JPH0518970A - 化学発光を利用した抗原・抗体の測定方法 - Google Patents
化学発光を利用した抗原・抗体の測定方法Info
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- JPH0518970A JPH0518970A JP19580791A JP19580791A JPH0518970A JP H0518970 A JPH0518970 A JP H0518970A JP 19580791 A JP19580791 A JP 19580791A JP 19580791 A JP19580791 A JP 19580791A JP H0518970 A JPH0518970 A JP H0518970A
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- antigens
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 本発明は、表面に抗体が固定された抗体電極
を使用し、化学発光性アクリジニウム誘導体で標識され
た標識抗原が添加された被検液中に該電極を浸漬し、抗
原−抗体反応により、被検液中に存在する抗原及び標識
抗原を電極表面の抗体に固定し、次いで、該電極表面を
洗浄して固定されていない標識抗原を分離した後、該電
極を作用極として用いて、溶存酸素を有する電解液中で
該酸素の電気化学的還元を行なって発光を行ない、その
発光量を測定することにより被検液中の抗原の濃度を測
定することを特徴とする。 【効果】 本発明の方法は、抗原濃度が10-11 〜10-5ｇ
／ml程度の液の測定に有効であり、抗原濃度の変化に対
しての発光量の変化が十分大きく、従来の方法に比して
測定精度が著しく向上している。
を使用し、化学発光性アクリジニウム誘導体で標識され
た標識抗原が添加された被検液中に該電極を浸漬し、抗
原−抗体反応により、被検液中に存在する抗原及び標識
抗原を電極表面の抗体に固定し、次いで、該電極表面を
洗浄して固定されていない標識抗原を分離した後、該電
極を作用極として用いて、溶存酸素を有する電解液中で
該酸素の電気化学的還元を行なって発光を行ない、その
発光量を測定することにより被検液中の抗原の濃度を測
定することを特徴とする。 【効果】 本発明の方法は、抗原濃度が10-11 〜10-5ｇ
／ml程度の液の測定に有効であり、抗原濃度の変化に対
しての発光量の変化が十分大きく、従来の方法に比して
測定精度が著しく向上している。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、化学発光を利用して液
中に存在する抗原・抗体の濃度を測定する方法に関す
る。
中に存在する抗原・抗体の濃度を測定する方法に関す
る。
【０００２】
【従来技術】化学発光を利用して液中に存在する抗原・
抗体の濃度を測定する方法は公知である。例えば、試料
液中に存在する抗体に対応する抗原に予めルミノール、
ピレン等の化学発光を行なう物質を固定化しておき、こ
の抗原を前記液体試料に添加して抗体と反応させると、
反応後の抗原に固定化されている化学発光性物質の電気
化学的発光が抑制される。このことを利用して、その時
の電気化学的発光量を測定することにより、液体試料中
の抗体濃度を測定する方法が知られている。
抗体の濃度を測定する方法は公知である。例えば、試料
液中に存在する抗体に対応する抗原に予めルミノール、
ピレン等の化学発光を行なう物質を固定化しておき、こ
の抗原を前記液体試料に添加して抗体と反応させると、
反応後の抗原に固定化されている化学発光性物質の電気
化学的発光が抑制される。このことを利用して、その時
の電気化学的発光量を測定することにより、液体試料中
の抗体濃度を測定する方法が知られている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】然しながら、上記方法
は、抗体濃度の変化に対する発光量の変化が小さく、測
定精度が低いという問題がある。従って本発明は、測定
すべき抗体あるいは抗原の濃度変化に対する発光量の変
化が大きく、測定精度が向上した抗原・抗体の測定方法
を提供することを目的とする。
は、抗体濃度の変化に対する発光量の変化が小さく、測
定精度が低いという問題がある。従って本発明は、測定
