DE69128181T2

DE69128181T2 - Enzymtests

Info

Publication number: DE69128181T2
Application number: DE69128181T
Authority: DE
Inventors: Hidetoshi Arakawa; Masako Maeda; Akio Tsuji
Original assignee: Sankyo Co Ltd
Current assignee: Sankyo Co Ltd
Priority date: 1990-09-12
Filing date: 1991-09-12
Publication date: 1998-05-28
Anticipated expiration: 2011-09-13
Also published as: ATE160177T1; CA2051144A1; DK0476930T3; HK1003840A1; EP0476930B1; JPH04356200A; GR3025741T3; DE69128181D1; EP0476930A1; ES2110979T3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Nachweisverfahren, insbesondere Irnmunoassays, bei denen ein 3-O-Indoxylester in die entsprechende Indigo- Verbindung über die Einwirkung eines geeigneten Enzyms umgewandelt wird.
Viele Arten von Nachweistechniken sind auf dem biologischen Gebiet bekannt, wobei häufig weitere Fortschritte erzielt werden. Ein kürzlich entwickeltes Gebiet von besonderem Interesse ist das der Enzymimmunoassays (EIA).
Enzymimmunoassays haben das Potential einer überaus wirkungsvollen Technik. Insbesondere ist alles, was für den Erfolg erforderlich ist, daß ein Antikörper erzeugt werden kann, der spezifisch für die Substanz, die nachgewiesen werden soll, ist. Ein Enzym kann dann an den Antikörper gebunden werden, und der resultierende markierte Antikörper kann zum Nachweis einer Probe ausgesetzt werden. Sobald der gebundene Antikörper von ungebundenem oder freiem Antikörper getrennt worden ist, kann der gebundene Antikörper durch die Aktivität seines Enzyms gegenüber einem geeigneten Substrat, das nach der Trennung der beiden Phasen eingeführt wird, nachgewiesen werden.
Ein Weg, um die Trennung gebunden/frei (B/F) zu erzielen, besteht darin, einen Antikörper für die Substanz, die nachgewiesen werden soll, bereitzustellen, der an eine feste Phase (zum Beispiel eine Flüssigchromatographiesäule) gebunden ist, die Probe einzuführen, die ungebundene Probe auszuwaschen und dann markierten Antikörper einzuführen. Da die Substanz für den Nachweis dann von zwei Antikörpern gebunden ist, ist dies als »Sandwich-Assay« bekannt.
Bei einer alternativen Technik ist ein zweiter Antikörper, der wiederum an einen geeigneten Marker, wie ein Enzym, gebunden ist, spezifisch für den ersten Antikörper, der an die Substanz bindet, die nachgewiesen werden soll. Diese Technik ist also weniger direkt, da ein Antikörper, der an die substanz, die nachgewiesen werden soll, gebunden ist, anstelle der Substanz selbst nachgewiesen wird.
Ein Problem bei dieser Art von Technik ist die Notwendigkeit, ein geeignetes Enzym bereitzustellen, das auf eine solche Weise nachgewiesen werden kann, daß definitiv, d.h. zweifelsfrei, feststeht, daß die Ergebnisse qualitativ oder quantitativ das Substrat, das bestimmt werden soll, anzeigen.
Da Enzyme, wie bekannt ist, natürlich auftreten, ist es, wenn ein Bioassay durchgeführt wird, selbstverständlich möglich, daß es eine geringe, jedoch signifikante Menge an Enzym oder dessen Substrat in der Probe, die untersucht wird, gibt, die das Ergebnis verzerrt.
Eine der empfindlichsten Assaytechniken, die gegenwärtig auf den Gebiet der Enzymimmunoassays verfügbar ist, beinhaltet die Verwendung von Enzymen, die die Bildung von Wasserstoffperoxid in der Gegenwart des Substrates katalysieren. Zum Beispiel kann das Enzym Glucoseoxidase mit einem geeigneten Antikörper für einen Assay verknüpft werden, und das Substrat&sub1; in diesem Fall Glucose, kann eingeführt werden, sobald der Antikörper von der Probe getrennt worden ist. Das Vorhandensein von Wasserstoffperoxid wird anschließend bestimmt, um die Menge der Zielsubstanz nachzuweisen. Auch bei dieser Assaytechnik bestehen jedoch die vorstehend beschriebenen Nachteile.
Eine vorteilhaftere Art von Assay kann in zweckmäßiger Weise ein System umfassen, bei dem das Enzym imstande ist, auf ein synthetisches Substrat einzuwirken, das normalerweise nicht in einer biologischen Probe auftritt. Ein Beispiel für diese Art von Assay umfaßt den Fall, bei dem Bakterien auf Komplementierung untersucht werden. Ein geeignetes Ziel für einen Komplementierungsassay nutzt die α-Komplementierung des lac- Operons. Die Einführung eines Gens, das mit der codierenden Information für die ersten 146 Aminosäüren des β-Galactosidasegens (lac Z) markiert ist, kann eine Lac&supmin;-Mutante in eine Lac&spplus;-Mutante umwandeln. Eine einfache Assaytechnik besteht dann darin, X-gal (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid) dem Substrat, auf dem die Kolonien gezüchtet werden, einzuverleiben. Lac&spplus;-komplementierte Kolonien können dann ohne weiteres gezahlt werden, da sie eine blaue Farbe durch die Einwirkung der rekonstituierten β-Galactosidase auf X-gal entwickeln.
Die Ergebnisse derartiger Assays sind im allgemeinen entweder positiv oder negativ, wobei jedoch Ergebnisse, die dazwischen liegen, durch das Vorhandensein einer blassen Färbung festgestellt werden können. Es besteht jedenfalls in keinem Fall die Notwendigkeit, das Ergebnis colorimetrisch zu bestimmen.
Eine ähnliche Art von Assay ist auch auf dem Gebiet der Enzymhistochemie bekannt, um das Vorhandensein von alkalischer Phosphatase in Gewebeproben festzustellen. Das Substrat BCIP (5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat) entwickelt, wenn darauf das Enzym alkalische Phosphatase einwirkt, eine blaue Farbe innerhalb einer erheblichen Zeitspanne, da BCIP zuerst hydrolysiert und dann unter Bildung von 5,5'-Dibrom-4,4'-dichlorindigo dimerisiert wird. Geeignete Verfahren zur Bestimmung von Enzymen, die sich im Innern von Gewebezellen befinden, nach dieser Technik werden in Enzyme Histochemistry: Asakura Pub. Inc. (1982) beschrieben.
Das Problem bei dieser Form von Assay besteht darin, daß er sehr langsam und nicht besonders empfindlich ist.
Die Verwendung von BCIP allein ist nun durch einen ähnlichen Assay abgelöst worden, der jedoch in Gegenwart von Nitroblau-tetrazoliurn (NBT) oder Tetranitroblau-tetrazolium (TNBT) durchgeführt wird. Dieser Assay ist erheblich schneller und führt zu einer blauen Farbe durch die Bildung eines Formazans, das colorimetrisch nachgewiesen werden kann. Es hat sich erwiesen, daß dieser Assay erheblich empfindlicher ist, und seine Anwendung ist auf Fälle ausgedehnt worden, bei denen ein größerer Grad an Genauigkeit erforderlich ist.
Verschiedene Techniken zur Anwendung des BCIP/NBT-Assays sind beschrieben worden. Zum Beispiel wird in Molecular doning [A Laboratory Manual, zweite Auflage, Sambrook, Frisch und Maniatis, (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press) ein Immunoassay beschrieben, bei dem alkalische Phosphatase (ALP) mit einem Antikörper verknüpft wird, um die Proteinexpression in transformierten Zellen nachzuweisen, wobei die Bestimmung unter Verwendung von BCIP/NBT erfolgt.
Gemäß einer alternativen Technik stellt Dupont einen Reagenzsatz bereit, der ALP in kovalenter Verknüpfung mit einem Thymidinrest in einem Abschnitt von cDNA umfaßt, der bei Standardhybridisierungsassays verwendet werden kann. Das Vorhandensein von ALP wird dann wie üblich unter Verwendung von BCIP/NBT festgestellt, wobei eine Farbe gebildet wird.
Ein Hauptproblem, das auch bei der BCIP/NBT-Technik auftritt, besteht jedoch darin, daß es nicht möglich ist, sehr geringe Konzentrationen an Substanzen nachzuweisen, wie sie möglicherweise in einzelnen Zellen gefunden werden. Dies hat seinen Grund hauptsächlich darin, daß anstelle der Messung der Aktivität eines Enzyms auf der molekularen Ebene die Colorimetrie angewandt werden muß, um das gebildete Formazan nachzuweisen, was eine erhebliche Bildung an Farbstoff erfordert.
Es gibt auch weitere Assaytechniken, wie den Radioimmunoassay (RIA). Wie die Colorimetrie, so wird auch der RIA überwiegend zum Nachweis des Vorhandenseins oder der Abwesenheit einer gegebenen Substanz verwendet, wobei er im besten Fall qualitative anstelle von quantitativen Ergebnissen bietet. Außerdem ist die Verwendung der erforderlichen Radioisotope mit Problemen verbunden, vor allem bei Handhabung und Entsorgung.
In Proceedings of the Royal Society (Series B, 148, 506-519 (1958)] wird ein Mechanismus für die Bildung einer Indigo-Verbindung aus 3-O-Indoxylderivaten beschrieben. Im wesentlichen wird ein Indoxylester durch die Einwirkung eines geeigneten Katalysators, wie eines Metallsalzes oder Enzyms, hydrolysiert. Das resultierende Indoxyl unterliegt dann einer Reaktion mit atmosphärischem Sauerstoff, wobei die entsprechende Indigo- Verbindung gebildet wird. Es wurde festgestellt, daß Wasserstoffperoxid als Ergebnis dieser Reaktion gebildet wurde, daß jedoch die erhaltene Menge uneinheitlich war. Der Bericht schloß, daß die Bildung von Wasserstoffperoxid eine Schwierigkeit darstellt (Seite 519, Zeilen 1 ff). Der Nachweis der hydrolytischen Enzyme durch die Bildung der Indigo-Verbindung aus 3-O-Indoxylderivaten wird auch in GB-A-1128371 beschrieben.
Es wurde nun festgestellt, daß genaue Enzymassays, die sich für die Verwendung bei Immunoassaytechniken eignen, für Enzyme, die mit der Dimerisierung von Indoxylestern unter Bildung der entsprechenden Indigo-Verbindungen in Zusammenhang stehen, möglich sind, wobei die Assays die Bildung von Wasserstoffperoxid aus dieser Reaktion nutzen, da die Wasserstoffperoxidbildung ausreichend konsistent ist, so daß sie zur genauen Berechnung der Enzymaktivität bis herunter auf Werte von 1 in 1000 im Vergleich mit colorimetrischen Techniken für die gleichen Enzyme herangezogen werden kann.
Gemäß einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird also ein Verfahren zum Nachweis einer Substanz, vorzugsweise in einem Bioassay, bereitgestellt, wobei der Assay die Umwandlung eines 3-O-Indoxylesters oder von Estern in eine entsprechende Indigo-Verbindung über die Einwirkung eines geeigneten Enzyms oder geeigneter Enzyme, das/die vorzugsweise als Markierung verwendet wird/werden, umfaßt und dadurch gekennzeichnet ist, daß das Wasserstoffperoxid-Bildungspotential bestimmt wird.
Es wurde festgestellt, daß es möglich ist, die Enzyme, die mit der Dimerisierung von Indoxylestern unter Bildung der entsprechenden Indigo- Verbindungen in Zusammenhang stehen, herunter bis auf Werte der Genauigkeit, die bei bisherigen Techniken nicht möglich waren, nachzuweisen. Wir haben überraschenderweise festgestellt, daß die Bildung von Wasserstoffperoxid aus dieser Reaktion nicht ein Nachteil ist, wie bisher angenommen wurde, sondern vielmehr ausreichend konsistent, oftmals in stöchiometrischen Mengen, abhängig von dem Indoxyl, verläuft, so daß sie herangezogen werden kann, um die Enzymaktivität bis auf Werte von 1 in 1000 im Vergleich mit denen, die durch colorimetrische Techniken meßbar sind, zu berechnen.
