DE69831965T2

DE69831965T2 - Auf peroxiden basierender chemilumineszenztest und chemilumineszente verbindungen die in diesem benutzt werden

Info

Publication number: DE69831965T2
Application number: DE69831965T
Authority: DE
Inventors: A. Alexander WALDROP; P. Calvin VARY
Original assignee: Maine Medical Center; Capricorn Products Inc
Current assignee: Maine Medical Center; Capricorn Products Inc
Priority date: 1997-08-21
Filing date: 1998-08-21
Publication date: 2006-07-20
Anticipated expiration: 2018-08-22
Also published as: EP1019379A4; ATE307116T1; WO1999009012A1; US20030219844A1; US7718576B2; JP2003517426A; EP1019379A1; EP1019379B1; JP4838932B2; AU9110698A; DE69831965D1

Description

Hintergrund der Erfindung:
Die vorliegende Erfindung befindet sich auf dem allgemeinen Gebiet der Erkennungssysteme mit analytischen Tests, wie zum Beispiel Erkennungssystemen auf Chemilumineszenzbasis für analytische Bindungstests. Es werden verschiedene Reagenzien und (analytische) Aufbauten zum Erkennen eines Ereignisses benutzt, das die Anwesenheit oder Menge eines Analyten (einer zu analysierenden Substanz) in einem Gemisch anzeigt. Beispielsweise beruhen verschiedene analytische Tests auf dem Einsatz von speziellen analytischen Bindungspartnern, um mit dem Analyten zu reagieren (oder an ihn zu binden). Das Eintreten der Bindung wird auf verschiedene Art und Weise aufgespürt (erkannt), häufig durch ein Bindungsreagenz, welches in gewisser Weise mit einem erkennbaren Marker versehen ist. Immunologische Analysentests und Analysentests auf Hybridisierungsbasis stellen gerade zwei solche Analyseaufbauten dar, die sich derartige Marker zunutze machen. Diese analytischen Tests schließen solch unterschiedliche Marker, wie zum Beispiel Radioisotope, kolloidales Gold wie auch die enzymatische Erzeugung einer Licht absorbierenden oder aussendenden Verbindung, mit ein. Ein Vorteil der enzymatischen Marker ist deren katalytische Funktion, wobei ein einzelnes Enzymmolekül zahlreiche Moleküle des aufzuspürenden enzymatischen Produkts hervorbringt.
Erst vor kurzem wurden zwei Klassen von aktivierten Acridincarbonsäuren beschrieben: Acridincarbonylhalogenide und Carbonsäureanhydride von Acridincarbonsäure. Die 9-Acridinpercarbonsäure wurde zum ersten Male 1965 von Rauhut, Sheehan et al. bei Cyanamid Amerika[Rauhut, M. M.; Sheehan, D.; Clarke, R. A.; Roberts, B. G. und Semsel, A. M. in Journal of Organic Chemistry, Bd. 30, S. 3587 bis 3592, (1965)] als Reaktionsprodukt aus Peroxid, Pyridin und 9-Acridincarbonylchlorid beschrieben. Das Hauptaugenmerk in diesem Dokument ist auf die Chemilumineszenz des 9-Chlorcarbonyl-10-methylacridiniumchlorids gerichtet; es wird jedoch darin erwähnt, dass durch die oben erwähnte Reaktion eine Chemilumineszenz hervorgerufen würde, dass das Acridon ein Reaktionsprodukt und dass das Spektrum der Chemilumineszenz mit dem Acridon, das den Emittenten darstellt, konsistent wären. Die herausgegebenen (Schriften) US-A-3-352 791 und die US-A-3 539 574 stützen sich auf diese Forschung. In der US-A-3-352 791 ist erwähnt, dass das 9-Acridincarbonylchlorid zuerst von Samdahl und Marker [Samdahl und Weider in Bull. Soc. Chim., [5], 2, 2008, (1935)] isoliert wurde, jedoch in dieser Arbeit nicht als Chemilumineszenzmittel identifiziert wurde. Das 9-Acridincarbonylchlorid stellte somit das erste bekannte aktivierte Derivat der 9-Acridincarbonsäure dar. Es ist allerdings in Wasser nicht sehr stabil, wobei nicht zu erwarten sein dürfte, dass es ein geeignetes Reagenz zur Verwendung bei den meisten diagnostischen Testanordnungen darstellen würde. In diesen beiden Patenten waren zusätzlich zur Beanspruchung des Säurechlorid-Derivats der 9-Acridincarbonsäure auch das Bromid und das Fluorid beansprucht. Es sind darin auch Derivate des Carbonsäureanhydrids der 9-Acridincarbonsäure beansprucht. Darüber hinaus sind im Zusammenhang mit all diesen Verbindungen auch Derivate dieser Verbindungen mit Substitutionen an den Acridinringen beansprucht. Eigentlich dürfte zu erwarten sein, dass lediglich einige dieser Derivate (zum Beispiel das Fluorid und möglicherweise sterisch gehinderte Anhydride) im wässrigen Milieu mäßig stabil sind. Die hauptsächliche Anwendung, die für diese Verbindungen ins Auge gefasst wird, ist die, sie als Lichtquellen in Situationen einzusetzen, bei denen andere Lichtquellen ein Risiko darstellen könnten. "Cyalume" – Leuchtstäbe stellen ein Produkt dar, das aus dieser Forschung stammt, wobei jedoch offensichtlich eher Derivate der Oxalsäure als Derivate der Acridincarbonsäure zum Einsatz gelangen, vermutlich auf Grund einer höheren Quantenausbeute.
Weder in einem dieser Patente noch in einem der Dokumente, welche dieses Forschungsgebiet abdecken, findet sich eine Erwähnung des Einsatzes dieser Verbindungen als analytische Reagenzien. Es gibt auch keine Besprechung darüber, ob die chemilumineszierende Ausbeute zu der Konzentration an Wasserstoffperoxid proportional ist. In der Tat sind die Konzentrationen an Peroxid im allgemeinen größer als 50 mM, sodass sie gut oberhalb der Pegel liegen, die jeweils zur Verwendung bei den empfindlichen diagnostischen Testanordnungen erforderlich sind. Es war auch keine Diskussion ihres potentiellen Einsatzes zur Messung der Enzymaktivität einbezogen. Es wurde in spezifischer Weise auf den Mangel an Stabilität dieser Derivate in wässrigem Milieu Bezug genommen, wobei erwähnt wird, dass "dann, wenn Wasser zuerst zu der Acridinverbindung hinzugefügt wird, das Peroxid vernünftigerweise bald danach hinzugegeben werden sollte, um optimale Ergebnisse zu erhalten" (Sheehan, D.; Clarke, R. A.; Rauhut, M. M. in US-A-3 352 791, Spalte 9, Z. 12 bis 14). In der biologisch-analytischen Fachwelt wurde möglichen Anwendungen dieser Verbindungen keine Aufmerksamkeit geschenkt, möglicherweise auf Grund der vorweg genommenen Probleme im Zusammenhang mit der Stabilität in Wasser. Andere Autoren studierten die Chemilumineszenz derartiger Verbindungen [White, Emil H.; Roswel David F.; Dupont Andrea C. und Wilson, Alan A. in Journal of the American Chemical Society, Bd. 109, S. 5189 bis 5196, (1987)], des Phenylesters der 9-Acridincarbonsäure und verschiedener Hydrazide der 9-Acridincarbonsäure [Rapaport, Eliezer; Cass, Malcolm W. und White, Emil H. in Journal of the American Chemical Society, Bd. 94, S. 3153 bis 3159, (1972)].
Es ist wahrscheinlich, dass die Bedingungen, welche für das Ingangsetzen der Chemilumineszenz erforderlich sind, von einer weiteren Untersuchung dieser Verbindungen als potentiell biologischanalytische Marker abgehalten haben. Darüber hinaus ist die berichtete Quantenausbeute bei einer Vielzahl dieser Verbindungen niedrig. Ebenso könnte durch den Erfolg der N-Alkylacridiniumester als Markierungsmittel die Bedeutung der Substitution am heterocyclischen Stickstoff des Acridinrings als eine Quelle für die Potenz der Chemilumineszenz überbetont worden sein. Auf jeden Fall hat niemand die Verwendung irgendeiner dieser Verbindungen als Reagenz für die Analyse von Proben mit einem Gehalt an Peroxidverbindungen, in immunologischen analytischen Enzymtests oder in analytischen Tests unter Einsatz von Oligonukleotidsonden beschrieben.
In zahlreichen Dokumenten und mehr als 30 Patenten wurde bislang auf die Chemilumineszenz der Acridiniumester und damit verwandter Verbindungen (zum Beispiel Sulfonamide) Bezug genommen, wobei große Anstrengungen dahingehend unternommen wurden, bessere Markierungsmittel oder solche zu entwickeln, die sich hinreichend von dem zu patentierenden Originalester unterschieden. Die O riginalarbeit über die Acridiniumester wurde von der Gruppe um F. McCapra durchgeführt [McCapra, Frank; Richardson, D. G. und Chang, Y. C. in Photochemistry and Photobiology, Bd. 4, S. 1111 bis 1121, (1965)], sowie die früher erwähnte (Arbeits)Gruppe bei der Cyanamidgruppe Amerika. Die Anwendung von Acridinestern in immunologischen analytischen Tests begann mit der Veröffentlichung der Synthese und des Einsatzes eines Acridiniumesters mit einem Gehalt an einer N-Oxysuccinimidestergruppe, was die Verknüpfung des Acridiniumesters mit Proteinen und anderen biologischen Molekülen erleichterte, insbesondere solchen mit Alkylamingruppen [Weeks, Ian; Beheshti, Iraj; McCapra, Frank; Campbell, Anthony K. und Woodhead, J. Stuart in Clinical Chemistry, Bd. 29, S. 1474 bis 1479, (1983)]. Die Gruppe an der Welsh National School of Medicine erhielt ein Patent, das Acridiniumester als Markierungsreagenzien abdeckt [Campbell, Anthony K.; Woodhead, J. Stuart und Weeks, Ian in GB-B-2 112 779 (8. 12. 1982) sowie Campbell, Anthony K.; Woodhead, James S. und Weeks Ian in US-A-4 946 958]. Andere erteilte Patente, die auf modifizierte Derivate gerichtet sind, schließen solche mit ein, die an Folgende erteilt wurden: Ciba – Corning (US-A-4 745 181; US-A-4 918 192, US-A-4 927 769, US-A-5 093 270, US-A-5 110 932, US-A-5 227 489, US-A-5 241 070, US-A-5 395 752); Abbott Laboratories (US-A-5 468 646, US-A-5 543 524, US-A-5 565 570); Gen-Probe (US-A-4 950 613); Mochida Pharmaceutical Co. (US-A-5 438 139, US-A-5 521 103, US-A-5 594 112); Amoco (US-A-5 155 216); London Diagnostics (US-A-5 281 712, US-A-5 283 334, US-A-5 284 951, US-A-5 284 952, US-A-5 290 936, US-A-5 321 136, US-A-5 338 847) und Nichols Institute (US-A-5 395 938).
