DE2927054A1 - Testzusammensetzung zur bestimmung von kreatinin, verfahren zu deren herstellung und testeinrichtungen, welche dieselbe enthalten - Google Patents
Testzusammensetzung zur bestimmung von kreatinin, verfahren zu deren herstellung und testeinrichtungen, welche dieselbe enthaltenInfo
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Description
HOFFMANN · EITX.E «& PARTNER
DIPL.-ING. K. FUCHSIE · DR. RER. NAT. B. H ANS EN
ARABELLASTRASSE 4 (STERNHAUS) · D-8000 MÖNCHEN 81 ■ TELEFON (089) 911087 · TELEX 05-29619 (PATHE)
32 28o o/fg
Miles Laboratories, Inc., Elkhart, Indiana / USA
Testzusammensetzung zur Bestimmung von Kreatinin,Verfahren
zu deren Herstellung und Testeinrichtungen, welche dieselbe enthalten
Die Erfindung betrifft ganz allgemein das Gebiet von Zusammensetzungen
für Diagnosetests und insbesondere Diagnosetests, die für die Bestimmung von Kreatinin und dessen
enzymatischen Produkten geeignet sind.
Kreatinin ist ein Produkt des endogenen Metabolismus von Muskeln. Die Menge an Kreatinin im Urin steht in Beziehung
zur Gesamtmuskelmasse und dem Grad der Muskelaktivität.
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Keine Beziehung besteht zu den mit der Nahrung zugeführten und verdauten Proteinen. Kreatinin stammt hauptsächlich aus
Kreatin und Phosphokreatin bei dem Energiefreimachungsprozess in verschiedenen Körpergeweben, hauptsächlich Muskelgeweben.
Die Menge an Kreatinin im Urin von Einzelpersonen ist bemerkenswert
konstant und unterliegt nur geringen täglichen Änderungen. Messungen von im Urin enthaltenen Kreatinin
können zur Bestimmung der Genauigkeit von 24-Stunden-Urin-Sammlungen verwendet werden. Normale Kreatininausscheidungsmengen
liegen bei o,6 bis 1,5 g/Tag bei Frauen und bei
1 ,o bis 2,ο g/Tag bei Männern. Kreatinin wird nahezu vollständig
in den Nierenröhrchen reabsorbiert, so dass nur eine geringe Menge, nämlich weniger als 1oo mg/24 h im Urin
gefunden wird. Deshalb ist das Schwergewicht bei der Bestimmung von Kreatinin bei der Urinmarkierung. Bei der Mehrzahl
von klinischen Zuständen, bei denen eine Urinanalyse Teil der Diagnose darstellt, bleibt das Kreatininniveau
konstant und es erfolgt eine Messung des Volumens und der Konzentration oder der Urinabseheidung bei solchen Patienten.
Urinäres Kreatinin kommt in den frühen Stadien der Muskeldystrophie
in erhöhtem Masse vor, wenn der Muskelabbau schnell abläuft und bei allen zehrenden Krankheiten, einschliesslich
Gewebekatabolismus. Urinäres Kreatinin wird in verstärktem Masse gebildet bei schwerer und anstrengender Muskelaktivität
und Hyperthyroidismus. Die Bildung von urinärem Kreatinin nimmt während der späteren Stadien von Muskeldystrophie
ab und immer dann, wenn die Nierenfunktion geschwächt ist. Urinäres Kreatinin erhöht sich bei den gleichen Krankheitszuständen,
bei denen eine Erhöhung an urinärem Kreatinin erfolgt.