Dementsprechend ist es möglich, die Empfindlichkeit eines Enzymimmunoassays zu erzielen, indem eine Esterase eingesetzt wird, die sich für die Förderung der Dimerisierung von Indoxylestern unter Bildung der entsprechenden Indigo-Verbindungen eignet. Der erfindungsgemäße Assay beruht daher nicht auf einem natürlichen Substrat für das Enzym. Ferner wird die Empfindlichkeit eines Wasserstoffperoxid-Assays erreicht, ohne daß Standardsubstrate verwendet werden müssen, wobei zusätzlich auch eine Bestätigung durch colorimetrische Techniken möglich ist.
Die Enzyme können auf beliebige zweckmäßige Weise in den erfindungsgemäßen Assays verwendet werden, und zwar typischerweise als Marker, zum Beispiel an einem Antikörper. Die Verwendung von Enzymen, die zur Katalyse der Indigobildung imstande sind, in Assays ist gut bekannt, und ähnliche Techniken können in der vorliegenden Erfindung angewandt werden, mit der Ausnahme, daß das Wasserstoffperoxid-Bildungspotential anstelle der Farbstoffbildung bestimmt wird.
Typischerweise ist das Enzym, das bei dem erfindungsgemäßen Assay verwendet wird, an einen Träger gebunden, der auf irgendeine Weise in Wechselwirkung mit der Substanz, die nachgewiesen werden soll, tritt, wobei nicht in Wechselwirkung tretendes Enzym-Träger-Konjugat aus dem System entfernt wird. Das Ausmaß der Wechselwirkung ist repräsentativ für die Menge oder Konzentration der Assaysubstanz. Die Bestimmung der Enzymaktivität kann also herangezogen werden, um die Menge der Substanz in der Probe zu berechnen.
Mit »Wasserstoffperoxid-Bildungspotential« ist die Menge an Wasserstoffperoxid gemeint, die in einem einfachen Enzym/Substrat-System gebildet würde. In den meisten Beispielen für die vorliegende Erfindung wird die tatsächliche Bildung von Wasserstoffperoxid gemessen; bei gewissen Techniken ist es jedoch möglich, das Potential oder die Fähigkeit zur Bildung von Wasserstoffperoxid zu messen.
Techniken, bei denen das Wasserstoffperoxid-Bildungspotential gemessen wird, umfassen die Enzymelektrodentechnik [für einen Überblick vergleiche Robinson, G.A., et al., Clin. Chem., (1985), 31/9, 1449-52]. Bei diesen Techniken wird häufig eine Kohlenstoffelektrode, die mit einer selektiven Membran geschützt ist, die nur ausgewählte gelöste Stoffe passieren können, verwendet, und sie werden typischerweise zum Nachweis von Glucose durch die Einwirkung von Glucoseoxidase verwendet, wobei eine Anzeige der Zuckerspiegel in Blut oder Urin erhalten wird.
Die Einwirkung von Glucoseoxidase auf Glucose ergibt unter normalen Bedingungen Gluconolacton und Wasserstoffperoxid; bei der Enzymelektrodentechnik wird dies jedoch durch das Vorhandensein von Ferrocen oder einer ähnlichen Verbindung umgangen. Ferrocen wird durch die Einwirkung des Enzyms reduziert, und es wird kein Wasserstoffperoxid gebildet.
Das reduzierte Ferrocen kann dann die selektiv permeable Membran passieren und an der Elektrodenoberfläche reoxidiert werden. Der resultierende Strom kann dann gemessen werden, um eine Anzeige der Menge der nachzuweisenden Substanz, die in der Probe vorhanden ist, zu erhalten.
Bei einer geeigneten Enzymelektrodentechnik wird eine Standardenzymelektrode, wie sie für den Nachweis von Glucose verwendet werden kann, eingesetzt, wobei ein Antikörper, der spezifisch für die Substanz ist, die nachgewiesen werden soll, an die Oberfläche einer selektiv permeablen Membran, die die Elektrode schützt, gebunden ist, wobei das Verfahren folgende Stufen umfaßt:
A) gegebenenfalls wird eine Probe in einer geeigneten flüssigen Form, wie einer Suspension oder Lösung, hergestellt;
B) die Probe wird in Kontakt mit dem gebundenen Antikörper gebracht;
C) die Elektrode wird vorzugsweise gewaschen, um alles, was nicht von dem gebundenen Antikörper zurückgehalten wird, zu entfernen;
entweder: D) (i) eine Zubereitung von Material, das spezifisch für die Substanz ist, die nachgewiesen werden soll, wird mit der Elektrode in Kontakt gebracht, und vorzugsweise wird gewaschen, um Material, das von dem gebundenen Antikörper nicht zurückgehalten wird, zu entfernen; und (ii) eine Zubereitung des Enzyms wird in Kontakt mit der Elektrode gebracht, wobei das Enzym an einen Träger gebunden ist, der spezifisch für das Material ist;
oder:
E) eine Zubereitung des Enzyms wird in Kontakt mit der Elektrode gebracht, wobei das Enzym an einen Träger gebunden ist, der spezifisch für die Substanz ist, die nachgewiesen werden soll;
F) die Elektrode wird gewaschen, um alle Substanzen, die nicht zurückgehalten werden, zu entfernen;
G) eine Zubereitung eines 3-O-Indoxylesters wird zusammen mit Ferrocen oder einer ähnlichen Substanz in Kontakt mit der Elektrode gebracht; und
H) der Strom an der Elektrode wird gemessen.
Das Ferrocen kann der Membran einverleibt werden, anstatt daß es getrennt zugegeben wird; es ist jedoch bevorzugt, es getrennt zuzugeben, so daß ein Überschuß an Ferrocen sicherstellen kann, daß der Strom nicht durch die beschränkten Mengen an Substrat begrenzt ist.
Die Stufen B-E können in einer beliebigen Reihenfolge durchgeführt werden, sofern keine Waschstufe stattfindet, bevor Stufe B durchgeführt wird.
Gemäß einer alternativen Ausführungsform der Enzymelektrodentechnik kann die Elektrode auf einem magnetisierbaren Substrat angeordnet sein. Antikörper, der spezifisch für die Nachweissubstanz ist, wird dann an magnetische Teilchen gebunden und mit einer Probe sowie einer Zubereitung eines zweiten Antikörpers, der spezifisch für die Substanz ist, die nachgewiesen werden soll, gemischt. Das Gemisch kann dann mit der Elektrode und dem magnetisierten magnetisierbaren Substrat in Kontakt gebracht werden; die Elektrode wird dann gewaschen, um alle Bestandteile des Gemisches, die nicht zurückgehalten werden, zu entfernen, wobei das Substrat während dessen magnetisiert bleibt. Ferrocen zusammen mit Substrat für das Enzym kann dann zugegeben werden, und der Strom kann wie zuvor bestimmt werden.
Bei keinem der erfindungsgemäßen Assays ist es erforderlich, daß das fixierte Substrat die Substanz, die nachgewiesen werden soll, direkt erkennt oder daß der Enzymträger die Substanz direkt erkennt. Beispiele werden hier vorgelegt. Die einzige Anforderung ist eine direkte Kette der Bindung, wie durch eine Anzahl von geeignet gewählten Antikörpern, um sicherzustellen, daß die gemessene Enzymaktivität repräsentativ für die Menge an Substanz, die in der Probe nachgewiesen werden soll, ist. Es ist jedoch um so besser, je kleiner die Anzahl der Glieder zwischen Träger und Enzym ist.
Ein direkter erfindungsgemäßer Assay, bei dem die tatsächliche Bildung von Wasserstoffperoxid bestimmt wird, kann durch eine Anzahl von Verfahrensstufen wie folgt gekennzeichnet werden:
A) gegebenenfalls wird eine Probe in einer geeigneten flüssigen Form, wie einer Suspension oder Lösung, hergestellt;
B) die Probe wird in Kontakt mit einer Phase gebracht, die imstande ist, die Substanz, die nachgewiesen werden soll, selektiv zurückzuhalten;
C) vorzugsweise wird die Phase gewaschen, um alles zu entfernen, was nicht von der Phase zurückgehalten wird;
entweder: D) (i) eine Zubereitung von Material, das spezifisch für die Substanz ist, die nachgewiesen werden soll, wird mit der Phase in Kontakt gebracht, und vorzugsweise wird gewaschen, um Material, das von der Phase nicht zurückgehalten wird, zu entfernen; und (ii) eine Zubereitung des Enzyms wird in Kontakt mit der Phase gebracht, wobei das Enzym an einen Träger gebunden ist, der spezifisch für das Material ist;
oder
E) eine Zubereitung des Enzyms wird in Kontakt mit der Phase gebracht, wobei das Enzym an einen Träger gebunden ist, der spezifisch für die Substanz ist, die nachgewiesen werden soll;
F) die Phase wird zur Entfernung aller Substanzen, die nicht zurückgehalten werden, gewaschen;
G) ein 3-O-Indoxylester wird in mit der Phase in Kontakt gebracht;
und
H) Wasserstoffperoxid wird nachgewiesen, wahlweise nach Ablauf einer Reaktion zwischen dem Enzym und dem 3-O-Indoxylester für eine festgelegte Zeitspanne.
Bei dem vorstehenden Verfahren ist das Enzym das erfindungsgemäße Enzym, und das Substrat ist ein damit hydrolysierbarer 3-O-Indoxylester. Die »Phase« ist ein beliebiges Substrat oder ein beliebiger Träger, der eine chromatographische Säule oder ein Filter, das/der die Substanz für den Assay unter den angewandten Waschbedingungen selektiv zurückhält. Die Ausdrücke »selektiv« und »spezifisch«, wie sie hier verwendet werden, müssen nicht notwendigerweise bedeuten, daß nur die Substanz, die nachgewiesen werden soll, zurückgehalten oder erkannt wird, sofern mindestens eine der so definierten Substanzen, wie die Phase, das Material oder der Träger, auf diese Weise beschränkt ist.
Zum Beispiel kann ein Nitrozellulosefilter verwendet werden, um DNA zurückzuhalten, und es kann lediglich erforderlich sein, DNA allgemein nachzuweisen, wobei in diesem Fall das Material von Stufe D) zum Beispiel eine Biotin-markierte λDNA-Sonde sein kann und das Enzym mit Avidin verknüpft sein kann. Wenn ein spezifischerer Assay erforderlich ist, dann kann das Enzym zum Beispiel an eine CDNA-Sonde gebunden sein. Ähnliche Überlegungen gelten für andere Formen des Assays, wie einen Immunoassay.
Zusätzlich können verschiedene Stufen gleichzeitig oder in umgekehrter Reihenfolge durchgeführt werden, sofern die gewünschte Wirkung erzielt wird. Zum Beispiel können die Stufen B-E in einer beliebigen Reihenfolge durchgeführt werden, sofern keine Waschstufe vor dem Abschluß einer Abfolge der Stufen, die aus der angegebenen Abfolge B, D/E stammt, erfolgt. Die Stufen G und H können gleichzeitig durchgeführt werden, wobei dies jedoch nicht bevorzugt ist, da die Gefahr besteht, daß Genauigkeit und Empfindlichkeit etwas beeinträchtigt werden.
Ein indirekter oder kompetitiver Assay gemäß der vorliegenden Erfindung kann durch eine Anzahl von Verfahrensstufen wie folgt charakterisiert werden:
A) gegebenenfalls wird eine Probe in einer geeigneten flüssigen Form, wie einer Suspension oder Lösung, hergestellt;
B) die Probe wird in Kontakt mit einer Phase gebracht, die imstande ist, selektiv die Substanz, die nachgewiesen werden soll, zurückzuhalten;
