DE69533035T2

DE69533035T2 - Verfahren zur Erzeugung einer Chemilumineszenz

Info

Publication number: DE69533035T2
Application number: DE69533035T
Authority: DE
Inventors: Hashem Akhavan-Tafti; Zahra Arghavani; Renuka Desilva
Original assignee: Lumigen Inc
Current assignee: Lumigen Inc
Priority date: 1994-09-02
Filing date: 1995-08-30
Publication date: 2005-04-07
Anticipated expiration: 2015-08-31
Also published as: AU3541195A; JP3828150B2; JPH10505495A; EP0778947A4; AU707682B2; ATE266867T1; EP0778947A1; EP0778947B1; DE69533035D1; CA2197668A1; WO1996007911A1; US5686258A

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
(1) GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur chemischen Erzeugung von Licht (Chemilumineszenz) durch die Wirkung eines Enzyms, das ein Mittel erzeugt, das die Reaktivität eines Peroxidaseenzyms fördert, das wiederum eine Chemilumineszenzreaktion katalysiert. Die Erfindung betrifft auch die Anwendung dieses Verfahrens zum Nachweis des ersteren Enzyms. Außerdem betrifft die Erfindung die Anwendung des Verfahrens zum Nachweis und zur mengenmäßigen Erfassung verschiedener biologischer Moleküle, einschließlich Haptene, Antigene und Antikörper, durch die Immunoassay-Technik, von Proteinen durch Western-Blotting, von DNA und RNA durch Southern- bzw. Northern-Blotting. Das Verfahren kann auch zum Nachweis der DNA bei Anwendungszwecken zur DNA-Sequenzanalyse angewendet werden. Das Verfahren kann auch angewendet werden, um DNA-Mutationen nachzuweisen.
(2)BESCHREIBUNG DES EINSCHLÄGIGEN STANDES DER TECHNIK
(a) Aryl- und Alkylester von 10-Methylacridan-9-carbonsäure unterliegen in dipolaren aprotischen Lösungsmitteln unter stark basischen Bedingungen der Autooxidation zu N-Methylacridon, wodurch eine Chemilumineszenz erzeugt wird (F. McCapra, Acc. Chem. Res., 9(6), 201–8 (1976)). Die Quantenausbeuten der Chemilumineszenz lagen im Bereich von 10^–5 bis 0,1, und es wurde festgestellt, daß sie zunahmen, wenn der pK_s-Wert der austretenden Phenol- oder Alkoholgruppe abnahm. Die Quantenausbeuten in einer wäßrigen Lösung waren aufgrund der konkurrierenden nicht-lumineszierenden Zersetzung eines Zwischenproduktes deutlich geringer. Außerdem verstärkte das kationische oberflächenaktive Mittel CTAB die scheinbare Lichtausbeute um das 130-Fache, indem eine konkurrierende Dunkelreaktion verhindert wurde.
Die gleichzeitig anhängigen Anmeldungen des Anmelders, Seriennummern 08/061,810, am 17. Mai 1993 eingereicht (EP-A-0 625 510), 08/205,093, am 2. März 1994 eingereicht (WO-A-9523971) und 08/228,290, am 15. April 1994 eingereicht (WO-A-9528495) offenbaren chemilumineszierende Acridanverbindungen, die für den Nachweis von Peroxidaseenzymen, wie Meerrettichperoxidase (HRP), vorteilhaft sind. Abgesehen von den vorstehend genannten gleichzeitig anhängigen Anmeldungen des Anmelders gibt es keine Berichte über die Verwendung von Peroxidase oder anderen Enzymen, um Acridane zu oxidieren, wodurch eine Chemilumineszenz erzeugt wird.
(b) Schemata der enzymatischen Amplifizierung
US-Patent 5,306,621 von Kricka beschreibt ein Verfahren zur enzymatischen Erzeugung eines Verstärkers aus einem inaktiven Pro-Verstärker für die von HRP katalysierte chemilumineszierende Oxidation von Luminol. Die Verwendung von Acridanen als chemilumineszierende Substrate wird weder offenbart noch hahegelegt. Die aufgeführte relativ geringe Empfindlichkeit dieses Verfahrens (10^–16 Mol alkalische Phosphatase) ist für viele Anwendungszwecke unzureichend.
Es wurde von einer gekoppelten Enzym-Kaskadenreaktion für den kolorimetrischen Nachweis von alkalischer Phosphatase berichtet (D.M. Obzansky et al., Clin. Chem., 37, 1513–8 (1991)). In diesem Schema erzeugt alkalische Phosphatase eine Substanz, die mit einer inaktiven Form eines zweiten Enzyms reagiert, wobei sie diese in ihren aktiven Zustand überführt. Das zweite Enzym reagiert mit seinem eigenen Substrat, womit H₂O₂ erzeugt wird. Dieses H₂O₂ wird durch ein anschließendes kolorimetrisches Verfahren nachgewiesen. Der Chemilumineszenznachweis wird weder offenbart noch hahegelegt.
Es wurde von einem Western-Blot-Chemilumineszenzverfahren berichtet, bei dem ein Konjugat aus gebundener HRP-Antikörper eine Reaktion katalysiert, die dazu führt, daß auf der Oberfläche der Membran ein Konjugat aus Biotin-Phenol abgeschieden wird. Das gebundene Biotin dient dazu, ein weiteres Konjugat von HRP-Streptavidin einzufangen. Das eingefangene Enzym wurde durch Chemilumineszenz mit Luminol nachgewiesen (D.A. Wigle, N.N. Radakovic, S.L. Venance, S.C. Pang, BioTechniques, 14, 562–3 (1993)). Die Verwendung von Acridanen als chemilumineszierende Substrate wird weder offenbart noch hahegelegt.