すべき抗体あるいは抗原の濃度変化に対する発光量の変
化が大きく、測定精度が向上した抗原・抗体の測定方法
を提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明によれば、表面に
抗原もしくは抗体が固定された抗原または抗体電極を、
化学発光性アクリジニウム誘導体で標識された標識抗体
もしくは抗原が添加された被検液中に該電極を浸漬し、
抗原−抗体反応により、被検液中に存在する抗体もしく
は抗原及び標識抗体もしくは抗原を電極表面の抗原もし
くは抗体に固定し、次いで、該電極表面を洗浄して固定
されていない標識抗体もしくは抗原を分離した後、該電
極を作用極として用いて、溶存酸素を有する電解液中で
該酸素の電気化学的還元を行なって発光を行ない、その
発光量を測定することにより被検液中の抗原または抗体
の濃度を測定することを特徴とする測定方法が提供され
る。
抗原もしくは抗体が固定された抗原または抗体電極を、
化学発光性アクリジニウム誘導体で標識された標識抗体
もしくは抗原が添加された被検液中に該電極を浸漬し、
抗原−抗体反応により、被検液中に存在する抗体もしく
は抗原及び標識抗体もしくは抗原を電極表面の抗原もし
くは抗体に固定し、次いで、該電極表面を洗浄して固定
されていない標識抗体もしくは抗原を分離した後、該電
極を作用極として用いて、溶存酸素を有する電解液中で
該酸素の電気化学的還元を行なって発光を行ない、その
発光量を測定することにより被検液中の抗原または抗体
の濃度を測定することを特徴とする測定方法が提供され
る。
【０００５】本発明方法を、被検液中の抗原濃度を測定
する場合を例にとって、その工程を図１に示す。即ち、
この場合には、電極１表面に、上記抗原に対しての抗体
２が固定される（工程（Ａ））。次いで、抗原３を有す
る被検液に、化学発光性アクリジニウム誘導体４で標識
された標識抗原５が添加され、その溶液中に上記で作成
された抗体電極が浸漬される（工程（Ｂ））。ここで抗
原５を標識している化学発光性アクリジニウム誘導体４
は、過酸化水素の存在下で化学発光し、その発光強度は
極めて大である。次いで抗原−抗体反応が行なわれ、被
検液中の抗原３及び標識抗原５が電極表面に固定され、
さらに固定されていない標識抗原５が洗浄、除去される
（工程（Ｃ））。ここで、電極表面に固定される標識抗
原の量は、被検液中の抗原濃度が高い程少なく、また抗
原濃度が低い程多い。次いで、上記電極を用いて電気化
学発光が行なわれる（工程（Ｄ））。この電気化学発光
は、溶存酸素を有する電解液中で上記電極を作用電極と
して、該酸素の電気化学的還元を行なうことにより生じ
るものであり、酸素の還元により過酸化水素が発生する
ため、電極に固定されている標識抗原５を標識している
アクリジニウム誘導体４が化学発光するものである。従
って、本発明方法によって得られる検量線は図２に示す
ようなものとなる。
する場合を例にとって、その工程を図１に示す。即ち、
この場合には、電極１表面に、上記抗原に対しての抗体
２が固定される（工程（Ａ））。次いで、抗原３を有す
る被検液に、化学発光性アクリジニウム誘導体４で標識
された標識抗原５が添加され、その溶液中に上記で作成
された抗体電極が浸漬される（工程（Ｂ））。ここで抗
原５を標識している化学発光性アクリジニウム誘導体４
は、過酸化水素の存在下で化学発光し、その発光強度は
極めて大である。次いで抗原−抗体反応が行なわれ、被
検液中の抗原３及び標識抗原５が電極表面に固定され、
さらに固定されていない標識抗原５が洗浄、除去される
（工程（Ｃ））。ここで、電極表面に固定される標識抗
原の量は、被検液中の抗原濃度が高い程少なく、また抗
原濃度が低い程多い。次いで、上記電極を用いて電気化
学発光が行なわれる（工程（Ｄ））。この電気化学発光
は、溶存酸素を有する電解液中で上記電極を作用電極と
して、該酸素の電気化学的還元を行なうことにより生じ
るものであり、酸素の還元により過酸化水素が発生する
ため、電極に固定されている標識抗原５を標識している
アクリジニウム誘導体４が化学発光するものである。従
って、本発明方法によって得られる検量線は図２に示す
ようなものとなる。
【０００６】以上、被検液中の抗原濃度を測定する場合
を例にとって簡単に説明したが、抗体濃度を測定する場
合には、上記において、抗原と抗体とを逆に使用すれば
よく、例えば抗体電極の代わりに抗原電極が使用され