C) eine festgelegte Menge einer Stammzubereitung von markierter Nachweissubstanz wird in Kontakt mit der Phase in einer ausreichenden Menge gebracht, um das Rückhaltevermögen der Phase zu sättigen, und es wird eine ausreichende Zeit gelassen, um eine Konkurrenz von markierter und nicht-markierter Substanz zu ermöglichen;
D) vorzugsweise wird die Phase gewaschen, um alles zu entfernen, was von der Phase nicht zurückgehalten wird;
E) wenn es sich bei der Markierung nicht um ein Enzym handelt, wird die Zubereitung des Enzyms in Kontakt mit der Phase gebracht, wobei das Enzym an einen Träger gebunden ist, der spezifisch für die Markierung ist;
F) die Phase wird gewaschen, um alle Substanzen, die nicht zurückgehalten werden, zu entfernen;
G) ein 3-O-Indoxylester wird in Kontakt mit der Phase gebracht; und
H) Wasserstoffperoxid wird nachgewiesen, vorzugsweise nach Ablauf der Reaktion für eine festgelegte Zeitspanne.
Bei dem vorstehenden Verfahren sind das Enzym und das Substrat wie vorstehend definiert. Außerdem bedeutet »Markierung« alles, was dazu dient, die Stammzubereitung der Substanz, die nachgewiesen werden soll, zu charakterisieren. Es kann sich also um einen Antikörper-Substanz-Komplex, der wahlweise kovalent verknüpft ist, handeln, oder es kann sich zum Beispiel um ein Konjugat mit dem Enzym handeln. Wenn es sich um ein Enzymkonjugat handelt, dann ist es nicht erforderlich, Stufe F durchzuführen.
Ähnliche Überlegungen gelten für den kompetitiven Assay wie für den direkten Assay. Zum Beispiel können die Stufen B-E in einer beliebigen Reihenfolge durchgeführt werden, sofern keine Waschstufe stattfindet, bevor die beiden Stufen B und C abgeschlossen sind. Die Stufen G und H können wiederum gleichzeitig durchgeführt werden, wobei dies jedoch aus den vorstehend angegebenen Gründen nicht bevorzugt ist.
Ferner muß das Enzym-Träger-Konjugat nicht so zugeführt werden, daß es die Gesamtmenge an Substanz oder Markierung bindet, sofern der Anteil des Trägers ohne Enzym bekannt ist, so daß genaue Bestimmungen möglich sind. Derartige Überlegungen gelten auch für den direkten Assay. Dies ist im allgemeinen jedoch nicht bevorzugt, da die Menge an Wasserstoffperoxid entsprechend verringert wird, was empfindlichere Nachweistechniken erfordert.
Bei den erfindungsgemäßen Assays ist es im allgemeinen bevorzugt, einen Überschuß an Substanzen, wie Antikörpern, einzusetzen, so daß sichergestellt wird, daß der einzige beschränkende Faktor für die Messungen eine Folge der Menge der Substanz, die nachgewiesen werden soll, ist.
Die vorliegende Erfindung ist zwar nicht an eine Theorie gebunden; es wird jedoch angenommen, daß Wasserstoffperoxid nicht als Folge der direkten Einwirkung des eingesetzten hydrolytischen Enzyms erzeugt wird. Es wird angenommen, daß das Enzym dazu dient, die 3- und möglicherweise die 1-Estergruppen zu hydrolysieren, so daß man die nicht-veresterte Indoxylverbindung erhält. Zwei Moleküle Indoxyl werden dann direkt durch zwei Moleküle atmosphärischen Sauerstoff oxidiert, wobei man ein Molekül Indigo-Verbindung und zwei Moleküle Wasserstoffperoxid erhält.
Es ist also ersichtlich, daß die Enzyme, die bei den erfindungsgemäßen Assays verwendet werden können, nur durch die Anforderung beschränkt sind, daß sie imstande sein müssen, einen geeigneten 3-O-Indoxylester zu hydrolysieren. Da ferner derartige Esteraseaktivität üblicherweise mit der Beschaffenheit der Acylgruppe und nicht mit der Beschaffenheit des veresterten Moleküls oder der Substanz in Zusammenhang steht, ist ein beliebiges Enzym mit hydrolytischer Aktivität potentiell bei den erfindungsgemäßen Assays geeignet, sofern jeweils ein geeigneter 3-O-Indoxylester hergestellt werden kann oder verfügbar ist.
Typische geeignete Enzyme umfassen: alkalische Phosphatase, β-D-Galactosidase, Esterase, Acetylcholinesterase, Alkylsulfatase, Sulfatase, β-D-Glucosidase und β-D-Glucuronidase.
Von den vorstehenden Enzymen ist es am stärksten bevorzugt, alkalische Phosphatase oder β-D-Galactosidase zu verwenden, und zwar aufgrund ihrer leichten Verfügbarkeit und Stabilität.
Die vorliegende Erfindung stellt auch einen Reagenzsatz zur Durchführung eines hier definierten Assays bereit, der einen 3-O-Indoxylester oder mehrere Ester, ein Enzym oder Enzyme, die für die Umwandlung des Indoxylesters oder der Ester in die entsprechenden Indigo-Verbindungen geeignet sind, und Mittel zum Nachweis des Wasserstoffperoxid-Bildungspotentials umfaßt.
Der bei den erfindungsgemäßen Assays geeignete 3-O-Indoxylester weist vorzugsweise die folgende allgemeine Formel (I) auf:
worin R¹, R² , R³ und R&sup4; gleich oder verschieden sein können und jeweils ein Wasserstoffatom oder eine kleine elektrophile Gruppe darstellen;
Ra ein Wasserstoffatom oder eine Acylgruppe von Rb darstellt; und
Rb eine beliebige Acyloxygruppe darstellt.
Wenn einer der Reste R¹ - R&sup4; eine kleine elektrophile Gruppe darstellt, dann ist eine derartige Gruppe zweckmäßigerweise ausgewählt unter: Cyanogruppen, Aminogruppen, Aminogruppen, die mit 1 oder 2 Methyloder Ethylgruppen substituiert sind, Trifluormethylgruppen, Hydroxygruppen, Halogenatomen, Methyl-, Ethyl-, Methoxy- und Ethoxygruppen.
Es ist bevorzugt, daß die Substituenten R¹ - R&sup4; entweder Wasserstoff oder Halogen darstellen, und wenn sie Halogen darstellen, dann sind Brom und/oder Chlor bevorzugt.
Es ist möglich, daß alle der Substituenten R¹ - R&sup4; elektrophile Gruppen gemäß der vorstehenden Definition darstellen; es ist jedoch bevorzugt, daß mindestens einer Wasserstoff darstellt. Es ist auch möglich, daß alle der Substituenten R¹ - R&sup4; Wasserstoff darstellen; dies ist jedoch wiederum nicht bevorzugt.
Die am stärksten bevorzugten Verbindungen sind die, bei denen zwei oder drei der Substituenten R¹ - R&sup4; Wasserstoff darstellen und zwei oder einer ein Halogenatom darstellen. Insbesondere ist es bevorzugt, daß, wenn zwei der Substituenten R¹ - R&sup4; Halogen darstellen, der eine Brom und der andere Chlor darstellt. Wenn nur einer der Substituenten R¹ - R&sup4; Halogen darstellt, dann ist es bevorzugt, daß er Brom darstellt.
Die am stärksten bevorzugten Positionen an der Verbindung der Formel (1) für die Substitution sind die 4- und 5-Positionen, die R¹ und R² entsprechen. Wenn nur einer der Reste R¹ - R&sup4; eine Gruppe darstellt, die von Wasserstoff verschieden ist, dann ist es bevorzugt, daß diese Gruppe R² ist, und wenn zwei der Substituenten R¹ - R&sup4; eine Gruppe, die von Wasserstoff verschieden ist, darstellen, dann ist es bevorzugt, daß diese Sub stituenten R¹ und R² sind, wobei die Verbindungen, in denen R¹ einen 5- Bromsubstituenten darstellt, am stärksten bevorzugt sind. Es ist möglich, einen Bromsubstituenten an der 6-Position bereitzustellen; dabei besteht jedoch die Gefahr, daß nicht für eine stöchiometrische Bildung von Wasserstoffperoxid gesorgt wird. Die Bildung von Wasserstoffperoxid ist jedoch noch ausreichend konsistent, um es zu erlauben, daß erfindungsgemäße Assays unter Verwendung der Verbindung mit einer geeigneten Kontrolle oder geeigneten Kontrollen durchgeführt werden.
Der Substituent Ra kann Wasserstoff oder die Acylgruppe, die der für Rb angegebenen Acyloxygruppe entspricht, sein. Im allgemeinen ist es jedoch bevorzugt, daß Ra ein Wasserstoffatom darstellt.
Wenn Ra eine Acylgruppe darstellt, dann sollte diese Acylgruppe durch das gleiche Enzym, das zur Hydrolyse von Rb verwendet wird, hydrolysierbar sein. Wenn dies nicht der Fall ist, dann kann es erforderlich sein, weitere Enzyme in den erfindungsgemäßen Assays einzusetzen, und es wäre nicht möglich, die Qualität der erhaltenen Ergebnisse zu garantieren. Es kann sich auch als schwierig oder unmöglich erweisen, in geeigneter Weise ausgehend von einem Reagenzleerwert zu extrapolieren.
Bevorzugte Bedeutungen für Ra, wenn Ra nicht Wasserstoff darstellt, sind Acylgruppen, die von anorganischen Säuren oder einfachen organischen Säuren abgeleitet sind.
Wenn Ra eine Acylgruppe darstellt, die von einer anorganischen Säure abgeleitet ist, dann ist es bevorzugt, daß die Säure ausgewählt ist unter: Phosphorsäure, Phosphonsäure, Schwefelsäure, Sulfonsäure und Kohlensäure.
Wenn Ra eine Acylgruppe darstellt, die von einer einfachen organischen Säure abgeleitet ist, dann sind die bevorzugten Säuren Carbonsäuren, wie: Essigsäure, Propansäure, Butansäure und Isomere davon, Brenztraubensäure, Zuckersäuren und L-Aminosäuren.
Rb ist nicht besonders beschränkt, sofern es sich um eine 3-O-Acylgruppe handelt. Die einzige Beschränkung für Rb besteht darin, daß eine Hydrolyse durch ein verfügbares Enzym möglich sein sollte. Dementsprechend ist ersichtlich, daß die 3-O-Acylgruppen im allgemeinen die sind, die in der Natur vorkommen, oder die denen, die in der Natur vorkommen, ausreichend gut entsprechen, so daß sie durch das relevante Enzym hydrolysierbar sind.
Typische verfügbare Acylgruppen umfassen: Phosphat, Acetat, Galactopyranoside, Sulfat, Glucuronat, Glucopyranoside, Fructopyranoside und Mannopyranoside. Es ist auch ersichtlich, daß die Acylgruppen, die vorstehend für Ra beschrieben wurden, geeignet sind.
Im allgemeinen sind die Acylgruppen, die Rb darstellt, von einfachen anorganischen oder organischen Säuren abgeleitet, oder sie sind von natürlich auftretenden Substanzen, wie Aminosäuren und Zuckersäuren, abgeleitet. Wie vorstehend beschrieben wurde, muß der Rest, den Rb darstellt, nicht notwendigerweise ein natürlich auftretender Rest sein, sofern er durch ein verfügbares Enzym hydrolysiert werden kann.
Es ist auch ersichtlich, daß, wenn Rb und möglicherweise Ra einen Rest, der einer Salzbildung unterliegen kann, zum Beispiel eine Phosphatgruppe, darstellen, die Salze gebildet werden können, und derartige Salze gehören zum Gebiet der Erfindung. Derartige Salze sind wiederum nicht besonders beschränkt, sofern sie nicht den erfindungsgemäßen Assay stören. Geeignete Salze sind die, die die Gruppe Ra oder Rb ausgleichen, so daß zum Beispiel das Sulfat ein Salz mit einer Base bilden kann. Typische Salze umfassen die Natrium- und p-Toluidin-Salze.
Besonders bevorzugte Indoxylderivate, die erfindungsgemäß verwendet werden können, umfassen: 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat, 5-Brom-4- chlor-3-indolylphosphat (Dinatriumsalz), 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat (p-Toluidinsalz), 3-Indolylphophat (Dinatriumsalz), 3-Indolylphosphat (p- Toluidinsalz), 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid, S-Brorn-3- indolyl-β-D-galactopyranosid, 5-Brom-4-chlor-3-indolylacetat, 5-Brom-4- chlor-3-indolyl-1,3-diacetat, 5-Brom-6-chlor-3-indolylacetat, 5-Brom-4- chlor-3-indolylsulfat (p-Toluidinsalz), 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D- glucopyranosid und 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-glucuronat (MCHA [Monocyclohexylammonium]-Salz).
