung mit jenen, erhalten durch übliches Enzymimmunoassay.

Markieren von Anti-Human-IgG-Antikörper mit Acridiniumverbindung

Anti-Human-IgG wurde in 0,25M Natriumcarbonatpuffer (pH 9,0, erhalten durch Vermischen von 0,25M Natriumcarbonat mit Natriumhydrogencarbonat) gelöst. Die erhaltene Lösung wurde mit einem Verdünnungsmittel auf eine Anti-Human-IgG-Konzentration von 20 mg/ml verdünnt. Zu der so erhaltenen verdünnten Lösung wurde 4-(2-Succinimidyloxycarbonylethyl)phenyl-10-methylacridinium-9-carboxylatfluorsulfat als Acridiniumverbindung in einer Menge von 0,05 g pro 1 mg des Anti-Human-IgG gegeben und unter mäßigem Rühren bei Raumtemperatur 3 Stunden reagieren lassen.
Freie, nicht an den Antikörper gebundene Acridiniumverbindung wurde durch Fraktionierung unter Verwendung einer Sephadex G-25-Säule (Handelsname, Produkt von Pharmacia), äquilibriert mit PBS, entfernt. Bei der Fraktionierung wurde PBS als Elutionslösung verwendet.
Die rohe Fraktion der Anti-Human-IgG-Lösung wurde über Nacht an einer Affinitätssäule bei 4ºC zirkulieren lassen. Anschließend wurde die in der Säule adsorbierte Acridiniumverbindung mit einem PBS mit pH 7,4 fortgewaschen. Danach wurde der aktive Acridinium-markierte Antikörper mit einem Glycin-HCI-Puffer von 2,3, gefolgt von Neutralisation mit NaOH und Dialyse gegen ein PBS von pH 7,4 eluiert. Somit wurde ein Acridinium-markiertes Antigen hergestellt.

Beispiel 2

Die vorstehend hergestellte ITO-Antikörperelektrode wurde in eine flüssige Probe, bestehend aus einem PBS, enthaltend ein zu messendes Antigen (Human-IgG) in einer bekannten Konzentration, getaucht und eine Antigen-Antikörper-Reaktion wurde 1 Stunde stattfinden lassen, wodurch wurde das Antigen in der flüssigen Probe an den immobilisierten Antikörper auf der Elektrode binden konnte. Die markierte, wie vorstehend hergestellte Antikörperlösung (markierte Antikörperkonzentration: 1 µg/ml) wurde zu der so behandelten flüssigen Probe in einer Menge von 1 ml pro ml der flüssigen Probe zur Herstellung eines flüssigen Gemisches gegeben. In das flüssige Gemisch wurde die wie vorstehend hergestellte Antikörperelektrode eingetaucht und eine Antigen-Antikörper-Reaktion wurde 1 Stunde stattfinden lassen, wodurch der markierte Antikörper wie vorstehend an das immobilisierte Antigen binden kann. Die Elektrode wurde dann aus dem flüssigen Gemisch herausgenommen und zur Abtrennung von überschüssigen oder freien markierten Antikörpern daran dreimal mit PBS gewaschen.
Mit der so behandelten Elektrode als Arbeitselektrode und einer Platinelektrode als Gegenelektrode wurde Elektrochemilumineszenz durch Anlegen eines Potentials von -1,3 V gegenüber Ag/AgCl als Arbeitselektrode 30 Sekunden bewirkt. Für diese Lumineszenz wurde ein PBS mit pH 7,4 als elektrolytische Lösung verwendet. Die Menge der Lumineszenz für den Zeitraum von 30 Sekunden wurde gemessen und durch ein Photozählverfahren integriert.
Die vorstehende Messung wurde für verschiedene PBS mit entsprechenden bekannten Antigenkonzentrationen wiederholt, um die Beziehung zwischen Antigenkonzentration und integrierter Lumineszenzmenge zu bestimmen. Die Ergebnisse werden in dem in Figur 6 gezeigten Diagramm wiedergegeben.
Des weiteren wurde die Lumineszenzmenge für einige flüssige Proben mit unbekannten Human-IgG-Konzentrationen in der gleichen Weise wie vorstehend gemessen und die Antigenkonzentrationen wurden aus dem Diagramm (Kalibrierkurve) von Figur 6 bestimmt. Die gemessenen Werte waren in guter Übereinstimmung mit jenen, die durch übliches Enzymimmunoassay erhalten wurden.