る。以下、本発明を詳細に説明する。
を例にとって簡単に説明したが、抗体濃度を測定する場
合には、上記において、抗原と抗体とを逆に使用すれば
よく、例えば抗体電極の代わりに抗原電極が使用され
る。以下、本発明を詳細に説明する。
【０００７】抗原または抗体電極 本発明においては、電気化学発光を行なうための作用電
極として、表面に抗原または抗体が固定化された電極が
使用される。抗原または抗体の電極表面への固定化は、
従来公知の技術により行なうことができ、例えば、シラ
ンカップリング剤、あるいはブドウ状球菌より得られる
プロティンＡを電極表面に被膜させ、そして抗体もしく
は抗原を結合させることにより行なわれる。
極として、表面に抗原または抗体が固定化された電極が
使用される。抗原または抗体の電極表面への固定化は、
従来公知の技術により行なうことができ、例えば、シラ
ンカップリング剤、あるいはブドウ状球菌より得られる
プロティンＡを電極表面に被膜させ、そして抗体もしく
は抗原を結合させることにより行なわれる。
【０００８】電極表面に固定される抗原または抗体の種
類は、測定対象である特定の抗原または抗体に対して抗
体または抗原の関係にあるものであり、被検液中の抗原
または抗体に応じて選択される。かかる抗原及び抗体の
例としては次のものを挙げることができる。
類は、測定対象である特定の抗原または抗体に対して抗
体または抗原の関係にあるものであり、被検液中の抗原
または抗体に応じて選択される。かかる抗原及び抗体の
例としては次のものを挙げることができる。
【０００９】抗原類； IgG、 IgA、 IgM、 IgE、アルブ
ミン、 HCG、 AFP、カルジオライピン抗原、血液型物
質、コンカナバリン A、 DNT、プロスタグランジン、 C
RP、HBs、ヒト成長ホルモン、ステロイドホルモン、 CE
A、IgD 等。
ミン、 HCG、 AFP、カルジオライピン抗原、血液型物
質、コンカナバリン A、 DNT、プロスタグランジン、 C
RP、HBs、ヒト成長ホルモン、ステロイドホルモン、 CE
A、IgD 等。
【００１０】抗体類；抗アルブミン抗体、抗HCG 抗体、
抗IgG 抗体、抗IgA 抗体、抗IgM 抗体、抗IgE 抗体、抗
IgD 抗体、抗AFP 抗体、抗DNT 抗体、抗プロスタグラン
ジン抗体、抗ヒト凝固ファクター抗体、抗CRP 抗体、抗
HBs 抗体、抗ヒト成長ホルモン抗体、抗ステロイドホル
モン抗体、及びこれらを含む血清、並びにモノクロナー
ル抗体。
抗IgG 抗体、抗IgA 抗体、抗IgM 抗体、抗IgE 抗体、抗
IgD 抗体、抗AFP 抗体、抗DNT 抗体、抗プロスタグラン
ジン抗体、抗ヒト凝固ファクター抗体、抗CRP 抗体、抗
HBs 抗体、抗ヒト成長ホルモン抗体、抗ステロイドホル
モン抗体、及びこれらを含む血清、並びにモノクロナー
ル抗体。
【００１１】また上記抗原または抗体を固定すべき電極
としては、これらの固定が有効に行なわれる限り、任意
の電極を使用することができるが、一般的には、白金電
極、金電極等の金属電極、グラファイト、グラッシーカ
ーボン等の炭素電極、その他ＩＴＯ電極等の酸化物電極
が好適に使用される。
としては、これらの固定が有効に行なわれる限り、任意
の電極を使用することができるが、一般的には、白金電
極、金電極等の金属電極、グラファイト、グラッシーカ
ーボン等の炭素電極、その他ＩＴＯ電極等の酸化物電極
が好適に使用される。
【００１２】標識抗体または抗原の調製 本発明においては、上記電極表面に固定された抗原また
は抗体に対して、抗体または抗原の関係にあるものを化
学発光性アクリジニウム誘導体で標識する。即ち、化学
発光性アクリジニウム誘導体は、マイルドな条件下で抗
体や抗原と共有結合し、特異性の高い化学発光性を持つ
標識分子となる。
は抗体に対して、抗体または抗原の関係にあるものを化
学発光性アクリジニウム誘導体で標識する。即ち、化学
発光性アクリジニウム誘導体は、マイルドな条件下で抗
体や抗原と共有結合し、特異性の高い化学発光性を持つ
標識分子となる。
【００１３】このような化学発光性アクリジニウム誘導
体としては、例えば、式(1) 、
体としては、例えば、式(1) 、
【化１】 （式中、Ａはアニオンを示す、）で表されるアクリジニ
ウム塩、式(2) 、
ウム塩、式(2) 、
【化２】 （式中、Ｒは直鎖状、分岐状もしくは環状の脂肪族また