Wie vorstehend beschrieben wurde, wird Wasserstoffperoxid in ausreichend konsistenter Weise gebildet, so daß sehr genaue Bestimmungen der Enzymaktivität erfolgen können.
Es sind verschiedene Verfahren zur Bestimmung von Wasserstoffperoxid bekannt, und sie sind auf diesem Gebiet gut beschrieben worden. Die Verfahren, die sich für die Anwendung in der vorliegenden Erfindung eignen, sind jedoch die&sub1; die eine Messung auf einer molekularen Basis und nicht auf einer Volumenbasis oder einer quantitativen Basis erlauben.
Geeignete Verfahren zur Bestimmung von Wasserstoffperoxid entsprechend dem Assay und der Stufe H der direkten Verfahren der vorliegenden Erfindung umfassen zum Beispiel Colorimetrie, Fluorimetrie und Chemolumineszenz.
Typische Techniken werden in Molecular Cloning (a.a.O.) und Enzyme Irnmunoassay [3. Auflage, Igaku-Shoin, (1987)] beschrieben.
Wenn die Colorimetrie zur Bestimmung von Wasserstoffperoxid eingesetzt wird, dann umfassen geeignete Reagenzien 1,2-Diaminobenzol oder 2,2'-Amino-bis (3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonsäure). Diese Reagenzien unterliegen einer Reaktion mit Wasserstoffperoxid, wobei intensive Farben, die leicht durch ein Colorimeter nachweisbar sind, gebildet werden. Es ist jedoch klar, daß eine derartige Technik wahrscheinlich nicht geeignet ist, die Empfindlichkeit der Fluorimetrie oder Chemolumineszenz zu erreichen.
Geeignete Reagenzien für die Fluorimetrie umfassen p-Hydroxyphenylpropionsäure, Tyrarnin und Homovalin, und das Ergebnis der Reaktion mit Wasserstoffperoxid kann mit einem Fluorimeter bestimmt werden.
Die am stärksten bevorzugte Technik ist die der Chemolumineszenz, und geeignete Reagenzien umfassen: Luminol, Isoluminol, N-(4-Aminobutyl)- N-ethylluminol und andere Luminolderivate, Lucigenin, Acridium, Pyrogallol, Oxalat, Bis (2,4,6-trichlorphenyl)oxalat, Bis (2,4-dinitrophenyl)oxalat, -Pentafluorphenyloxalat und andere Oxalatderivate, im allgemeinen in Verbindung mit einem Farbstoff, wie 8-Anilinonaphthalin-1-sulfonsäure, Fluorescein, Rhodamin, Pyren oder Dansylchlorid. Ein Oxidationskatalysator, wie Peroxidase, Mikroperoxidase, Kaliumferricyanid, Kaliumferrocyanid oder Ferricyanid, ist erforderlich, bevor viele der vorstehenden Reagenzien mit Wasserstoffperoxid reagieren können, so daß sie zum Beispiel mit einem Lumineszenzmeßgerät bestimmt werden können.
Es ist klar, daß die Aktivität des Enzyms in einer gewissen Weise repräsentativ für die Menge der nachzuweisenden Substanz in der Probe sein muß. Es gibt keine Beschränkung dahingehend, wie dies erreicht wird, sofern die Ergebnisse des Assays herangezogen werden können, um die Menge der Substanz zu bestimmen. Die vorstehend beschriebenen Verfahren geben geeignete Beispiele für Techniken, die herangezogen werden können, um die gewünschten Ergebnisse zu erzielen.
Allgemein gesagt kann das Enzym so in das System eingeführt werden, daß es entweder proportional oder umgekehrt proportional zur Menge der Substanz, die nachgewiesen werden soll, ist. Wenn die Enzymaktivität proportional zu der Substanz, die nachgewiesen werden soll, ist, dann wird der Assay auf eine solche Weise durchgeführt, daß die Menge an Enzym durch die Menge an Substanz bestimmt wird. Dies kann eine Form annehmen, bei der die Substanz, die nachgewiesen werden soll, fixiert wird, Enzym an die fixierte Substanz gebunden wird, freies Enzym ausgewaschen wird und dann die Aktivität des Enzyms bestimmt wird, wie bei dem vorstehend beschriebenen direkten Assay. Wenn das Ausmaß der Enzymaktivität umgekehrt proportional ist, dann wird das Enzym in das System auf eine solche Weise eingeführt, daß es sich in Konkurrenz mit der Substanz, die nachgewiesen werden soll, befindet.
Eine Enzymaktivität, die repräsentativ für die Menge an Substanz in der Probe ist, kann auf verschiedene Weise erhalten werden. Im allgemeinen wird jedoch das Enzym an eine Form eines Trägers gebunden, der selbst die Substanz, die nachgewiesen werden soll, erkennt und bindet, oder der um die Bindungsstellen mit der Substanz, die nachgewiesen werden soll, konkurriert.
Es ist oft der Fall, daß der Enzymträger ein Antikörper ist. Der resultierende markierte Antikörper kann dann auf bekannte Weise verwendet werden, wie in dem beschriebenen direkten Assayverfahren. Ein Beispiel ist ELISA (Festphasen-Enzymimmunoassay), wobei dieser Assay es umfassen kann, eine Assayprobe über einen Antikörper für die Substanz, die nachgewiesen werden soll, zu leiten, wobei der Antikörper mit einem festen Träger verknüpft ist (Festphasenantikörper, wie in Stufe B der erfindungsgemäßen direkten und indirekten Assays). An diesem Punkt ist es bevorzugt, die feste Phase zu waschen, um ungebundene Probe zu entfernen (Stufe C). Das Waschen muß jedoch nicht vor Abschluß der nächsten Stufe erfolgen, die die Einführung des enzymmarkierten Antikörpers (Enzym und Träger aus Stufe E) umfaßt, wobei der Antikörper spezifisch für die Substanz, die nachgewiesen werden soll, ist. Die feste Phase wird dann gewaschen, um jeglichen ungebundenen markierten Antikörper zu entfernen (Stufe F), und ein 3-O-Indoxylester wird dann eingeführt (Stufe G), und Enzymaktivität wird anschließend nachgewiesen (Stufe H). Diese Art als Assay ist als »Sandwich-Assay« bekannt.
Andere Formen von Assays, die markierte Antikörper beinhalten, sind ebenfalls bekannt, und sie können zum Beispiel den markierten Antikörper, der spezifisch für eine Art von Antikörper ist, wie Mausantikörper, enthalten. In einem solchen Fall kann der Mausantikörper spezifisch für die Substanz, die nachgewiesen werden soll, sein, und eine erste Stufe des Assays beinhaltet die Bindung von Mausantikörper an die Substanz (das Material, das spezifisch für die Substanz ist, die bestimmt werden soll - Stufe D) und die Trennung von gebundenem und freiem Antikörper (B/F-Trennung). Markierter Antikörper, wie Ziegen-anti-Maus-Antikörper, der mit ALP markiert ist, wird dann eingeführt (Stufe E), es wird zur Abtrennung von freiem Antikörper gewaschen (Stufe F), und das Enzym wird wie zuvor bestimmt.
Andere geeignete Verfahren werden in Molecular Cloning (a.a.O.) und Enzyme Immunoassay (a.a.O.) beschrieben. Diese Veröffentlichungen stellen auch geeignete Verfahren zur Verknüpfung des Enzyms mit dem Antikörper bereit.
Es ist klar, daß die bei den vorstehenden Assays verwendeten Antikörper vorzugsweise monodonale Antikörper sind; in einigen Fällen mag es jedoch möglich sein, polydonale Antikörper zu verwenden. Berücksichtigt man jedoch die Genauigkeit, die im allgemeinen erforderlich ist, und die geringe Konzentration an Substanz, die nachgewiesen werden soll, so werden im allgemeinen monodonale Antikörper gewählt.
Wie vorstehend angegeben, kann es sich bei dem Träger um ein beliebiges Material handeln, das die Regulierung der Enzymaktivität, so daß diese die Konzentration der Assaysubstanz anzeigt, unterstützt. Ein alternativer Assay beinhaltet also die Herstellung einer markierten Probe der Substanz für den Assay, wobei die Markierung ein Enzym ist, wie es beschrieben wurde. Die markierte Substanz kann dann in einem kompetitiven Assay, wie er vorstehend beschrieben wurde, verwendet werden, wobei die markierte Substanz und die Substanz in der Probe, die nachgewiesen werden soll, um die Bindung, zum Beispiel an Festphasenantikörper, die spezifisch für die Substanz sind, konkurrieren. Die Probe kann vor, nach oder gleichzeitig mit der markierten Substanz zugegeben werden, und zwar abhängig davon, wie die Enzymaktivität bestimmt werden soll. Es ist im allgemeinen jedoch bevorzugt, die Probe zum gleichen Zeitpunkt wie die markierte Substanz zuzugeben, um die Berechnungen, die die Kinetik der Konkurrenz betreffen, zu vereinfachen.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein erfindungsgemäßes Enzym verwendet, um eine Oligonucleotidsonde zu markieren. Diese Sonde kann dann direkt bei einem Southern-Blot verwendet werden, und die Enzymaktivität kann direkt auf dem Nitrozellulosefilter bestimmt werden.
Alternativ kann eine Oligonucleotidsonde, die mit Biotin markiert ist, eingesetzt werden, um mit der gewünschten Nucleotidsequenz zu hybridisieren. Nach Waschen des Filters, um überschüssige Biotin-markierte Sonde zu entfernen, kann ein Enzym-Avidin-Konjugat eingeführt werden, es kann gewaschen werden, um überschüssiges Enzym-Avidin-Konjugat zu entfernen, und die Enzymaktivität kann wie vorstehend nachgewiesen werden. In diesem Fall ist es nicht wesentlich, daß das Enzym direkt an Avidin gebunden ist, und es kann sein, daß Avidin verwendet wird, um einen Antikörper zu markieren, wobei das Enzym verwendet wird, um einen zweiten Antikörper zu markieren, der spezifisch für den ersten ist. Dies ist jedoch nicht bevorzugt, da es eine unnötige Stufe in die Technik einführt.
Es gibt keine besondere Beschränkung hinsichtlich der Beschaffenheit der Substanz, die nachgewiesen werden soll. Sofern irgendein Weg gefunden werden kann, um Enzymaktivität auf der Basis der Konzentration der Substanz zu moderieren, sind die Kriterien erfüllt.
Wenn die Technik, die eingesetzt werden soll, mit einem Antikörper verbunden ist, dann sollte die Substanz, die nachgewiesen werden soll, antigen sein. Es ist also bevorzugt, daß die Substanz, die nachgewiesen werden soll, eine natürlich vorkommende Substanz ist, wie eine, die im Körper gefunden wird. Geeignete Proben für den Assay können aus physiologischen Flüssigkeiten oder geeignet hergestellten Biopsieproben genommen werden. Geeignete Flüssigkeiten umfassen Serum, Plasma, Urin und Ascites.
Substanzen für den Assay sind geeignete Substanzen, die imstande sind, medizinische Information zu geben, wenn ihr Vorhandensein und/oder ihre Konzentration bestimmt werden kann. Beispiele für derartige Substanzen umfassen fötales Protein, wie α-Foetoprotein oder CEA (carcinoembryogenes Antigen), Hormone, wie Peptid- und Steroidhormone, Immunglobuline, wie antivirale oder antibakterielle Antikörper, und Arzneimittel.
Die beigefügten Beispiele erläutern weiter die vorliegende Erfindung, sind dafür jedoch in keiner Weise beschränkend. Sofern nichts anderes angegeben ist, weisen alle Enzyme, die in den Beispielen verwendet werden, EIA-Qualität auf.

