CH651138A5

CH651138A5 - Immunometrische und inhibierungsassays unter verwendung von monoclonalen antikoerpern.

Info

Publication number: CH651138A5
Application number: CH5009/81A
Authority: CH
Inventors: Gary Samuel David; Howard Edward Greene
Original assignee: Hybritech Inc
Priority date: 1980-08-04
Filing date: 1981-08-03
Publication date: 1985-08-30
Also published as: DE3130834A1; GB2086041B; GB2150288B; GB2086041A; FR2487983A1; NL8103615A; GB2150288A; FR2487983B1; US4486530A; GB8322753D0

Description

Die Erfindung betrifft immunometrische und Inhibie-rungsassays zum Nachweisen und/oder Bestimmen von Konzentrationen von antigenen Substanzen in Flüssigkeiten, wie Serum.

Die Bestimmung der Anwesenheit oder Konzentration von antigenen Substanzen, beispielsweise von solchen, wie sie bei zahlreichen physiologischen Unstimmigkeiten vorkommen, in Serum oder anderen Körperflüssigkeiten, macht in zunehmendem Masse von Immunoassaytechniken Gebrauch. Diese Techniken basieren auf der Bildung eines Komplexes zwischen der zu bestimmenden antigenen Substanz und einem Antikörper oder Antikörpern, in denen ein oder mehrere Teile des Komplexes markiert sein können, beispielsweise durch ein radioaktives Element, wie l2iJ, wodurch dann der Nachweis und/oder die quantitative Analyse nach der Abtrennung des komplexen markierten Antigens oder Antikörpers von nichtkomplexen markierten Antigenen oder Antikörpern ermöglicht wird.

Im Falle einer kompetitiven Immunoassaytechnik liegt die antigene Substanz einer zu untersuchenden Flüssigkeitsprobe im Wettbewerb mit einer bekannten Menge eines markierten Antigens für eine limitierte Menge an Antikörperbindungsstellen. Daher ist die Menge des markierten, an den Anitkörper gebundenen Antigens umgekehrt proportional zu der Menge des Antigens in der Probe. Dagegen verwenden immunometrische Untersuchungen einen markierten Antikörper. Bei einer solchen Assay ist die Menge des mit dem Komplex gebundenen markierten Antikörpers proportional der Menge der in der Flüssigkeitsprobe enthaltenen antigenen Substanz.

Immunometrische Assays sind besonders zum Nachweis von polyvalenten Antigenen, d.h. antigenen Substanzen, die in der Lage sind, mit zwei oder mehr Antikörpern gleichzeitig einen Komplex zu bilden, geeignet. Bei solchen Assays werden typischerweise eine Menge eines unmarkierten Antikörpers, gebunden an einen festen Träger, der in der zu untersuchenden Flüssigkeit unlöslich ist, und eine Menge eines löslichen Antikörpers, der eine Markierung, wie ein radioaktives Isotop, trägt, verwendet, so dass dann der Nachweis und/ oder eine quantitative Bestimmung der Menge des ternären Komplexes, der sich zwischen dem Festphasen-Antikörper, dem Antigen und dem markierten Antikörper ausbildet, möglich wird.

In den bekannten immunometrischen Assays werden typischerweise «Forward»-Assays angewendet, bei denen der an die feste Phase gebundene Antikörper zunächst mit der zu untersuchenden Probe in Berührung gebracht wird, um das Antigen aus der Probe durch Bildung eines binären Festphasen-Antikörper: Antigen-Komplexes zu extrahieren. Nach einer geeigneten Inkubationsperiode wird der feste Träger gewaschen, um den Rest der Flüssigkeitsprobe, einschliesslich nichtumgesetzten Antigens, falls vorhanden, zu entfernen, und wird dann mit einer Lösung, die eine bekannte Menge des markierten Antikörpers enthält, in Berührung gebracht.

Nach einer zweiten Inkubierungsperiode, bei welcher man den markierten Antikörper einen Komplex mit dem Antigen bilden lässt, das an den festen Träger durch den unmarkierten Antikörper gebunden ist, wird der feste Träger ein zweites Mal gewaschen, um nichtumgesetzten markierten Antikörper zu entfernen. In einer einfachen «Ja-Nein»-Assay zur Bestimmung, ob Antigen in der zu untersuchenden Probe vorhanden ist, wird der gewaschene feste Träger untersucht, um die Gegenwart von markiertem Antikörper festzustellen, beispielsweise indem man die emittierte Strahlung misst,

wenn die Markierung ein radiokatives Element ist. Die Menge des nachgewiesenen markierten Antikörpers wird mit der einer negativen Kontrollprobe, die frei von dem Antigen ist, verglichen. Der Nachweis von markiertem Antikörper in Mengen, die erheblich oberhalb der Hintergrundniveaus sind, wie sie durch eine Negativkontrolle angezeigt werden, gibt dann die Gegenwart des verdächtigen Antigens an. Quantitative Nachweise sind möglich, indem man die Messungen von markierten Antikörpern, die man mit kalibrierten Proben, enthaltend bekannte Mengen des Antigens, erhält, vergleicht.

Diese Art der Assay wird häufig als eine «Zwei-Stellen»-oder «Sandwich»-Assay bezeichnet, weil das Antigen zwei Antikörper an verschiedenen Stellen seiner Oberfläche gebunden hat. Diese und ähnliche Techniken werden von Wider auf Seiten 199-206 in «Radioimmunoassay Methods», herausgegeben von Kirkham und Hunter, E.&S. Livingstone, Edinburgh (1970), beschrieben. Ein auf dieser Technik basierendes Assay zum Nachweis von bei Serumhepatitis vorkommenden Antigenen, unter Verwendung von l25J-markiertem Antikörper, wird in US-PS 3 867 517 beschrieben.

Trotz der grossen Brauchbarkeit sind die bekannten immunometrischen Assays doch recht langsam, insbesondere weil zwei Waschstufen erforderlich sind und wegen der langen Inkubierungszeiten, die man benötigt, um Gleichgewichtszustände herbeizuführen, d.h. den Punkt, bei welchem sich die Menge des gebildeten Komplexes nicht mehr im Laufe der Zeit verändert.

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Um wenigstens eine der bei diesem Verfahren benötigten Waschstufen zu vermeiden, sind schon sogenannte «gleichzeitige» und «Umkehr»-Assays vorgeschlagen worden. Bei einem «gleichzeitigen» Assay wird nur eine einzige Inkubie-rungsstufe angewendet, weil der an den festen Träger gebundene Antikörper und der markierte Antikörper beide gleichzeitig zu der zu untersuchenden Probe zugegeben werden. Nach Beendigung der Inkubierung wird der feste Träger gewaschen, um den Rest der Flüssigkeitsprobe und nichtkomplexen markierten Antikörper zu entfernen. Die Anwesenheit von markiertem Antikörper auf dem festen Träger wird dann nachgewiesen wie bei einer üblichen «Fordward» Sandwich-Assay.

Bei einer Umkehrassay gibt man stufenweise zuerst eine Lösung des markierten Antikörpers zu der Flüssigkeitsprobe, und dann gibt man nach einer geeigneten Inkubierungszeit einen unmarkierten Antikörper, gebunden an einen festen Träger, zu. Nach einer zweiten Inkubierung wird die feste Phase von Resten der zu untersuchenden Probe und der Lösung von nichtumgesetztem markiertem Antikörper gewaschen. Die Bestimmung des markierten Antikörpers auf dem festen Träger wird davon vorgenommen wie bei den «gleichzeitigen» und «Fordward»-Assays.

Sowohl die «gleichzeitige» als auch die «Umkehr»-Assay-technik erfordert eine ausreichende Überschussmenge an Festphasen-Antikörper, um den grössten Teil oder das gesamte vorhandene Antigen zu binden, um einen Hochdo-sen-Haken-Effekt zu vermeiden, bei dem künstlich negative oder niedrige Mengen von Antigen festgestellt werden bei ausserordentlich hohen Konzentrationen von Antigen. Aus diesem Grund ist die «Forward»-Assay beim bisherigen Stand der Technik bevorzugt worden. Dies liegt daran, dass grosse Mengen an hochgereinigtem aktivem Antikörper, der gegenüber dem interessierenden Antigen spezifisch ist, für die Herstellung einer Festphase mit einer ausreichenden Antigen-Bindungskapazität schwierig aus den polyclonalen Antikörpern, wie sie bisher verwendet wurden, zu erhalten sind. Wird eine immunogene Substanz in einen lebenden Körper eingeführt, so reagiert das Körperimmunsystem, indem es an allen Stellen, an denen das Immunogen erkannt wird, Antikörper bildet. Ein grosses immunogenes Proteinmolekül kann Dutzende von Stellen haben, und eine Fremdzelle kann Hunderte davon haben. Während jede Antikörper bildende Zelle Antikörper produziert, die spezifisch für eine einzelne antigene Stelle sind, hat das Immunsystem eine Spezies von spezifischen Antikörper produzierenden Zellen für jede erkannte immunogene Stelle entwickelt. Ausserdem bildet der Körper verhältnismässig grosse Mengen an Antikörpern für solche Antigene, die nicht diejenigen sind, die gerade von Interesse sind, so dass die meisten der Antikörper in dem polyclonalen Gemisch nicht spezifisch für das interessierende Antigen sind. Infolgedessen sind die bei den bisherigen immunometrischen Assays verwendeten Antikörper notwendigerweise «polyclonal», weil sich diese Antikörper von Antisera ableiten, die in üblicher Weise in Tieren entwickelt wurden und deren Reinigung schwierig ist. Verfahren zum Affiniiätsreini-gen solcher Antikörper sind im allgemeinen zeitraubend und ergeben nur niedrige Ausbeuten und den Verlust von Antikörpern mit hoher Affinität.