Es sind verschiedene Biolumineszenz- und Chemilumineszenzreaktionen bekannt, die mehrere Enzyme beinhalten (A. Tsuji, M. Maeda, H. Arakawa, Anal. Sci., 5, 497–506 (1989)). Bei den meisten dieser Verfahren zeigt eine sorgfältige Betrachtung des Wirkungsmodus, daß im Gegensatz zur vorliegenden Erfindung nur ein Amplifizierungsschritt stattfindet. Alle nachfolgenden Schritte erzeugen nur ein Elektronen-Verstärkersystem für die Durchführung der abschließenden Lumineszenzreaktion. Nur das kolorimetrische Verfahren, das auf der Erzeugung von NADP⁺ durch alkalische Phosphatase basiert, ist wirklich ein duales Amplifizierungsverfahren (A. Johannsson, C.J. Stanley, C.H. Self, Clin. Chim. Acta, 148, 119–24 (1985)). Es ist auch ein Fluorimetrieassay bekannt, der auf dem gleichen Prinzip basiert (D.B. Cook, C.H. Self Clin. Chem., 39, 965–71 (1993)). In keinem Dokument wird die Anwendung der Chemilumineszenz beschrieben oder nahegelegt.
FIGUREN
1 ist eine graphische Darstellung der Linearität des Nachweises von alkalischer Phosphatase (AP) unter Verwendung einer erfindungsgemäßen Reagenzzusammensetzung. Eine Lösung, die den geschützten HRP-Verstärker 2-Naphthylphosphat enthielt, wurde mit den angegebenen Mengen von AP inkubiert. Nach dem ersten Reaktionszeitraum von 30 Minuten bei 37 °C wurden 50 μl eines erfindungsgemäßen Reagenz zugesetzt, das bei Raumtemperatur gehalten worden war. Das Reagenz enthielt 0,1 mM 2',3',6'-Trifluorphenyl-3-methoxy-10-methylacridan-9-carboxylat, 1,2 mM Harnstoffperoxid, 2 mM EDTA, 0,05 % TWEEN 20 und 40 pMol HRP. Die Lichtempfindlichkeit wurde bei 15 Minuten gemessen. Der Begriff S–B steht für das Chemilumineszenzsignal (S) in RLE in Gegenwart von AP, das bezüglich der Hintergrund-Chemilumineszenz (B) ohne AP korrigiert ist. Auf diese Weise konnte 0,1 aMol (1 × 10^–19 Mol) AP nachgewiesen werden.
2 ist eine graphische Darstellung der Linearität des Nachweises von β-Galactosidase (β-Gal) unter Verwendung einer erfindungsgemäßen Reagenzzusammensetzung. Eine Lösung, die den geschützten HRP-Verstärker p-Phenylphenolgalactosid in 0,005 m Natriumphosphat-Puffer, pH = 7,0, enthielt, wurde bei Raumtemperatur mit den angegebenen Mengen von β-Gal inkubiert. Nach einem ersten Reaktionszeitraum von 30 wurden 50 μl des Nachweisreagenz zugesetzt, das bei Raumtemperatur gehalten worden war. Das Reagenz enthielt 0,1 mM 2',3',6'-Trifluorphenyl-3-methoxy-10-methylacridan-9-carboxylat, 1,2 mM Harnstoffperoxid, 2 mM EDTA, 0,05 % TWEEN 20 und 40 pMol HRP in 0,01 m Tris-Puffer, pH = 8,0. Die Lichtintensität wurde bei 15 Minuten gemessen. Auf diese Weise konnten 0,56 aMol (5,6 × 10^–19 Mol) β-Gal nachgewiesen werden.
AUFGABEN
Es ist folglich eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zum Nachweis von hydrolytischen Enzymen und Konjugaten davon anzugeben, das geschützte Verstärker verwendet, um durch die Wirkung eines Peroxidaseenzyms eine Chemilumineszenz zu erzeugen. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren zum Nachweis von biologischen Materialien und Verbindungen anzugeben, das geschützte Verstärker verwendet, um durch die Wirkung eines Peroxidaseenzyms eine Chemilumineszenz zu erzeugen. Der Nachweis kann die Form von Immunoassays in einer Lösung, des Nachweises von Proteinen in Western-Blots und von DNA in Southern-Blots oder Anwendungszwecken bei der DNA-Sequenzanalyse und anderen DNA-Hybridisierungsassays, wie der Nachweis von Mutationen, haben.
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSBEISPIELE
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erzeugung einer Chemilumineszenz, das das Umsetzen einer geschützten Verstärkerverbindung mit einem ersten Enzym, wodurch eine Verstärkersubstanz erzeugt wird, die die Reaktion einer Acridanverbindung, vorzugsweise eines N-Alkylacridancarbonsäure-Derivats, und eines Peroxids mit einem Peroxidaseenzym erleichtert, wodurch die Chemilumineszenz erzeugt wird. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel ist das erste Enzym ein hydrolytisches Enzym. Bevorzugte Acridanverbindungen haben die Formel:
worin R aus Alkyl-, Heteroalkyl- und Aralkylgruppen ausgewählt ist, R₁ bis R₈ unabhängig voneinander aus Gruppen ausgewählt sind, die die Erzeugung von Licht erlauben, und Y eine austretende Gruppe ist, die die Erzeugung von Licht aus dem Acridan durch Reaktion mit einem Peroxid und einer Peroxidase erlaubt.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Anwendung dieses Verfahrens zum Nachweis eines Analyts bei einem Assayverfahren durch eine Chemilumineszenzreaktion, wobei der Analyt direkt oder indirekt an das erste Enzym gebunden ist oder gebunden werden kann und wobei die Menge des erzeugten Lichtes mit der Menge des Analyts in Zusammenhang steht. Das Verfahren kann zum Beispiel zum Nachweis von Haptenen, Antigenen und Antikörpern mit der Immunoassaytechnik, von Proteinen durch Western-Blotting, von DNA und RNA durch Southern- bzw. Northern-Blotting angewendet werden. Das Verfahren kann auch zum Nachweis der DNA bei Anwendungszwecken zur DNA-Sequenzanalyse angewendet werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Anwendung dieses Verfahrens zum Nachweis eines hydrolytischen Enzyms oder eines Konjugats eines hydrolytischen Enzyms mit einem biologischen Molekül.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine Verbesserung eines Verfahrens zum Nachweis eines Analyts bei einem Assayverfahren durch eine Chemilumineszenzreaktion, wobei die Verbesserung folgendes aufweist: Bereitstellen einer Reagenzzusammensetzung, die in Gegenwart eines hydrolytischen Enzyms Licht erzeugt. Die Reagenzzusammensetzung weist eine wäßrige Lösung auf, die ein N-Alkylacridancarbonsäure-Derivat der Formel:
eine Peroxidverbindung, ein Peroxidaseenzym, eine geschützte Verstärkersubstanz, die eine Phenolverbindung sein kann, die die Reaktivität der Peroxidase verstärkt; ein oberflächenaktives Mittel, das die Lichterzeugung verstärkt, und einen Chelatbildner enthält, der verhindert, daß die Peroxidverbindung das N-Alkylacridancarbonsäure-Derivat vor der Reaktion mit der Peroxidase aktiviert.