Vergleichsbeispiel

Colorimetrische Bestimmung von alkalischer Phosphatase

Um die minimale Menge an alkalischer Phosphatase (ALP-EIA-Qualität, Boehringer) zu bestimmen, die nach der colorimetrischen Standardtechnik (wie sie in Molecular Cloning, A Laboratory Journal, zweite Auflage, Sambrook, Frisch und Maniatis, Herausgeber, 18.74 beschrieben ist) bestimmt werden kann, wurde eine Anzahl von Verdünnungen von ALP in einem Puffer mit einem Gehalt an 0,1% BSA, 100 mM MgCl&sub2; und 100 mM Tris HCl (pH-Wert: 9,5) hergestellt.
Anteile von 10 µl ALP-Lösung wurden auf eine Nitrozellulosemembran (BABS, Schlicher und Schuell) getüpfelt und in BCIP/NBT (5-Brom-4-chlor- 3-indolylphosphat/Nitroblau-tetrazolium, Kirkegaard and Perry Laboratories Inc.) eingetaucht.
Nach Entwicklung für eine Stunde wurden die Thpfel auf die Farbentwicklung analysiert, und es wurde festgestellt, daß die geringste Menge an ALP, die nach diesem Verfahren nachgewiesen werden kann, 100 pg/10 µl beträgt.

Beispiel 1

Nachweis von alkalischer Phosphatase durch Chemolumineszenz

Alkalische Phosphatase wurde sodann durch Chernolumineszenz nachgewiesen, um festzustellen, eine wie geringe Konzentration an Enzym nach dieser Technik gemessen werden kann.
Verdünnungen von alkalischer Phosphatase (ALP) wurden in 0,1 M Tris HCl-Standardpuffer (mit einem Gehalt an 0,1% Rinderserumalbumin und 100 TNM MgCl&sub2; [pH-Wert: 9,5]) hergestellt. Die hergestellten Verdünnungen reichten von 100 pg/ml bis 1 µg/ml. 10 µl jeder Lösung wurden zu Anteilen von 100 µl einer 0,38 mM BCIP-Lösung (Wako Pure Chem. Ind. Ltd.) im Tris HCl-Standardpuffer gegeben.
Man ließ die Lösungen für 1 Stunde bei 37ºC reagieren. Das Lumineszenzreagenz (Tris HCl-Pufferlösung mit einem Gehalt an 0,12 mM Isoluminol und 0,5 µM Mikroperoxidase [pH-Wert: 9,5]) wurde dann zugegeben (500 µl), und die integrierte Lumineszenzintensität wurde mit einem Lumineszenzmeßgerät (Aloka) gemessen.
Eine Eichkurve für den Assay wurde aufgezeichnet, wobei die Ordinate und die Abszisse die integrierte Intensität der Lumineszenz (Zählrate) bzw. die Konzentration an alkalischer Phosphatase waren.
Aus der Eichkurve ist klar, daß Enzymkonzentrationen mit einem recht geringen Wert von 0,1 pg/10 µl ohne weiteres nachweisbar sind.
Es ist also ersichtlich, daß die erfindungsgemäße Technik imstande ist, nützliche Ergebnisse bei Enzymkonzentrationen zu geben, die bis zu 1000fach geringer sind, als die, die bei den herkömmlichen colorimetrischen Techniken verwendet werden können, wie sie beispielhaft im vorstehenden Vergleichsbeispiel angegeben wurden.