は芳香族の基であり、これらの基は反応性の基を有して
いてもよく、Ａはアニオンを示す、）で表されるアクリ
ジニウムエステルを挙げることができる。この式(2) の
アクリジニウムエステルの中でも、代表的なものとし
て、アクリジニウム−Ｉ、即ち４−(2−スクシンイミジ
ルオキシカルボニルエチル) フェニル−10−メチルアク
リジニウム−９−カルボキシレート・フルオロ硫酸塩が
挙げられる。またこれら以外にも、特開昭63−57572 号
公報及び特開平１−261461号公報に記載の化学発光性ア
クリジン誘導体、米国特許出願 766,038号明細書、米国
特許第 3,352,791号明細書、英国特許第 1,316,363号明
細書、同 1,461,877号明細書及び特開昭62−61969 号明
細書等に記載の化学発光性アクリジニウムエステルも使
用することができる。
は芳香族の基であり、これらの基は反応性の基を有して
いてもよく、Ａはアニオンを示す、）で表されるアクリ
ジニウムエステルを挙げることができる。この式(2) の
アクリジニウムエステルの中でも、代表的なものとし
て、アクリジニウム−Ｉ、即ち４−(2−スクシンイミジ
ルオキシカルボニルエチル) フェニル−10−メチルアク
リジニウム−９−カルボキシレート・フルオロ硫酸塩が
挙げられる。またこれら以外にも、特開昭63−57572 号
公報及び特開平１−261461号公報に記載の化学発光性ア
クリジン誘導体、米国特許出願 766,038号明細書、米国
特許第 3,352,791号明細書、英国特許第 1,316,363号明
細書、同 1,461,877号明細書及び特開昭62−61969 号明
細書等に記載の化学発光性アクリジニウムエステルも使
用することができる。
【００１４】上記化学発光性アクリジニウム誘導体を用
いての抗体または抗原の調製は、例えば抗体または抗原
の希アルカリ水溶液中に化学発光性アクリジニウム誘導
体を添加して、反応させることによって容易に行なうこ
とができる。この場合、反応条件はマイルドなものであ
ってよく、例えば、０℃〜室温程度の温度で反応液を攪
拌する程度で十分に反応が進行して標識抗体または抗原
が得られる。このように抗体または抗原を標識した化学
発光性アクリジニウム誘導体は、発光強度が極めて高
く、例えばペルオキシターゼ・エンハンサー系の数十倍
の発光強度を有する。この発光機構は、従来公知であ
り、アルカリ性で過酸化水素の存在下で生じ、格別の触
媒の添加を必要としない。
いての抗体または抗原の調製は、例えば抗体または抗原
の希アルカリ水溶液中に化学発光性アクリジニウム誘導
体を添加して、反応させることによって容易に行なうこ
とができる。この場合、反応条件はマイルドなものであ
ってよく、例えば、０℃〜室温程度の温度で反応液を攪
拌する程度で十分に反応が進行して標識抗体または抗原
が得られる。このように抗体または抗原を標識した化学
発光性アクリジニウム誘導体は、発光強度が極めて高
く、例えばペルオキシターゼ・エンハンサー系の数十倍
の発光強度を有する。この発光機構は、従来公知であ
り、アルカリ性で過酸化水素の存在下で生じ、格別の触
媒の添加を必要としない。
【００１５】抗原・抗体反応 本発明方法においては、上記で調製された標識抗体また
は抗原の溶液を被検液に添加し、次いで前述した抗原ま
たは抗体電極を浸漬して抗原・抗体反応を行なう。これ
によって、被検液中に存在している抗体または抗原と標
識抗体または抗原の一部が電極表面に固定される。この
場合、被検液中の抗体または抗原濃度が高ければ固定さ
れる標識抗体または抗原の割合は小さく、一方、被検液
中の抗体または抗原濃度が低ければ固定される標識抗体
または抗原の割合は大きくなる。従って、後述する電気
化学的な発光量は、被検液中の抗体または抗原濃度が高
ければ少なく、逆に抗体または抗原濃度が低ければ多く
なる。
は抗原の溶液を被検液に添加し、次いで前述した抗原ま
たは抗体電極を浸漬して抗原・抗体反応を行なう。これ
によって、被検液中に存在している抗体または抗原と標
識抗体または抗原の一部が電極表面に固定される。この
場合、被検液中の抗体または抗原濃度が高ければ固定さ
れる標識抗体または抗原の割合は小さく、一方、被検液
中の抗体または抗原濃度が低ければ固定される標識抗体
または抗原の割合は大きくなる。従って、後述する電気
化学的な発光量は、被検液中の抗体または抗原濃度が高