Die vorliegende Erfindung beinhaltet ein Verfahren zum Erzeugen eines Verstärkers oder eines zyklisierenden Mittels durch die Wirkung eines ersten Enzyms, das die Wirkung eines Peroxidaseenzyms verstärkt oder amplifiziert, das wiederum eine Chemilumineszenzreaktion katalysiert. Damit erlaubt die Erfindung aufgrund dieser beiden Signalverstärkungsprozesse die Anwendung dieses Verfahrens zum Nachweis des ersten Enzyms mit einer sehr hohen Empfindlichkeit. Die Intensität des entstehenden Lichtes liefert ein direktes Merkmal der Menge des markierten organischen oder biologischen Moleküls.
Die vorliegende Erfindung zieht auch Kits zum Nachweis irgendeiner Substanz in Form eines Analyts, eines hydrolytischen Enzyms oder eines Konjugats eines hydrolytischen Enzyms bei einem Assayverfahren durch eine Chemilumineszenzreaktion in Betracht. Für die Durchführung der vorliegenden Erfindung nach einem ihrer Ausführungsbeispiele vorteilhafte Kits umfassen in einem oder mehreren Behältern:

a) eine Acridanverbindung, wie sie vorstehend beschrieben ist;
b) ein Peroxid, wenn der nachzuweisende Analyt kein Peroxid oder kein Peroxid erzeugendes Reagenz ist;
c) ein Peroxidaseenzym, wenn der nachzuweisende Analyt nicht Peroxidase oder kein Konjugat von Peroxidase mit dem Analyt oder kein Konjugat von Peroxidase mit einem Reagenz ist, das mit dem Analyt ein spezifisches Bindungspaar bildet;
d) eine geschützte Verstärkerverbindung; und gegebenenfalls
e) ein oberflächenaktives Mittel und einen Chelatbildner.

Die Komponenten des Kits können getrennt oder in verschiedenen Kombinationen gepackt werden, wie es angesichts der verschiedenen Methoden der Durchführung der erfindungsgemäßen Reaktionen ersichtlich ist, die nachstehend ausführlich beschrieben sind.
Das erfindungsgemäße Reaktionsverfahren kann nach einigen verschiedenen Methoden durchgeführt werden. Bei einer Methode oder einem Ausführungsbeispiel wird das hydrolytische Enzym bei einer Temperatur von etwa Raumtemperatur bis mindestens etwa 40 °C getrennt mit einer wäßrigen Lösung des geschützten Verstärkers umgesetzt. Die Lösung kann Mittel, wie Metallionen, enthalten, die für die Enzymaktivität vorteilhaft sind. Nach einem geeigneten Reaktions- oder Inkubationszeitraum wird diese Lösung oder ein Teil davon mit einer zweiten Lösung gemischt, die die Acridanverbindung, das Peroxid und die Peroxidase enthält. Die zweite Lösung kann gegebenenfalls weitere Mittel enthalten, dazu gehören oberflächenaktive Mittel und Metallchelatbildner. In einem anderen Ausführungsbeispiel ist die Acridanverbindung nicht in der zweiten Lösung enthalten sondern wird der abschließenden Reaktionslösung getrennt zugesetzt. In einem weiteren Ausführungsbeispiel sind der geschützte Verstärker, das Acridan, das Peroxid, die Peroxidase und das oberflächenaktive Mittel zusammen in einer wäßrigen Lösung für die direkte Reaktion mit dem hydrolytischen Enzym enthalten.
Schema 1
Das Entfernen der Gruppe X aus einem geschützten Verstärker durch ein Enzym erzeugt einen Katalysator oder Verstärker, wie Phenol, der die Fähigkeit eines Peroxidaseenzyms, insbesondere von Meerrettichperoxidase, die Oxidation eines N-Alkylacridancarbonsäure-Derivats mit Wasserstoffperoxid zu katalysieren, deutlich verbessert, wodurch Licht erzeugt wird. Eine bevorzugte Klasse von geschützten Verstärkern umfaßt Verbindungen der Formel Ar-OX, worin Ar eine aromatische Gruppe ist und X eine austretende Gruppe ist, die von einem hydrolytischen Enzym abgespalten werden kann, wodurch eine Phenolverbindung Ar-OH oder deren Anion erzeugt wird. Einige Beispiele von maskierten oder geschützten Phenolen sind im Schema 1 mit bestimmten austretenden Gruppen X dargestellt. Zu Beispielen spezifischer Enzyme, die mit geeignet geschützten Phenolen reagieren können, indem die Gruppe X abgespalten und das Phenol freigesetzt wird, gehören saure Phosphatase, alkalische Phosphatase, Phosphodiesterase, Phospholipase, β-D-Galactosidase, β-Glucuronidase, β-Glucosidase, Lactase, Carboxylesterase und Acetylcholinesterase. Zu möglichen Gruppen O-X gehören irgendeine austretende chemische Gruppe, die unter den Anwendungsbedingungen stabil ist und durch die Reaktion mit einem Enzym abgespalten werden kann, dazu gehören ohne Einschränkung Alkyl- oder Arylcarboxylester, ein Salz einer anorganischen Oxysäure, einschließlich Phosphat und Sulfat, und Sauerstoffpyranosid, einschließlich β-D-Galactosid, β-Glucuronid und β-Glucosid und dergleichen, wie es dem Fachmann klar ist. Phenolverbindungen, die bekanntlich andere Peroxidasereaktionen verstärken, sind in G. Thorpe, L. Kricka in Bioluminescence and Chemiluminescence, New Perspektives, J. Scholmerich, et al., Herausg., S. 199–208 (1987), M. Ii, H. Yoshida, Y. Aramaki, H. Masuya, T. Hada, M. Terada, M. Hatanaka, Y. Ichimori, Biochem. Biophys. Res. Comm., 193(2), 540–5 (1993) und in US-Patenten Nr. 5,171,668 und 5,206,149 beschrieben. Bevorzugte Verstärker werden aus der Gruppe ausgewählt, die aus substituierten Phenolen, unsubstituierten und substituierten Naphtholen besteht, dazu gehören p-Phenylphenol, p-Iodphenol, p-Bromphenol, p-Hydroxyzimtsäure, 2-Naphthol und 6-Brom-2-naphthol, sie sind jedoch nicht darauf begrenzt.