Beispiel 2

Einstufige Bestimmung von alkalischer Phosphatase

Um die Möglichkeit der Bestimmung der Enzymaktivität während der Wasserstoffperoxidbildung zu untersuchen, wurden Substrat und Chemolumineszenzreagenz gleichzeitig zugegeben.
Verdünnungen von alkalischer Phosphatase (Boehringer) wurden in Tris HCl-Pufferlösung, die in Beispiel 1 beschrieben wurde, hergestellt. Die hergestellten Verdünnungen reichten von 100 pg/ml bis 1 µg/ml. 10 µl jeder Lösung wurden dann zu 200 µl der Mischlösung aus Enzymsubstrat und Lumineszenzreagenz (0,1 M Tris HCl-Pufferlösung mit einem Gehalt an 0,19 mM BCIP [p-Toluidinsalz - Wako Pure Chem. Ind. Ltd.], 0,25 mM Isoluminol, 5 U/ml Meerrettich-Peroxidase [Toyobo Co. Ltd.] und 100 mM Magnesiumchlorid [pH-Wert: 9,5]) gegeben, und die integrierte Lumineszenzintensität wurde wie in Beispiel 1 gemessen.
Die Änderungen der integrierten Lumineszenzintensität für die verschiedenen Konzentrationen an alkalischer Phosphatase wurden graphisch aufgetragen, wobei die Ordinate und die Abszisse die integrierte Lumineszenzintensität (Zähirate) bzw. die Zeit waren.
Aus den Auf tragungen der integrierten Lumineszenzintensität und der Zeit ist im wesentlichen ersichtlich, daß Enzymkonzentrationen mit einem recht geringen Wert von 10 pg/10 µl nachweisbar waren. Die Empfindlichkeit ist offensichtlich schlechter als die des zweistufigen Assays von Beispiel 1, zeigt jedoch, daß einstufige Assays möglich sind.

Beispiel 3

Nachweis von β-D-Galactosidase (β-Gal) durch Chemolumineszenz

Auf eine Weise ähnlich Beispiel 1 wurde β-D-Galactosidase durch Chemolumineszenz nachgewiesen.
Verdünnungen von β-D-Galactosidase (Boehringer) wurden in Phosphatpuffer (0,01 M Phosphatpufferlösung mit einem Gehalt an 0,1% Rinderserumalbumin und 0,5 mM Magnesiumchlorid (pH-Wert: 8,0]) hergestellt. Die hergestellten Verdünnungen reichten von 0,25 x 10 M bis 1 x 10&supmin;¹&sup0; M. 50 µl jeder Lösung wurden zu Anteilen von 100 µl der vorstehenden Pufferlösung mit einem Gehalt an 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid (X-Gal-Puffer mit einem Gehalt an 0,2 mM BCI-Gal [Wako Pure Chem. Ind. Ltd.]) gegeben und bei 37ºC gehalten.
Nach zwei Stunden wurde das Lumineszenzreagenz [Na&sub2;CO&sub3;-Pufferlösung mit einem Gehalt an 0,12 mM Isoluminol und 0,5 µM Mikroperoxidase [pH Wert: 9,5]) zugegeben, und die integrierte Lumineszenzintensität wurde gemessen, wie es in Beispiel 1 beschrieben wurde.
Eine Eichkurve für den Assay wurde aufgezeichnet, wobei die Ordinate und die Abszisse die integrierte Lumineszenzintensität (Zählrate) bzw. die Konzentration an β-D-Galactosidase waren.
Aus der Eichkurve ist ersichtlich, daß Konzentrationen von β-Galactosidase mit einem recht geringen Wert von 2 x 10&supmin;¹&sup9; Mol/SO µl durch diesen Assay nachweisbar sind.

Beispiel 4

Nachweis von β-D-Glucosidase durch Chemolumineszenz

Auf ähnliche Weise wie in Beispiel 3 wurde β-D-Glucosidase durch die Chemolumineszenztechnik nachgewiesen.
Verdünnungen von β-D-Glucosidase (β-Glu, Boehringer) wurden in Acetatpuffer < 0,1 M Acetatpufferlösung mit einem Gehalt an 0,1% Rinderserumalbumin und 0,5 mM Magnesiumchlorid [pH-Wert: 5,4]) hergestellt. Die hergestellten Verdünnungen reichten von 0,02 mU/ml bis 200 mU/ml. 50 µl jeder Lösung wurden zu Anteilen von 100 µl Acetatpufferlösung mit einem Gehalt an 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-glucopyranosid [BCI-Glu-Puffer mit einem Gehalt an 0,2 mM BCI-Glu (Aldrich]) gegeben und bei 37ºC gehalten.
Nach zwei Stunden wurde die Reaktionslösung mit dem Lumineszenzreagenz (Natriumcarbonatpufferlösung mit einem Gehalt an 0,12 mM Isoluminol und 0,5 µM Mikroperoxidase [pH-Wert: 9,5]) gemischt, und die integrierte Lumineszenzintensität wurde gemessen, wie es in Beispiel 1 beschrieben wurde.
Eine Eichkurve für den Assay von β-D-Glucosidase wurde aufgezeichnet, wobei die Ordinate und die Abszisse die integrierte Lumineszenzintensität (Zählrate) bzw. die Konzentration an β-D-Glucosidase waren. Aus der Eichkurve ist ersichtlichl daß Konzentrationen an β-Glu mit einem recht geringen Wert von 5 x 10&supmin;¹&sup6; /so µl (0,02 mU/ml) nachweisbar sind.

Beispiel 5

Eichkurve für α-Foetoprotein (AFP) unter Verwendung von ALP-markiertern Antikörper

Um festzustellen, daß ein Protein, wie α-Foetoprotein, nach dem erfindungsgemäßen Verfahren nachgewiesen werden kann, wurde ein Sandwich- Assay durchgeführt.
Verdünnungen von α-Foetoprotein (AFP) wurden unter Verwendung von 0,1 M Phosphatpufferlösung hergestellt, so daß 1000 ng/ml AFP in Phosphatpuffer verdünnt wurden, wobei man Verdünnungen von 0,5, 1, 10, 100 und 1000 ng/ml erhielt.
Anti-AFP-Antikörper-beschichtete Röhrchen (AFP-Röhrchen) wurden gemäß dem Verfahren hergestellt, das in Fluorescent Enzyme Immunoassay Method of Thyroxine (Bunseki-Kagaku 34, 544-548 (1985)] beschrieben ist.
30 µl jeder Verdünnung wurden zu 270 µl 0,01 M Phosphatpufferlösung gegeben und in ein AFP-Röhrchen eingeführt.
Nach Inkubation für 15 Minuten bei 37ºC wurde das AFP-Röhrchen dreimal mit 1,5 ml 0,01 M Phosphatpufferlösung gewaschen, um freies AFP abzutrennen.
ALP-markierte anti-AFP-Antikörper wurden nach dem Verfahren hergestellt, daß in Enzyme Immunoassay (a.a.O.) beschrieben wird. 300 µl ALP- markierter anti-AFP-Antikörper wurden zu den AFP-Röhrchen gegeben und nach Inkubation für 15 Minuten bei 37ºC wurden die AFP-Röhrchen dreimal mit jeweils 1,5 ml 0,01 M Phosphatpufferlösung gewaschen.
Nachdem die Röhrchen gewaschen worden waren, wurden 300 µl Pufferlösung (0,1 M Tris HCl-Pufferlösung mit einem Gehalt an 0,1% Rinderserumalbumin und 100 mM Magnesiumchlorid [pH-Wert: 9,5]) mit einem Gehalt an 0,38 mM BCIP (Wako) in das Röhrchen eingeführt. Nach 15 Minuten bei 37ºC wurden 100 µl Reaktionslösung abgezogen, und 100 µl Lumineszenzreagenz (CHES [2-Cyclohexylaminoethansulfonsäure]-Pufferlösung [Dojin Kagaku] mit einem Gehalt an 0,2 mM Luminol und 60 µM Mikroperoxidase [pH-Wert: 9,51) wurden damit gemischt, wobei die integrierte Lumineszenzintensität unter Verwendung eines Chemolumineszenzdetektors (Sankyo Co., Ltd., Tokyo) gemessen wurde. Die Lumineszenzintensität ist durch die Integration des Ausgangsstromwertes eines Photomultipliers für 10 Sekunden gegeben. Die Einheiten sind als µA x sec dargestellt.
Eine Eichkurve für den Assay wurde aufgezeichnet, wobei die Ordinate und die Abszisse die integrierte Lumineszenzintensität (µA x sec) bzw. die Konzentration an α-Foetoprotein waren.
Die resultierende Eichkurve zeigt, daß Konzentrationen mit einem recht geringen Wert von 1 ng/ml AFP mit guter Empfindlichkeit durch diese Technik gemessen werden können.