Modifizierungen schlossen unter Einbeziehung von Gruppen mit sterischer Hinderung Ansätze für Estergruppen mit ein (US-A-4 745 181), wobei auf diese Weise die Stabilität in wässrigem Milieu anstieg, wie zum Beispiel am Phenylring "ortho" im Hinblick auf den Ester (US-A-4 745 181, US-A -5 284 951) oder an einem oder mehreren Acridinringen "peri" im Hinblick auf den Ester (US-A-5 321 136). Zur Verbesserung der Wasserlöslichkeit wurden zu jedem Ring auch substituierende Gruppen hinzugefügt (US-A-5 227 489, US-A-5 281 712), um aus der Abgangsgruppe eine verbesserte Gruppe zu machen oder um das Ausmaß des Angriffs durch das Peroxid auf den Ester zu verstärken. Es wurden Substituenten an einen oder mehrere Acridinringe hinzugefügt, um die lumineszierenden Eigenschaften des Acridonproduktes zu verbessern. Es wurden Acridinium-ester mit verschiedenen Abgangsgruppen auf Oxyarylbasis mit oder ohne Substituenten synthetisiert, wobei auf diese Weise Derivate mit Sulfonamidgruppen erhalten wurden (US-A-5 468 646), welche die reguläre Phenoxyabgangsgruppe ersetzen. An einen oder mehrere Acridinringe wurden verschiedene Kupplungsgruppen angehängt, an die Abgangsgruppe (Aryl- oder Alkylester- oder Sulfonamidgruppe) (US-A-5 241 070, US-A-5 283 334) oder eine Alkyl- oder Arylgruppe unter Quaternisierung des heterocyclschen Stickstoffs (US-A-5 438 139). Der heterocyclische Acridinstickstoff wurde auch mit O oder O-Alkyl quaternisiert [Septak, M. in J. of Biolum. and Chemilum., Bd. 4, S. 351 bis 356 (1989)]. Andere Abgangsgruppen schließen Hydroxamate, Enamide, Thiolester, Thioester sowie aktivierte exocyclische Arylamide mit ein. Es wurden verschiedene Heterocyclen, welche den Acridiniummolekülrest ersetzen (wie zum Beispiel Phenanthridinium und Chinolin), beansprucht. An sich werden durch den Einsatz all dieser Reste bei der Synthese von deren modifizierten Verbindungen Derivate des Acridincarbonylchlo rids verwendet, aber durch keinen wird die Lehre eines Einsatzes von Acridincarbonylhalogeniden oder Derivaten des Carbonsäureanhydrids der Acridincarbonsäure als Erkennungsmittel von Peroxiden vermittelt.
In verschiedenen Patenten sind Acridanderivate offenbart. Einige dieser Acridane stellen echte Acridane mit einem Wasserstoffatom in der Stellung 9 dar, welche für das Starten der Chemilumineszenzreaktion oder die Oxidation zurück zur Form des Acridiniums anstelle von Peroxid eher Sauerstoff benötigen; andere jedoch stellen Addukte dar, die zur Acridiniumform zurückführen, und zwar bei leichten Veränderungen bei den (Reaktions)-Bedingungen, wie zum Beispiel der Zugabe von Säure oder Verdünnung.
In keinem der oben stehenden Patent wird der Einsatz von Acridinderivaten diskutiert. In einigen werden offenbar jedoch Acridinderivate beansprucht, allerdings in der Form eines Acridiniumsalzes, wobei der Ring am Stickstoff protoniert ist und eine positive Ladung trägt (siehe beispielsweise Anspruch 2 in der US-A-5 155 216). Unter den Bedingungen eines niedrigen pH-Wertes, die für die Protonierung des Stickstoffs im Acridinring und Erzielung der Acridiniumform erforderlich sind, dürfte das Peroxid an sich vollständig protoniert werden; dies würde somit keine besonders gute Nukleophilie bedeuten, wobei nicht zu erwarten sein dürfte, dass bei einer regulären Phenylester- (oder einer modifizierten Phenylester)-Abgangsgruppe das Acridiniumsalz eine außerordentliche Chemilumineszenz aufweisen würde. In der Tat weist der Standardphenylester der Acridincarbonsäure unter den meisten Bedingungen keine großartige Chemilumineszenz auf. In keinem Fall wird in den Beispielen eine Acridinverbindung mit experimentellen Ergebnissen besprochen.
Trotz der gewaltigen Anstrengungen, die nach dem Stand der Technik unternommen wurden, um die Acridiniumester zu verbessern, hat sich keine dieser Gruppen bzw. Gesellschaften vergegenwärtigt bzw. entdeckt, dass die darin offenbarten aktivierten Acridincarbonsäurederivate nützliche Reagenzien mit Chemilumineszenz darstellen würden.
Ziele und Zusammenfassung der vorliegenden Erfindung
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung besteht in der Schaffung neuer chemischer Verbindungen, mit denen Wasserstoffperoxid oder andere peroxidähnliche Verbindungen aufgespürt und/oder gemessen werden können, insbesondere bei niedrigen Konzentrationen vermittels einer Reaktion auf Chemilumineszenzbasis.
Ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung besteht in der Schaffung chemischer Verbindungen, mit denen vermittels Chemilumineszenz Enzyme aufgespürt und/oder gemessen werden können, die Wasserstoffperoxid oder andere peroxidähnliche Verbindungen direkt erzeugen.
Ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung besteht in der Schaffung chemischer Verbindungen, mit denen vermittels Chemilumineszenz Enzyme aufgespürt und/oder gemessen werden können, die Wasserstoffperoxid oder andere peroxidähnliche Verbindungen indirekt erzeugen.
Ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung besteht in der Schaffung chemischer Verbindungen, mit denen vermittels Chemilumineszenz Enzyme aufgespürt und/oder gemessen werden können, die Wasserstoffperoxid oder andere peroxidähnliche Verbindungen verbrauchen.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht in der Schaffung von analytischen Tests auf Chemilumineszenzbasis, die dafür eingesetzt werden können, Antikörper unter Einsatz irgendeines der Enzyme aufzuspüren und/oder zu messen, die Wasserstoffperoxid oder andere peroxidähnliche Verbindungen erzeugen oder verbrauchen, und zwar direkt oder indirekt.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht in der Schaffung von analytischen Tests auf Chemilumineszenzbasis, die dafür verwendet werden können, Antigene unter Einsatz irgendeines der Enzyme aufzuspüren und/oder zu messen, die Wasserstoffperoxid oder andere peroxidähnliche Verbindungen erzeugen oder verbrauchen, und zwar direkt oder indirekt.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht in der Schaffung von analytischen Tests auf Chemilumineszenzbasis, die dafür verwendet werden können, Proteinliganden unter Einsatz irgendeines der Enzyme aufzuspüren und/oder zu messen, die Wasserstoffperoxid oder andere peroxidähnliche Verbindungen erzeugen oder verbrauchen, und zwar direkt oder indirekt.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht in der Schaffung von analytischen Tests auf Chemilumineszenzbasis, die dafür verwendet werden können, Nukleinsäuren unter Einsatz irgendeines der Enzyme aufzuspüren und/oder zu messen, die Wasserstoffperoxid oder andere peroxidähnliche Verbindungen erzeugen oder verbrauchen, und zwar direkt oder indirekt.
Ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung besteht in der Schaffung von analytischen Tests auf Chemilumineszenzbasis, die dafür verwendet werden können, Polysaccharide unter Einsatz irgendeines der Enzyme aufzuspüren und/oder zu messen, die Wasserstoffperoxid oder andere peroxidähnliche Verbindungen erzeugen oder verbrauchen, und zwar direkt oder indirekt.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht in der Schaffung von analytischen Tests auf Chemilumineszenzbasis, die dafür verwendet werden können, Biopolymere unter Einsatz irgendeines der Enzyme aufzuspüren und/oder zu messen, die Wasserstoffperoxid oder andere peroxidähnliche Verbindungen erzeugen oder verbrauchen, und zwar direkt oder indirekt.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht in der Schaffung von analytischen Tests auf Chemilumineszenzbasis, die dafür verwendet werden können, Moleküle von medizinischer Bedeutung unter Einsatz irgendeines der Enzyme aufzuspüren und/oder zu messen, die Wasserstoffperoxid oder andere peroxidähnliche Verbindungen erzeugen oder verbrauchen, und zwar direkt oder indirekt.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht in der Schaffung von analytischen Tests auf Chemilumineszenzbasis, die dafür verwendet werden können, Moleküle von veterinärmedizinischer Bedeutung unter Einsatz irgendeines der Enzyme aufzuspüren und/oder zu messen, die Wasserstoffperoxid oder andere peroxidähnliche Verbindungen erzeugen oder verbrauchen, und zwar direkt oder indirekt.
Ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung besteht in der Schaffung von analytischen Tests auf Chemilumineszenzbasis, die dafür verwendet werden können, pharmakologisch bedeutsame Moleküle unter Einsatz irgendeines der Enzyme aufzuspüren und/oder zu messen, die Wasserstoffperoxid oder andere peroxidähnliche Verbindungen erzeugen oder verbrauchen, und zwar direkt oder indirekt.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht in der Schaffung von analytischen Tests auf Chemilumineszenzbasis, die dafür verwendet werden können, diagnostisch bedeutsame Moleküle unter Einsatz irgendeines der Enzyme aufzuspüren und/oder zu messen, die Wasserstoffperoxid oder andere peroxidähnliche Verbindungen erzeugen oder verbrauchen, und zwar direkt oder indirekt.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht in der Schaffung von analytischen Tests auf Chemilumineszenzbasis, die dafür verwendet werden können, Moleküle von forensischer Bedeutung unter Einsatz irgendeines der Enzyme aufzuspüren und/oder zu messen, die Wasserstoffperoxid oder andere peroxidähnliche Verbindungen erzeugen oder verbrauchen, und zwar direkt oder indirekt.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht in der Schaffung von Reagenzien, die in Anwesenheit von Wasserstoffperoxid oder anderen peroxidähnlichen Verbindungen entweder ein Aufglühen oder ein Aufblitzen in Form eines Chemilumineszenzsignals erzeugen.
Ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung besteht in der Schaffung von Reagenzien, die in wässrigen Lösungen oder in wässrigem Milieu mit einem Gehalt an einem oder mehreren Detergenzien oder ähnlichen oberflächenaktiven Stoffen einschließlich Reagenzien auf Phasentransferbasis zumindest mäßig stabil sind, jedoch im Stillen in der Anwesenheit von Wasserstoffperoxid oder anderen peroxidähnlichen Verbindungen eine Reaktion bewirken, um so entweder ein Aufglühen oder ein Aufblitzen in Form eines Chemilumineszenzsignals hervorzufufen.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht in der Schaffung von analytischen Tests auf Chemilumineszenzbasis unter Einschluss der Typen, die in den vorstehenden unterschiedlichen Absätzen beschrieben sind, – jedoch ohne Beschränkung darauf, wobei diese Ausführungen dazu verwendet werden können, diagnostisch bedeutsame Moleküle unter Einsatz irgendeiner der Reaktionen aufzuspüren und/oder zu messen (mit organischen oder anorganischen Katalysatoren oder mit einem biologischen Katalysator oder auch ohne Katalysator), die Wasserstoffperoxid oder andere peroxidähnliche Verbindungen erzeugen oder verbrauchen, und zwar direkt oder indirekt.
In Einklang mit der vorliegenden Erfindung hat es sich herausgestellt, dass auf diese Weise stabile, in Wasser lösliche Acridinverbindungen (Derivate der 9-Acridincarbonsäure) geschaffen werden, die mit Peroxiden reagieren und so eine starke und in vielen Fällen eine unerwartet langlebige Aktivität der Chemilumineszenz hervorrufen. Die Stärke des Chemilumineszenzsignals aus dieser Reaktion ist im allgemeinen mit der Konzentration an Peroxid korreliert, wobei das Signal lang genug andauern kann, um so ein zweckmäßiges Auslesen bei den analytischen Tests zu ermöglichen, und zwar unter Einschluss solcher Signale, die in wässrigen System hervorgerufen werden.
Die Verbindungen sind daher für das analytische Austesten des Vorhandenseins und der Konzentration von Peroxiden nützlich. Durch verschiedene Reaktionen kann Peroxid aus Reaktionspartnern erzeugt werden, welche selbst den Analyten von Interesse darstellen. Beispielsweise wird die Glukoseoxidase auf die Anwesenheit von Glukose durch die Produktion von Peroxid antworten. In dem Falle, dass das so produzierte Peroxid mit einer Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung reagiert, ist die daraus resultierende Chemilumineszenz ein Hinweis auf die Anwesenheit und auch Konzentration von Glukose.