ければ少なく、逆に抗体または抗原濃度が低ければ多く
なる。
【００１６】被検液中に添加する標識抗体または抗原の
溶液の量は、通常、その標識抗体または抗原と、電極表
面に固定されている抗原または抗体とが、モル比で10：
１〜１：１となるような割合とすることが望ましい。即
ち、標識抗体または抗原の量が過度に多くても少なくて
も、被検液中に存在する抗原または抗体の濃度変化に対
する発光量の変化が微小となり、測定精度が低下するお
それがある。
溶液の量は、通常、その標識抗体または抗原と、電極表
面に固定されている抗原または抗体とが、モル比で10：
１〜１：１となるような割合とすることが望ましい。即
ち、標識抗体または抗原の量が過度に多くても少なくて
も、被検液中に存在する抗原または抗体の濃度変化に対
する発光量の変化が微小となり、測定精度が低下するお
それがある。
【００１７】洗浄 抗原・抗体反応終了後、上記電極を被検液中から取り出
して洗浄し、電極表面に存在する固定されていない標識
抗体または抗原を除去する。この洗浄は、電極表面に固
定されている標識抗体または抗原に悪影響を及ぼさない
限り、任意の液を用いて行なうことができるが、一般に
は、リン酸ナトリウム緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用い
て行なうことが好適である。
して洗浄し、電極表面に存在する固定されていない標識
抗体または抗原を除去する。この洗浄は、電極表面に固
定されている標識抗体または抗原に悪影響を及ぼさない
限り、任意の液を用いて行なうことができるが、一般に
は、リン酸ナトリウム緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用い
て行なうことが好適である。
【００１８】電気化学的発光 本発明によれば、上記標識抗体または抗原が固定された
電極を作用極とし、溶存酸素を有する電解液を用いて、
該酸素の電気化学的還元を行なうことにより電気化学的
発光を生じせしめる。即ち、溶存酸素の電気化学的還元
により作用極表面に過酸化水素が発生し、これが電極表
面に固定されている標識抗体または抗原に接触すること
により発光を生じるものである。
電極を作用極とし、溶存酸素を有する電解液を用いて、
該酸素の電気化学的還元を行なうことにより電気化学的
発光を生じせしめる。即ち、溶存酸素の電気化学的還元
により作用極表面に過酸化水素が発生し、これが電極表
面に固定されている標識抗体または抗原に接触すること
により発光を生じるものである。
【００１９】この方法において、用いる電解液として
は、溶存酸素を有していることが必須であり且つその溶
存酸素は、その電極表面に固定されている標識抗体また
は抗原（化学発光性物質で標識されている）の発光を生
じせしめるに十分な量の過酸化水素を発生させるに十分
な量でなくてはならない。通常、この条件が満たされな
いことは稀であり、溶存酸素量が不十分である恐れのあ
るときは、測定に先立って用いる電解液中に空気や一定
分圧以上の酸素含有ガスを通気することにより、十分な
溶存酸素量を確保できる。
は、溶存酸素を有していることが必須であり且つその溶
存酸素は、その電極表面に固定されている標識抗体また
は抗原（化学発光性物質で標識されている）の発光を生
じせしめるに十分な量の過酸化水素を発生させるに十分
な量でなくてはならない。通常、この条件が満たされな
いことは稀であり、溶存酸素量が不十分である恐れのあ
るときは、測定に先立って用いる電解液中に空気や一定
分圧以上の酸素含有ガスを通気することにより、十分な
溶存酸素量を確保できる。
【００２０】また用いる電解液としては、一般にｐＨが
７以上のアルカリ性水溶液であることが好ましく、通
常、リン酸ナトリウム緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が好適
に使用される。
７以上のアルカリ性水溶液であることが好ましく、通
常、リン酸ナトリウム緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が好適
に使用される。
【００２１】溶存酸素の電気化学的還元による発光を行
なうに必要な作用電極の設定電位は、用いる電解液や電
極物質の特性、環境条件等によっても異なるが、例えば
室温において、ｐＨが 7〜7.4 のＰＢＳを電解液として