Wendet man übliche polyclonale Antikörpergemische bei Umkehrs- und Gleichzeitig-Assays an, so ist die Bildung eines «Sandwichs» aus dem Antigen, mit zwei oder mehr markierten Antikörpern, wobei das Antigen an verschiedenen Stellen gebunden ist, möglich. Diese Komplexe können in der zu untersuchenden Probe löslich bleiben und in der nachfolgenden Waschstufe entfernt werden und zählen nicht mit, wenn die Festphase für den an der Festphase gebundenen markierten Antikörper analysiert wird. Wenn dies in grösserem Aus-

mass stattfindet, wird die Empfindlichkeit der Assay vermindert, und es können falsche Ergebnisse eintreten. Gibt man jedoch unmarkierten, gebundenen Antikörper zuerst zu der Probe, wie bei der «Forward-Sandwich»-Assay, wird durch sterische Überlegungen die Bildung eines Sandwich aus dem Antigen, das mit zwei oder mehr unmarkierten Antikörpern komplex verbunden ist, verhindert, so dass der markierte Antikörper sich nicht mit dem Antigen verbinden kann. Infolgedessen kann das Antigen frei mit dem markierten Antikörpermolekül reagieren. Trotzdem wurde vorgeschlagen, eine gleichzeitige Assay für humanes thyroidstimulierendes Hormon (HTSH) anzuwenden, indem man einen grossen Über-schuss an nichtmarkiertem Antikörper, gebunden an eine feste Phase, verwendet, um die Bildung eines löslichen Komplexes durch einen löslichen markierten Antikörper zu mini-malisieren (siehe Jeong et al., «Comparison of Radioimmu-noassay (RIA) with a Unique, Single-Incubation Two-Site Immunoradioemtric Assay (IRMA) as Applied to the Determination of Human Thyroid Stimulating Hormone (HTSH)», Bio-Rad Laboratories, 1979.

Eine Variation einer «Gleichzeitig»-Assay wird in US-PS 4 174 384 beschrieben. Bei dieser Assay werden abgeteilte Anteile von Anti-lgG (Human) mit einem fluoreszierenden Chromophor (Fluorescein) bzw. einem Chromophor (Rhoda-min), welcher das von dem Fluorescein emittierte Licht absorbiert, markiert. Beide Antikörper werden in löslicher Form mit der Human-IgG enthaltenden Probe in Berührung gebracht. Die Umsetzung des Anti-lgG mit IgG kann zwei Chromophore nahe genug aneinanderbringen, d.h. innerhalb 100 A oder weniger, dass die Emission des Lichtes durch den fluoreszierenden Chromophor von dem anderen absorbiert wird. Der Prozentsatz der Maximalfluoreszenz bei dieser Probe wird bestimmt und als Mass für die Menge an IgG in der Probe genommen.

Es wurde auch vorgeschlagen, für HTSH, hepatitisassoziiertes Antigen (HAA) und carcinoembryonisches Antigen (CEA) eine Umkehrassay anzuwenden, indem man eine Menge an markiertem Antikörper verwendet, die ausreicht für einen markierten Antikörper-Antigen-Komplex, die aber nicht ausreicht zu Bildung eines «Sandwich» des gesamten in der Probe vorhandenen Antigens, siehe US-PS 4 093 876.

Da alle drei Verfahrensweisen des Standes der Technik polyclonale Gemische von Antikörpern verwenden, wird die Möglichkeit für Kreuzreaktionen mit anderen Materialien in dem Serum oder anderen Flüssigkeiten als dem Antigen, für welches der Test durchgeführt wird, erhöht. Das Auftreten der Kreuzreaktivität mit anderen Antigenen vermindert auch die Empfindlichkeit des Testes für das verdächtige Antigen und erhöht die Aussichten auf ein «Falsch-Positiv-Assay». Darüber hinaus erfordert die Anwendung von polyclonalen Antikörpern bei einer Gleichzeitig- oder Umkehrassay eine sorgfältige Abwägung der Mengen der verwendeten markierten Antikörper, relativ zu der Menge an vorhandenem Festphasen-Antikörper und/oder Antigen. Im Falle der Verwendung von Fluoreszenzabsorption wird die Empfindlichkeit vermindert, weil bei Verwendung von polyclonalen Antikörpern der Minimalabstand zwischen dem fluoreszierenden Chromophor und dem absorbierenden Chromophor nicht gewährleistet ist.

Aufgrund dieser Nachteile sind die Grenzen der bekannten immunometrischen Verfahrensweisen klar ersichtlich. Die üblichen Forward-Assays werden mit weniger Stufen erzielt, benötigen aber grosse Mengen an festphasenspezifischen Antikörpern und sind nicht gut geeignet zur Bestimmung von kleinen Antigenkonzentrationen, weil die Bildung eines Sandwich des Antigens mit einer Vielzahl von markierten Antikörpermolekülen im Wettbewerb steht mit der Bildung des Sandwiches, das den gebundenen Antikörper:Antigen:markierten

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Antikörper enthält oder, im Falle einer Fluoreszenzabsorption, weil die Bildung eines Sandwich möglich wird, ohne dass sich ein Fluoreszenzchromophor mit einem absorbierenden Chromophor paart. Es können sich deshalb Missinterpretationen oder Falsch-Positiv-Angaben aufgrund der polyclonalen Natur des Antikörpers ergeben.

Eine Aufgabe der Erfindung ist es, ein verbessertes immu-nometrisches Assay für antigene Substanzen zu zeigen. Insbesondere ist es Aufgabe der Erfindung, eine schnellere immunometrische Assaytechnik zu zeigen. Ein weiteres Ziel der Erfindung ist es, empfindlichere immunometrische Assay-techniken zu zeigen. Verbunden mit dieser Aufgabe ist auch, verbesserte «Gleichzeitig»- und «Umkehr»- immunometrische Assays zu zeigen; und schliesslich ist es eine Aufgabe der Erfindung, verbesserte Inhibierungsassays zu zeigen.

Die Aufgaben wurden gelöst, indem die polyclonalen Antikörper, die in einer immunometrischen Assay verwendet werden, beispielsweise als unmarkierte Antikörper, gebunden an einen festen Träger, und die Antikörper, verwendet als löslicher markierter Antikörper, oder, im Falle von Assays, die auf einer Fluoreszenzabsorption beruhen, die ein fluoreszierendes oder absorbierendes Chromophor tragenden Antikörper durch wenigstens ein und im allgemeinen zwei oder mehr unterschiedliche monoclonale Antikörper ersetzt werden. Jeder monoclonale Antikörper ist spezifisch auf eine einzelne antigene Stelle und ausschliesslich von Clonen hergestellt, die sich von einzigartigen Zellen ableiten.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein immuno-metrisches Assayverfahren zur Bestimmung von Flüssigkeitsproben, wobei man einen ternären Komplex aus der antigenen Substanz, einem ersten Antikörper und einem zweiten Antikörper, der an eine andere Stelle des Antigens als der erste Antikörper gebunden ist, bildet, indem man die Probe mit dem ersten und dem zweiten Antikörper in Berührung bringt und wobei die Verbesserung darin besteht, dass man einen monoclonalen Antikörper als ersten und als zweiten Antikörper verwendet, wobei die ersten und zweiten Antikörper so ausgewählt sind, dass sie eine Affinität für das Antigen von mindestens 1081/mol aufweisen.

Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform ist der monoclonale Antikörper, der als an den festen Träger gebundener Antikörper verwendet wird, das Produkt einer anderen Zellinie als der monoclonale Antikörper, der für den markierten Antikörper verwendet wird, und die beiden monoclonalen Antikörper werden so ausgewählt, dass sie sich an die antigene Substanz an auseinanderliegenden Stellen binden und nicht miteinander an den Bindungsstellen mit dem Antigen stören. Im Falle einer Fluoreszenzabsorption sind die beiden Antikörper im allgemeinen die Produkte von unterschiedlichen Zellinien und werden so ausgewählt, dass sie sich nicht gegenseitig beim Binden stören, aber doch die beiden Chro-mophore ausreichend eng aneinanderbringen, um die Absorption der Fluoreszenz zu ermöglich, d.h. innerhalb von etwa 100 Â. Die Vorteile der vorliegenden Erfindung, insbesondere bei «Gleichzeitig»- und «Umkehr»-Assays, gegenüber dem Stand der Technik werden ersichtlich, wenn man die anliegenden Zeichnungen und die nachfolgenden ausführliche Beschreibung heranzieht.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch das im Anspruch 38 definierte Verfahren, worin monoclonale Antikörper in Inhibierungsassays verwendet werden. Bei solchen Assays wird eine bekannte Menge eines Antigens und eines monoclonalen Antikörpers mit einer Probe in Berührung gebracht, von der man annimmt, dass sie ein Antigen enthält, das dem zu dem monoclonalen Antikörper zugegebenen Antigen entspricht. Das Ausmass, in welchem eine Inhibierung des Komplexes zwischen dem Antikörper und dem Antigen eintritt, und zwar weil sich ein Komplex aus dem monoclonalen Antikörper und dem Antigen in der Probe bildet, ist ein Mass für die Gegenwart und/oder Menge des Antigens in der zu untersuchenden Probe.

Das genannte erfindungsgemässe Verfahren zum Bestimmen der Anwesenheit oder Konzentration einer antigenen Substanz in einer Flüssigkeit umfasst folgende Stufen:

a) Kontaktieren einer Probe der Flüssigkeit mit einer bekannten Menge einer zugegebenen antigenen Substanz und eines monoclonalen Antikörpers zu der antigenen Substanz, und b) Messen der Inhibierung der Bildung eines Komplexes zwischen dem Antikörper und der zugegebenen antigenen Substanz durch Kombination des monoclonalen Antikörpers und der antigenen Substanz in der Flüssigkeit, unter Ausbildung eines zweiten Komplexes.

Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform sind der Antikörper bzw. das Antigen an eines der Glieder aus einem Paar von fluoreszierenden und adsorbierenden Chromopho-ren gebunden. Die Inhibierung der Bildung eines Komplexes zwischen dem markierten Antigen und Antikörper durch Antigene in der zu untersuchenden Probe, führt zu einer Verminderung der Adsorption und zu einer Erhöhung der Fluoreszenz. Das Ausmass der Inhibierung der Adsorption ist ein Mass für die Antigenkonzentration in der Probe. Gemäss einer weiteren bevorzugten Ausführungsform bei einer Inhi-bierungsassay werden bekanntes Antigen und Antikörper des ursprünglichen Komplexes an Teilchen, beispielsweise an Latexteilchen, einer Grösse, welche eine Agglomerierung zulässt, gebunden. Wird eine Probe, von der man annimmt, dass sie ein Antigen enthält, mit Antikörper und dem gebundenen Antigen in Berührung gebracht, findet eine Inhibierung der Agglomeratbildung statt, aufgrund einer Komplexbildung zwischen dem gebundenen Antikörper und dem Probe-Antigen, die kein Agglomerat bilden können. Die Verringerung der Agglomerierung kann dann durch Trübungsmessung festgestellt werden.

Fig. 1 ist eine grafische Darstellung der Ergebnisse, die man bei Verwendung von polyclonalen Antikörpern bei vier Typen immunometrischer Assays für Human-IgE erhält, und

Fig. 2 ist eine ähnliche grafische Darstellung und zeigt den Unterschied der Ergebnisse, die man bei Verwendung von monoclonalen Antikörpern bei den gleichen vier Typen von immunometrischen Assays für Human-IgE erhält.

Wie dargelegt, werden in den erfindungsgemässen Verfahren in immunometrischen Assays für eine antigene Substanz monoclonale Antikörper anstelle der früher verwendeten polyclonalen Antikörper eingesetzt. In ähnlicher Weise werden monoclonale Antikörper in Inhibierungsassays verwendet. Die Erfindung ist für die Bestimmung der Gegenwart und der Konzentration einer grossen Anzahl von antigenen Subtanzen, einschliesslich polyvalenten antigenen Substanzen, geeignet. Deshalb bedeutet der hier verwendete Ausdruck Antigene oder antigene Substanz allgemein Substanzen, gegenüber denen Antikörper gebildet werden können. Solche Substanzen sind beispielsweise Haptene, Hormone, wie Insulin, und humanes thyroidstimulierendes Hormon (HTSH), Gammaglobuline, Allergene, Viren, Viurs-Subein-heiten, Bakterien, Toxine, wie solche die mit Tetanus und mit tierischen Giften vorkommen, und auch gewisse Drogen. Zu den spezifischen Antigenen, die man nach dem erfindungsgemässen Verfahren untersuchen kann, gehören beispielsweise carcinoembryonisches Antigen (CEA), Hepatitis A und B, Hepatitis-Nicht-A, -Nicht-B, IgE und Alphafetoprotein.

Die für die vorliegende Erfindung geeigneten monoclonalen Antikörper erhält man nach einem Verfahren, das von Milstein und Kohler beschrieben und berichtet wird in Nature 256, 495-497 (1975). Die Einzelheiten dieses Verfahrens sind bekannt und brauchen hier nicht wiederholt zu wer5

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den. Das Verfahren besteht grundsätzlich darin, dass man eine Maus oder ein anderes geeignetes Tier mit einem Immunogen injiziert. Anschliessend wird die Maus getötet und Zellen, aus der Milz entnommen, werden mit Myelomazellen fusioniert. Man erhält Hybridzellen, die als Hybridoma bezeichnet werden, die sich in vitro reproduzieren. Die Population der Hybridoma wird überwacht und manipuliert, so dass man einzelne Clone isoliert, von denen jedes eine einzige Antikörperspezies gegenüber dem Antigen abscheidet. Jede auf diese Weise erhaltene individuelle Antikörperspezies ist das Produkt einer einzigen B-Zelle aus dem Immunotier, die erzeugt wurde als Reaktion auf eine spezifische antigene Seite der immunogenen Substanz.

Wird eine immunogene Substanz in einen lebenden Wirt eingeführt, dann reagiert das Immunsystem des Wirts unter Bildung von Antikörpern gegenüber allen erkennbaren Stellen auf der Substanz. Dieser «Gewehrschuss»-Effekt, nämlich die Bildung von Antikörpern im Abwehrkampf gegen den Eindringling besteht in der Bildung von Antikörpern verschiedener Affinitäten und Spezifitäten für die immunogene Substanz. Wenn man daher die verschiedenen hybridomen Zellinien so untersucht, dass man diejenigen identifiziert, die gegenüber dem gewünschten Antigen Antikörper bilden, werden die von den individuellen Hybridom-Zellinien gebildeten Antikörper bevorzugt untersucht, um diejenigen zu identifizieren, die die höchste Affinität für die immunogene Substanz haben, indem man ihre ursprüngliche Bildung stimuliert, bevor man sie dann für die vorliegende Erfindung auswählt. Die auf diesem Kriterium aufbauende Auswahl hilft, die Empfindlichkeit in den immunometrischen und Inhibierungsassays der vorliegenden Erfindung unter Verwendung von monoclonalen Antikörpern zu erhöhen im Vergleich zu den gemäss dem Stand der Technik verwendeten polyclonalen Antikörpern, die bestenfalls eine Affinität zu dem Antigen aufweisen, die grob nur der Durchschnitt der Affinitäten von allen in dem Immunsystem gebildeten Antikörpern darstellt. Vorzugsweise hat der ausgewählte monoclonale Antikörper eine Affinität, die mit der gewünschten Empfindlichkeit in dem Bereich in dem in Betracht kommenden Testsytem verträglich ist. Vorzugsweise hat der Antikörper eine Affinität von wenigstens 10" 1/mol.

Weiterhin kann man die die höchsten Affinitäten aufweisenden monoclonalen Antikörper weiter durchmustern,

indem man einen simulierten Assay mit Proben durchführt, von denen bekannt ist, dass sie falsche Positiv-Ergebnisse liefern, wobei man übliche polyclonale Antikörper anwendet, um diejenigen monoclonalen Antikörper zu identifizieren, die nicht kreuzreagieren und falsche positive Ergebnisse liefern.

Da die Zwei-Stellen-immunometrische Assay auf der Bildung von Antikörper:Antigen:Antikörper-Sandwich beruht, werden im allgemeinen zwei unterschiedliche monoclonale Antikörper, die sich nicht gegenseitig beim Binden an das Antigen behindern, als gebundener Antikörper ausgewählt und der lösliche markierte Antikörper und das Antikörperpaar werden ausgewählt, wenn Fluoreszenzabsorption angewendet wird. Da beide notwendig sind, um ein Sandwich zu bilden, kann eine Umkehr- oder Gleichzeitig-Assay ohne Schwierigkeiten durchgeführt werden, z.B. derart, dass sich ein Komplex aus markiertem Antikörper-.Antigen-.markiertem Antikörper bildet, der die Bildung eines Komplexes zwischen dem Antigen und dem an die feste Phase gebundenen Antikörper ausschliesst und hierin liegt ein besonderer Vorteil der vorliegenden Erfindung. Weiterhin kann man eine Forward-Assay durchführen, ohne die Zwischenwaschstufe, weil sich die beiden Antikörper an zwei unterschiedliche Stellen binden. Deshalb kann ein solches Verfahren auch als ein schnelles «Forward»-Assay bezeichnet werden.

Insbesondere bei einem Forward-Assay kann man den gleichen monoclonalen Antikörper sowohl als markierten Antikörper als auch als Antikörper, gebunden an den festen Träger, verwenden, wenn die antigene Substanz identische Antikörperbindungsstellen enthält, die ausreichend weit voneinander liegen, so dass mehr als ein Antikörpermolekül gleichzeitig gebunden werden kann. Bei einem solchen System schliesst die Zugabe von zuerst dem gebundenen Antikörper zu der Probe die Bildung eines Sandwiches aufgrund sterischer Überlegungen aus. Wenn der markierte monoclonale Antikörper anschliessend zugegeben wird, kann dieser auch mit dem Antigen, gebunden an den unmarkierten Antikörper, auf der festen Phase einen Komplex bilden.

Der unmarkierte monoclonale Antikörper, der beim erfin-dungsgemässen Verfahren verwendet wird, um die antigene Substanz aus der zu untersuchenden Probe zu extrahieren, kann auf irgendeinem der üblichen Trägermaterialien, wie sie bei immunometrischen Assays verwendet werden, immobilisiert werden. Zu diesen Trägermaterialien gehören Filterpapier, Plastikperlen oder Reagenzgläser aus Polyethylen, Polystyrol, Polypropylen oder anderem geeigneten Material. Geeignet sind auch feinteilige Materialien, wie Agarose, ver-netztes Dextran und andere Polysaccharide. Die Techniken zum Binden von Antikörpern an solche Materialien sind dem Fachmann geläufig. Beispielsweise kann man Antikörper an Polysaccharidpolymere unter Verwendung des in US-PS 3 645 852 beschriebenen Verfahrens binden.

Die bei der vorliegenden Erfindung verwendeten markierten monoclonalen Antikörper können mit den gleichen Markierungen ausgestattet werden, wie bei bekannten immunometrischen Assays. Hierzu gehören fluorogene Markierungen zum Nachweis durch Fluorimetrie, wie sie in US-PS 3 940 475 beschrieben werden, und enzymatische Markierungen, wie sie in US-PS 3 654 090 beschrieben werden. Es wird gegenwärtig bevorzugt, den Antikörper mit einem Radioisotop, wie ,25.I, zu markieren, wobei man das Verfahren von Hunter und Green-wood, Nature 144 ( 1962), Seite 945, oder das von David et al, Biochemistry, Bd. 13, Seiten 1014-1021, 1974, anwendet.