Beispiel 6

Eichkurve für nicht-isotope DNA unter Anwendung der Chemolumineszenz

Verdünnungen von wärmedenaturierter β-DNA wurden in entionisiertem Wasser hergestellt. Die Verdünnungen lagen zwischen 10 pg und 10 ng. 200 µl jeder Verdünnung wurden auf eine Mikrotiterplatte gegeben und über Nacht bei 4ºC stehengelassen. Nach dieser Zeit wurde der Überstand auf den Platten entfernt.
Vorhybridisierungslösung wurde dann hergestellt und in die einzelnen Vertiefungen in einer Menge von 250 µl gegeben. Die Vorhybridisierungslösung bestand aus 4 x ssc (ssc besteht hier aus 0,15 M NaCl, 0,015 M Na- Citrat, pH-Wert: 7; Vielfache davon bezeichnen Vielfache der Konzentrationen an NaCl und Na-Citrat in bezug auf die Basislösung), 0,064% PVP (Polyvinylpyrrolidon), 0,064% Ficoll (Marke), 0,064% Rinderserumalbumin und 50 µg/ml wärmedenaturierter Rinderthymus-DNA. Die Platten wurden dann für 1 Stunde bei 65ºC stehengelassen.
Nach dieser Zeit wurde die Vorhybridisierungslösung entfernt, und 250 µl Hybridisierungslösung wurden zugegeben. Die Hybridisierungslösung umfaßte 4 x ssc, 0,064% PVP, 0,064% Ficoll (Marke), 0,064% Rinderserumalbumin, 10% Dextransulfat, 50 µg/ml wärmedenaturierter Rinderthymus-DNA und 1 µg/ml Biotin-markierte λ-DNA-Sonde (hergestellt, wie es in der japanischen Offenlegungsschrift Hei-1-228500 beschrieben ist).
Nach Reaktion über Nacht bei 65ºC wurde die Reaktionslösung entfernt, und 250 µl 2 x ssc wurden zugegeben. Es erfolgte eine Umsetzung für 30 Minuten bei 65ºC. Jede Vertiefung wurde dann dreimal mit 250 µl Phosphatpufferlösung (pH-Wert: 7,0) mit einem Gehalt an 0,9% NaCl gewaschen.
Nachdem die Vertiefungen gewaschen worden waren, wurden 150 µl einer verdünnten Lösung (20000 x) ALP-Avidin-Konjugat (Bio-Yeda) in jede Vertiefung der Mikrotiterplatte gegeben und für zwei Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen.
Nach dieser Zeit wurden die einzelnen Vertiefungen dreimal mit 250 µl phosphatgepufferter Lösung mit einem Gehalt an 0,9% NaC1 gewaschen. Anschließend wurden 150 µl Pufferlösung (0,1 M Tris HCl-Pufferlösung mit einem Gehalt an 0,1% Rinderserumalbumin und 100 mM Magnesiumchlorid [pH Wert: 9,5]) mit einem Gehalt an 0,38 mM BCIP (p-Toluidinsalz - Wako) zu dem Reaktionsgemisch gegeben und für 1 Stunde bei 37ºC umgesetzt.
Nach dieser Zeit wurden 500 µl des Lumineszenzreagenzes (Tris HCl- Pufferlösung mit einem Gehalt an 0,12 mM Isoluminol und 0,5 µM Mikroperoxidase [pH-Wert: 9,5]) zu 100 µl der Reaktionslösung gegeben, und zwischen 15 Sekunden und 21 Sekunden nach der Zugabe wurde die integrierte Lumineszenzintensität für 6 Sekunden unter Verwendung eines Lumineszenzmeßgerätes (Aloka) gemessen.
Eine Eichkurve für den Hybridisierungsassay wurde aufgetragen, wobei die Ordinate und die Abszisse die integrierte Lumineszenzintensität (Zähirate) bzw. die Konzentration an λ-DNA waren.
Die Eichkurve zeigt, daß Mengen von λ-DNA mit einem recht geringen Wert von 10 pg/Vertiefung mit hoher Empfindlichkeit nachgewiesen werden können.

Beispiel 7

Nachweis einer spezifischen Gensequenz unter Verwendung einer ALP- markierten Sonde

Proben-DNA (HSV-II-Plasmid, erhalten aus dem SNAP[Marke]-Reagenzsatz, Molecular Biosystems, USA) wird mit entionisiertem Wasser verdünnt, für 5 Minuten gekocht und dann rasch zur Bildung von einzelsträngiger DNA abgekühlt, die dann in Vertiefungen einer Polystyrolplatte gegeben wird, wobei jede Vertiefung 100 µl DNA-Beschichtungspuffer (8 mM Na&sub2;HPO&sub4;, 1,5 mM KH&sub2;PO&sub4;, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 0,1 M MgCl&sub2;-H&sub2;O, pH-Wert nicht eingestellt) enthielt, und es wird gerührt. Die Probe wird dann einer physikalischen Adsorption auf der Polystyrolplatte bei 4ºC über Nacht unterzogen.

Vorhybridisierung

Nach Entfernung der DNA-Lösung aus der Vertiefung werden 200 µl einer Hybridisierungslösung (5 x ssc, 0,5% BSA, 0,5% Polyvinylpyrrolidon, pH-Wert nicht eingestellt) zugegeben, und die Reaktion wird in einem Wasserbad bei 60ºC für 20 Minuten durchgeführt.

Hybridisierung

Die Hybridisierungslösung wird aus der Vertiefung entfernt, und 200 µl einer Hybridisierungslösung mit einem Gehalt an 50 µg/ml Rinderthymus- DNA und 1% (Vol./Vol.) SNAP (Marke; Reagenzsatz, erhältlich von Molecular Biosystems, USA)-Sonde (mit alkalischer Phosphatase markiertes HSV-II- Gen) werden zugegeben. Die Reaktion wird in einem Wasserbad bei 60ºC für 20 Minuten durchgeführt.
Die Hybridisierungslösung wird dann entfernt, und es wird zweimal mit jeweils 250 µl ssc bei Raumtemperatur für 1 Minute und dann zweimal wie zuvor, jedoch bei 60ºC für 5 Minuten, gewaschen.
Nach Stehen für 2 Stunden bei Raumtemperatur werden die einzelnen Vertiefungen dreimal mit 250 µl Phosphatpufferlösung mit einem Gehalt an 0,9% NaCl gewaschen. Anschließend werden 150 µl Pufferlösung (0,1 M Tris -HCl-Pufferlösung mit einem Gehalt an 0,1% Rinderserumalbumin und 100 mM Magnesiumchlorid [pH-Wert: 9,5]) mit einem Gehalt an 0,38 mM BCIP (p-Toluidinsalz - Wako) zu dem Reaktionsgemisch gegeben und für 1 Stunde bei 37ºC umgesetzt.
Nach dieser Zeit werden 500 µl des Lumineszenzreagenzes (Tris HCl- Pufferlösung mit einem Gehalt an 0,12 mM Isoluminol und 0,5 µM Mikroperoxidase [pH-Wert: 9,5]) zu 100 µl der Reaktionslösung gegeben, und von 15 Sekunden bis 21 Sekunden nach der Zugabe wird die integrierte Lumineszenzintensität für 6 Minuten unter Verwendung eines Lumineszenzmeßgerätes (Aloka) gemessen.

Claims

1. Verfahren zum Nachweis einer Substanz, wobei der Nachweis die Umwandlung eines 3-O-Indoxylesters oder von Estern in eine entsprechende Indigo-Verbindung über die Einwirkung eines geeigneten Enzyms oder geeigneter Enzvme umfaßt, dadurch gekennzeichnet, daß das Wasserstoffperoxid-Bildungspotential bestimmt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, das folgende Stufen umfaßt;

A) gegebenenfalls wird eine Probe in einer geeigneten flüssigen Form, wie einer Suspension oder Lösung, hergestellt;

B) die Probe wird in Kontakt mit einer Phase gebracht, die imstande ist, die Substanz, die nachgewiesen werden soll, selektiv zurückzuhalten;

c) vorzugsweise wird die Phase gewaschen, um alles zu entfernen, was nicht von der Phase zurückgehalten wird; entweder: D) (i) eine Zubereitung von Material, das spezifisch für die Substanz ist, die nachgewiesen werden soll, wird mit der Phase in Kontakt gebracht und vorzugsweise wird gewaschen, um Material, das von der Phase nicht zurückgehalten wird, zu entfernen; und (ii) eine Zubereitung des Enzyms wird in Kontakt mit der Phase gebracht, wobei das Enzym an einen Träger gebunden ist, der spezifisch für das Material ist;

oder: E) eine Zubereitung des Enzyms wird in Kontakt mit der Phase gebracht, wobei das Enzym an einen Träger gebunden ist, der spezifisch für die Substanz ist, die nachgewiesen werden soll;

F) die Phase wird zur Entfernung aller Substanzen, die nicht zurückgehalten werden, gewaschen;

G) ein 3-O-Indoxylester wird in Kontakt mit der Phase gebracht; und

H) Wasserstoffperoxid wird nachgewiesen, wahlweise nach Ablauf einer Reaktion zwischen dem Enzym und dem 3-O-Indoxylester für eine festgelegte Zeitspanne.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Phase nach jeder der Stufen B, D(i)/E gewaschen wird, um alles zu entfernen, was nicht davon zurückgehalten wird.

4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, wobei die Phase Festphasenantikörper oder einen Filter für einen Nucleotidsequenz-Blot umfaßt.

5. Verfahren näch einem der Ansprüche 2 bis 4, wobei mindestens einer der Bestandteile Phase, Material und Träger und vorzugsweise alle diese Bestandteile spezifisch auf die Substanz beschränkt sind, die nachgewiesen werden soll.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, wobei die Stufen B - E in einer beliebigen Reihenfolge durchgeführt werden, sofern keine Waschstufe erfolgt, bevor Stufe B durchgeführt worden ist.

7. Verfahren nach einen der Ansprüche 2 bis 6, wobei die Stufen G und H gleichzeitig durchgeführt werden.

8. Verfahren nach Anspruch 1, das folgende Stufen umfaßt;

B) die Probe wird in Kontakt mit einer Phase gebracht, die imstande ist, selektiv die Substanz, die nachgewiesen werden soll, zurückzuhalten;

C) eine festgelegte Menge einer Stammzubereitung von ci markierter Nachweissubstanz wird in Kontakt mit der Phase in einer ausreichenden Menge gebracht, um das Rückhaltevermögen der Phase zu sättigen, und es wird eine ausreichende Zeit gelassen, um eine Konkurrenz von markierter und nicht markierter Substanz zu ermöglichen;

D) vorzugsweise wird die Phase gewaschen, um alles zu entfernen, was von der Phase nicht zurückgehalten wird;

E) wenn es sich bei der Markierung nicht um ein Enzym handelt, wird die Zubereitung des Enzyms in Kontakt mit der Phase gebracht, wobei das Enzym an einen Träger gebunden ist, der spezifisch für die Markierung ist;

F) die Phase wird gewaschen, um alle Substanzen, die nicht zurückgehalten werden, zu entfernen;

G) ein 3-O-Indoxylester wird in Kontakt mit der Phase gebracht; und

H) Wasserstoffperoxid wird nachgewiesen, vorzugsweise nach Ablauf der Reaktion für eine festgelegte Zeitspanne.

9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei Stufe D durchgeführt wird.

10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, wobei die Markierung ein beliebiges Material ist, das dazu dient, die Stammzubereitung der Substanz, die nachgewiesen werden soll, zu charakterisieren.