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Die bekannteste Methode zur Bestimmung von Kreatinin ist die nicht-enzymatische Jaffe-Methode, die die Bildung einer
orangeroten Farbe mit alkalischer Picratlösung einschliesst. Dieses Verfahren ist jedoch nicht für Kreatinin spezifisch,
weil viele Pseudokreatininsubstanzen auch mit alkalischem Picrat reagieren. Verschiedene Versuche zur Verbesserung
der Jaffe-Methode sind in Clinical Chemistry auf den Seiten
541 und ff. von Henry und in US-PS 3 7o5 o13 diskutiert
worden. Alle diese Versuche basieren auf einer nicht-enzymatischen
Farbentwicklung bei der Quantifizierung von Kreatinin.
Viele Forscher haben nach einer Enzymquelle, die für die
Kreatininbestimmung geeignet ist, gesucht. Kreatin und dessen
Anhydrid, Kreatinin kommen nicht in Bakterien, Hefe oder Schimmel vor. Aber über 4o verschiedene Bakterienstämme
und Hefen wurden gefunden, die in der Lage sind, Kreatin und Kreatinin zu verwerten. Aus der Literatur sind wenigstens
vier verschiedene enzymatische Pfade bekannt, mittels welcher Bakterien und Schimmelpilze Kreatin metabolisieren
können.
Deshalb wurden geeignete lösliche Enzyme gesucht, die spezifisch messbare Reaktionen von Kreatinin katalysieren
könnten. U.a. wurden Kreatinase, Kreatininase und eine Glycocyaminase
gefunden. Ein Enzym, das als Kreatin-Mutase bezeichnet wurde, wurde aus. Bodenbakterien isoliert und ist
verantwortlich für die Gleichgewichtseinstellung zwischen Kreatinin und Kreatin.
Aus US-PS 3 8o6 416 sind zwei Enzyme bekannt, die als Kreatininamidohydrolase
und Kreatinamidinohydrolase bezeichnet
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werden und aus Älcaligenes spec. WS 514oo und Penicillium
WS 9ooo1 hergestellt werden. Von ersterem Enzym ist bekannt, dass es Kreatinin in Kreatin überführt und vom letzteren,
dass es Kreatin in Sarcosin und Harnstoff umwandelt. Aus US-PS
3 006 42o ist ein Verfahren zur Herstellung dieser Enzyme aus diesen Stämmen bekannt.
In US-PS 3 9o7 644 wird eine Kreatininnachv/eismethode beschrieben,
bei welcher eine wässrige kreatininhaltige Lösung mit Kreatininamidohydrolase bei einem pH zwischen 7,5 und
inkubiert wird und entweder das gebildete Kreatinin oder die Abnahme von Kreatin in bekannter Weise bestimmt wird. Weiterhin
wird die Verwendung von Kreatinase, auch als Kreatinamidinohydrolase
bezeichnet, zur Umwandlung von Kreatin in Sarcosin und Harnstoff offenbart. Das Sarcosin und der Harnstoff
können in üblicher Weise bestimmt werden. Eine Reagenskombination wird gezeigt, die einen Kreatininstandard, Picrinsäure,
eine wässrige Lösung von NaOH und Kreatininamidohydrolase allein oder zusammen mit Puffer und gewünsentenfalls
in Mischung mit Kreatinase in unvermischtem Zustand vor der Anwendung enthält. Eine andere Reagenskombination enthält
einen Puffer, reduziertes Nikotinamid-adenindinucleotid (NADH), Adenosintriphosphat (ATP)und Phosphoenolpyruvuat (PEP);
Lactatdehydrogenase (LDH),Pyrovatkinase (PK) und Magnesiumchlorid;
(3) Kreatinkinase und (4) Kreatiniamidohydrolase.
Trotz dieser Bemühungen in früheren Arbeiten auf diesem Gebiet besteht weiterhin die Schwierigkeit, dass die benötigten
Reagentien nicht in einer einzigen wässrigen Lösung verträglich sind. Weiterhin benötigte man bei den Versuchen
kaustische Reagentien, wie starke Säuren oder Basen. Es ist
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deshalb bisher nicht möglich gewesen, eine alle Bestandteile
enthaltende Testzusammensetzung zur Verfügung zu stellen, oder
die Testreagentien in einem leicht verwendbaren Format zu vereinen.