Bei einem anderen Aufbau des analytischen Erkennungstests wird ein in einem analytischen Bindungstest verwendetes Reagenz mit einem der Elemente markiert, die gemäß der vorliegenden Beschreibung für die Erzeugung der Chemilumineszenz benötigt werden. Die Anwesenheit des Markierungsmittels wird durch den Zusatz der übrigen Elemente erkannt. Beispielsweise wird ein Enzym, das Wasserstoffperoxid erzeugt, an einen der Bindungspartner in einem analytischen Bindungstest gekoppelt. Nach der Durchführung des analytischen Bindungstests wird das Enzymsubstrat und eine oder mehrere Verbindungen auf Chemilumineszenzbasis, die vorliegend beschrieben sind, zum Erzeugen des Chemilumineszenzsignals hinzugegeben, welches einen Hinweis darauf gibt, dass das markierte Bindungsreagenz abgefangen ist. Die Verbindungen auf Chemilumineszenzbasis können vor dem Start der Enzymreaktion, gleichzeitig oder danach hinzugegeben werden. In einigen Fällen (so zum Beispiel dann, wenn die Bedingungen der Enzymreaktion und der Chemilumineszenzreaktion nicht optimal kompatibel sind) können die Verbindungen auf Chemilumineszenzbasis nach der Enzymreaktion hinzugegeben werden.
Schließlich lassen sich Verbindungen gemäß der Erfindung in einem analytischen Negativtest einsetzen, um die Anwesenheit von Analyten aufzuspüren, welche Peroxide einschließlich Antioxidantien verbrauchen. Beispielsweise lassen sich Enzyme (oder andere Reagenzien), die in der Anwesenheit eines Substrats Wasserstoffperoxid freigeben, in einem analytischen Test für das Substrat einsetzen, und zwar durch die Bestimmung des Verlustes an Chemilumineszenz im Vergleich zu einer Kontrolle, welche das Enzym und eine Verbindung auf Chemilumineszenzbasis mit einschließt. In ähnlicher Weise lässt sich das Reagenz, das Peroxid verbraucht (wie zum Beispiel Peroxidase oder Katalase), an einen der Bindungspartner in einem analytischen Bindungtest ankoppeln. Das Abfangen des Bindungspartners, der mit dem ein Peroxid verbrauchenden Reagenz markiert wurde, wird durch den Zusatz einer Lösung, welche auf Grund der Reaktion des Peroxids und einem der Chemilumineszenzreagenzien der Chemilumineszenz unterliegt, aufgezeigt, wobei auch der Verlust an Chemilumineszenz im Vergleich zu einer Kontrolle, bei welcher die Chemilumineszenzlösung in ein Röhrchen ohne abgefangenen, markierten Bindungspartner gegeben wurde, laufend überwacht wird
Die vorstehende Diskussion ist schwerpunktmäßig auf Wasserstoffperoxid gerichtet, da jener in biologischen Systemen allgemein üblich ist. Andere reaktive Sauerstoffspezies, wie zum Beispiel Peracide, substituierte Peroxide einschließlich Hydroperoxiden (oder Spezies auf Basis von freien Radikalen) können ebenso ein Chemilumineszenzsignal aus den Verbindungen gemäß der Erfindung hervorrufen. Ebenfalls unterliegen unter dem Einsatz der Erfindung Produkte aus der Zersetzung von Peroxid der Erkennung, wie auch Superoxide, Hydroxidradikale, Hydroperoxidradikale und Anionen, die sich von Wasserstoffperoxid ableiten. Reaktionen mit Peraciden und substituierten Peroxiden können ein Zwischenprodukt aus einem substituierten Acridin-Peracid-Derivat [AcrC(=O)OOR] erzeugen, das in einigen Fällen ganz spontan die nicht substituierte aktive Form [AcrC(=O)OOH] oder [AcrC(=O)OO] der Acridinpercarbonsäure erzeugt, wobei jene jedoch in anderen Fällen eine nachfolgende Reaktion zum Entfernen des blockierenden Substituenten "R" erforderlich macht. Diese Situation kann einen erleichterten Einsatz dieser Verbindung zum Hervorrufen eines Signals vom Aufblitztyp ermöglichen, sofern die Reaktion zum Entfernen des blockierenden Rests hinreichend schnell abläuft.
Eine Differenzierung zwischen den folgenden 3 Typen von Acridinverbindungen ist von Bedeutung, nämlich den Acridanen, Acridinen und Acridiniumverbindungen. Eine Verwechslung dieser Typen von Verbindungen ist leicht möglich, weil die Namen nach zweierlei unterschiedlichen Gesichtspunkten verwendet werden: je nach struktureller Form und dem Oxidationszustand. In struktureller Hinsicht weisen die Acridane einen nicht-aromatischen zentralen Ring mit 2 Substituenten in der Stellung 9 auf. Allerdings stellt die Verbindung dann, wenn 1 oder beide dieser Substituenten ein Nukleophil darstellt, das leicht dissoziieren kann (Beispiele schließen das Cyanid, Amine, Thiole und das Phosphat mit ein), eigentlich eine Form von Addukt einer Acridiniumverbindung dar. Acridiniumverbindungen tragen am Ringstickstoffatom eine positive Ladung. Obschon es korrekt ist, auf die protonierte Form der Acridinverbindungen mit keinem anderen Substituenten an dem heterocyclischen Stickstoff in Form der Acridiniumsalze zu verweisen, wird für gewöhnlich davon ausgegangen, dass echte Acridiniumverbindungen an dem heterocyclischen Stickstoff mit einem Rest substituiert sind, der nicht so leicht dissoziiert. Addukte mit Acridiniumverbindungen werden durch den Angriff eines Nukleophilen in der Stellung 9 gebildet. Die Addukte sind mit der Acridiniumform im Gleichgewicht, wobei deren Bildung durch eine Veränderung der Bedingungen leicht umkehrbar ist, wie zum Beispiel durch eine Erniedrigung des pH-Werts, Zugabe eines Reagenzes, das die Konzentration des Nukleophilen erniedrigt oder auch durch Verdünnen der Lösung. In typischer Weise ergeben die Acridiniumverbindungen hellgelbe Lösungen. Durch die Zugabe einer nukleophilen Verbindung in einer ausreichend hohen Konzentration wird das Addukt gebildet, wobei die gelbe Farbe verschwindet; dies ist ein Hinweis darauf, dass die vorherrschende Form als Acridan-Addukt vorliegt. Durch eine Erniedrigung der Konzentration an dem Nukleophilen wird die gelbe Farbe wieder hergestellt. Bei den pH-Werten, bei denen der heterocyclische Stickstoff des Acridins protoniert ist (pH < 5), werden nur wenige gute Nukleophile entprotoniert, so dass Addukte von Acridiniumverbindungen ohne einen kovalenten Substituenten an dem Ringstickstoff ungewöhnlich sind. Das Reduzieren von Acridiniumverbindungen ergibt echte Acridanverbindungen, welche sich von den Adduktformen durch ein Wasserstoffatom in der Stellung 9 unterscheiden lassen.
Dieses Proton ist dissoziierbar, jedoch als Elektrophil (in wässrigen Lösungen in Form von H₃O⁺) und nicht als Nukleophil. In der Tat stellt das Acridan-Anion, das aus der Dissoziierung dieses Protons stammt, ein Nukleophil dar. In einem jeweils wässrigem Milieu dürfte die Dissoziierung des Hydrids aus den Acridanverbindungen kein wahrscheinlicher Vorgang sein. Andere "echte" Acridane dürften Acridane mit 2 nicht-dissoziierenden Gruppen in der Stellung 9 oder mit einem weiteren elektrophilen Substituenten (z.B. Li oder Mg) an Stelle des Protons mit einschließen.
In den beigefügten Zeichnungen stellt
Die 1 das Chemilumineszenzsignal vom Acridincarbonylimidazol dar, und zwar als Funktion der Konzentration an Wasserstoffperoxid in dem angegebenen Glukoseoxidasepuffer. Die unterschiedlichen Eichlinien stehen für verschiedene Zeitpunkte nach dem Zusatz von Wasserstoffperoxid.
Die 2 zeigt die Kinetik der Entwicklung des Chemilumineszenzsignals als Funktion der Zeit nach der Zugabe von Wasserstoffperoxid. Die unterschiedlichen Kurven repräsentieren die Werte aus Proben mit unterschiedlichen Mengen an hinzugefügtem Wasserstoffperoxid.
Die 3 stellt die Ergebnisse aus einem zweiten aufgezeichneten Versuch dar, um die Eichung zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Zugabe unterschiedlicher Mengen an Glukoseoxidase zu dem angezeigten Puffer mit einem Gehalt an 9-Acridincarbonylimidazol aufzuzeigen.
Die 4 zeigt die Kinetik der Entwicklung des Chemilumineszenzsignals mit den angezeigten Mengen an hinzugefügter Glukoseoxidase.
Die 5 stellt die Eichkurven der Chemilumineszenz für einen dritten Versuch dar: Die Erkennung der alkalischen Phosphatase zu den angezeigten Zeitpunkten nach Zugabe der alkalischen Phosphatase zu einem geeigneten Puffer mit einem Gehalt an 9-Acridincarbonylimidazol.
Die 6 zeigt die Kinetik der Signalentwicklung für den Zusatz der angegebenen Mengen an alkalischer Phosphatase.
Die 7–10 stellen die Ergebnisse der Austestung unterschiedlicher Reaktionsgemische für die Chemilumineszenz unter Verwendung verschiedener pH-Systeme dar.
Beschreibung der Erfindung im Detail
Vorliegend wird eine neue Familie von Chemilumineszenzreagenzien offenbart, die für die Erkennung und Messung von Peroxiden und anderen peroxidähnlichen Spezies von Nutzen ist, einschließlich einigen weiteren reaktiven Sauerstoffspezies.
Da zahlreiche Enzyme ein Peroxid direkt erzeugen, oder zusammen mit geeigneten Substraten ein Peroxid indirekt hervorrufen können, befinden sich unter den nützlicheren Anwendungen dieser Chemilumineszenzreagenzien analytische Tests auf Chemilumineszenzbasis für Nukleinsäuren ebenso wie immunologisch-analytische Tests auf Chemilumineszenzbasis, die sich eines dieser Peroxid erzeugenden Enzyme als Markierungsmittel bedienen. Peroxid erzeugende Enzyme schließen direkt, jedoch ohne Beschränkung darauf, (1) Glukoseoxidase, (2) Xanthinoxidase, (3) Cholesteroloxidase und (4) Glycerolphosphatoxidase mit ein. Mit einem geeigneten Substrat ein Peroxid erzeugende Enzyme schließen, jedoch ohne Beschränkung darauf, (1) die alkalische Phosphatase mit BCIP (5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat, auch bekannt als X-P oder X-PO₄), (2) die β-Galaktosidase mit BCI-Galaktosid (oder X-Gal), (3) die β-Glukuronidase mit X-Glukuronid und (4) zahlreiche weitere Esterasen mit dem entsprechenden X-Ester (viele davon sind im Handel erhältlich) mit ein. Analytische Negativtests sind auch im Zusammenhang mit Enzymen möglich, die Peroxid verbrauchen, wie zum Beispiel Peroxidasen und Katalasen. Aktuell sind die alkalische Phosphatase und Meerrettichperoxidase die am häufigsten verwendeten Enzyme in analytischen Immuntests sowie Analysentests mit Nukleinsäuresonden. Knapp hinter diesen beiden populären Enzymen folgen die Glukoseoxidase, β-Galaktosidase, β-Glukuronidase und Xanthinoxidase. Die vorliegend offenbarten Reagenzien lassen sich zur laufenden Überwachung der Aktivität von beliebigen dieser Enzyme einsetzen.