Bei einer typischen Assay wird die Menge an markiertem Antikörper, die auf einem unlöslichen Sandwich-Komplex vorhanden ist, bestimmt, indem man das unlösliche Trägermaterial auf geeignete Weise untersucht. Es ist jedoch möglich, die Gegenwart oder die Abwesenheit des Antigens in einer zu untersuchenden Flüssigkeitsprobe in Beziehung zu setzen zu der Menge an markiertem Antikörper, der nicht während der Assay reagiert hat und in löslicher Form verbleibt.

Die Vorteile der vorliegenden Erfindung, bei welcher monoclonale Antikörper in immunometrischen Assays im Vergleich zu polyclonalen Antikörpern verwendet werden, sind aus dem nachfolgenden Beispiel ersichtlich. In diesem Beispiel werden vier Vergleichsassays, ein «Gleichzeitig» Assay, ein «Umkehr»-Assay, ein «Forward»-Assay und ein schnelles «Forward»-Assay angewendet, wobei man sowohl monoclonale Antikörper als auch polyclonale Antikörper verwendet, und ein Standardserum, enthaltend 100 IU/ml vom Human IgE als Positivprobe einsetzte. Normales Pferdeserum, enthaltend IgE wurde als Negativkontrolle verwendet.

Der polyclonale Antikörper zu IgE, wie er als markierter Antikörper in dem Beispiel verwendet wurde, wurde von Pharmacia Diagnostics of Piscataway, New Jersey/USA, erhalten. Der polyclonale Antikörper, der an den festen Träger gebunden war, wurde von Tago Inc. of Burlingame, California/USA, erhalten.

Monoclonaler Antikörper zu IgE wurde nach der vorerwähnten Methode von Milstein und Kohler erhalten. Die beiden ausgewählten Antikörper zeigten eine Affinität für IgE von mehr als 10" 1/mol und störten sich nicht gegenseitig bei der Bindung an IgE.

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Die Assays wurden durchgeführt unter Verwendung von unmarkierten Antikörpern, gebunden an Agarose, nach dem Verfahren gemäss US-PS 3 645 852. Die Markierung des Antikörpers erfolgte durch i:äJ nachdem vorerwähnten Verfahren von David et al. Zum Waschen aller Proben wurde phosphatgepufferte Kochsalzlösung, pH 7,4, verwendet.

Beispiel 1

(1) Gleichzeitig-Assay-Methode

Duplikatproben wurden angesetzt, in denen 100 ul einer Suspension von Antikörper, immobilisiert auf Agaroseteilchen, mit 100 ul der Probe (Serum) und 100 ul löslichem l25J-markierten Antikörper vermischt wurden. Die Mischung wurde in den in Tabelle 1 (für polyclonale Antikörper) und Tabelle 2 (für monoclonale Antikörper) angegebenen Zeiten inkubiert plus 30 Minuten. Die extra 30minütige Inkubationsperiode wurde hinzugefügt, um diese Assaymethode den anderen Assaymethoden, bei denen man eine zusätzliche 30minütige Inkubationszeit für ein zweites zugefügtes Reagenz benötigte, anzupassen. Im Anschluss an die Inkubationsperiode wurden die Agaroseteilchen durch Zusatz von Puffer gewaschen und zentrifugiert. Nach Entfernung der Waschflüssigkeit durch Absaugen, wurden die zurückbleibenden Agaroseteilchen auf gebundenem ,:L5J-markierten Antikörper untersucht. Die Zählung, die man bei jedem Komplex nach der angegebenen Inkubationszeit erhielt, wird in den Tabellen 1 und 2 wiedergegeben.

(2) Umkehr-Assay-Methode

Duplikatproben wurden angesetzt, bei denen 100 ul einer Probe (Serum) mit 100 ,ul l25J-markiertem löslichen Antikörper vermischt wurden und die Mischungen wurden in den in Tabellen 1 und 2 angegebenen Zeiten inkubiert. 100 ul einer Suspension eines auf Agaroseteilchen immobilisierten Antikörpers werden zu dem Gemisch gegeben und dieses lässt man weitere 30 Minuten inkubieren. Die Agaroseteilchen werden dann gewaschen und gezählt, wie bei der Gleichzei-tig-Assay-Methode (simultaneous assay method). Die Zählungen werden in den Tabellen 1 und 2 angezeigt.

(3) Forward-Assay-Methode

Duplikatproben wurden mit 100 ul der Probe (Serum) angesetzt und vermischt mit 100 ,ul einer Suspension aus auf Agaroseteilchen immobilisiertem Antikörper und dann für die in den Tabellen 1 und 2 angegebenen Zeiten inkubiert. Die Agaroseteilchen wurden einmal durch Zugabe von 2,5 bis 3,0 ml eines Puffers gewaschen, der nach dem Vermischen abzentrifugiert wurde und die Flüssigkeit wurde abgesaugt. 100 [0.1 von l25J-markiertem löslichen Antikörper wurden zu dem Gemisch gegeben und weitere 30 Minuten inkubiert. Die Agaroseteilchen wurden dann gewaschen und wie bei der Gleichzeitig-Assay-Methode gezählt. Die Zählungen sind in den Tabellen 1 und 2 angegeben.

(4) Schnelle Forward-Assay-Methode

Die Untersuchung wurde doppelt, ähnlich wie bei der Forward-Assay-Methode durchgeführt, mit der Ausnahme, dass die Waschstufe zwischen der ersten Inkubierung der 5 Probe mit Antikörper, immobilisiert auf Agaroseteilchen, und die Zugabe von löslichem l25J-markierten Antikörper weggelassen wurde.

Die Zählungen/Minute für die Duplikatkontrolle und die Duplikat-Assays der Probe, enthaltend IgE unter Verwen-m dung von polyclonalem Antikörper und monoclonalem Antikörper, werden in den Tabellen 1 bzw. 2 gezeigt. Diese Daten wurden für die Anfertigung der Figuren 1 und 2 in folgender Weise verwendet. Der Durchschnitt der Zählungen/Minute für eine Kontrolle für eine gegebene Inkubierungszeit wurde 15 von dem Durchschnitt der Zählungen/Minute für die entsprechende IgE-Assay abgezogen. Die Differenz wurde als Prozentsatz der Gesamtzählungen/Minute von zu der Probe zugegebenem markierten Antikörper berechnet und wird auf der Y-Achse als Prozentsatz der Gesamtzählungen/Minute an 20 an die Festphase gebundenen Antikörpern aufgetragen. Die Inkubierungszeit wird auf der X-Achse aufgetragen.

Ein Vergleich der Punkte in Fig. 2, in denen die Ergebnisse von Assays unter Verwendung von monoclonalen Antikörpern gezeigt wird, mit denen von Fig. 1 von Assays unter 25 Verwendung von polyclonalen Antikörpern zeigt, dass bei jeder Assay-Art, bei der gleichzeitigen, bei der Umkehr-, bei der Forward- und bei der schnellen Forward-Assay, das Assay unter Verwendung von monoclonalen Antikörpern empfindlicher war, was durch den höheren Prozentsatz der 30 Gesamtzählungen/Minute, gebunden an die feste Phase mit 100 IU IgE/ml Probe ersichtlich wird. Unerwarteterweise wurde bei den gleichzeitigen und bei den Umkehr-Assays gefunden, dass solche Ansätze mit monoclonalen Antikörpern das Gleichgewicht schneller erreichen als die entspre-35 chenden Assays unter Verwendung von polyclonalen Antikörpern. Wenn man daher monoclonale Antikörper bei diesen Verfahren anwendet, kann man die Zeit für die Assays erheblich über die Zeit hinaus vermindern, die man einspart, indem man lediglich die Waschstufe fortlässt. In dieser Hin-40 sieht erreichte die Umkehr-Assay mit monoclonalen Antikörpern das Gleichgewicht in weniger als 1 Stunde. Beim gleichen Ansatz mit einer polyclonalen Assay wurde das Gleichgewicht erst nach 4 Stunden erreicht. Bei der gleichzeitigen Assay wurde das Gleichgewicht unter Verwendung von 45 monoclonalem Antikörper innerhalb 8 Stunden erreicht, während bei der Assay mit polyclonalen Antikörpern das Gleichgewicht nicht innerhalb 24 Stunden erreicht werden konnte. Infolgedessen ergibt die vorliegende Erfindung wesentlich schnellere und empfindlichere Gleichzeitig- und so Umkehr-Assays gegenüber den Verfahren des Standes der Technik und eliminiert die Bedenken, dass die Bildung eines löslichen «Sandwich»-Komplexes mit der Bildung des gewünschten unlöslichen Komplexes in Wettbewerb tritt.