In der Praxis der vorliegenden Erfindung sind zahlreiche Acridanverbindungen vorteilhaft. Die gleichzeitig anhängigen Anmeldungen des Anmelders, Seriennummern 08/061,810, am 17. Mai 1993 eingereicht (EP-A-0 625 510), 08/205,093, am 2. März 1994 eingereicht (WO-A-9523971) und 08/228,290, am 15. April 1994 eingereicht (WO-A-9528495) offenbaren verschiedene chemilumineszierende Acridanverbindungen, einschließlich Arylester (Y = OAr), insbesondere halogensubstituierte Phenylester, Thioester (Y = SAr), insbesondere Phenylthioester und halogensubstituierte Phenylthioester, und Arylsulfonimide (Y = NR₉SO₂Ar). Acridane mit einer Ringsubstitution, d.h. bei denen ein oder mehrere R₁ bis R₈ ein Atom oder eine Gruppe sind, das bzw. die von Wasserstoff verschieden ist, liegen im Umfang der Verbindungen, die bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung Verwendung finden.
Zu Chelatbildnern, die bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung vorteilhaft sein können, gehören zum Beispiel mehrzählige Kationenkomplexbildner, wie EDTA, EGTA und deren Salze, sowie auch andere Reagenzien, wie es auf diesem Fachgebiet bekannt ist. Es ist selbstverständlich, daß von Metall abhängige Enzyme, wie alkalische Phosphatase, von Chelatbildnern nachteilig beeinflußt werden. Bei der Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Nachweis dieser Enzyme sollte die Verwendung von Chelatbildnern in den gleichen Lösungen wie denen des Enzyms vermieden werden. Zu oberflächenaktiven Mitteln, die im erfindungsgemäßen Verfahren vorteilhaft sind, gehören anionische oberflächenaktive Mittel, wie Natriumdodecylsulfat (SDS), kationische oberflächenaktive Mittel, wie oberflächenaktive Mittel aus quaternärem Ammonium, oder vorzugsweise ein nichtionisches oberflächenaktives Mittel, wie polyoxyethylenierte Alkylphenole, polyoxyethylenierte Alkohole, polyoxyethylenierte Ether, polyoxyethylenierte Sorbitolester und dergleichen.
Ein wichtiger Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung besteht darin, daß eine Zusammensetzung, die ein N-Alkylacridancarbonsäure-Derivat, ein Peroxid, ein Peroxidaseenzym und einen geschützten Verstärker enthält, ohne das hydrolytische Enzym kein starkes Chemilumineszenz-Hintergrundsignal erzeugt. Die Reaktion mit dem hydrolytischen Enzym zur Erzeugung eines freien Verstärkers führt zu einer Chemilumineszenz mit einer längeren Dauer im Vergleich mit dem Luminol-System, das in US-Patent 5,306,621 offenbart ist. Eine längere Dauer vereinfacht die Messung, indem die erforderliche exakte zeitliche Steuerung der Reaktion entfällt und die Empfindlichkeit des Nachweises verbessert wird, wenn Nachweisverfahren auf Filmbasis angewendet werden.
Weitere Vorteile der N-Alkylacridancarbonsäure-Derivate und Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung, im Vergleich mit herkömmlichen Verfahren sind die höhere Empfindlichkeit und der dynamische Nachweisbereich des ersten Enzyms. Vergleichsversuche zeigen eine zumindest 100-fache Verringerung der Nachweisgrenze von alkalischer Phosphatase, wenn eine erfindungsgemäße Reagenzzusammensetzung verwendet wird, im Vergleich mit einem Reagenz, das Luminol enthält.
Diese und weitere Vorteile werden angesichts der Beispiele deutlich.
BEISPIELE
Beispiel 1: Synthese von p-Iodphenylphosphat, Dinatriumsalz
Pyridin (0,395 g, 5 mMol) wurde in 15 ml CH₂Cl₂ gelöst. Die Lösung wurde auf etwa 5°C abgekühlt und gerührt, wobei langsam POCl₃ (2,30 g, 15 mMol) zugesetzt wurde. Danach wurde innerhalb eines Zeitraums von 5 Minuten tropfenweise eine Lösung von p-Iodphenol (1,10 g, 5 mMol) in 10 ml CH₂Cl₂ zugesetzt. Das Kühlbad wurde entfernt, und es wurde 30 Minuten weitergerührt. Die Lösungsmittel wurden bei reduziertem Druck entfernt, und es wurden 15 ml CH₃CN zugesetzt, um die Feststoffe zu lösen. Eine Lösung von NaOH (0,80 g, 20 mMol) in 1 ml Wasser wurde unter Rühren tropfenweise zugesetzt, wodurch es zu einem weißen Niederschlag kam.
Nachdem das Ganze 10 Minuten stehengelassen worden war, wurden die Feststoffe aufgefangen und mit einem großen Volumen von CH₃CN und danach mit Aceton gewaschen und luftgetrocknet.