Immunologische Enzymtests und Analysentests mit Nukleinsäuresonden
Die am häufigsten verwendeten Enzyme in analytischen Tests auf Enzymbasis für Antikörper und für Nukleinsäuresonden stellen die Meerrettichperoxidase (HRP), alkalische Phosphatase (AP) sowie die β-Galaktosidase dar [Mayer, Andreas und Neuenhofer, Stephan in Angew. Chem. Int. Ed. Engl., Bd 33, S. 1044–1072 (1994)]. Im Handel sind Konjugate dieser 3 Enzyme mit zum Beispiel Antikörpern, Biotin, Streptavidin oder Avidin. Die beliebteren analytischen Tests auf Chemilumineszenzbasis sind das verstärkte Chemilumineszenzsystem unter Einsatz von Luminol und Peroxidase, das von Kricka et al. entwickelt wurde, verschiedene Luciferasesysteme und die Substrate auf Basis von Dioxetanderivaten, die von Irena Bronstein et alia bei Tropix entwickelt wurden, wobei als Enzyme die alkalische Phosphatase, β-Galaktosidase und β-Glukuronidase mit dem passenden Substrat eingesetzt wer den. Neuere Systeme tauchen auf, wie zum Beispiel der Einsatz der Xanthinoxidase, siehe Tijsen, P. in "Practice and Theory of Enzyme Immunoassays", S. 173 bis 219, (1985), Elsevier Science Publishers B.V. im Hinblick auf die Eigenschaften zahlreicher dieser Enzyme und eine Diskussion der Eigenschaften einer idealen Enzymmarkierung.
Anwendungen von Enzymreagenzien und Vergleiche mit anderen Systemen.
Zusätzlich zum Einsatz als Markierungsmittel durch das Anknüpfen an einen Antikörper, ein Antigen oder eine Sonde wird die HRP oft zum Messen von Peroxid verwendet, das durch andere Enzyme in analytischen Tests auf Cholesterin (unter Verwendung der Cholesteroloxidase), auf Glukose (unter Einsatz von Glukoseoxidase), auf Triglyceride (unter Einsatz von Glycerolphosphatoxidase) und anderen Molekülen von diagnostischer Bedeutsamkeit produziert wird. Die vorliegend offenbarten Reagenzien lassen sich in den Situationen einsetzen, bei denen die Meerrettichperoxidase sowie kolorimetrische, fluorimetrische oder chemiluminogene Substrate zum gegenwärtigen Zeitpunkt eingesetzt werden. Typische kolorimetrische HRP-Substrate schließen das 3,3' ,5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB), 3,3'-Diaminobenzidin und die Trinder-Reagenzien mit ein. Luminol stellt in Anwesenheit von Verstärkern das Substrat der Wahl für die Erkennung von HRP auf Chemilumineszenzbasis dar. Das offenbarte System bietet verschiedene Vorteile gegenüber diesen Peroxidasesystemen:

1. Einzig das Erkennungsreagenz bedarf des Zusatzes an Stelle eines Enzyms (Peroxidase), eines Erkennungsreagenzes (Luminol oder eines anderen Substrats) und Verstärkern.
2. Zum Erkennen von Luminol ist für gewöhnlich ein hoher pH-Wert erforderlich; diese Acridinreagenzien lassen sich über einen weiten pH-Bereich einschließlich saurer pH-Werte einsetzen; dies dürfte einfachere Analysenaufbauten ermöglichen und analytische Tests realisieren, welche früher schwer zu entwickeln waren.
3. Der Mechanismus des Luminolsystems auf Peroxidasebasis ist kompliziert, wobei er selbst nach Jahrzehnten der Untersuchungen noch nicht völlig verstanden wird. Im Gegensatz dazu scheint der Mechanismus des Hervorrufens von Leuchten aus den Acridinreagenzien wesentlich einfacher, was eine Erleichterung dafür ist, dass die Effekte verschiedener Verunreinigungen oder anderer Komponenten der analytischen Tests vorhersehbar sind.
4. Eine der Einschränkungen durch die Peroxidase besteht darin, dass die Aktivität während eines typischen analytischen Tests erstirbt. Dieses Problem wird durch die Ausschaltung der Peroxidase vermieden. Es gibt keinen Hinweis darauf, dass irgendeines der Nebenprodukte in den Konzentrationen, die bei einer typischen Reaktion gebildet werden, mit der weiteren Erkennung oder mit einem wiederholten analytischen Test eine Störung ergeben. Das Chemilumineszenzsignal von zahlreichen vorliegend offenbarten Reagenzien hält stundenlang an und in manchen Fällen sogar tagelang.

Es hat sich herausgestellt, dass die Dioxetane die Hauptverwendung beim Blotting- oder Membrantestaufbau finden, jedoch beim Testaufbau mit Lösungen nicht zweckmäßig sind. Um eine verbesserte Empfindlichkeit zu erzielen, müssen Verstärkungsmittel hinzugegeben werden. Wie die Dioxetane, ergibt eine Vielzahl dieser Acridinreagenzien eine Kinetik des "Aufglühens" (langlebiges Chemilumineszenzsignal), wobei es Verbindungen, wie zum Beispiel Detergenzien und organische Lösungsmittel gibt, welche das Signal für diese Reagenzien zu verstärken vermögen. Testaufbauten auf Lösungsmittelbasis funktionieren mit den offenbarten Reagenzien gut. Die Reagenzien brauchen jedoch nicht für jedes einzelnes Enzym wie die Dioxetane umkonstruiert werden. Je nach aufzuspürendem Enzym kann ein Hilfsreagenz erforderlich sein (zum Beispiel BCIP oder BCI-gal), wobei jedoch viele davon im Handel erhältlich sind. Die offenbarten Reagenzien vervollständigen die Dioxetane, weisen allerdings einen breiteren Anwendungsbereich auf, womit eine umfassendere Vielfalt von Enzymen, wie bereits oben stehend erörtert, aufgespürt werden kann.
Analytische Negativtests
Peroxidase und Katalase
Obschon die Katalase noch kein beliebtes Enzym für analytische Immuntests darstellt, weist sie mehrere Eigenschaften auf, die sie für derartige Anwendungen attraktiv macht, insbesondere ihre hohe Umsatzrate (eine der höchsten, soweit bekannt, nämlich 40 Mio. pro Sekunde), siehe Creighton, Thomas E. in Proteins, S. 407, (1984), W. H. Freeman & Company. Peroxidase und Katalase verbrauchen Peroxid. Ein analytischer Negativtest, der sich einer der Acridinreagenzien bedient, ist ausführbar. Der dynamische Bereich leidet jedoch darunter im Vergleich zu den analytischen Positivtests; allerdings kann durch die Variation des Arbeitsbereiches des analytischen Tests vermittels einer Veränderung der Peroxidasekonzentration, die zum Einrichten des Plateausignalpegels verwendet wird, das Chemilumineszenzsignal so formuliert werden, dass es in Abwesenheit von Peroxidase ein an sich konstantes Signal hervorruft, und zwar auf Grund der Beständigkeit des Chemilumineszenzsignals über einen sehr langen Zeitraum. Die Peroxidase und Katalase lassen sich auch als Reagenzien zur Verminderung des Hintergrundsignals in einem analytischen Positivtest verwenden.
Alkalische Phosphatase und β-Galaktosidase
Die alkalische Phosphatase ist zusätzlich zu dem Umstand, ein äußerst beliebtes Enzym für analytisch-immunologische Tests zu sein, auch mit höchster Sicherheit das beliebteste Enzym für den Einsatz bei analytischen Nukleinsäuresondentests. Eines der beliebtesten Substrate für die alkalische Phosphatase, BCIP (5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat) kann im Anschluss an die Entfernung der Phosphatgruppe (anfänglich zum Erhalt von BCI) mit Sauerstoff unter Erzeugung von Wasserstoffperoxid und einem Indigofarbstoff reagieren [Arakawa, H.; Maeda, M., Tsuji, A. in Analytical Biochemistry, Bd. 199, S. 238–242, (1991)]. Dieses indirekte Verfahren zum Erzeugen von Peroxid dürfte auch bei den anderen Enzymen funktionieren, für welche das BCI (oder andere Indigo- bzw. chinolylähnliche) Substrate einschließlich der β-Galaktosidase und β-Glukuronidase sowie verschiedener anderer Esterasen erhältlich ist. Mit dem passenden BCI-Substrat sind analytische Tests auf beliebige dieser Enzyme mit aktivierten Acridincarbonsäurederivaten möglich. Erst vor kurzem wurde eine neue Klasse von ähnlichen Indolylsubstraten entwickelt (US-A-5 364 854 und US-A-5 364 und US-A -5 364 767). Die "red-PO₄"- und "red-Gal"-Substrate regieren in ähnlicher Weise; sie könnten auch dazu eingesetzt werden, das Peroxid mit dem passenden Enzym zu erzeugen. Offensichtlich dürfte jedes beliebige Substrat für eine Hydrolase, welches als die geschützte Form einer Verbindung betrachtet werden kann, die nach dem Entfernen der Schutzgruppe durch eine enzymatische Aktion leicht Peroxid hervorbringt (für gewöhnlich in Reaktion mit Sauerstoff, jedoch ohne Beschränkung darauf), ein geeignetes Substrat für den Einsatz bei analytischen Tests sein, welche den Gegenstand der vorliegenden Offenbarung darstellen. So sind zum Beispiel Anthrahydrochinone wohlbekannt als handelsübliche Quellen für die Synthese von Wasserstoffperoxid; sie reduzieren unter Erhalt von Wasserstoffperoxid und Anthrachinonen leicht den Sauerstoff. Die Phosphorylierung des Anthrahydrochinons sollte ein geschütztes Derivat ergeben, das ein Substrat für die alkalische Phosphatase wäre. Ein Anthrahydrogalaktosid wiederum wäre geeignet für einen Einsatz mit beispielsweise der β-Galaktosidase.
Verschiedene Enzyme (Oxidasen) sind dafür bekannt, dass sie das Peroxid direkt erzeugen, wobei viele davon im Handel erhältlich sind. Die Xanthinoxidase und die Glukoseoxidase (GOase) stellen zwei Oxidasen dar, die bislang in analytisch-immunologischen Tests benutzt werden [Kricka, L. J. in Clinical Chemistry, Bd. 37, S. 1472–81, (1991)]. Mit der Glukoseoxidase und dem Imidazolid der Acridincarbonsäure kann bei ihrer Anwesenheit während der ganzen Reaktion etwa 10 Attomol (1 Attomol entspricht 10^–18 Mol oder etwa 600 000 Molekülen) Glukoseoxidase aufgespürt werden. Die Glukoseoxidase wird in zahlreichen klinisch-analytischen Tests verwendet, um die Glukose beim Führen von Diabetikern laufend zu überwachen. In Laboratorien, wo verschiedene andere analytische Tests auf Chemilumineszenzbasis an einer Patienten(blut)probe durchgeführt werden, dürften analytische Tests unter Verwendung eines der aktivierten Derivate von 9-Acridincarbonsäure zum Messen des produzierten Wasserstoffperoxids eine realisierbare Alternative zu gegenwärtig verwendeten Verfahren sein. Zwei andere Oxidasen, welche in klinisch relevanten Analysentests zum Erzeugen von Peroxid angewendet werden, stellen die Cholesteroloxidase und die Glycerolphosphatoxidase dar, um Triglyceride zu messen. Während die Systeme auf Meerrettichperoxidasebasis (HRP) zum gegenwärtigen Zeitpunkt die beliebtesten biologisch-analytischen Verfahren sind, welche zum Messen von Wasserstoffperoxid eingesetzt werden, bieten die vorliegend beschriebenen Acridinreagenzien verschiedene Vorteile.