使用し且つ電極（抗原または抗体電極）として白金電極
を使用した場合には、−1.5 〜−0.2 Ｖ（vs. Ag／AgC
l）程度の電位を与えればよい。またこの際に使用され
る対電極としては、白金、金等の金属電極、グラファイ
ト、グラッシーカーボン等の炭素電極、その他ＩＴＯな
どの酸化物系の電極を使用することができる。
なうに必要な作用電極の設定電位は、用いる電解液や電
極物質の特性、環境条件等によっても異なるが、例えば
室温において、ｐＨが 7〜7.4 のＰＢＳを電解液として
使用し且つ電極（抗原または抗体電極）として白金電極
を使用した場合には、−1.5 〜−0.2 Ｖ（vs. Ag／AgC
l）程度の電位を与えればよい。またこの際に使用され
る対電極としては、白金、金等の金属電極、グラファイ
ト、グラッシーカーボン等の炭素電極、その他ＩＴＯな
どの酸化物系の電極を使用することができる。
【００２２】かくして生じる発光量は、例えば、光電子
増倍管等の光検出装置を用いて測定される。この発光量
は、既に述べた通り、被検液中の抗体または抗原濃度が
高ければ少なく、逆に抗体または抗原濃度が低ければ多
くなる。従って、この発光量を測定することにより、被
検液中の抗原または抗体濃度を測定することが可能とな
る。
増倍管等の光検出装置を用いて測定される。この発光量
は、既に述べた通り、被検液中の抗体または抗原濃度が
高ければ少なく、逆に抗体または抗原濃度が低ければ多
くなる。従って、この発光量を測定することにより、被
検液中の抗原または抗体濃度を測定することが可能とな
る。
【００２３】
【実施例】抗体抗ヒトIgG 固定化電極の作成 ＩＴＯ電極を十分に洗浄した後、アセトンにより水分を
除去し、次いで該電極を２％γ−アミノプロピルトリエ
トキシシランアセトン溶液に浸し、室温で30分放置する
ことによりシラン処理を行なった。シラン処理後、電極
を蒸留水で数回洗浄し、次いで５％グルタルアルデヒド
（ＧＡ）水溶液に浸し、３時間室温で放置することによ
りＧＡ処理を行なった。ＧＡを除去後、アルデヒド臭が
なくなるまで、リン酸ナトリウム緩衝生理食塩水（ＰＢ
Ｓ）で該電極の洗浄を行なった。上記電極を、過剰量の
抗ヒトIgG を含む水溶液中（目安として10〜20μｇ／ml
に浸漬し、室温で１時間反応させた。次いでＰＢＳで数
回洗浄後、１％エタノールアミンで30〜60分ほど処理を
行ない、表面に残った活性基をブロックした。
除去し、次いで該電極を２％γ−アミノプロピルトリエ
トキシシランアセトン溶液に浸し、室温で30分放置する
ことによりシラン処理を行なった。シラン処理後、電極
を蒸留水で数回洗浄し、次いで５％グルタルアルデヒド
（ＧＡ）水溶液に浸し、３時間室温で放置することによ
りＧＡ処理を行なった。ＧＡを除去後、アルデヒド臭が
なくなるまで、リン酸ナトリウム緩衝生理食塩水（ＰＢ
Ｓ）で該電極の洗浄を行なった。上記電極を、過剰量の
抗ヒトIgG を含む水溶液中（目安として10〜20μｇ／ml
に浸漬し、室温で１時間反応させた。次いでＰＢＳで数
回洗浄後、１％エタノールアミンで30〜60分ほど処理を
行ない、表面に残った活性基をブロックした。
【００２４】アクリジニウム誘導体の抗原ヒトIgG への
固定化 抗原ヒトIgG を、0.25Ｍの炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
9.0 : 0.25Ｍの炭酸ナトリウムと重炭酸ナトリウムを混
合して得る）に溶解し、次いで希釈液により抗原蛋白濃
度を20mg／mlとした（１mg／mlは、OD280nm ＝1.33に相
当する）。アクリジニウム誘導体〔４−(2−スクシンイ
ミジルオキシカルボニルエチル)フェニル−10−メチル
アクリジニウム−９−カルボキシレート・フルオロ硫酸
塩、 C28 H23 N2 O6 FSO3 ＝ 582.56 〕を、抗原ヒト
IgG １mg当たり0.05ｇ加え、静かに攪拌を続けながら、
室温で３時間反応させた。ＰＢＳで平衡化させたSephad
ex G−25カラム ( Pharmacia社製、商品名) を用いて前
記抗原と結合しなかった遊離のアクリジニウム誘導体
を、フラクション分取にて取り除いた。この時、溶出液
としてはＰＢＳを用いた。上記で得られた抗原ヒトIgG
粗分画溶液を、アフィニティカラムにかけ、４℃で一晩
循環させた。次いで、ｐＨ7.4 のＰＢＳを用いてカラム