Beispiel 2: Synthese von p-Phenylphenolphosphat, Dinatriumsalz
Pyridin (0,395 g, 5 mMol) wurde in 15 ml CH₂Cl₂ gelöst. Die Lösung wurde auf etwa 5°C abgekühlt und gerührt, wobei langsam POCl₃ (2,30 g, 15 mMol) zugesetzt wurde. Danach wurde innerhalb eines Zeitraums von 5 Minuten tropfenweise eine Lösung von p-Phenylphenol (0,85 g, 5 mMol) in 10 ml CH₂Cl₂ zugesetzt. Das Kühlbad wurde entfernt, und es wurde 30 Minuten weitergerührt. Die Lösungsmittel wurden bei reduziertem Druck entfernt, und es wurden 15 ml CH₃CN zugesetzt, um die Feststoffe zu lösen. Eine Lösung von NaOH (0,80 g, 20 mMol) in 1 ml Wasser wurde unter Rühren tropfenweise zugegeben, wodurch es zu einem weißen Niederschlag kam. Nachdem das Ganze 10 Minuten stehengelassen worden war, wurden die Feststoffe aufgefangen und mit einem großen Volumen von CH₃CN und danach mit Aceton gewaschen und luftgetrocknet.
Beispiel 3: Synthese von p-Iodphenyl-β-D-galactopyranosid
p-Iodphenol (1 g, 4,5 mMol), in 3 ml Aceton gelöst, wurde mit 3 ml 5 m KOH (wäßr.) behandelt. Der gerührten Lösung wurde Acetobromgalactose (5,6 g, 13,6 mMol) in Portionen zugegeben. Zuerst wurde eine 4,1 g Portion mit 1 ml 5 m KOH in Abständen von zwei bis drei Stunden zugesetzt, 0,5 g Portionen von Acetobromgalactose wurden zusammen mit 0,5 ml 5 m KOH zugesetzt, bis insgesamt 5,6 g (3 Äqu.) zugegeben worden waren. Es wurde über Nacht weitergerührt. Wasser wurde zugegeben, und die Lösung wurde mit Methylenchlorid und danach mit Ethylacetat extrahiert. Die gemischten organischen Schichten wurden verdampft, und das rohe Produkt wurde durch Säulenchromatographie über Siliciumdioxid gereinigt, wobei 30 % Ethylacetat in Hexan verwendet wurde, um den nicht umgesetzten Zucker zu entfernen. Das Entfernen der Lösungsmittel aus den geeigneten Fraktionen erzeugte den Tetraacetatester der gewünschten Verbindung. Die Hydrolyse zur gewünschten Verbindung wurde erreicht, indem eine 300 mg Portion in 2 ml Aceton gelöst und über Nacht mit 650 μl 10 m KOH gerührt wurde. Das Aceton wurde verdampft, und es wurden 30 ml Wasser zugesetzt. Ammoniumchlorid wurde zugegeben, um den pH-Wert neutral zu machen, und die entstandene Lösung wurde mit Ethylacetat extrahiert. Die Ethylacetatlösung wurde mit MgSO₄ getrocknet und bei reduziertem Druck konzentriert, wodurch ein weißer Feststoff erhalten wurde, der durch Säulenchromatographie weiter gereinigt wurde, wobei 50 % Methanol/Ethylacetat verwendet wurden;
¹H NMR (CD₃OD) δ 3,28–3,89 (m, 6H), 4,81 (d, 1H), 6,89–7,57 (m, 4H).
Beispiel 4: Synthese von p-Phenylphenol-β-D-galactopyranosid
Zu einer Lösung von p-Phenylphenol (250 mg, 1,46 mMol) in Aceton wurde 1 ml 10 n KOH, gefolgt von Acetobromgalactose (1,8 g, 4,37 mMol) gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die TLC-Analyse zeigte, daß kein Ausgangsmaterial zurückgeblieben war. 10 n KOH (1 ml) wurde zugegeben, um die Desacetylierung zu komplettieren, und die Lösung wurde erneut über Nacht gerührt. Nach dem Verdampfen des Acetons wurde das rohe Material in Ethylacetat aufgenommen und mit 5 × 150 ml Wasser gewaschen. Ethylacetat wurde mit MgSO₄ getrocknet und bei reduziertem Druck konzentriert, wodurch ein weißer Feststoff erhalten wurde, der durch Säulenchromatographie weiter gereinigt wurde, wobei 30 % Methanol/Ethylacetat verwendet wurden;
¹H NMR (CD₃OD) δ 3,56–3,91 (m, 6H), 4,89 (m, 1H), 7,15–7,57 (m, 9H).
Beispiel 5: Synthese von p-Phenylphenolacetat
Pyridin (2 ml) wurde in 15 ml CH₂Cl₂ gelöst. Die Lösung wurde auf etwa 5 °C abgekühlt und gerührt, wobei langsam Acetylchlorid (393 mg, 5 mMol) zugesetzt wurde. Danach wurde innerhalb eines Zeitraums von 15 Minuten tropfenweise eine Suspension von p-Phenylphenol (0,85 g, 5 mMol) in 20 ml CH₂Cl₂ zugegeben. Das Kühlbad wurde entfernt, und es wurde 30 Minuten weitergerührt. Die Lösungsmittel wurden bei reduziertem Druck entfernt, und es wurden 50 ml Ethylacetat zugegeben, um die Feststoffe zu lösen. Die Lösung wurde mit Wasser extrahiert, über Na₂SO₄ getrocknet und bei reduziertem Druck verdampft.
Beispiel 6: Synthese der Peroxidase-Substratverbindung
2',3',6'-Trifluorphenyl-3-methoxy-10-methylacridan-9-carboxylat

(a) Die Verbindung 3-Methoxyacridin-3-carbonsäure wurde nach einem in der Literatur beschriebenen Verfahren hergestellt (G. Zomer, J. Stavenuiter, R. Van Den Berg, E. Jansen, in Luminescence Techniques in Chemical and Biochemical Analysis, W. Baeyens, D. De Keukeleire, K. Korkidis, Herausg., Dekker, New York, 505–521, (1991)). Das Kondensieren des handelsüblichen 3-Methoxydiphenylamins (Aldrich) mit Oxalylchlorid ergab ein Gemisch der 3-Methoxy- und der 1-Methoxyacridincarbonsäure, die als ein Gemisch in die Ester überführt worden waren.