Weiterhin waren die bisherigen Tests so ausgerichtet, dass man die Absorption in ultraviolettem Licht mass, und dies
machte zeitraubende Verfahren und kostspielige Ausrüstungen erforderlich.
Es ist ein Hauptziel der Erfindung," einen verbesserten Test zur Bestimmung von Kreatinin und dessen enzymaischen Produkten
zu zeigen.
Ein weiteres Ziel der Erfindung ist es, eine Testeinrichtung für Kreatinin zu zeigen, z.B. eine Zusammensetzung oder eine
Vorrichtung, die besonders geeignet ist für die Prüfung von Proben aus Körperflüssigkeiten.
Eine Aufgabe der Erfindung besteht auch darin, einen Kreatinintest
zu zeigen, der mit dem Auge abgelesen werden kann.
Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung einen Kreatinintest, bei dem im wesentlichen keine kaustischen Reagentien
verwendet werden.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, einen Kreatiniritest
zu zeigen, der die vorerwähnten Vorteile aufweist und in Form einer Zusammensetzung vorliegt aus einem Kreatinin
hydrolysierenden Enzym, Kreatinamidinohydrolase, Sarcosindehydrogenase
und einem Tetrazoliumindikator.
Weitere Ziele und ein besseres Verständnis der Erfindung gehen aus der folgenden Beschreibung und den dort beschriebenen
bevorzugten Ausfuhrungsformen hervor.
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2S27054
Erfindungsgemäss wird eine Testeinrichtung gezeigt, wie eine
Zusammensetzung oder eine Vorrichtung, ein Verfahren zur Herstellung der Testeinrichtung und ein Verfahren zur Bestimmung
von Kreatinin und dessen enzymatisehen Produkten.
Insbesondere wird Kreatinin gemessen, indem man eine zu untersuchende Flüssigkeitsprobe mit dieser Testeinrichtung
in Berührung bringt, z.B. einer Zusammensetzung enthaltend ein Kreatinin hydroIysierendes Enzym, Kreatininamidinohydrolase,
Sarcosindehydrogenase und einen Tetrazoliumindikator, und dass man die entstehende Farbänderung beobachtet. Ein
farbiges Formazan wird im Verhältnis zu dem vorhandenen Kreatinin gebildet. Die Empfindlichkeit des Systems wird
erhöht und die Nachweisgrenzen erniedrigt, wenn man Forma1-dehyd-*-
dehydrogenase, Diaphorase und Nikotinamidadenindinucleotid (NAD) zugibt. Kreatinin oder Sarcosin werden in
diesem System durch Fortfall des Kreatinin hydrolysierenden Enzyms bzw. des Kreatinin hydrolysierenden Enzyms und der
Kreatinamidinohydrolase gemessen. Die Enzyme, Tetrazoliumfarbstoffe und anderen Komponenten sind miteinander verträglich
und können in einer einzigen Lösung vereint werden. Diese Zusammensetzung wird vorteilhaft in einem Träger, einer
Matrix oder einer Tablette vereint und bildet so eine Testeinrichtung.
Gemäss einer bevorzugten Ausfuhrungsform ist der verwendete
Tetrazoliumindikator 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazoliumbromid^thiazolylblau,MTT7.
Andere Tetrazoliumfarbstoffe, die auch verwendet werden können, schliessen ein 2-p-Iodophenyl-3-p-nitrophenyl-5-phenyl-2H-tetrazoliumchlorid/INT),
3,3'-(3,3'-Dimethoxy-4,4'-biphenylen)-bis-(2-p-nitrohpenyl-5-phenyl-2H-tetrazQliumchlorid)
[_ Nitroblau-tetrazolium, ΝΒΤ7 und 3,3'-Dimethoxy-4,4'-biphenylen)-bis-(2,5-p-nitrophenyl-2H-tetrazoliumchlorid
[_ Tetranitroblau-tetrazolium, TNBT_7·
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Von den Kreatinin hydrolysierenden Enzymen, die erfindungsgemäss
brauchbar sind, wird Kreatininamidohydrolase besonders bevorzugt.