Weitere Anwendungen
Zusätzlich zu dem Umstand, dass die β-Galaktosidase, β-Glukuronidase und die sezernierte alkalische Phosphatase in analytischen Sondentests und immunologisch-analytischen Tests verwendet werden, sind sie auch häufig in molekularbiologischen Untersuchungen als Reportergene in Gebrauch. Die von Tropix, Inc., (Bedford, MA) entwickelten Dioxetane wurden an die laufende Überwachung der Expression dieser Gene vermittels Chemilumineszenz angepasst, siehe Bronstein, Irena; Fortin, John; Stanley, Philip E.; Stewart, Gordon S. A. B. und Kricka, Larry J. in Analytical Biochemisty, Bd. 219, S. 169–181 (1994). Die aktivierten Formen der 9-Acridincarbonsäure dürften ebenfalls an derartige Anwendungen angepasst werden können. Je mehr analytische Tests sich in der "Menüauswahl" befinden, umso leichter ist es, ein Labor dahin zu bringen, eine bestimmte Philosophie zu übernehmen und das Instrumentarium zu erwerben oder zu mieten und die analytischen Tests und Reagenzien zu nutzen. Zusätzlich zu den Oxidasen und enzymatischen Markierungsmitteln, die vorstehend besprochen sind, dürfte es auch möglich sein, die Aktivität der meisten Dehydrogenasen laufend zu überwachen, da Methoden zum Verkoppeln der Dehydrogenaseaktivität mit der Produktion von Wasserstoffperoxid bekannt sind, siehe Kricka, L. J. in Clinical Chemistry, Bd. 37, S. 1472 bis 1481, (1991). Eine weitere potentielle Verwendung dieser Verbindungen stellt das Aufspüren von Wasserstoffperoxid in Zellen dar. Es gibt eine aktuelle Spekulation darüber, dass das Peroxid ein intrazellulärer zweiter Botenstoff ist, siehe Sundaresan, Maitryee, Yu, Zu-Xi, Ferrans, Victor J., Irani, Kaikobad, Finkel, Toren in Science, Bd. 270, S. 296 bis 299, (1995). Einige unter diesen Acridinderivaten können in Zellen eindringen und lassen sich zur laufenden Überwachung der Peroxidspiegel einsetzen. Durch den Einsatz einer unter schiedlichen Abgangsgruppe lassen sich die Eigenschaften des Reagenzes zum Aufspüren so anpassen, dass sie für eine besondere Anwendung geeignet ist. Diese Eigenschaften schließen die Ladung, Löslichkeit und Stabilität im Reaktionsmedium sowie die Kinetik der Verschiebung von Peroxid mit ein.
Geeignete Derivate der Acridincarbonsäure
Die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendeten Reagenzien stellen aktivierte Derivate der Acridincarbonsäure dar, wobei viele davon in wässrigen Lösungen in überraschender Weise stabil sind. Die Reagenzien reagieren auch über einen weiten pH-Bereich mit nukleophilen Peroxidverbindungen und bringen ein Chemilumineszenzsignal hervor, vermutlich dadurch, dass zuerst eine Acridinpercarbonsäure gebildet und im Anschluss daran unter Erhalt von Acridan und unter Aussenden von Licht zersetzt wird. Das Ausmaß der Chemilumineszenz ist zur Peroxidkonzentration über mehrere Größenordnungen direkt proportional.
Die für den Gebrauch gemäß der vorliegenden Erfindung geeigneten Derivate der Acridincarbonsäure lassen sich durch die folgende Formel definieren:
worin
C* ein sp2 – Koordinationskohlenstoffatom bedeutet;
A einen Molekülrest in Form von 9-Acridinyl oder einem substituierten 9-Acridinyl gemäß der unten stehenden Bedeutungen darstellt;
Z einen Molekülrest bedeutet, der kovalent an C* gebunden und aus O, S, N-R¹ und ^⊕N-R¹R² ausgewählt ist, worin R¹ und R² aus den Molekülresten Wasserstoff, Alkyl, Alkoxy, Aryl, Alkylaryl, Heteroaryl oder Heteroalkoxy ausgewählt sind, wobei jeder dieser Reste substituiert oder nicht substituiert sein kann; und
Q aus Abgangsgruppen ausgewählt ist, die unten stehend spezifiziert sind. Vorzugsweise enthalten die Molekülanteile in Z von 1–5 Kohlenstoffatome.
A stellt
dar, worin R₁₂ bis R₁₉ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Wasserstoff, Alkyl, Alkoxy, Aryl, Alkylaryl, Heteroaryl, Heteroalkoxy, Aldehyd, Keto, Amino, Nitro, Halogen, Sulfat, Sulfonyl, Carboxy, Carboxyester, Phosphat oder Phosphoester, wobei jeder dieser Reste substituiert oder nicht substituiert sein kann. Vorzugsweise enthalten die Molekülreste Alkyl und Alkoxy von 1–5 Kohlenstoffatome. Beliebige 2 Reste durchgehend aus R₁₂ bis R₁₉ können Teil einer cyclischen Struktur sein, welche aromatisch oder nicht aromatisch sein kann und eine beliebige kleine Anzahl von Neteroatomen aufweisen kann.
Q stellt unter wässrigen oder gemischt wässrig-organischen Bedingungen eine Abgangsgruppe dar (einschließlich, jedoch ohne Beschränkung auf Detergenslösungen, Gemischen aus polaren Lösungsmitteln, Emulsionen und Mehrfachphasensystemen) mit dem Ziel des Erhalts einer Verbindung, die in Anwesenheit eines Peroxids oder einer peroxidartigen Verbindung Eigenschaften von Chemilumineszenz zeigt, wobei die genannte Gruppe ausgewählt ist aus:
(1) N-verknüpften, ggf. substituierten heterocyclischen Arylmolekülresten, die aus Imidazol, Oxazol, Thiazol, Pyrazol, Pyrimidin, Purin, Chinolin, Isochinolin, Pyrrol, Indol, Pyridin, Tetrazol, Triazol und Carbazol ausgewählt sind;
(2) O-N=C(CN)-CO-R³, worin R³ Alkoxy, substituiertes Alkoxy, Sulfhydryl, Alkyl oder einen substituierten Alkylrest bedeutet, worin der Alkylrest vorzugsweise von 1 bis 5 Kohlenstoffatome aufweist.
(3) O-Ar, worin Ar einen aromatischen oder heteroaromatischen cyclischen Molekülrest dar stellt, der mit mindestens 1 Elektron entziehenden Element substituiert ist oder der im Falle der Nicht-substitution eine Abgangsgruppe bedeutet, die leicht durch Wasserstoffperoxid (H₂O₂) oder ein Anion, das von H₂O₂ abgeleitet ist (wie zum Beispiel ggf. substituiertes Phenyl, ggf. substituiertes Pyridinyl, zum Beispiel Dinitrophenyl oder Chlorpyridinyl), ersetzt werden kann. Andere Beispiele dafür wären im Falle von Ar ein Triazol, Benzotriazol, ein Azabenzotriazol oder Benzotriazinon, oder im Falle von O-Ar N-Oxysuccinimid und Oxyyphthalimid.
worin R⁵ Bestandteil eines einfach cyclischen oder multicyclischen heterocyclischen Molekülrestes ist;
(5) O-N=C(CN)-Ar, worin Ar einen aromatischen oder heteroaromatsichen Molekülrest bedeutet;
worin R⁶, R⁷ and R⁸ unabhängig voneinander aus den Molekülresten Alkyl, Alkoxy, Aryl, Al-kylaryl, Heteroaryl oder Heteroalkoxy ausgewählt sind, wobei jeder dieser Reste substituiert oder nicht substituiert sein kann;
(7) S-R⁹, worin R⁹ einen Molekülrest in Form von Alkyl, Alkoxy, Aryl, Alkylaryl oder Heteroaryl darstellt, wobei jeder dieser Reste ggf. substituiert sein kann;
worin R¹⁰ und R¹¹ unabhängig voneinander aus den Molekülresten Alkyl, Aryl, Alkylaryl oder Heteroaryl ausgewählt sein können, wobei jeder dieser Reste ggf. substituiert sein kann (zum Beispiel mit CF₃).
In der oben stehenden Formel enthält jeder der vorgenannten Alkyl- oder Alkoxymolekülreste vorzugsweise von 1–5 Kohlenstoffatome.
(9) Ethylcyanglyoxylat-2-oxim
(10) 2-Hydroxyimino-2-phenylacetonitril
(11) 3-Hydroxy-1,2,3-benzotriazin-4(3H)-on
(12) 1-Hydroxybenzotriazol
(13) N-Hydroxysuccinimid
(14)6-Chlor-2-pyridinol
(15) 2,4-Dinitrophenol
(16) 4-Hydroxy-3,5-dinitrobenzoesäure
(16) Imidazol
(18) N-α-Acetyl-L-histidin
(19) 1,2,4 – Triazol
(20) 2,3,5,6-Tetrafluor-4-hydroxybenzoesäure
(21) 1-Methylimidazol
(22) 4,5 -Dicvanimidazol
(23) 1H-Tetrazol
Der Bindungsstrich in den oben stehenden Strukturdiagrammen zeigt die angenommene Verknüpfungsstelle des bezeichneten Q an dem sp2-koordinierten Kohlenstoffatom C* an. In einigen Fällen gibt es 2 oder mehr Stellen am Q, welche die Bindung zu diesem C* bilden könnten. Beispiele schlie ßen das (18) N-α-Acetyl-L-Histidin, (19) 1,2,4-Triazol und (23) das 1H-Tetrazol mit ein. Die angegebene Stelle ist ein Ort, der aus chemischen Gründen entweder in sterischem Zusammenhang oder aus Sicht der strukturellen Bestimmungen verwandter Verbindungen gemäß der Beschreibung in der chemischen Literatur zu erwarten ist. In einigen Fällen kann es sich dabei sogar um ein Produktgemisch handeln, das bei der Synthese gebildet wird. In dem Falle, dass eine daran angeschlossene Analyse aufzeigen, dass die Bindung an C* mit einer Stelle nicht dargestellt ist, setzt dies keinen unserer Ansprüche auf diese Verbindung außer Kraft. Die Strukturdiagramme dienen lediglich dem Zwecke der Erläuterung.
Verbindungen, bei denen die Abgangsgruppe (Q) den in den Resten 1, 2, sowie 4 bis 12 und 14 bis 23 angegebenen Bedeutungen wie oben stehend entspricht, stellen neue Verbindungen dar.
Unter den Vorteilen der Erkennungssysteme auf Chemilumineszenzbasis im Vergleich zu den kolorimetrischen und fluorimetrischen Systemen im allgemeinen sind die Empfindlichkeit (eine jeweilige Empfindlichkeit im Subfemtomolbereich für die Zielorte der Spezies ist nicht ungewöhnlich), niedriger Hintergrundpegel) und ein weiter dynamischer Bereich.