11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Markierung ein Komplex zwischen einer Zubereitung der Substanz, die nachgewiesen werden soll, und einem Antikörper oder ein Konjugat zwischen der Substanz, die nachgewiesen werden soll, und dem Enzym ist.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 11, wobei die Phase Festphasenantikörper oder einen Filter für einen Nucleotidsequenz-Blot umfaßt.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 12, wobei mindestens einer der Bestandteile Phase, Material und Träger und vorzugsweise alle diese Bestandteile spezifisch auf die Substanz, die nachgewiesen werden soll, beschränkt sind.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 13, wobei die Stufen B - E in einer beliebigen Reihenfolge durchgeführt werden, sofern keine Waschstufe durchgeführt wird, bevor die beiden Stufen B und C abgeschlossen sind.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 14, wobei die Stufen F und G gleichzeitig durchgeführt werden.

16. Verfahren nach Anspruch 1, wobei eine Enzymelektrode eingesetzt wird, die einen Antikörper, der spezifisch für die Substanz, die nachgewiesen werden soll, gebunden an eine exponierte Oberfläche einer selektiv permeablen Membran, die die Elektrode schützt, aufweist, und das Verfahren folgende Stufen umfaßt:

B) die Probe wird in Kontakt mit den gebundenen Antikörper gebracht;

C) die Elektrode wird vorzugsweise gewaschen, um alles, was nicht von dem gebundenen Antikörper zurückgehalten wird, zu entfernen;

entweder: D) (i) eine Zubereitung von Material, das spezifisch für die Substanz ist, die nachgewiesen werden soll, wird mit der Elektrode in Kontakt gebracht, und vorzugsweise wird gewaschen, um Material, das von dem gebundenen Antikörper nicht zurückgehalten wird, zu entfernen; und (ii) eine Zubereitung des Enzyms wird in Kontakt mit der Elektrode gebracht, wobei das Enzym an einen Träger gebunden ist, der spezifisch für das Material ist;

oder: E) eine Zubereitung des Enzyms wird in Kontakt mit der Elektrode gebracht, wobei das Enzym an einen Träger gebunden ist, der spezifisch für die Substanz ist, die nachgewiesen werden soll;

F) die Elektrode wird gewaschen, um alle Substanzen, die nicht zurückgehalten werden, zu entfernen;

G) eine Zubereitung eines 3-O-Tndoxylesters wird zusammen mit Ferrocen oder einer ähnlichen Substanz in Kontakt mit der Elektrode gebracht; und

H) der Strom an der Elektrode wird gemessen.

17. Verfahren nach Anspruch 16, wobei die Elektrode nach Stufe B und, wo dies in Betracht kommt, nach Stufe D(i) gewaschen wird.

18. Verfahren nach Anspruch 16, wobei die Stufen B - E in einer beliebigen Reihenfolge durchgeführt werden, sofern keine Waschstufe stattfindet, bevor Stufe B durchgeführt wird.

19. Verfahren nach Anspruch 1, wobei eine Enzymelektrode verwendet wird, die auf einem magnetisierbaren Substrat angeordnet ist, und das Verfahren folgende Stufen umfaßt:

A) Antikörper, der spezifisch für die Nachweissubstanz ist, wird an magnetische Teilchen gebunden;

B) die hergestellten Teilchen Von Stufe A werden mit einer Probe und einer Zubereitung eines zweiten Antikörpers, der spezifisch für die Substanz ist, die nachgewiesen werden soll, gemischt;

C) das Gemisch von Stufe B wird dann in Kontakt mit der Elektrode und dem nagnetisierten magnetisierbaren Substrat gebracht;

D) die Elektrode wird gewaschen, um alle Bestandteile des Gemisches, die nicht zurückgehalten werden, zu entfernen, wobei das Substrat währenddessen magnetisiert bleibt;

E) eine Zubereitung eines 3-O-Indoxylesters wird zusammen mit Ferrocen oder einer ähnlichen Substanz in Kontakt mit der Elektrode gebracht; und

F) der Strom an der Elektrode wird bestimmt.

20. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der 3-O-Indoxylester die folgende allgemeine Formel (I) aufweist:

worin R¹, R² , R³ und R&sup4; gleich oder verschieden sein können und jeweils ein Wasserstoffatom oder eine kleine elektrophile Gruppe darstellen;

Ra ein Wasserstoffatom oder eine Acylgruppe von Rb darstellt; und

Rb eine beliebige Acyloxygruppe darstellt.

21. Verfahren nach Auspruch 20, wobei mindestens einer der Reste R¹ - R&sup4; eine kleine elektrophile Gruppe darstellt.

22. Verfahren nach Anspruch 21, wobei die elektrophile Gruppe eine Cyanogruppe, eine Aminogruppe, eine mit 1 oder 2 Methyl- oder Ethylgruppen substituierte Aminogruppe, eine Trifluormethylgruppe, eine Hydroxygruppe, ein Halogenatom oder eine Methyl-, Ethyl-, Methoxy- oder Ethoxygruppe ist.

23. Verfahren nach Anspruch 20, wobei jeder der Reste R¹ - R¹ Wasserstoff oder Halogen darstellt.

24. Verfahren nach Anspruch 21, wobei die elektrophile Gruppe Brom oder Chlor ist.

25. Verfahren nach Anspruch 20, wobei einer oder zwei der Substituenten R¹ - R&sup4; Halogenatome darstellen und die restlichen Wasserstoff darstellen.

26. Verfahren nach Anspruch 20, wobei einer der Substituenten R¹ - R&sup4; ein Bromatom darstellt und die restlichen Wasserstoffatome darstellen.

27. Verfahren nach Anspruch 20, wobei einer der Substituenten R¹ - R&sup4; ein Bromatom darstellt, einer der Substituenten R¹ - R&sup4; ein Chloratom darstellt und die restlichen Wasserstoff darstellen.

28. Verfahren nach einem der Ansprüche 20 bis 27, wobei jeder der Reste R³ und R&sup4; Wasserstoff darstellt, einer oder beide Reste und R¹ eine R² elektrophile Gruppe darstellen und, wenn einer der Reste R¹ und R² kein Halogen darstellt, dieser Substituent dann Wasserstoff darstellt.

29. Verfahren nach einem der Ansprüche 20 bis 28, wobei Ra ein Wasserstoffatom darstellt.

30. Verfahren nach einem der Ansprüche 20 bis 29, wobei Ra eine Acylgruppe darstellt, die von einer anorganischen Säure oder einer einfachen organischen Säure abgeleitet ist.

31. Verfahren nach Anspruch 30, wobei Ra eine Acylgruppe, die von Phosphorsäure, Phosphonsäure, Schwefelsäure, Sulfonsäure oder Kohlensäure abgeleitet ist, darstellt.

32. Verfahren nach Anspruch 30, wobei Ra von Essigsäure, Propansäure, Butansäure und Isomeren davon, Brenztraubensäure, einer Zuckersäure oder einer L-Aminosäure abgeleitet ist.

33. Verfahren nach einem der Ansprüche 20 bis 32, wobei Rb ein Phosphat, Acetat, Galactopyranosid, Sulfat, Glucuronat, Glucopyranosid, Fructopyranosid oder Mannopyranosid ist.

34. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der 3-O-Indoxylester ein Salz ist.

35. Verfahren nach Anspruch 34, wobei das Salz ein p-Toluidinsalz, ein Mono- oder Dinatriumsalz oder ein Monocyclohexylammoniumsalz ist.

36. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der 3-O-Indoxylester das 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat, das 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat-dinatriumsalz, das 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat-p-toluidin-salz, das 3-Indolylphosphat-dinatriumsalz, das 3-Indolylphosphat-p-toluidinsalz, das 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid, das 5-Brom-3-indolyl-β-D-µgalactopyranosid, das 5-Brom-4-chlor-3- indolylacetat, das 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-1,3-diacetat, das 5-Brom-6-chlor-3-indolylacetat, das. 5-Brom-4-chlor-3-indolylsulfat-p-toluidin-salz, das 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D- glucopyranosid oder das 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-glucuronat-monocyclohexylammoniumsalz ist.

37. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Enzym alkalische Phosphatase, β-D-Galactosidase, Esterase, Acetylcholinesterase, Alkylsulfatase, Sulfatase, β- D-Glucosidase oder β-D-Glucuronidase ist.

38. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Wasserstoffperoxid colorimetrisch, fluorimetrisch und vorzugsweise durch Chemolumineszenz nachgewiesen wird.

39. Verfahren nach Anspruch 38, wobei die Technik die Colorimetrie ist und das Reagenz 1,2-Diamonibenzol oder 2,2'- Amino-bis(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonsäure) umfaßt.

40. Verfahren nach Anspruch 38, wobei die Technik die Fluorimetrie ist und das Reagenz p-Hydroxyphenylpropionsäure, Tyramin oder Homovalin umfaßt.

41. Verfahren nach Anspruch 38, wobei die Technik die Chemolumineszenz ist und das Reagenz Luminol, Isoluminol, N- (4-Aminobutyl)-N-ethyl-luminol oder ein anderes Luminoldenvat, Lucigenin, Acridium, Pyrogallol, Oxalat, Bis(2,4,6- trichlorphenyl)oxalat, Bis(2,4-dinitrophenyl)oxalat, Pentafluorphenyloxalat oder ein anderes Oxalatderivat in Verbindung mit einem Farbstoff und einem Oxidationskatalysator, sofern erforderlich, ist.

42. Verfahren nach Anspruch 41, wobei der Farbstoff 8- Anilinonaphthalin-1-sulfonsäure, Fluorescein, Rhodamin, Pyren oder Dansylchlorid umfaßt.

43. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Enzym an einen Träger dafür gebunden ist.

44. Verfahren nach Anspruch 43, wobei der Träger ein Antikörper, die Substanz, die nachgewiesen werden soll, oder eine Oligonucleotidsonde ist.

45. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei es mit einer physiologischen Flüssigkeit oder geeignet hergestellten Biopsieprobe durchgeführt wird.

46. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Substanz, die nachgewiesen werden soll, α-Foetoprotein, carcinoembryogenes Antigen, ein Peptidhormon, ein Steroidhormon, ein Immunglobulin oder ein Arzneistoff ist.

47. Reagenzsatz zur Durchführung des Nachweises gemäß der Definition in Anspruch 1, umfassend einen 3-O-Indoxylester oder Ester, ein Enzym oder Enzyme, die für die Umwandlung des Indoxylesters oder der Ester in die entsprechenden Indigoverbindungen geeignet sind, und Mittel zum Nachweis des Wasserstoffperoxid-Bildungspotentials