Tabelle 1

Assay-Ergebnisse unter Verwendung von polyclonalen Antikörpern

Gleichzeitig-Assay Umkehr-Assay Forward-Assay schnelle Forward-Assay

Inkubations- Kontrolle IgE Kontrolle IgE Kontrolle IgE Kontrolle IgE

zeit (h) Probe Probe Probe Probe Probe Probe Probe Probe

0,25

372,314

2705,2667

302,243

2568,2581

357,326

2092,2077

396,293

2271,2238

0,50

348,265

2391,2366

284,262

2953,2999

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5

1,00

315,277

2793,2708

305,277

3154,3218

355,424

2157,2255

304,284

1789,1706

2,00

342,356

2897,2887

290,274

3377,3212

302,314

1946,2019

288,312

1728,1867

4,00

421,385

3696,3746

28,280

3413,3651

274,255

2019,2392

283,292

1720,1683

6,00

447,436

4028,4101

296,281

3762,3643

241,267

1750,1452

301,257

1283,1424

24,00

526,577

4564,4628

233,263

3651,3546

320,277

1553,1604

273,256

1450,1470

651 138

Tabelle 2

Assay-Ergebnisse unter Verwendung von monoclonalen Antikörpern

Gleichzeitig-Assay Umkehr-Assay Forward-Assay schnelle Forward-Assay

Inkubations- Kontrolle IgE Kontrolle IgE Kontrolle IgE Kontrolle IgE

zeit (h) Probe Probe Probe Probe Probe Probe Probe Probe

0,25

135,132

5610,5803

388,594

8407,8358

210,205

4618,4894

194,183

4859,4906

0,50

558,459

7472,7115

240,231

8238,8271

223,228

4987,5273

198,197

5024,5152

1,00

269,265

6289,6529

325,265

8010,8377

230,187

3453,4308

215,192

4887,4901

2,00

282,275

6787,6784

255,305

7856,7644

226,197

4834,4268

192,210

4937,4944

4,00

308,272

8150,8155

343,305

8017,7788

231,216

5269,4420

218,187

4929,5071

6,00

549,667

8884,9494

698,850

7870,7358

226,361

2006,3631

405,243

3033,3713

25,55

426,420

8669,9044

497,323

7037,7359

194,201

2465,2586

246,233

3945,2943

Bei der vorhergehenden Diskussion wurde der Schwerpunkt auf Zwei-Stellen- oder Sandwich-Assays gesetzt, bei denen einer der Antikörper insolubilisiert ist, während der andere in dem zu analysierenden Medium löslich ist. Weitere Veränderungen sind möglich. Eine bevorzugte Variante verwendet Antikörper, die an Teilchen gebunden sind, beispielsweise an Latexteilchen, derart, dass jedes Teilchen eine Vielzahl von Antikörpern trägt. Wenn eine Menge der Teilchen, an welche ein erster monoclonaler Antikörper gebunden ist, mit beispielsweise einer Teilchenmenge vermischt wird, an welche ein zweiter monoclonaler Antikörper gebunden ist, entsteht eine milchige Suspension. Wird jedoch eine Probe, enthaltend polyvalentes Antigen, für welches die Antikörper spezifisch sind, in die Suspension eingeführt, so tritt eine Agglomerisierung oder Agglutinisierung der Teilchen ein, unter Ausbildung von leicht nachweisbaren verklumpten Teilchen.

Der visuelle Nachweis von Agglumeratbildung kann in einem Screening-Test für den Nachweis von Antigen angewendet werden. Diesen Nachweis kann man erleichtern,

wenn man die Teilchen, die den einen monoclonalen Antikörper tragen, unterschiedlich von den Teilchen, die den anderen tragen, färbt. Das Ausmass der Agglomerisierung kann aber auch als ein Mass für die Menge des in der Probe vorhandenen Antigens angesehen werden. Beispielsweise kann man die Veränderung der Trübung messen unter Verwendung von Standardverfahren, wie der Nebelmessung.

Gegenwärtig bevorzugt man es, Latexteilchen zu verwenden, an denen der Antikörper kovalent gebunden ist, unter Anwendung von Verfahren, die dem Fachmann geläufig sind. Es können jedoch auch andere teilchenförmige Träger verwendet werden. Dazu behören beispielsweise Siliziumdioxid, Glas, Zellen, Polyacrylamide, Polymethylmethacrylat und Agarose. Vorzugsweise haben die Teilchen eine Grösse zwischen etwa 0,2 und etwa 10 um. Visuelles Screening erfordert jedoch Teilchen von wenigstens etwa 1,0 um.

Gemäss einer anderen Variante wird einer der Antikörper auf einer Perle an der Wand eines Reagenzglases oder auf einem anderen makroskopischen festen Träger insolubilisiert und der andere wird auf kleinen Latexteilchen oder anderen geeigneten Materialien gebunden. In Gegenwart des Antigens bildet sich ein Sandwich aus dem Antigen zwischen dem makroskopisch gebundenen Antikörper und den an ein Teilchen gebundenen Antikörper. Indem man z.B. die Teilchen färbt, kann man die Bildung des Sandwich visuell feststellen. Eine Fluoreszenz-, enzymatische, radioaktive oder andere Markierung auf dem an Teilchen gebundenen Antikörper kann man zur quantitativen Bestimmung genauso verwenden, wie bei Verwendung der vorerwähnten löslichen Antikörper.

Bei einer weiteren bevorzugten Variante der Zwei-Stellen-Assay wird wenigstens einer von zwei unterschiedlichen monoclonalen Antikörpern an ein Enzym gebunden, welches eine Reaktion katalysiert, bei der eine an den anderen mono-20 clonalen Antikörper gebundene Substanz entweder eine nachweisbare Substanz produziert oder in irgendeiner anderen Weise mit der Substanz auf dem zweiten Antikörper in Reaktion tritt, um dadurch den Nachweis des Antikörper: Antigen:Antikörper-Komplexes zu ermöglichen. Der Nach-25 weis kann beispielsweise durch Colorimetrie, Fluorometrie, Lumineszenz, Spektrofotometrie oder auf ähnliche Weise erfolgen. Bei Anwendung solcher Verfahren muss keiner der Antikörper insolubilisiert werden, was die Assay erheblich vereinfacht.

30 Bei der gegenwärtig bevorzugten Ausführungsform ist die Substanz auf dem zweiten Antikörper auch ein Enzym und die Assay verwendet ein Paar von enzymmarkierten Antikörpern, um die nacheinander ablaufenden Reaktionen, bei denen eine ein Produkt produziert, das von der anderen 35 benötigt wird, zu katalysieren. Bei diesen Reaktionen werden die beiden Antikörper so ausgewählt, dass dann, wenn sie sich mit dem Antigen binden, sie sterisch so positioniert sind, dass das Produkt der ersten enzymatischen Reaktion in einer so nahen Nachbarschaft zu dem zweiten enzymmarkierten 40 Antikörper erzeugt wird, dass die zweite Reaktion eintritt, bevor eine merkliche Diffusion des Produktes der ersten Reaktion in das Umgebungsmedium ablaufen kann.

Dieses Verfahren kann man illustrieren unter Verwendung eines Paares von monoclonalen Antikörpern, von denen eines 45 mit Hexokinase (HK) und das andere mit Glukose-

6-phosphatdehydrogenase (G-6-PDH) markiert ist, in der folgenden Reaktionsreihe anwendet.

-> Adenosindi-

50

(1) Adenosintriphosphat + Glukose-phosphat (ADP)+ GIukose-6-phosphat

(2) Glukose-6-phosphat + Nikotinamidadenindinukleo-

tid (NAD+) ti-ft-PQH ►Glukonolakton-6-phosphat + Dihydroni-kotinamidadenindinukleotid (NADH)

55

Das Assay wird durchgeführt, indem man zu der Probe, die das verdächtige Antigen enthält, den markierten Antikörper zu dem Antigen, ATP, Glukose und das Coenzym NAD + gibt. Ist das Antigen vorhanden, bildet sich der nachfolgende y, Komplex:

65

A CT

Ab (HK)

Ab(G-6-PDH)

651 138

10

Der HKmarkierte Antikörper katalysiert die Bildung von Glukose-6-phosphat in dem G-6-PDH-markierten Antikörper wo er in Glukonolakton-6-phosphat umgewandelt wird. Das bei dieser Reaktion durch Reaktion von NAD+ gebildete NADH kann spektrofotometrisch nachgewiesen werden, aufgrund der starken Absorption bei 340 nm, die für ein Dihydronikotinamid charakteristisch ist.

Die gleiche Umwandlung von Glukose in Glukonolakton-6-phosphat unter Bildung von NADH kann auch in dem Medium selbst, katalysiert durch die nicht-komplexgebundenen markierten Antikörper, stattfinden, jedoch mit einer viel geringeren Geschwindigkeit als wenn zwei Antikörper nahe beieinander in dem Antikörper:Antigen:Antikörper-Komplex positioniert sind. Infolgedessen bestätigt eine Erhöhung der Absorption bei 340 nm im Vergleich zu der Kontrollprobe, die Gegenwart von Antigen in der Probe. Die Erhöhung der Absorption kann auch in bezug gebracht werden zu der Menge des Antigens in dem Komplex.

Jedes beliebige andere Paar von geeigneten in Reihenfolge ablaufenden enzymatisch katalyisierten Reaktionen kann bei einer Zwei-Stellen-Assay mit entsprechend markierten Antikörpern für ein verdächtiges Antigen angewendet werden. Dazu gehört z.B. die Reaktion von Glukose, katalysiert mit Glukoseoxidase, unter Bildung von Glukonolakton und Wasserstoffperoxid, worauf sich die Umsetzung von Wasserstoffperoxid mit Orthophenylendiamin, katalysiert durch Peroxidase unter Bildung gefärbten Gruppe, anschliesst. Bei dieser Assay wird einer der monoclonalen Antikörper mit Glukoseoxidase markiert und der andere mit Peroxidase. Die Intensität der gebildeten Färbung, verglichen mit einer Kontrolle, kann in Beziehung gebracht werden zu der Anwesenheit und/oder der Menge des Antigens in der untersuchten Probe. Selbstverständlich kann man andere Substanzen, die in Gegenwart eines Enzyms zu einer gefärbten Gruppe oxidiert werden können, anstelle von Orthophenylendiamin verwenden.

Ein weiteres geeignetes Paar für der Reihe nach ablaufende Reaktionen unter Verwendung eines Paares von Antikörpern für ein gewünschtes markiertes Antigen, mit NAD-Oxidoreduktase bzw. Luziferase ist das folgende:

(1)NADH + Riboflavin-5'-phosphat (FMN) NAIMKitlnicdula.iM.-^ FMNH: + NAD +

(2) FMNH2 + RCHO + 02LuzifelUM>FMN* + RCOOH + H:0

RCHO ist ein typisches geradkettiges Aldehyd mit 10 oder mehr Kohlenstoffatomen.

Der Erzeugung von FMN*, einem angeregten Zustand von FMN, folgt die Emission eines Photons, das fotometrisch nachgewiesen werden kann und in Beziehung gebracht werden kann mit einer Kontrollprobe, um die Gegenwart und/ oder Menge eines Antigens in einer zu untersuchenden Probe zu bestimmen.