Die Acridiniumester werden für gewöhnlich als direkte Markierungsmittel für eine Chemilumineszenz (CL) verwendet, wobei sie kovalent an den Antikörper oder an die Nukleinsäuresonde gebunden werden. Mit Standardreagenzien für das Starten von CL handelt es sich bei der Kinetik um den Typ "Aufblitzen", wobei ein plötzliches kurzes Aufleuchten für gewöhnlich in weniger als 10 Sekunden auftritt. Dies ermöglicht schnelle und äußerst empfindliche analytische Tests, die für Tests auf Acridiniumesterbasis kennzeichnend sind. Für derartige analytische Tests muss das Luminometer einen oder mehrere Injektoren aufweisen, wobei die Injektionskraft auch eine gute Vermischung sicherstellen muss. Dies kann schwierig oder teuer sein für ein Ableseinstrument einer Vielfachnäpfchenplatte. Mit dem vorliegenden System kann die Aufglühkinetik außerhalb des Instruments gestartet werden, ohne dass dafür im geringsten die Ausbeute oder Präzision geopfert würden. Durch das Starten der Chemilumineszenz auf Acridiniumesterbasis bei jeweils niedrigeren pH-Werten (< 10,5) ist eine Aufglühkinetik möglich, wobei jedoch bei der Wahl der Puffer und ihrer Konzentration mit Sorgfalt vorgegangen werden muss. Die Acridiniumester bilden Addukte mit den meisten nukleophilen Verbindungen einschließlich der Basenform der meisten Puffersubstanzen, ausgenommen das Borat. Dies kann den Entwurf der analytischen Tests und die Reproduzierbarkeit kompliziert machen. Ebenso stellt die Aufglühkinetik mit den Acridiniumestern bei diesen niedrigen pH-Werten (< 10,5) kein Plateau dar, wie dies der Fall beim Acridincarbonylimidazol ist, sondern einen rasch aufstrebenden Gipfel mit einem langsamen Abfall, der das Erfassen des zeitlichen Ablaufs kritischer gestaltet. Da weder eine Säure (zur Rückbildung der während eines analytischen Tests gebildeten Acridiniumesteraddukte) noch eine Base (zum Erzielen eines pH-Werts > 10,5) benötigt wird, um mit den vorliegenden Reagenzien die Aussendung von Licht zu starten, sind mit diesem System weniger Risiken verbunden. Darüber hinaus besteht bei einem Direktmarker, der durch seine Erkennung zerstört wird, der einzige Weg zum Überprüfen eines fraglichen Ergebnisses mit Acridiniumestern darin, eine gewisse Probenmenge für einen wiederholten analytischen Test zurückzuhalten. Bei dem vorliegenden System ermöglicht es die Beständigkeit des Signals, unmittelbar jedes beliebige fragliche oder unerwartete Signal nochmals zu überprüfen.
Der jeweilige Beitrag der Probe zum Hintergrundpegel) dürfte wahrscheinlich bei dem niedrigeren pH-Wert zum Starten der Chemilumineszenz geringer sein.
Syntheseverfahren
Die aktivierten Derivate der 9-Acridincarbonsäure werden leicht anhand von Standardverfahren in der organischen Chemie synthetisiert. Beispielsweise lässt sich das Imidazolid synthetisieren durch (1) Auflösen der Carbonsäure in Pyridin und Zusatz von Carbonyldi-imidazol (CDI), oder (2) durch Umwandlung der Carbonsäure in das Carbonylchlorid mit Thionylchlorid, Reinigen des Carbonylchlorids und dessen Reaktion mit Imidazol. Ein anderer Weg ist die Reaktion der Carbonsäure mit einem Carbodi-imid (Dicyclohexylcarbodi-imid – DCC oder Di-isopropylcarbodi-imid – Dipc) und Imidazol. Der Weg über Thionylchlorid ist aus verschiedenen Gründen wahrscheinlich der bequemste. Das Reagenz wird leicht durch Abdampfen unter Kochen entfernt. Das Produkt Carbonylchlorid lässt sich in einem passenden Lösungsmittel auflösen und mit einer oder in getrennten Reaktionen mit verschiedenen Abgangsgruppen zur Reaktion bringen. Der Nachteil dieses Synthesewegs ist darin zu sehen, dass das Carbonylchlorid gegenüber einer Hydrolyse mit Wasser empfindlich ist. In dem Falle, dass das Tetramethyluroniumderivat der gewünschten Abgangsgruppe zu erhalten ist (NHS- und HOBt-Derivate zu erhalten sind) oder zuerst synthetisiert wird, kann es mit der Carbonsäure direkt oder in Form seiner Salze zur Reaktion gebracht werden, um das aktivierte Derivat zu liefern.
In speziellerer Weise lässt sich das 9-Acridincarbonylimidazol durch das folgende Verfahren synthetisieren. In ein Glasfläschchen von 4 ml wurden 93,8 mg (408 μM) 9-Acridincarbonsäure als Hydrat (Aldrich #24,634-4, FW (Formelgewicht) = 223,23; 97 %, effektives MG = 230,134) sowie 2 ml (27,1 mM entsprechend der 66,6-fachen Menge an 9-Acridincarbonsäure) Thionylchlorid (Aldrich #23,046-4, FW = 118,97; 99 %, Dichte = 1,631) hinzugegeben. Das Gemisch wurde bei etwa 85 °C unter Rückfluss gekocht; nach einer kurzen Zeit wurde das Gemisch unter Rückfluss geklärt. Nach 4 Stunden unter Rückfluss wurde der Kondensator entfernt und der Überschuss an Thionylchlorid durch Abdampfen bei 85 °C entfernt, wobei ein gelber, kristalliner Rückstand verblieb. Nach dem Abkühlen wurde das Glasfläschchen mit einer Kappe versehen, mit Parafilm versiegelt, um einen eigenen Schutz vor Feuchtigkeit zu bilden; dann wurde bei –20 °C eingelagert. Nach der Literatur stellt der Rückstand ein Hydrochloridsalz des gewünschten 9-Acridincarbonylchlorids dar.
Unmittelbar vor der Benutzung wurde das Glasfläschchen zum Aufwärmen bei Raumtemperatur stehen gelassen, bevor 4,0 ml Acetonitril (das über Molekularsieben zum Vermindern des Feuchtigkeitsgehaltes aufbewahrt war) hinzugefügt wurden. Eine gewisse Menge des Rückstandes wurde aufgelöst, wobei eine gelbe bis orangefarbene Lösung des Hydrochloridsalzes von 9-Acridincarbonylchlorid auftrat. 1 ml dieser Lösung wurde zu 200 μl 1,0 M Imidazol in CH₃CN hinzugegeben. Der Zusatz des Imidazols machte die Lösung schnell beinahe farblos, was die Neutralisation des Hydrochloridsalzes anzeigte. Die Reaktion wurde zum Fortschreiten bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die nachfolgende Analyse mittels HPLC zeigte in der Tat eine vollständige Umwandlung in das 9-Acridincarbonylimidazolid.
Die Lösung des 9-Acridincarbonylchlorids lässt sich zur Bildung anderer Konjugate, Ester oder Amide einsetzen. Die so erhaltenen Produkte lassen sich dann auf Chemilumineszenz hin austesten, wobei dadurch auch andere potentielle Abgangsgruppen untersucht werden. Beispielsweise können zu 50 μl dieser Lösung (mit einem Gehalt an annäherungsweise 5 μM aktivierten Acridinderivats) eine Lösung der gewünschten Abgangsgruppe, vorzugsweise in Acetonitril oder N,N,Dimethylformamid (DMF) mit einem Gehalt an einem Überschuss an der Abgangsgruppe, vorzugsweise in der 2- bis 20-fachen Menge an Carbonylchlorid (in diesem Beispiel 10 bis 100 μM) hinzugefügt werden. In solchen Fällen, bei denen die Abgangsgruppe in ihrer protonierten Form vorliegt, ist es auch hilfreich, eine genügende Menge einer schwach nukleophilen Base, wie zum Beispiel Pyridin zur Deprotonierung der Abgangsgruppe hinzuzugeben, wobei so das Hydrochloridsalz von Acridincarbonylchlorid (in diesem Beispiel wurden annäherungsweise 125 μM Pyridin eingesetzt) neutralisiert wurde. Sobald die Base hinzugefügt war, wurde die ursprünglich orangefarbene Lösung erst gelb und dann blassgelb (wenn die Lösung der Abgangsgruppe nicht auch gefärbt war); dies zeigte an, dass der Acridinring weniger protoniert war. Wenn die Lösung farblos wird, läuft die Reaktion möglicherweise sogar besser ab; sie kann allerdings auch empfindlicher gegenüber einer Hydrolyse sein, und zwar im Hinblick auf Wasser, das rein zufällig in der Lösung vorhanden sein kann. Der moderate pKa-Wert des Pyridins (wie auch von Imidazol in dem vorstehenden Beispiel) ist dabei hilfreich, den pH-Wert nicht allzu hoch ansteigen zu lassen. Nach der Reaktion über den gewünschten Zeitraum (irgendwo zwischen Minuten bis zu Tagen) lässt sich die Reaktion direkt auf Chemilumineszenz hin austesten, und zwar einfach durch den Zusatz an einer aliquoten Menge zu einer Peroxidlösung in dem gewünschten Medium. Beispielsweise kann eine kleine aliquote Menge einer Reaktionslösung) zu einer Lösung aus 40 μM Wasserstoffperoxid in 50 μM Natriumphosphatpuffer bei einem pH-Wert nahe an 8,2 hinzugefügt werden, wobei die Chemilumineszenz gegen die Zeit gemessen wird; dies stellt eine gute Konzentration an Peroxid für die Zwecke von Austestungen dar, wobei jedoch auch höhere oder niedrigere Konzentrationen verwendet werden können. Es ist dabei von Bedeutung, dass eine Kontrollreaktion ohne den Zusatz einer Abgangsgruppe mit eingeschlossen wird, jedoch unter Hinzufügung einer beliebigen Base, da irgendein in den bei den Reaktionen benutzten Lösungsmitteln vorhandenes Peroxid direkt die Percarbonsäure und so auch die Chemilumineszenz ausbildet. Eine weitere durchzuführende Kontrolle ist der Zusatz einer aliquoten Reaktion(smenge) zu dem Medium ohne Peroxidzusatz, sowie die laufende Überwachung der Chemilumineszenz und der spätere Zusatz von Peroxid. Diese Kontrolle zeigt an, ob das Produkt in dem gewählten Medium über eine jeweils genügend lange, zweckmäßige Zeitdauer stabil ist. Die Länge der Zeitdauer zwischen dem Zusatz des Reagenzes und dem Zusatz des Peroxids dürfte von den Erfordernissen der (jeweiligen) Anwendung abhängig sein, wobei je nach Wunsch Abwandlungen davon erfolgen können. Die Chemilumineszenz, die vor dem Peroxidzusatz beobachtet wird, stellt einen Indikator für die in den Reaktionslösungsmitteln vorhandene Menge an Peroxid sowie/oder die Komponenten des Testmediums dar.
Beispiele
1. Reaktion mit Wasserstoffperoxid
In den 1 und 2 ist die Chemilumineszenz des Imidazolids von 9-Acridincarbonsäure im Anschluss an die Reaktion mit verschiedenen Pegeln der Wasserstoffperoxidkonzentration in einem Milieu aufgezeigt, das sich für die laufende Überwachung der Aktivität von Glukoseoxidase eignet. Sowohl die Kinetik der Signalentwicklung als auch die Variation der Signalintensität als Funktion der Pe roxidkonzentration sind dargestellt. Es wäre anzumerken, dass die nicht auf die Zeit bezogenen Achsen logarithmisch sind und das Signal nach der Peroxidgabe innerhalb von 30 Minuten ein virtuelles Plateau erreicht.
Protokoll für die 1 und 2:
Luminometer: BMG Lumimaster Plattenlesegerät,
Signalrauschen im Bereich von 50 bis 100 RLU pro Sekunde,
In jedes Näpfchen werden 100 μL der Vormischung gegeben. Ablesen der Chemilumineszenz erfolgt mehrmals. Zusatz von 5 μL Wasserstoffperoxid in 10 mM Puffer mit NaPi (Natriumphosphat) (pH = pKa). Ablesen der Chemilumineszenz während mehrerer Stunden.