(b) Ein Gemisch der 3-Methoxy- und der 1-Methoxyacridincarbonsäur (1,5 g) wurde in 10 ml SOCl₂ suspendiert, und das Reaktionsgemisch wurde 3 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Das Lösungsmittel wurde bei reduziertem Druck entfernt, wodurch ein gelber Feststoff erhalten wurde, der unter Argon in Methylenchlorid (CH₂Cl₂) und Pyridin (0,7 ml) gelöst wurde. Eine Lösung von 2,3,6-Trifluorphenol (0,878 g) in CH₂Cl₂ wurde tropfenweise zugegeben. Die Lösung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, danach mit weiterem CH₂Cl₂ (100 ml) verdünnt und mit Wasser gewaschen (3 × 50 ml). Die organische Schicht wurde über Na₂SO₄ getrocknet und konzentriert, wodurch ein Gemisch der isomeren Ester erhalten wurde. Das Produkt 2',3',6'-Trifluorphenyl-3-methoxyacridin-9-carboxylat wurde durch Chromatographie über Siliciumdioxid mit 25 % Ethylacetat/Hexan abgetrennt; ¹H NMR (CDCl₃) δ 4,043 (s, 3H), 7,08–8,25 (m, 9H).
(c) Die vorstehende Verbindung (0,24 g) wurde unter Argon in Methylenchlorid (3 ml) gelöst, und es wurde Methyltrifluormethansulfonat (0,1 ml, 1,4 Äqu.) zugesetzt. Die Lösung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, wodurch ein dicker gelber Niederschlag erhalten wurde. Dieser Niederschlag wurde filtriert, mit Ether gewaschen und getrocknet, wodurch das reine 2',3',6'-Trifluorphenyl-3-methoxyacridin-9-carboxylattrifluormethansulfonat als gelbe Kristalle erhalten wurde; ¹H NMR (DMSO-d₆) δ 4,288 (s, 3H), 4,837 (s, 3H), 7,64–8,89 (m, 9H).
(d) Der Acridiniumester (35 mg) wurde in absolutem Ethanol (15 ml) suspendiert, und die Lösung wurde 10 Minuten unter Rückfluß erhitzt, wodurch eine klare Lösung erhalten wurde. Der Lösung wurde das überschüssige Ammoniumchlorid (4 g) in Portionen zugesetzt, darauf folgte Zink (4 g), was zur sofortigen Entfärbung der Lösung führte. Die farblose Lösung wurde 30 Minuten unter Rückfluß erhitzt, abgekühlt, filtriert, und der Niederschlag wurde mit Ethanol gewaschen (3 × 20 ml). Die Lösung wurde konzentriert, wodurch ein weißlicher Feststoff erhalten wurde, der erneut in Methylenchlorid gelöst und mit Wasser gewaschen wurde (3 × 50 ml). Das nach dem Verdampfen des Methylenchlorids erhaltene rohe Material wurde über Kieselgel chromatographiert (Ethylacetat/Hexan), wodurch das reine 2',3',6'- Trifluorphenyl-3-methoxy-10-methylacridan-9-carboxylat als weißer Feststoff erhalten wurde; ¹H NMR (CDCl₃) δ 3,422 (s, 3H), 3,847 (s, 3H), 5,25 (s, 1H), 6,54–7,39 (m, 9H).

Beispiel 7: Synthese der Peroxidase-Substratverbindung
2',3',6'-Trifluorphenylacridin-9-carboxylat

(a) Acridin-9-carbonsäure (Aldrich, 0,5 g) wurde in einem Überschuß von Thionylchlorid (5 ml) suspendiert, und das Reaktionsgemisch wurde 3 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Das Lösungsmittel wurde bei reduziertem Druck entfernt, wodurch ein gelber Feststoff erhalten wurde, der unter Argon in Methylenchlorid und Pyridin (0,53 g) gelöst wurde. Eine Lösung des Phenols (0,365 g) in Methylenchlorid wurde tropfenweise zugegeben. Die Lösung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, danach mit weiterem Methylenchlorid (100 ml) verdünnt und mit Wasser gewaschen (3 × 50 ml). Die organische Schicht wurde über Na₂SO₄ getrocknet und konzentriert, wodurch das Produkt erhalten wurde. Der gelbe Feststoff wurde außerdem mit Ether gewaschen, um das überschüssige Phenol zu entfernen (Ausbeute 82 %); ¹H NMR (CDCl₃) δ 7,08–7,28 (m, 2H), 7,71–8,42 (m, 8H).
(b) 2',3',6'-Trifluorphenyl-10-methylacridinium-9-carboxylattrifluormethansulfonat. Der Ester (0,30 g) wurde dann unter Argon in Methylenchlorid (25 ml) suspendiert, und es wurde Methyltrifluormethansulfonat (0,95 ml) zugesetzt. Die Lösung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, wodurch ein dicker gelber Niederschlag erhalten wurde. Dieser Niederschlag wurde filtriert, mit Ether gewaschen und getrocknet, wodurch das Produkt als gelbe Kristalle erhalten wurde. ¹H NMR (Aceton-d₆) δ 5,29 (s, 3H), 7,50–7,67 (m, 2H), 8,26–9,14 (m, 8H).
(c) 2',3',6'-Trifluorphenyl-10-methylacridan-9-carboxylat. Der Acridiniumester (0,20 g) wurde in 10 ml Eisessig gelöst, wodurch eine gelbe Lösung erhalten wurde, und es wurde Zink zugesetzt (2,5 g), was zum sofortigen Entfärben der Lösung führte. Nach 5-minütigem Rühren bei Raumtemperatur zeigte die TLC des Reaktionsgemischs ein nichtpolares Material. Die Essigsäure wurde dekantiert, und der Feststoff wurde mit Methylenchlorid gewaschen. Die gemischten organischen Lösungen wurden verdampft, wodurch ein roher Feststoff erhalten wurde, der erneut in Methylenchlorid gelöst wurde und mit zwei oder drei 50 ml Portionen Wasser gewaschen wurde. Das nach dem Verdampfen des Methylenchlorids erhaltene rohe Material wurde über Kieselgel chromatographiert (20 bis 30 % Ethylacetat/Hexan), wodurch das reine Produkt als weißer Feststoff erhalten wurde; ¹H NMR (CDCl₃) δ 3,44 (s, 3H), 5,29 (s, 1H), 6,76–6,84 (m, 2H), 6,99–7,39 (m, 8H).