Gemäss einer weiteren Ausführungsform unter Anwendung eines Paares von Antikörpern, welche mit Enzym markiert sind, kann das Produkt der ersten enzymatisch katalysierten Reaktion entweder ein allosterischer Aktivator oder Inhibitor der nachfolgenden enzymkatalysierten Reaktion sein. Ein allosterischer Abbinder wird nicht bei der nachfolgenden zweiten Reaktion verbraucht, sondern wirkt mit dem Enzym unter Verstärkung dessen Affinität für ein Substrat oder um den Umwandlungsgrad des Substrates für das Produkt zu erhöhen, nachdem der Enzym-Substrat-Komplex gebildet ist. AUosterische Inhibitoren andererseits haben die umgekehrte Wirkung und vermindern die Enzymaffinität für ein Substrat oder vermindern den Umwandlungsgrad des Substrates in das Produkt. Die allosterische Inhibierung kann vom kompetitiven oder nichtkompetitiven Typ sein.

Ein Beispiel für eine Assay unter Verwendung der alloste-rischen Aktivierung wendet ein Paar markierter Antikörper an, wobei diese mit Phosphofruktokinase bzw. Phosphoenol-pyruvat markiert sind und folgendes Reaktionsschema abläuft:

(1) Fruktose-6-phosphat + ATP ''hosphaumktokinase^ Fruk_ tose-l,6-diphosphat + ADP

(2)HC03_ + Phosphoenolpyruvat(PEP) Phosphoenol-pyruvat c"rh"'iyla-':^ Oxaloacetat (OAA)

(3) OAA + NADH Malaidehydrogenase». Majat + NAD +

Das in Reaktion (1) gebildete Fruktose-1,6-diphosphat reagiert allosterisch mit der Phosphoenolpyruvatcarboxylase und aktiviert die Katalyse der Reaktion (2), nämlich der Bildung von Oxaloacetat aus PEP. Reaktion (3) läuft im Umgebungsmedium ab, d.h. es ist nicht erforderlich, der Malatde-hydrogenase an einen dritten monoclonalen Antikörper zu binden. Die Gegenwart und/oder Menge eines verdächtigen Antigens wird bestimmt, indem man die Reduktion der Adsorption bei 340 nm durch NADH, die in der Reaktion (3) in NAD+ oxidiert wird, in Beziehung setzt.

Ein Beispiel für ein Assay unter Verwendung von allosterischer Inhibierung und Anwendung eines Paares von markierten Antikörpern, die mit Aspartataminotransferase (AST) bzw. Phosphoenolpyruvatcarboxylase markiert sind, verläuft nach folgendem Reaktionsschema:

(1) Oxaloacetat + Glutamat AST ►- Aspartat + -Keto-glutorat

(2) PEP + NADH PhüsPhoen»|PVL"atcarhoxyläseQAA + NAD +

Das bei der Reaktion (1) gebildete Aspartat inhibiert die zweite Reaktion durch allosterische Reaktion mit der Phosphoenolpyruvatcarboxylase. Dadurch wird die Rate, mit welcher NADH zu NAD+ oxidiert wird, vermindert. Die Abnahme in der Adsorption bei 340 nm, die durch NADH bewirkt wird, kann in Beziehung gesetzt werden zur Gegenwart und/oder Menge von Antigenen in der zu untersuchenden Probe und eine geringere Abnahme als die, die bei einer Kontrollprobe auftritt, zeigt die Gegenwart von Antigen an.

Für den Fachmann ist es ersichtlich, dass zahlreiche weitere Reaktionspaare, bei denen eine Aktivierung oder Inhibierung bei der zweiten enzymatischen katalysierten Reaktion auftritt, anstelle der vorher dargelegten Beispiele für eine Zwei-Stellen-Assay verwendet werden können.

Gemäss einer weiteren Ausführungsform wird nur einer der in dem Antikörperpaar vorhandenen Antikörper mit einem Enzym markiert und der zweite wird mit einer Substanz markiert, beispielsweise einer solchen, die eine durch ein Enzym katalysierte Reaktion eingeht und dabei ein zweites Produkt bildet, das dann colorimetrisch, fluorimetrisch, durch Lumineszenz oder Spektrofotometrie oder andere Techniken nachgewiesen und/oder quantifiziert werden kann. Bei einem solchen Beispiel wird ein Paar von monoclonalen Antikörpern verwendet, von denen das eine mit Peroxidase und das andere mit Luminol markiert ist und wobei die Reaktion in folgender Weise abläuft:

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

u

651 138

Lumino!

Das Photon (hu), das durch diese Reaktion emittiert wird, kann durch fotometrische Verfahren nachgewiesen werden und in Beziehung gesetzt werden zur Anwesenheit und/oder Menge des in der zu untersuchenden Probe enthaltenen Antigens. 15

Gemäss einer weiteren bevorzugten Variante des Zwei-Stellen-Assays werden die beiden monoclonalen Antikörper mit einem fluoreszierenden Chromophor bzw. einem absorbierenden Chromophor, das Licht der Wellenlänge die durch Fluoreszenz emittiert wird, absorbiert, konjugiert. Die beiden 2o Antikörper werden so ausgewählt, dass dann, wenn sie mit dem Antigen, für das sie spezifisch sind, kombinieren, die beiden Chromophore genügend dicht aneinander sind, um das durch Fluoreszenz emittierte Licht von dem anderen Chromophor absorbieren zu lassen. Im allgemeinen liegen sie 25 in einem Abstand von etwa 100 À und vorzugsweise innerhalb von etwa 50 À zueinander. Die Auswahl von geeigneten Antikörpern kann man durch ein Screening-Verfahren vornehmen, bei welchem ein Gemisch von fluoreszenzmarkierten und absorptionsmarkierten monoclonalen Antikörpern mit 30 einer Probe in Berührung gebracht wird, die eine bekannte Menge des Antigens enthält. Die Verringerung der Fluoreszenz ist ein Zeichen dafür, dass zwei Chromophore genügend eng beieinander positioniert sind.

Bei der Fluoreszenzabsorption ist es nicht erforderlich, 35 einen der beiden Antikörper zu insolubilisieren. Quantitative Messungen kann man in einfacher Weise vornehmen, indem man die Abnahme der maximalen Fluoreszenz misst, d.h. die Menge an Fluoreszenz, die von einer Kontrollprobe emittiert wird, welche frei von jeglichem Antikörper ist oder indem 40 man die Fluoreszenz der Probe mit der einer Kontrollprobe, die eine bekannte Menge an Antigen enthält, vergleicht. Fluo-reszenz-Absorptions-Chromophor-Paare können auch in Kombination mit der Teilchenagglomerationstechnik angewendet werden und bei einer Technik, wobei einer der Anti- 45 körper insolubilisiert wird, indem er an einen festen Träger, wie an die Wand eines Reagenzglases oder an Perlen gebunden wird, weil eine Paarbildung der Fluoreszenz-Absorp-tions-Chromophoren abläuft. Die Abnahme der Fluoreszenz ist ein Anzeichen für die Gegenwart oder die Menge des in 50 der Probe enthaltenen Antigens.

Geeignete Fluoreszenz- und Absorptions-Chromophore und -Verfahren für die Konjugation mit den Antikörpern werden in US-PS 4 174 384 beschrieben, das zum Zwecke der Offenbarung hier miteingeschlossen wird. Derzeit verwendet 55 man vorzugsweise Fluorescein bzw. Rhodamin als Fluoreszenz- bzw. Absorptions-Chromophore.

Bei der bisherigen Beschreibung der Erfindung wurde die Fluoreszenz-Absorptionstechnik beschrieben, bei welcher Antikörperpaare, die die erforderlichen Chromophoren tra- 60 gen, veranlasst werden, sich an ein Antigen zu binden, falls dieses in der zu analysierenden Probe vorhanden ist, und zwar in einer sterischen Anordnung durch welche das absorbierende Chromophor in der Lage ist, das von Fluoreszenzchromophor emittierte Licht zu absorbieren. Quantitative 65 Bestimmung der Menge des vorhandenen Antigens kann man durchführen, indem man die Abnahme der maximalen Fluoreszenz misst.

Dieses Verfahren ist sehr gut geeignet zur Bestimmung der Gegenwart eines Antigens in einer Probe über einen weiten Konzentrationsbereich. Die geringen Abnahmen in der Fluoreszenz, wie sie bei niedrigen Antigenkonzentrationen auftreten, kann man jedoch nur sehr schwer nachweisen und genau messen. Im Gegensatz hierzu kann man geringe Erhöhungen der Fluoreszenz verhältnismässig einfach nachweisen und genau messen. Infolgedessen wird gemäss einer weiteren Ausführungsform der Erfindung die Inhibierung der Absorption ausgenutzt und die Erhöhung der Fluoreszenz gemessen.

Um dies in einem Assay für ein spezielles Antigen zu verwirklichen, werden Mengen an Antigen und monoclonalen Antikörpern zu dem Antigen individuell dem einen oder dem anderen des Paares der Fluoreszenz-Absorptions-Chromo-phore markiert. Das Chromophor-markierte Antigen und die Antikörper werden dann unter Bildung eines Komplexes kombiniert, in welchem das Fluoreszenzchromophor so positioniert ist, dass das von ihm emittierte Licht von dem Absorptions-Chromophor absorbiert wird. Um dies zu ermöglichen, kann man das Antigen mit dem Fluorescei-rungsmittel markieren und den Antikörper mit dem Absorptionsmittel oder umgekehrt.

Eine Probe, von der man annimmt, dass sie das zu untersuchende Antigen enthält, wird mit dem Chromophor-mar-kierten Antigen oder Antikörper in Berührung gebracht.

Nach einer geeigneten Inkubationsperiode wird die Fluoreszenz gemessen. Wenn in der zu untersuchenden Probe Antigen vorhanden ist, so wird, zumindest zum Teil, die Bildung eines Komplexes zwischen dem Chromophor-markierten Antigen und dem Antigen inhibiert, indem es selbst einen Komplex mit dem monoclonalen Antikörper bildet. In dem Masse wie dies stattfindet, ist der Fluoreszenz-Chromophor nicht länger in Position, so dass das von ihm emittierte Licht von dem Absorptionschromophor absorbiert wird. Dadurch erhöht sich die Fluoreszenz. Die Erhöhung der Fluoreszenz kann gemessen werden und in Beziehung zur Konzentration in der analysierten Probe gebracht werden, indem man mit der Fluoreszenz einer Kontrollprobe, die kein Antigen oder Antigen in bekannten Mengen enthält, vergleicht.