Jedes Näpfchen enthielt 100 μL der Lösung mit einem Gehalt an 50 mM in NaPO₄ (pH = 8,2); 1,5 % (Gew./Vol) Glukose; 5,0 % (Vol./Vol) DMF; 2,0 % (Vol./Vol) Triton X-100; 210 μM Acl. Die Chemilumineszenz wurde mehrmals vor der Zugabe von 5 μL Wasserstoffperoxid abgelesen. Das Wasserstoffperoxid wurde in den folgenden Mengen (in Picomol) hinzugegeben: (1) 40 000, (2) 4000, (3) 400, (4) 40,0 und (5) 0,00. Die gezeigten Werte stellen jeweils den Durchschnitt aus 2 Näpfchen für die Wasserstoffperoxidproben dar, wobei 8 Näpfchen für leer (Blindwerte) stehen. Die Linien in der 1 bedeuten die Eichung zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Wasserstoffperoxidzugabe.
2. Erkennen der Chemilumineszenz von Glukoseoxidase
In den 3 und 4 ist die Eichung der Glukoseoxidase im Bereich von 5 Größenordnungen aufgezeigt. Es ist anzumerken, dass die Reaktionsbedingungen bei den 3 und 4 dieselben sind wie bei den 1 und 2. Die Erkennungsgrenze für die Glukoseoxidase in diesem Versuch beträgt etwa 10 Attomol in 105 L Reaktion(slösung).
Protokoll für die 3 und 4:
Luminometer: BMG Lumimaster Plattenlesegerät,
Signalrauschen im Bereich von 50 bis 100 RLU pro Sekunde,
In jedes Näpfchen werden 100 μL der Vormischung gegeben. Ablesen der Chemilumineszenz erfolgt mehrmals. Zusatz von 5 μL Wasserstoffperoxid in 10 mM Puffer mit NaPi (pH = pKa). Ablesen der Chemilumineszenz während mehrerer Stunden.
Jedes Näpfchen enthielt 100 μL der Lösung mit einem Gehalt an 50 mM in NaPO₄ (pH = 8,2); 1,5 % (Gew./Vol) Glukose; 5,0 % (Vol./Vol) DMF; 2,0 % (Vol./Vol) Triton X-100; 210 μM Acl. Die Chemilumineszenz wurde mehrmals vor der Zugabe von 5 μL Wasserstoffperoxid abgelesen. Das Wasserstoffperoxid wurde in der jeweils folgenden Menge (in Attomol 10^–18) hinzugegeben: (1) 60 000, (2) 6000, (3) 600, (4) 60,0, (5) 6,00 und (6) 0,00. Die gezeigten Werte stellen jeweils den Durchschnitt aus 2 Näpfchen für die Wasserstoffperoxidproben dar, wobei 8 Näpfchen für leer (Blindwerte) stehen.
3. Erkennen der Chemilumineszenz von alkalischer Phosphatase
In den 5 und 6 sind die Abhängigkeit der Kinetik und Konzentration der Chemilumineszenzsignalerzeugung mit alkalischer Phosphatase und BCIP als Substrat aufgezeigt, welche nach der Spaltung der Phosphatgruppe mit Sauerstoff unter Entstehung von Wasserstoffperoxid reagiert. Hier beträgt die Erkennungsgrenze etwa 8 Attomol an Enzym. Bei der Eichkurve wurden die Ablesungen der Blindwerte in diesem Bereich aufgezeichnet (willkürlich), um aufzuzeigen, dass dieser Enzympegel ein Signal oberhalb des Blindwertsignals ergibt. Der größte Anteil des Blindwertsignals stammt von Peroxidverunreinigungen im Detergenzienbestand. Der Abwärtsschwung in der kinetischen Kurve nach der Enzymzugabe lässt sich an Hand von 2 Faktoren erklären. Das BSA (Rinderserumalbumin) des Enzympuffers reagiert mit diesem Peroxid, wobei die Verdünnung ebenfalls einen schwachen Abfall der Signalintensität bewirkt.
Protokoll für die 5 und 6:
Luminometer: BMG Lumimaster Plattenlesegerät,
Signalrauschen im Bereich von 50 bis 100 RLU pro Sekunde,
In jedes Näpfchen werden 90 μL der Vormischung gegeben. Ablesen der Chemilumineszenz erfolgt mehrmals. Zusatz von 10 μL Enzym oder Pufferlösung in jedes Näpfchen. Ablesen der Chemilumineszenz während mehrerer Stunden. Zugabe von 10 μL Enzym oder Pufferlösung in jedes Näpfchen, um die angegebenen Mengen an Enzym (Puffer) in einer 100 μL Reaktionslösung) zu erhalten. Pufferlösung = 10,0 mM in NaCO₃, 1 % BSA. Der Puffer bildete auch das Verdünnungsmittel für die verschiedenen Enzymverdünnungen.
Jedes Näpfchen enthielt 90 μL der Lösung mit einem Gehalt an 100 mM in NaPO₄ (pH = 8,2); 100 mM NaCl, 50 mM MgCl₂, 0,1 mM ZnCl₂, 20 % (Vol./Vol) DMF; 2,0 % (Vol./Vol) Triton X-100; 211 μM Acl und 1,00 mg/mL BCIP. Das Enzym wurde in den folgenden Mengen (in Attomol) hinzugegeben: (1) 806 000, (2) 80 600, (3) 8060, (4) 806, (5) 80,60, (6) 8,06 und (8) 0,0806. Die gezeigten Werte stellen jeweils den Durchschnitt aus 2 Näpfchen für die Glukoseoxidaseproben dar, wobei 8 Näpfchen für leer (Blindwerte) stehen.
4. Austestungsreaktionen von 9-Acridincarbonylchlorid mit Abgangsgruppenverbindungen
A. Phosphatpuffer, pH 8,2
Es wurden Reaktionen des 9-Acridincarbonylchlorids mit verschiedenen potentiellen Abganggruppen realisiert. Kurz gesagt wurde eine Lösung aus dem Hydrochloridsalz des 9-Acridincarbonylchlorids (1 bis 5 μM) in Acetonitril getrennt zu den Lösungen der auszutestenden Verbindungen (mindestens 18 μM) in Acetonitril hinzugefügt. Die festen Verbindungen waren in Acetonitril, N,N-Dimethylformamid oder einem Gemisch aus diesen beiden Lösungsmitteln. Zu den meisten dieser Reaktionsmedien) wurde Pyridin zum Neutralisieren der Säure aus dem Carbonylchlorid hinzugesetzt, auch um sicherzustellen, dass die ausgetestete Verbindung in der nukleophilen, deprotonierten Form vorhanden war. Die Lösungen wurden zum Fortschreiten der Reaktion mindestens 12 Stunden lang bei Raumtemperatur belassen. Zur Austestung der Produkte aus diesen Reaktionslösungen auf Chemilumineszenz nahe an einem pH-Wert von 8,2 wurden Polypropylenröhrchen mit der äquivalenten Menge von 50 μL 100 mM Natriumphosphat, 40 μL Wasser und 5 μL 800 mM Wasserstoffperoxid bei pH 8,2 vorbereitet. Zum Zeitpunkt Null wurden 5 μL jeder Reaktionslösung) zu einem dieser Röhrchen hinzugefügt und die Chemilumineszenz mehrmals über einen Zeitraum von mehreren Stunden in dem Luminometer Magic Lite Analyzer II gemessen. Es wurden 2 Typen von Kinetik beobachtet: Plateau und Ab fallen. In der 7 sind Beispiele für ein Kinetikplateau dargestellt, wobei in der 8 Beispiele für abfallende Kinetikkurven gezeigt sind. Die Abkürzungen in den Abbildungserklärungen gelten für die Verbindung, die mit dem 9-Acridincarbonylchlorid zur Reaktion gebracht wurde: Das TRIAZOL liegt als 1,2,4-Triazol vor; HOBt stellt das 1-Hydroxybenzotriazol dar; N – AcetyIHis ist das N-α-Acetyl-L-histidin; F4HBA ist die 2,3,5,6-Tetrafluor-4-hydroxybenzoesäure und 1-MeIm stellt das 1-Methylimidazol dar.
Die Abkürzungen in der 8 sind wie folgt: TETRAZOL ist das 1H-Tetrazol; (CN)2Im stellt das 4,5-Dicyanimidazol dar; NHS ist das N-Hydroxysuccinimid und ECGO ist das Ethylcyanglyoxylat-2-oxim. Es ist anzumerken, dass sogar bei den Beispielen für die kinetischen abfallenden Kurven die Chemilumineszenz für mindestens 1 Stunde erkennbar ist. Unter den dargestellten Reaktionen wiesen lediglich die Reaktion mit Imidazol und 1-Methylimidazol kein Pyridin auf. Es wäre auch anzumerken, dass für dieses Austestungsverfahren das ungereinigte rohe Reaktionsgemisch eingesetzt wurde.
B. Acetatpuffer, pH 5,5
Das Austestungsverfahren wurde bei den gleichen Reaktionen wiederholt, wobei 100 mM Natriumacetatpuffer bei einem pH-Wert von 5,5 gegen einen Natriumphosphatpuffer bei einem pH-Wert von 8,2 ausgetauscht wurde. Wiederum wurden sowohl die Kinetik des Plateaus als auch die des Kurvenabfalls beobachtet. In der 9 ist die Kinetik des Plateaus und in der 10 die des Kurvenabfalls dargestellt.

Claims

Verfahren zum Erkennen (bzw. Aufspüren) der Anwesenheit einer Peroxidverbindung oder eines ihrer freien Radikale, wobei das Verfahren das Kontaktieren einer wässrigen oder gemischt wässrig-organischen Lösung der genannten Peroxidverbindung oder eines freien Radikals mit einem Chemilumineszenzmittel und das Erkennen der Chemilumineszenz umfasst, die durch die Reaktion des Chemilumineszenzmittels mit der Peroxidverbindung oder einem ihrer freien Radikale erzeugt wurde, welche jeweils aufgespüRaumtemperatur werden sollen, dadurch gekennzeichnet, dass das Chemilumineszenzmittel eine Verbindung darstellt, welche die Formel:
C* ein sp2 –Koordinationskohlenstoffatom bedeutet; A einen Molekülrest in Form von 9-Acridinyl oder einem substituierten 9-Acridinyl der Formel
darstellt, worin R₁₂ bis R₁₉ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Wasserstoff, Alkyl, Alkoxy, Aryl, Alkylaryl, Heteroaryl, Heteroalkoxy, Aldehyd, Keto, Amino, Nitro, Halogen, Sulfat, Sulfonyl, Carboxy, Carboxyester, Phosphat oder Phosphoester, wobei jeder dieser Reste substituiert oder nicht substituiert sein kann; Z einen Molekülrest bedeutet, der kovalent an C* gebunden und aus O, S, N-R¹ oder ^⊕N-R¹R² ausgewählt ist, wobei R¹ and R² aus den Molekülresten Wasserstoff, Alkyl, Alkoxy, Aryl, Alkylaryl, Heteroaryl oder Heteroalkoxy ausgewählt sind, wobei jeder dieser Reste substituiert oder nicht substituiert sein kann; und Q eine geeignete Abgangsgruppe unter wässrigen oder gemischt wässrig-organischen Bedingungen darstellt, welche eine Verbindung ergibt, die in Anwesenheit eines Peroxids oder einer peroxi dartigen Verbindung Eigenschaften von Chemilumineszenz zeigt, wobei die genannte Gruppe ausgewählt ist aus: (1) N-verknüpften, ggf. substituierten heterocyclischen Arylmolekülresten, die aus Imidazol, Oxazol, Thiazol, Pyrazol, Pyrimidin, Purin, Chinolin, Isochinolin, Pyrrol, Indol, Pyridin, Tetrazol, Triazol und Carbazol ausgewählt sind; (2) O-N=C(CN)-CO-R³, worin R³ Alkoxy, substituiertes Alkoxy, Sulfhydryl, Alkyl oder substituiertes Alkyl bedeutet; (3) O-Ar, worin Ar einen aromatischen oder heteroaromatischen cyclischen Molekülrest darstellt, der mit mindestens 1 Elektron entziehenden Element substituiert ist oder der im Falle der Nicht-substitution eine Abgangsgruppe bedeutet, die leicht durch Wasserstoffperoxid (H₂O₂) oder ein Anion, das von H₂O₂ abgeleitet ist, ersetzt werden kann;
worin R Bestandteil eines einfach cyclischen oder multicyclischen heterocyclischen Molekülrestes ist; (5) O-N=C(CN)-Ar, worin Ar einen aromatischen oder heteroaromatsichen Molekülrest bedeutet;
worin R⁶, R⁷ and R⁸ unabhängig voneinander aus den Molekülresten Alkyl, Alkoxy, Aryl, Al-kylaryl, Heteroaryl oder Heteroalkoxy ausgewählt sind, wobei jeder dieser Reste substituiert oder nicht substituiert sein kann; (7) S-R⁹, worin R⁹ einen Molekülrest in Form von Alkyl, Alkoxy, Aryl, Alkylaryl oder Heteroaryl darstellt, wobei jeder dieser Reste ggf. substituiert sein kann;
worin R¹⁰ und R¹¹ unabhängig voneinander aus den Molekülresten Alkyl, Aryl, Alkylaryl oder Heteroaryl ausgewählt sein können, wobei jeder dieser Reste ggf. substituiert sein kann;
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem Z Sauerstoff bedeutet.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem Q ein N-ver-knüpfter, ggf. substituierter Molekülrest in Form von Imidazol, Oxazol, Thiazol, Pyrazol, Pyrimidin, Purin, Chinolin, Isochinolin, Pyrrol, Indol, Pyridin, Tetrazol, Triazol oder Carbazol ist.