に吸着したアクリジニウム誘導体を洗浄し、その後、ｐ
Ｈ2.3 のグリシン−HCl 緩衝液で活性のあるアクリジニ
ウム固定化抗原を溶出させ、NaOHで中和後、ｐＨ7.4 の
ＰＢＳで透析し、アクリジニウム誘導体で標識された標
識抗原を調製した。
固定化 抗原ヒトIgG を、0.25Ｍの炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
9.0 : 0.25Ｍの炭酸ナトリウムと重炭酸ナトリウムを混
合して得る）に溶解し、次いで希釈液により抗原蛋白濃
度を20mg／mlとした（１mg／mlは、OD280nm ＝1.33に相
当する）。アクリジニウム誘導体〔４−(2−スクシンイ
ミジルオキシカルボニルエチル)フェニル−10−メチル
アクリジニウム−９−カルボキシレート・フルオロ硫酸
塩、 C28 H23 N2 O6 FSO3 ＝ 582.56 〕を、抗原ヒト
IgG １mg当たり0.05ｇ加え、静かに攪拌を続けながら、
室温で３時間反応させた。ＰＢＳで平衡化させたSephad
ex G−25カラム ( Pharmacia社製、商品名) を用いて前
記抗原と結合しなかった遊離のアクリジニウム誘導体
を、フラクション分取にて取り除いた。この時、溶出液
としてはＰＢＳを用いた。上記で得られた抗原ヒトIgG
粗分画溶液を、アフィニティカラムにかけ、４℃で一晩
循環させた。次いで、ｐＨ7.4 のＰＢＳを用いてカラム
に吸着したアクリジニウム誘導体を洗浄し、その後、ｐ
Ｈ2.3 のグリシン−HCl 緩衝液で活性のあるアクリジニ
ウム固定化抗原を溶出させ、NaOHで中和後、ｐＨ7.4 の
ＰＢＳで透析し、アクリジニウム誘導体で標識された標
識抗原を調製した。
【００２５】実施例１ 被検液１ml当たり、前記で調製された標識抗原溶液（標
識抗原濃度：１μｇ／ml) １mlを添加した混合液に、前
記で作成された抗体電極を浸漬し、２時間抗原・抗体反
応を行ない、被検液中の抗原及び標識抗原を電極表面に
固定した。次いで、該電極を取り出して、ＰＢＳで３回
洗浄することにより、遊離の標識抗原を分離した。上記
の処理が行なわれた電極を作用極、及び対電極として白
金電極を使用し、作用極に−1.3 Ｖ（vs. Ag／AgCl）の
電位を30秒間与えて電気化学発光を行なった。尚、電解
液としては、ｐＨ7.4 のＰＢＳを用いた。30秒間の発光
をフォトカウンティング法により計測、積算した。この
様にして、抗原濃度が既知の種々の被検液を使用して、
抗原濃度と最大発光量との関係を測定したところ、図３
に示す線図が得られた。さらに抗原濃度が既知の数種の
液について、上記と同様にして発光量を測定し、図３の
線図（検量線）から抗原濃度を求めたところ、測定値は
実際値とよく一致していた。
識抗原濃度：１μｇ／ml) １mlを添加した混合液に、前
記で作成された抗体電極を浸漬し、２時間抗原・抗体反
応を行ない、被検液中の抗原及び標識抗原を電極表面に
固定した。次いで、該電極を取り出して、ＰＢＳで３回
洗浄することにより、遊離の標識抗原を分離した。上記
の処理が行なわれた電極を作用極、及び対電極として白
金電極を使用し、作用極に−1.3 Ｖ（vs. Ag／AgCl）の
電位を30秒間与えて電気化学発光を行なった。尚、電解
液としては、ｐＨ7.4 のＰＢＳを用いた。30秒間の発光
をフォトカウンティング法により計測、積算した。この
様にして、抗原濃度が既知の種々の被検液を使用して、
抗原濃度と最大発光量との関係を測定したところ、図３
に示す線図が得られた。さらに抗原濃度が既知の数種の
液について、上記と同様にして発光量を測定し、図３の
線図（検量線）から抗原濃度を求めたところ、測定値は
実際値とよく一致していた。
【００２６】
【発明の効果】本発明の方法は、抗原または抗体濃度が
10-11 〜10-5ｇ／ml程度の液の測定に有効であり、抗原
または抗体濃度の変化に対しての発光量の変化が十分大
きく、従来の方法に比して測定精度が著しく向上してい
る。
10-11 〜10-5ｇ／ml程度の液の測定に有効であり、抗原
または抗体濃度の変化に対しての発光量の変化が十分大
きく、従来の方法に比して測定精度が著しく向上してい
る。
【図１】本発明方法の工程を簡単に示す図。
【図２】本発明の測定方法を実施することによって得ら
れる検量線の代表例を示す図。
れる検量線の代表例を示す図。