Beispiel 8: Nachweis von alkalischer Phosphatase auf einer Membran
Es wurde ein Reagenz für den Chemilumineszenznachweis von Konjugaten von alkalischer Phosphatase auf Membranen in einem Schritt hergestellt. Das Reagenz, das für das chemilumineszierende Western-Blotting verwendet werden kann, enthielt den geschützten HRP-Verstärker 2-Naphthylphosphat (Aldrich) mit 1 mM, 0,05 mM 2',3',6'-Trifluorphenyl-10-methylacridan-9-carboxylat, 2,5 mM Harnstoffperoxid, 0,5 % TWEEN 20 und 40 pMol HRP in 0,01 m Tris-Puffer, pH = 8,8. In einem Western-Blot wird ein mit alkalischer Phosphatase markierter Antikörper, der auf einer Nitrocellulose- oder PVDF-Membran immobilisiert ist, nachgewiesen, indem die Membran mit dem Nachweisreagenz benetzt wird, in eine Halterung (Transparenzfilm) gegeben wird, und die Membran für einen Zeitraum im Bereich von 5 s bis 30 min dem Röntgenfilm ausgesetzt und danach entwickelt wird.
Beispiel 9: Linearität des Nachweises von alkalischer Phosphatase
Die Linearität des Nachweises von alkalischer Phosphatase (AP) wurde mit der erfindungsgemäßen Reagenzzusammensetzung bestimmt. Eine Lösung (50 μl), die den geschützten HRP-Verstärker 2-Naphthylphosphat (1 mM) in 0,01 m Tris-Puffer, pH = 8,8, enthielt, wurde mit AP inkubiert, die 3,7 × 10^–15 bis 1,1 × 10^–19 Mol Enzym enthielt. Nach einem anfänglichen Reaktionszeitraum von 30 Minuten bei 37 °C wurden jeder dieser Lösungen 50 μl eines erfindungsgemäßen Reagenz zugesetzt. Das Reagenz enthielt 0,1 mM 2',3',6'-Trifluorphenyl-3-methoxy-10-methylacridan-9-carboxylat, 1,2 mM Harnstoffperoxid, 2 mM EDTA, 0,05 % TWEEN 20 und 40 pMol HRP in 0,01 m Tris-Puffer, pH = 8,0. Die Lichtintensität wurde für 15 Minuten kontinuierlich überwacht. Die aufgeführten Werte wurden bei 15 Minuten gemessen. 1 zeigt die hervorragende Empfindlichkeit, die erhalten werden kann; es konnte 0,11 aMol (1,1 × 10^–19 Mol) AP nachgewiesen werden. In der Graphik steht der Begriff S–B für das Chemilumineszenzsignal (S) in RLE in Gegenwart von AP, das in bezug auf die Hintergrund-Chemilumineszenz (B) ohne AP korrigiert ist. Die Ergebnisse sind der Durchschnittswert von drei Proben.
Beispiel 10: Linearität des Nachweises von β-Galactosidase
Die Linearität des Nachweises von β-Galactosidase (β-Gal) wurde unter Verwendung einer erfindungsgemäßen Reagenzzusammensetzung bestimmt. Eine Lösung (50 μl), die den geschützten HRP-Verstärker p-Phenylphenolgalactosid (0,15 mM) in 0,005 m Natriumphosphat-Puffer, pH = 7,0, enthielt, wurde mit β-Gal inkubiert, die 5,6 × 10^–15 bis 1,9 × 10^–19 Mol Enzym enthielt. Nach einem anfänglichen Reaktionszeitraum von 30 Minuten bei 25 °C wurden jeder dieser Lösungen 50 μl des Reagenz von Beispiel 9 zugesetzt. 2 zeigt die hervorragende Empfindlichkeit, die erhalten werden kann; es konnten 0,56 aMol (5,6 × 10^–19 Mol) β-Galactosidase nachgewiesen werden. Die Ergebnisse sind der Durchschnittswert von drei Proben.
Die vorangegangene Beschreibung soll die vorliegende Erfindung nur erläutern, und die vorliegende Erfindung soll nur durch die zugehörigen Ansprüchen eingeschränkt werden.

Claims

Verfahren zur Erzeugung einer Chemilumineszenz, das das Umsetzen eines hydrolytischen Enzyms mit einem geschützten Verstärker, einer Peroxidverbindung, einem Peroxidaseenzym und einer Acridanverbindung, die bei Reaktion mit der Peroxidverbindung und dem Peroxidaseenzym Licht erzeugt, umfasst, wobei die geschützte Verstärkerverbindung die Formel ArOX besitzt, worin X eine austretende Gruppe ist, die mit dem hydrolytischen Enzym reagieren kann, und Ar aus der Gruppe bestehend aus substituierten Phenyl-, Naphthyl- und substituierten Naphthylgruppen ausgewählt ist, wobei das hydrolytische Enzym mit der geschützten Verstärkerverbindung reagiert, um X zu entfernen und so die Menge des durch die Acridanverbindung erzeugten Lichts im Vergleich zu der ohne die Verstärkerverbindung erzeugten Menge zu erhöhen.
Verfahren nach Anspruch 1, das weiterhin Folgendes umfasst: (a) Umsetzen des hydrolytischen Enzyms mit dem geschützten Verstärker in einer wässrigen Lösung über einen ersten Zeitraum; und anschließendes (b) Mischen der das hydrolytische Enzym und den geschützten Verstärker enthaltenden Lösung mit einer Lösung, die ein Acridan, eine Peroxidverbindung und eine Peroxidase umfasst, zur Erzeugung von Licht.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Acridan die Formel:
besitzt, worin R aus Alkyl-, Heteroalkyl- und Aralkylgruppen ausgewählt ist, R₁ und R₈ unabhängig voneinander aus Gruppen ausgewählt sind, die die Erzeugung von Licht erlauben, und Y eine austretende Gruppe ist, die die Erzeugung von Licht aus dem Acridan durch Reaktion mit dem Peroxid und der Peroxidase erlaubt und aus der Gruppe bestehend aus einer Aryloxygruppe, einer Arylthiogruppe und einer Sulfonimidgruppe ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 3, bei dem die Gruppe Y eine Aryloxygruppe ist.