Verfahren nach Anspruch 3, bei dem Q ein N-verknüpftes Imidazol oder substituiertes Imidazol oder ein Pyridin, oder ein substituiertes Pyridin bedeutet.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei Q O-N=C(CN)-CO-R³ darstellt, worin R³ den Rest Alkoxy, substituiertes Alkoxy, Sulfhydryl, Alkyl, oder substituiertes Alkyl darstellt.
Verfahren nach Anspruch 5, bei dem R³ den Rest O-R⁴ bedeutet, worin R⁴ ein ggf. substituiertes Alkyl bedeutet.
Verfahren nach Anspruch 6, bei dem R³ einen Alkylrest bedeutet.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, bei dem Q den Rest O-Ar darstellt, wobei Ar einen aromatischen oder heteroaromatischen cyclischen Molekülrest bedeutet, der mit mindestens 1 Elektron entziehenden Element substituiert ist oder der im Falle der Nichtsubstitution eine Abgangsgruppe darstellt, die leicht durch Wasserstoffperoxid (H₂O₂) oder ein Anion, das von H₂O₂ abgeleitet ist, ersetzt werden kann.
Verfahren nach Anspruch 8, bei dem Ar eine ggf. substituierte Phenylgruppe oder eine ggf. substituierte Pyridinylgruppe darstellt.
Verfahren nach Anspruch 9, bei dem Ar eine Dinitrophenylgruppe oder eine Chlorpyridinylgruppe bedeutet.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, bei dem Q
bedeutet, worin R⁵ der Bestandteil eines einfachen cyclischen oder multicyclischen heterocyclischen Molekülrestes ist.
Verfahren nach Anspruch 8, bei dem Ar ein Triazol ist.
Verfahren nach Anspruch 8, bei dem Ar ein Benzotriazol oder Azabenzotriazol darstellt. 14. Verfahren nach Anspruch 8, bei dem Ar ein Benzotriazinon ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, bei dem Q ein N-Oxysuccin-imid oder eine substituierte N-Oxysuccinimidgruppe, oder ein Oxyphthalimid oder eine substituierte Oxyphthalimidgruppe bedeutet.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem Q O-N=C(CN)-Ar bedeutet, worin Ar einen aromatischen oder heteroaromatischen Molekülrest darstellt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, bei dem Q
bedeutet, worin R⁶, R⁷ und R⁸ unabhängig voneinander aus den Molekülresten Alkyl, Alkoxy, Aryl, Alkylaryl, Heteroaryl oder Heteroalkoxy gewählt sind, welche jeweils substituiert oder nichtsubstituiert sein können.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, bei dem Q den Rest S-R⁹ darstellt, worin R⁹ aus den Molekülresten Alkyl, Alkoxy, Aryl, Alkylaryl oder Heteroaryl ausgewählt ist, welche jeweils ggf. substituiert sein können.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, bei dem Q.
bedeutet, worin R¹⁰ and R¹¹ unabhängig voneinander aus den Molekülresten Alkyl, Aryl, Alkylaryl oder Heteroaryl gewählt sind, welche jeweils ggf. substituiert sein können.
Verfahren nach Anspruch 19, bei dem R¹¹ der Rest CF₃ ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 und 3 bis 19, bei dem Z ein Schwefelatom darstellt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, bei dem Q
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem Q
ist.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem Q
ist.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem Q
ist.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem Q
ist.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem Q
ist.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem Q
ist.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem Q
ist.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem Q
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem Q
ist.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem Q
ist
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem Q
ist.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem Q
ist.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem Q
ist.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem Q
ist.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem das genannte freie Radikal aus einem Produkt des Peroxidabbaus, Superoxid, Hydroxidradikal oder einem Hydroperoxidradikal ausgewählt ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 36, bei dem das genannte Peroxid oder freie Radikal daraus, das aufgespürt werden soll, Wasserstoffperoxid, ein von Wasserstoffperoxid abgeleitetes Anion, ein Peracid oder ein Hydroperoxid darstellt.
Verfahren nach Anspruch 38, bei dem das genannte Wasserstoffperoxid das Produkt einer Reaktion zwischen einem Analyten darstellt, dessen An- oder Abwesenheit bestimmt werden soll, und einem Reaktionspartner, der Wasserstoffperoxid ergibt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 36, bei dem das genannte Verfahren einen Test auf die An- oder Abwesenheit eines Analyten mit umfasst, der die Konzentration des Wasserstoffperoxids herabsetzt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 36, bei dem das genannte Verfahren einen kompetitiven Bindungstest für die An- oder Abwesenheit eines Analyten darstellt, wobei ein Bindungspartner für den Analyten mit einem Enzym, einem Substrat für das Enzym oder dem Chemilumineszenzmittel konjugiert wird.
Verfahren nach Anspruch Claim 41, bei dem der Analyt ein Substrat für eine enzymatische Reaktion darstellt, welche die Konzentration an Wasserstoffperoxid herabsetzt.
Verfahren nach Anspruch 41, bei dem das Verfahren ein kompetitiver Bindungstest ist, und zwar für die Anwesenheit oder Menge des Analyten, wobei der Probenanalyt mit einem kompetitiven Bindungsreagenz bei der Bindung an einen Bindungspartner im Wettbewerb steht, und wobei das kompetitive Bindungsreagenz mit dem Enzym, einem Substrat für das Enzym oder dem Chemilumineszenzmittel konjugiert wird, wodurch steigende Mengen an dem Analyten in einer Abnahme der Menge an dem Konjugat des kompetitiven Bindungsreagenzes resultiert, und auf diese Weise steigende Mengen an dem Analyten die Konzentration an Wasserstoffperoxid erhöhen, der für die Chemilumineszenzreaktion verfügbar ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 36, bei dem das genannte Verfahren mittels Chemilumineszenz Enzyme erkennt und/oder misst, die Wasserstoffperoxid oder peroxidartige Verbindungen direkt oder indirekt erzeugen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 36, bei dem durch das genannte Verfahren mittels Chemilumineszenz Enzyme erkannt und/oder gemessen werden, welche Wasserstoffperoxid oder peroxidartige Verbindungen verbrauchen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 36, bei dem durch das genannte Verfahren Antigene, Proteinliganden, Nukleinsäuren, Polysaccharide, Biopolymere, medizinisch bedeutsame Moleküle, veterinärmedizinisch bedeutsame Moleküle, pharmakologisch bedeutsame Moleküle, diagnostisch bedeutsame Moleküle oder forensisch bedeutsame Moleküle erkannt und/oder gemessen werden, wobei ein Enzym zum Einsatz gelangt, das direkt oder indirekt Wasserstoffperoxid oder peroxidartige Verbindungen erzeugt oder verbraucht.
Verbindung der Formel
worin C* ein sp2 – Koordinationskohlenstoffatom bedeutet; A einen Molekülrest in Form von 9-Acridinyl oder einem substituierten 9-Acridinyl der Formel
darstellt, worin R¹² bis R¹⁹ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Wasserstoff, Alkyl, Alkoxy, Aryl, Alkylaryl, Heteroaryl, Heteroalkoxy, Aldehyd, Keto, Amino, Nitro, Halogen, Sulfat, Sulfonyl, Carboxy, Carboxyester, Phosphat oder Phosphoester, wobei jeder dieser Reste substituiert oder nicht substituiert sein kann; Z einen Molekülrest bedeutet, der kovalent an C* gebunden und aus O, S, N-R¹ oder ^⊕N-R¹R² ausgewählt ist, wobei R¹ and R² aus den Molekülresten Wasserstoff, Alkyl, Alkoxy, Aryl, Alkylayl, Heteroaryl oder Heteroalkoxy ausgewählt sind, wobei jeder dieser Reste substituiert oder nichtsubstituiert sein kann; und Q eine geeignete Abgangsgruppe unter wässrigen oder gemischt wässrig-organischen Bedingungen darstellt, welche eine Verbindung ergibt, die in Anwesenheit eines Peroxids oder einer Verbin
dung mit Peroxidcharakter Eigenschaften von Chemilumineszenz zeigt, wobei die genannte Gruppe ausgewählt ist aus: (a) N-verknüpften, ggf. substituierten heterocyclischen Arylmolekülresten, die aus Imidazol, Oxazol, Thiazol, Pyrazol, Pyrimidin, Purin, Chinolin, Isochinolin, Pyrrol, Indol, Pyridin, Tetrazol, Triazol und Carbazol ausgewählt sind; (b) O-N=C(CN)-CO-R³, worin R³ Alkoxy, substituiertes Alkoxy, Sulfhydryl, Alkyl oder substituiertes Alkyl bedeutet;
worin R⁵ Bestandteil eines einfach cyclischen oder multicyclischen heterocyclischen Molekülrestes ist; (d) O-N=C(CN)-Ar, worin Ar einen aromatischen oder heteroaromatischen Molekülrest bedeutet;
worin R , R and R unabhängig voneinander aus den Molekülresten Alkyl, Alkoxy, Aryl, Al-kylaryl, Heteroaryl oder Heteroalkoxy ausgewählt sind, wobei jeder dieser Reste substituiert oder nichtsubstituiert sein kann; (f) S-R⁹, worin R⁹ einen Molekülrest in Form von Alkyl, Alkoxy, Aryl, Alkylaryl oder Heteroaryl darstellt, wobei jeder dieser Reste ggf. substituiert sein kann;
Verbindung nach Anspruch 47, worin die Verbindung die in einem der Ansprüche 2 bis 7, 11, 16 bis 18, 21 bis 25 und 27 bis 36 angegebenen Definitionen aufweist.
Verwendung einer Verbindung, wie sie in einem der vorstehenden Ansprüche definiert ist, bei der Erkennung der Anwesenheit einer Peroxidverbindung oder eines ihrer freien Radikale mittels Chemiluminesenz in wässriger oder wässrig-organischer Lösung.