【図３】実施例１による測定によって得られた抗原濃度
と発光量との関係を示す線図。
と発光量との関係を示す線図。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 【請求項１】 表面に抗原もしくは抗体が固定された抗
原または抗体電極を、化学発光性アクリジニウム誘導体
で標識された標識抗体もしくは抗原が添加された被検液
中に該電極を浸漬し、抗原−抗体反応により、被検液中
に存在する抗体もしくは抗原及び標識抗体もしくは抗原
を電極表面の抗原もしくは抗体に固定し、 次いで、該電極表面を洗浄して固定されていない標識抗
体もしくは抗原を分離した後、 該電極を作用極として用いて、溶存酸素を有する電解液
中で該酸素の電気化学的還元を行なって発光を行ない、
その発光量を測定することにより被検液中の抗原または
抗体の濃度を測定することを特徴とする測定方法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19580791A JPH0518970A (ja) | 1991-07-10 | 1991-07-10 | 化学発光を利用した抗原・抗体の測定方法 |
| EP19920302080 EP0522677B1 (en) | 1991-07-10 | 1992-03-11 | Method of measuring concentration of immunoreactant using electrochemiluminescence |
| DE1992615983 DE69215983T2 (de) | 1991-07-10 | 1992-03-11 | Verfahren zur Messung der Konzentration eines Immuno-Reaktanden unter Verwendung von Elektrochemilumineszenz |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19580791A JPH0518970A (ja) | 1991-07-10 | 1991-07-10 | 化学発光を利用した抗原・抗体の測定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0518970A true JPH0518970A (ja) | 1993-01-26 |
Family
ID=16347312
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP19580791A Pending JPH0518970A (ja) | 1991-07-10 | 1991-07-10 | 化学発光を利用した抗原・抗体の測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0518970A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH07159407A (ja) * | 1993-12-06 | 1995-06-23 | Olympus Optical Co Ltd | 光学的免疫測定方法及びこれに用いられる免疫測定装置 |
| KR20150104096A (ko) * | 2012-12-26 | 2015-09-14 | 저지앙 엔에이치유 스페셜 머티어리얼스 컴퍼니 리미티드 | 피버 그레이드 폴리페닐렌 설파이드 수지의 합성 방법 |
-
1991
- 1991-07-10 JP JP19580791A patent/JPH0518970A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH07159407A (ja) * | 1993-12-06 | 1995-06-23 | Olympus Optical Co Ltd | 光学的免疫測定方法及びこれに用いられる免疫測定装置 |
| KR20150104096A (ko) * | 2012-12-26 | 2015-09-14 | 저지앙 엔에이치유 스페셜 머티어리얼스 컴퍼니 리미티드 | 피버 그레이드 폴리페닐렌 설파이드 수지의 합성 방법 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20000411 |