Verfahren nach Anspruch 4, bei dem die Aryloxygruppe eine halogensubstituierte Phenoxygruppe ist.
Verfahren nach Anspruch 3, bei dem mindestens einer der Reste R₁ bis R₈ eine C₁-C₂₀-Alkoxygruppe ist und R eine C₁-C₂₀-Alkylgruppe ist.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Acridan 2',3',6'-Trifluorphenyl-3-methoxy-10-methylacridan-9-carboxylat ist.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das hydrolytische Enzym an ein Glied eines spezifischen Bindungspaares gebunden ist, das aus der Gruppe bestehend aus Haptenen, Antigenen, Antikörpern, Proteinen, Oligonucleotiden und Nukleinsäuren ausgewählt ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8 für den Nachweis der Gegenwart oder Menge eines ein hydrolytisches Enzym umfassenden Analyts, bei dem das hydrolytische Enzym, das wahlweise an ein Glied eines spezifischen Bindungspaares, das aus der Gruppe bestehend aus Haptenen, Antigenen, Antikörpern, Proteinen, Oligonucleotiden und Nukleinsäuren ausgewählt ist, gebunden ist, mit dem geschützten Verstärker umgesetzt wird, wobei X aus dem Verstärker entfernt wird, sowie mit dem Peroxid, der Peroxidase und dem Acridan umgesetzt wird, um aus dem Acridan Licht zu erzeugen; bei diesem Verfahren steht die Menge des erzeugten Lichtes mit der Gegenwart einer Menge des Analyts in Zusammenhang.
Kit für den Nachweis der Gegenwart oder Menge eines Analyts in einem Assayverfahren mittels einer Chemilumineszenzreaktion, das die Bereitstellung folgender Substanzen in einem oder mehreren Behältern umfasst: (a) einer Acridanverbindung; (b) einer Peroxidverbindung; (c) einer geschützten Verstärkerverbindung der Formel ArOX, worin X eine austretende Gruppe ist, die mit einem hydrolytischen Enzym reagieren kann, und Ar aus der Gruppe bestehend aus substituierten Phenyl-, Naphthyl- und substituierten Naphthylgruppen ausgewählt ist; (d) einem Peroxidaseenzym; und (e) wahlweise einem hydrolytischen Enzym, das entweder einzeln vorliegt oder an ein Glied eines spezifischen Bindungspaares gebunden ist.
Kit nach Anspruch 10, bei dem das Acridan die Formel:
besitzt, worin R aus Alkyl-, Heteroalkyl- und Aralkylgruppen ausgewählt ist, R₁ und R₈ unabhängig voneinander aus Gruppen ausgewählt sind, die die Erzeugung von Licht erlauben, und Y eine austretende Gruppe ist, die die Erzeugung von Licht aus dem Acridan durch Reaktion mit dem Peroxid und der Peroxidase erlaubt und aus der Gruppe bestehend aus einer Aryloxygruppe, einer Arylthiogruppe und einer Sulfonimidgruppe ausgewählt ist.
Kit nach Anspruch 11, bei dem die Gruppe Y eine Aryloxygruppe ist.
Kit nach Anspruch 12, bei dem die Aryloxygruppe eine halogensubstituierte Phenoxygruppe ist.
Kit nach Anspruch 11, bei dem mindestens einer der Reste R₁ bis R₈ eine C₁-C₂₀-Alkoxygruppe ist und R eine C₁-C₂₀-Alkylgruppe ist.
Kit nach Anspruch 11, bei dem das Acridan 2',3',6'-Trifluorphenyl-3-methoxy-10-methylacridan-9-carboxylat ist.
Kit nach einem der Ansprüche 11 bis 15, das eine Reagenszusammensetzung umfasst, die den geschützten Verstärker, die Peroxidverbindung, das Peroxidaseenzym und die Acridanverbindung in einer wässrigen Lösung umfasst.
Zusammensetzung, die in Gegenwart eines hydrolytischen Enzyms, das folgende Substanzen in einer wässrigen Lösung umfasst: (a) eine Peroxidverbindung; (b) ein Peroxidaseenzym; (c) eine Acridanverbindung, die bei Reaktion mit der Peroxidverbindung und dem Peroxidaseenzym Licht erzeugt; und (d) eine geschützte Verstärkerverbindung mit der Formel ArOX, worin X eine austretende Gruppe ist, die mit dem hydrolytischen Enzym reagieren kann, und Ar aus der Gruppe bestehend aus substituierten Phenyl-, Naphthyl- und substituierten Naphthylgruppen ausgewählt ist, wobei das hydrolytische Enzym mit der geschützten Verstärkerverbindung reagiert, um X zu entfernen und so die Menge des durch die Acridanverbindung erzeugten Lichts im Vergleich zu der ohne die Verstärkerverbindung erzeugten Menge zu erhöhen, Licht erzeugt.
Zusammensetzung nach Anspruch 17, bei der das Acridan die Formel:
besitzt, worin R aus Alkyl-, Heteroalkyl- und Aralkylgruppen ausgewählt ist, R₁ und R₈ unabhängig voneinander aus Gruppen ausgewählt sind, die die Erzeugung von Licht erlauben, und Y eine austretende Gruppe ist, die die Erzeugung von Licht aus dem Acridan durch Reaktion mit dem Peroxid und der Peroxidase erlaubt und aus der Gruppe bestehend aus einer Aryloxygruppe, einer Arylthiogruppe und einer Sulfonimidgruppe ausgewählt ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 18, bei der die Gruppe Y eine Aryloxygruppe ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 19, bei der die Aryloxygruppe eine halogensubstituierte Phenoxygruppe ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 17, bei der mindestens einer der Reste R₁ bis R₈ eine C₁-C₂₀-Alkoxygruppe ist und R eine C₁-C₂₀-Alkylgruppe ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 17, bei der das Acridan 2',3',6'-Trifluorphenyl-3-methoxy-10-methylacridan-9-carboxylat ist.