Aus dem vorhergehenden wird ersichtlich, dass der Chro-mophor-markierte Antigen:Antikörper-Komplex löslich sein kann. Gegenwärtig ist es jedoch bevorzugt, Chromophor-mar-kiertes Antigen und monoclonalen Antikörper zu verwenden, die an einen Latex oder an andere, z.B. die vorher erwähnten Teilchen einer Grösse, die mit dem gebildeten Komplex Agglomerate bildet, gebunden sind. Für diesen Zweck sind Teilchen einer Grösse von etwa 0,2 bis etwa 10 um im allgemeinen geeignet. Wird eine unbekannte Probe, die einen verdächtigen Antigen enthält, mit den agglomeratbildenden Teilchen des Antikörpers oder Antigens in Berührung gebracht, so findet eine Inhibierung der Agglomeration statt, weil das in der Probe enthaltene Antigen sich mit dem an den Teilchen gebundenen Antikörper kombiniert. Dadurch ergibt sich eine Erhöhung der Fluoreszenz, weil keine Adsorption mehr stattfindet, die nachgewiesen und gemessen werden kann, um dadurch eine Beziehung zwischen der Menge des Antigens in der Probe durch einen Vergleich mit der Fluoreszenz, die man

651 138

12

bei einer Probe beobachtet, die eine bekannte Menge des Antigens enthält, herzustellen.

Eingeschlossen in die Erfindung ist es, gebundenes Antigen und teilchengebundene monoclonale Antikörper in einer Untersuchung zu verwenden, bei der direkt die Inhibierung der Agglomeration gemessen wird. Bei dieser Technik ist weder das Antigen noch der Antikörper markiert. Wird eine antigenhaltige Probe mit den Teilchen in Berührung gebracht, so findet eine Inhibierung der Agglomeration während der Inkubationsperiode statt. Dadurch ergibt sich schliesslich eine teilweise Verminderung der Agglomeratbildung. Die Inhibierung wird durch Nebelmessung oder andere Verfahren für die Messung der Trübung nachgewiesen. Die Abnahme der Trübung kann in Beziehung gesetzt werden zur Menge 5 des Antigens in der Probe.

Die Beschreibung und die Beispiele haben die Anwendbarkeit der Erfindung auf Assays für IgE gezeigt, aber dies ist nur ein Beispiel für die zahlreichen Möglichkeiten, die durch die Erfindung genutzt werden können. Für den Fachmann ist io es ersichtlich, dass andere Variationen anwendbar sind.

G

2 Blatt Zeichnungen

Claims

651 138

2

PATENTANSPRÜCHE

1. Immunometrisches Assayverfahren zur Bestimmung der Anwesenheit oder der Konzentration von antigenen Substanzen in einer Flüssigkeitsprobe, bei dem man einen ternä-ren Komplex aus der antigenen Substanz, einem ersten Antikörper und einem zweiten, an einer unterschiedlichen Stelle wie der erste Antikörper an das Antigen gebundenen Antikörper bildet, indem man die Probe mit dem ersten und dem zweiten Antikörper in Berührung bringt, dadurch gekennzeichnet, dass man einen monoclonalen Antikörper als ersten und als zweiten Antikörper verwendet, wobei die ersten und zweiten Antikörper so ausgewählt sind, dass sie eine Affinität für das Antigen von mindestens 1081/mol aufweisen.
2. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ein Fluoreszenzchromophor an den ersten Antikörper gebunden ist und ein Chromophor, der in der Lage ist, Licht bei der Wellenlänge, die von dem Fluoreszenzchromophor emittiert wird, zu absorbieren, an den zweiten Antikörper gebunden ist, und bei dem man die Probe mit einer die ersten und die zweiten Antikörper enthaltenden Lösung in Berührung bringt und einen ternären Komplex bildet und die Intensität der Fluoreszenz bestimmt und mit der Fluoreszenz einer Standardprobe, die kein Antigen enthält oder die das Antigen in einer bekannten Menge enthält, vergleicht.
3. Verfahren gemäss Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der erste oder der zweite Antikörper an einen festen Träger, der in der Flüssigkeitsprobe unlöslich ist, gebunden ist, und der andere der Antikörper in der Flüssigkeitsprobe löslich ist.
4. Verfahren gemäss Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Flüssigkeitsprobe gleichzeitig mit dem ersten und dem zweiten Antikörper in Berührung gebracht wird, unter Ausbildung eines unlöslichen ternären Komplexes, und dass die Intensität der Fluoreszenz des ternären Komplexes bestimmt und verglichen wird mit der Fluoreszenz einer Standardprobe, die kein Antigen oder das Antigen in einer bekannten Menge enthält.
5. Verfahren gemäss Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe zuerst mit einem der ersten oder zweiten Antikörper in Berührung gebracht wird, unter Ausbildung eines Antikörper :Antigen-binären Komplexes und dann mit dem anderen des ersten oder zweiten Antikörpers in Berührung gebracht wird, unter Ausbildung eines ternären Komplexes, und dass man die Intensität der Fluoreszenz des Komplexes oder der Flüssigkeit bestimmt und mit einer Standardprobe vergleicht, die kein Antigen oder das Antigen in einer bekannten Menge enthält.
6. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der erste Antikörper an in der Flüssigkeitsprobe unlöslichen Teilchen gebunden ist und dass die Probe mit einer Suspension der Teilchen eine ausreichende Zeit in Berührung gebracht wird, unter Ausbildung eines ternären Komplexes, wodurch eine Agglomeration der an den ersten und zweiten Antikörper gebundenen Teilchen stattfindet.
7. Verfahren gemäss Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Grösse der Teilchen im Bereich von 0,2 um bis 10 um liegt.
8. Verfahren gemäss Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Teilchen ausgewählt sind aus Latex, Siliziumdioxid, Glas, Zellen, Polyacrylamid, Polymethylmethacrylat und Agarose.
9. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 6, 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass die an den ersten Antikörper gebundenen Teilchen eine unterschiedliche Farbe von denen haben, die an den zweiten Antikörper gebunden sind,
10. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 6, 7, 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Teilchen eine Grösse im Bereich von 1,0 bis 10 um haben.
11. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 6, 7, 8 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass man die Trübung der Probe nach der Bildung des ternären Komplexes bestimmt und in Beziehung bringt zu einer Kontrollprobe, von der bekannt ist, dass sie kein Antigen oder Antigen in einer bekannten Menge enthält.
12. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 6, 7, 8 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass ein Fluoreszenzchromophor an den ersten Antikörper und ein Chromophor, der in der Lage ist, das Licht der von dem Fluoreszenzchromophor emittierten Wellenlänge zu absorbieren, an den zweiten Antikörper gebunden ist, und dass man nach dem Kontaktieren die Intensität der Fluoreszenz bestimmt und mit der Fluoreszenz einer Standardprobe vergleicht, die frei von dem Antigen ist oder das Antigen in einer bekannten Menge enthält.
13. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 2,3,4, 5 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Fluoreszenzchromophor Fluorescein und der Chromophor, der in der Lage ist, das emittierte Licht zu absorbieren, Rhodamin ist.
14. Verfahren gemäss Anspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass ein Enzym an den ersten Antikörper und eine Substanz an den zweiten Antikörper gebunden wird und dadurch das Enzym mit der Substanz reagiert und den Nachweis des Antikörper:Antigen:Antikörper-Komplexes ermöglicht.
15. Verfahren gemäss Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die an den zweiten Antikörper gebundene Substanz ein Enzym ist.
16. Verfahren gemäss Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass das erste Antikörper-gebundene Enzym eine Reaktion katalysiert, bei welcher ein Produkt gebildet wird, welches bei einer Reaktion benötigt wird, die von dem zweiten Antikörper-gebundenen Enzym katalysiert wird.
17. Verfahren gemäss Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass das Produkt der von dem ersten gebundenen Enzym katalysierten Reaktion bei der Reaktion, die von dem zweiten gebundenen Enzym katalysiert wird, verbraucht wird.
18. Verfahren gemäss Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass das Produkt der von dem ersten gebundenen Enzym katalysierten Reaktion allosterisch mit dem zweiten gebundenen Enzym reagiert.
19. Verfahren gemäss Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass das Produkt der von dem ersten gebundenen Enzym katalysierten Reaktion allosterisch das zweite gebundene Enzym aktiviert oder allosterisch inhibiert.
20. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 16 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass bei der Reaktion die von dem zweiten Antikörper-gebundenen Enzym katalysiert wird, ein nachweisbares Produkt gebildet wird.
21. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 16 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass bei der von dem zweiten Antikörper-gebundenen Enzym katalysierten Reaktion eine nachweisbare Substanz verbraucht wird.
22. Verfahren gemäss Anspruch 20 oder 21, dadurch gekennzeichnet, dass die Bildung oder der Verbrauch der nachweisbaren Substanz colorimetrisch, fluorimetrisch, durch Lumineszenz oder durch Spektrofotometrie nachgewiesen wird.
23. Verfahren gemäss Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Substanz auf dem zweiten Antikörper eine Reaktion, die von dem ersten Antikörper-gebundenen Enzym katalysiert wird, eingeht.
24. Verfahren gemäss Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktion eine Substanz erzeugt, die colorimetrisch, fluorimetrisch, durch Lumineszenz oder durch Spektrofotometrie nachgewiesen werden kann.
25. Verfahren gemäss Anspruch 1, zur Bestimmung der Anwesenheit oder der Konzentration einer antigenen Substanz in einer Flüssigkeitsprobe, gekennzeichnet durch fol5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