Beispiel 3

Lumineszenz wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 2 stattfinden lassen, mit der Ausnahme, daß eine Platinelektrode mit daran immobilisierten Anti-IgG-Antikörper anstelle der Antikörper-immobilisierte ITO-Elektrode, verwendet wurde, und daß ein Potential von -1,5V gegenüber Ag/AgCl als Elektrode angelegt wurde. Messungen der Beziehung zwischen der Antigenkonzentration und der maximalen Lumineszenzmenge ergaben die durch die Zeichnung in Figur 7 wiedergegebenen Ergebnisse.

Claims

1. Verfahren zum Messen der Konzentration eines Immunoreaktanten in einer flüssigen Probe, umfassend die Schritte:

Zugeben eines mit dem Immunoreaktanten in der flüssigen Probe kompetitiven Immunoreaktanten zu der flüssigen, Immunoreaktanten-enthaltenden Probe, wobei der kompetitive Immunoreaktant zuvor mit einer chemilumineszenten Acridiniumverbindung markiert worden ist, Herbeiführen einer Immunreaktion zwischen den unmarkierten und markierten Immunoreaktanten mit einem komplementären Immunoreaktant, der zur spezifischen Bindung mit den Immunoreaktanten befähigt ist und der auf einer Elektrode immobilisiert ist, um das Stattfinden einer kompetitiven Bindung der unmarkierten und markierten Immunoreaktanten auf der Elektrode zu ermöglichen,

Waschen der Elektrode, um den Überschuß an Immunoreaktanten oder ungebundene, unmarkierte und markierte Immunoreaktanten zu entfernen, und

Unterwerfen von gelöstem Sauerstoff in einer elektrolytischen Lösung einer elektrochemischen Reduktion unter Verwendung der gewaschenen Elektrode als Arbeitselektrode zur Erzeugung von Lumineszenz, und Messen der Lumineszenzmenge.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin der markierte Immunoreaktant zur flüssigen Probe in einer überschüssigen Menge bezüglich des immobilisierten komplementären Immunreaktanten auf der Elektrode zugegeben wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die chemilumineszente Acridiniumverbindung ein Acridiniumacylchlorid mit der folgenden Formel (1) ist

wobei A ein Anion ist, oder ein Acridiniumester mit der folgenden Formel (2) ist

wobei A ein Anion ist und R ein aliphatischer oder alicyclischer Rest mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen, die substituiert oder unsubstituiert sein können, oder ein aromatischer Rest mit 6 bis 12 Kohlenstoffatomen, die substituiert oder unsubstituiert sein können, ist, wobei die Reste eine reaktive Gruppe aufweisen.

4. Verfahren zum Messen der Konzentration eines Immunoreaktanten in einer flüssigen Probe, umfassend die Schritte Herbeiführen einer Immunreaktion zwischen dem Immunoreaktanten mit einem komplementären Immunoreaktanten, der zur spezifischen Bindung mit dem zu messenden Immunoreaktanten befähigt ist und der auf einer Elektrode immobilisiert ist, in der flüssigen Probe, um das Stattfinden einer Bindung des Immunoreaktanten in der flüssigen Probe auf der Elektrode zu ermöglichen,

Zugeben eines Überschusses des mit einer chemilumineszenten Acridiniumverbindung markierten, komplementären Immunoreaktanten zu der so erhaltenen Flüssigkeit, um eine Reaktion des gebundenen Immunoreaktanten mit dem markierten komplementären Immunoreaktanten zu ermöglichen,

Waschen der Elektrode, um den Überschuß an Immunoreaktanten oder ungebundenen markierten komplementären Immunoreaktanten zu entfernen, und

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die chemilumineszente Acridiniumverbindung ein Acridiniumacylchlorid mit der folgenden Formel (1) ist