3

651 138

gende Stufen:

a) Kontaktieren einer Probe der Flüssigkeit mit einem löslichen ersten monoclonalen Antikörper zu der antigenen Substanz, unter Ausbildung eines löslichen Komplexes des Antikörpers und der in der Probe enthaltenen antigenen Substanz, wobei der erste monoclonale Antikörper markiert ist,

b) Kontaktieren des löslichen Komplexes mit einem zweiten monoclonalen Antikörper, der an einen festen, in der Flüssigkeit unlöslichen Träger gebunden ist, unter Ausbildung eines unlöslichen Komplexes des ersten monoclonalen Antikörpers, der antigenen Substanz und dem zweiten monoclonalen Antikörper, gebunden an den festen Träger,

c) Abtrennen des festen Trägers von der Flüssigkeitsprobe und von nichtreagiertem markierten Antikörper,

d) Messen entweder der Menge des auf dem festen Träger enthaltenen markierten Antikörpers oder der Menge an nichtreagiertem markierten Antikörper, und e) dass man die Menge an gemessenem markierten Antikörper mit der Menge des gemessenen markierten Antikörpers für eine Kontrollprobe, die nach den Stufen a) bis d) hergestellt wurde, vergleicht, wobei bekannt ist, dass die Kontrollprobe frei von der antigenen Substanz ist, um die Gegenwart der antigenen Substanz in der Flüssigkeitsprobe zu bestimmen, oder dass man die gemessene Menge des markierten Antikörpers mit der gemessenen Menge eines markierten Antikörpers einer bekannten Menge an antigenen Substanzen enthaltenden Probe, die gemäss den Stufen a) bis d) hergestellt worden ist, in Beziehung setzt, um die Konzentration der in der Flüssigkeitsprobe enthaltenen antigenen Substanz zu bestimmen.
26. Verfahren gemäss Anspruch 1, zur Bestimmung der Gegenwart einer antigenen Substanz in einer Flüssigkeitsprobe, gekennzeichnet durch die Stufen a) gleichzeitiges Inberührungbringen einer Probe der Flüssigkeit mit ersten und zweiten monoclonalen Antikörpern zu der antigenen Substanz, wobei der erste monoclonale Antikörper markiert ist und der zweite monoclonale Antikörper an einen festen Träger, der in der Flüssigkeit unlöslich ist, gebunden ist, unter Ausbildung eines unlöslichen Komplexes aus dem ersten monoclonalen Antikörper, der antigenen Substanz und dem zweiten monoclonalen Antikörper,

b) dass man den festen Träger von der Flüssigkeitsprobe und von nichtumgesetztem markierten Antikörper abtrennt,

c) dass man die Menge an markiertem Antikörper auf dem festen Träger oder die Menge an nichtreagiertem markierten Antikörper misst, und d) dass man die Menge an gemessenem markierten Antikörper mit der Menge an markiertem Antikörper, die bei einer Kontrollprobe, die gemäss den Stufen a) bis c) hergestellt worden ist und von der bekannt ist, dass sie die antigene Substanz nicht enthält, vergleicht, um dadurch die Anwesenheit der antigenen Substanz in der Flüssigkeitsprobe festzustellen, oder dass man die Menge an gemessenem markierten Antikörper mit der Menge an gemessenem markierten Antikörper einer Probe, die eine bekannte Menge der antigenen Substanz enthält und nach den Stufen a)-c) hergestellt worden ist, vergleicht, um die Konzentration an antigener Substanz in der Flüssigkeitsprobe festzustellen.
27. Immunometrisches Assay gemäss Anspruch I, zur Bestimmung der Gegenwart oder der Konzentration einer antigenen Substanz in einer Flüssigkeitsprobe, wobei ein ter-närer Komplex aus einem ersten markierten Antikörper, der antigenen Substanz und einem zweiten Antikörper, der an einen festen Träger, in der Flüssigkeit unlöslichen Träger gebunden ist, gebildet wird, dadurch gekennzeichnet, dass man einen monoclonalen Antikörper für sowohl den markierten Antikörper als auch für den an einen festen Träger gebundenen Antikörper verwendet.
28. Verfahren gemäss Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass man die Flüssigkeitsprobe zuerst mit dem zweiten Antikörper unter Ausbildung eines binären Komplexes der antigenen Substanz und dem zweiten Antikörper, der in der Flüssigkeitsprobe unlöslich ist, kontaktiert und dann mit dem ersten markierten Antikörper kontaktiert, unter Ausbildung des ternären Komplexes.
29. Verfahren gemäss Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass die Flüssigkeitsprobe zuerst mit dem zweiten Antikörper kontaktiert wird, unter Ausbildung eines binären Komplexes der antigenen Substanz und des zweiten Antikörpers, der in der Flüssigkeit unlöslich ist, und dass man die von dem festen Träger abgetrennte Probe und den festen Träger mit einer Lösung des ersten markierten Antikörpers in Berührung bringt und dadurch den ternären Komplex bildet.
30. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 25 bis 29, dadurch gekennzeichnet, dass der erste monoclonale Antikörper das Produkt einer von dem zweiten monoclonalen Antikörper unterschiedlichen Zellinie ist.
31. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 25 bis 29, dadurch gekennzeichnet, dass das Antigen wenigstens zwei identische Bindungsstellen hat und dass die ersten und zweiten monoclonalen Antikörper das Produkt dergleichen Zellinie sind.
32. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 25-29,

dadurch gekennzeichnet, dass die Affinität wenigstens 10" 1/mol beträgt.
33. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 25 bis 31, dadurch gekennzeichnet, dass der feste Träger gewaschen wird, um die Flüssigkeitsprobe von dem Träger abzutrennen.
34. Verfahren gemäss Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, dass der feste Träger mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen wird.
35. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 25 bis 31, dadurch gekennzeichnet, dass das Antigen ausgewählt ist aus der Gruppe IgE, Hepatitis A, Hepatitis B, Hepatitis-Nicht-A, Hepatitis-Nicht-B, Alphafetoprotein, carcinoembryonisches Antigen, Insulin und humanem thyroidstimulierenden Hormon.
36. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 25 bis 31, dadurch gekennzeichnet, dass der markierte Antikörper mit einem radioaktiven Isotop, einem Enzym oder einem fluoro- -genen Material markiert ist und dass man die Untersuchung radiometrisch, fluorometrisch oder enzymatisch vornimmt.
37. Verfahren gemäss Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, dass die Markierung radioaktives Isotop J125 ist.
38. Verfahren zur Bestimmung der Gegenwart oder der Konzentration von antigenen Substanzen in einer Flüssigkeitsprobe, gekennzeichnet durch die Stufen:

a) Kontaktieren einer Probe der Flüssigkeit mit einer bekannten Menge einer zugegebenen antigenen Substanz und eines monoclonalen Antikörpers zu der antigenen Substanz, und b) Messen der Inhibierung der Bildung eines Komplexes zwischen dem Antikörper und der zugegebenen antigenen Substanz durch Kombination des monoclonalen Antikörpers und der antigenen Substanz in der Flüssigkeit unter Ausbildung eine zweiten Komplexes.
39. Verfahren gemäss Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet, dass ein Fluoreszenzchromophor an die zugegebene antigene Substanz gebunden wird und ein Chromophor, der in der Lage ist, Licht einer Wellenlänge, wie sie von dem Fluoreszenzchromophor emittiert wird, zu absorbieren, an den monoclonalen Antikörper gebunden ist und wobei man nach dem Inberührungbringen die Intensität der Fluoreszenz bestimmt und mit der Fluoreszenz einer Standardprobe vergleicht, die keine antigene Substanz oder die antigene Substanz in einer bekannten Menge enthält.

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40. Verfahren gemäss Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet, dass ein Fluoreszenzchromophor an den monoclonalen Antikörper gebunden ist und ein Chromophor, das in der Lage ist, Licht der Wellenlänge, die von dem Fluoreszenzchromophor emittiert wird, zu absorbieren, an die zugegebene antigene Substanz gebunden ist, und dass man nach dem Kontaktieren die Intensität der Fluoreszenz bestimmt und mit der Fluoreszenz einer Standardprobe vergleicht, die frei von der antigenen Substanz ist oder die die antigene Substanz in einer bekannten Menge enthält.
41. Verfahren gemäss Anspruch 39 oder 40, dadurch gekennzeichnet, dass der Fluoreszenzchromophor Fluores-cein und der Chromophor, der in der Lage ist, emittierendes Licht zu absorbieren, Rhodamin ist.
42. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 39 oder 40, dadurch gekennzeichnet, dass der monoclonale Antikörper und die zugegebene antigene Substanz an Teilchen gebunden sind und dass der erste Komplex aus einem Agglomerat der den monoclonalen Antikörper bindenden Teilchen und der die antigene Substanz bindenen Teilchen besteht.
43. Verfahren gemäss Anspruch 42, dadurch gekennzeichr net, dass die Teilchen ausgewählt sind aus Latex, Siliziumdioxid, Glas, Zellen, Polyacrylamid, Polymethylmethacrylat und Agarose.
44. Verfahren gemäss Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet, dass der monoclonale Antikörper und die zugegebene antigene Substanz an Teilchen gebunden sind und dass der erste Komplex aus einem Agglomerat von Teilchen besteht, welche die zugegebene antigene Substanz binden, worauf man nach dem Kontaktieren die Trübung der Probe bestimmt und mit der Trübung einer Standardprobe, die keine antigene Substanz oder die antigene Substanz in einer bekannten Menge enthält, vergleicht.
45. Verfahren gemäss Anspruch 44, dadurch gekennzeichnet, dass die Teilchen ausgewählt sind aus Latex, Siliziumdioxid, Glas, Zellen, Polyacrylamid, Polymethylmethacrylat und Agarose.
46. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 42, 43, 44 oder 45, dadurch gekennzeichnet, dass die Teilchen eine Grösse im Bereich von etwa 0,2 bis etwa 10 um haben.