Gemäss einer anderen Ausführungsform zur Bestimmung von Kreatin
anstelle von Kreatinin enthält die Zusammensetzung im wesentlichen Kreatininamidinohydrolase/ Sarcosindehydrogenase
und einen Tetrazoliumindikator. Auch hier ist der bevorzugte Indikator Thiazolylblau.
Die bisher nicht erkannten Eigenschaften und Vorteile der vorliegenden Erfindung beruhen wahrscheinlich auf dem nachfolgenden
Mechanismus, obwohl dies keine Theorie ist, auf welcher die Erfindung in jedem Fall basiert.
Die Messung von Kreatinin wird durch Bestimmung des Produktes erzielt, das gebildet wird, wenn das Kreatinin hydrolysierende
Enzym die Hydrolyse von Kreatinin zu Kreatin gemäss der Reaktion (1) katalysiert.
Kreatinin hydrolysierendes Enzym Kreatinin + H3O : ^ Kreatin (1)
Das so gebildete Kreatin wird unter Verwendung von Kreatinamidinohydrolase,
Sarcosindehydrogenase und dem Tetrazoliumindikator, z.B. Thiazolylblau (MTT), gemäss den Reaktionen
(2) und (3) bestimmt.
v ^. A „ n Kreatinamidinohydrolase Sarcosin + Harnstoff (2)
Kreatin + H3O 7?
Bei der Reaktion (2) katalysiert die Kreatinamidinohydrolase
die Hydrolyse von Kreatin zu Sarcosin und Harnstoff. Daran schliesst sich die oxidative Demethylierung von Sarcosin
zu Formaldehyd und Glycin mittels Sarcosindehydrogenase in der Reaktion (3) an. Das MTT dient als Wasserstoffakzeptor
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in der späteren Reaktion und wird in das gefärbte Formazan
in stöchiometrischen Mengen umgewandelt; d.h. dass für jedes Molekül Kreatinin,das bei der Reaktion (1) hydrolysiert wird,
ein Mol MTTH2 (reduzierte Form von MTT) gemäss Gleichung (3)
gebildet wird.
Sarcosindehydrogenase S ar cos in + MTT+H2O y? ,.,.
MTTH2 + Formaldehyd + Glycin.
Die drei Enzyme und der Tetrazoliumindikator sind miteinander
verträglich und können in einer einzigen wässrigen Lösung enthalten sein. Nach Zugabe einer Kreatinin enthaltenden Probe
wird die Menge der gebildeten Farbe gemessen. Die Menge der entwickelten Farbe zu jeder gegebenen Zeit ist proportional
zu der Kreatininkonzentration und deshalb liegt eine Endpunktsund eine den Grad anzeigende Untersuchungsmethode vor.
Fig. 1 ist eine grafische Darstellung der in Beispiel I aufgezeichneten
Daten für eine Kreatxnintestzusammensetzung gemäss der Erfindung, die man durch Auftragen der Absorption gegen
die Kreatininkonzentration erhält.
Obwohl in der nachfolgenden Beschreibung aus Gründen der Klarheit bestimmte Ausdrücke verwendet werden, sollen sich diese
Ausdrücke nur auf die jeweilige Ausführungsform der Erfindung,
wie sie in den Beispielen gezeigt wird, beziehen und in keiner Weise den Umfang der Erfindung definieren oder begrenzen.
Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform enthält die erfindungsgemässe
Zusammensetzung Kreatininamidohydrolase, Kreatinamidinohydrolase, Sarcosindehydrogenase und Thiazolylblau. Die Empfindlichkeit
kann weiterhin dadurch erhöht werden, dass man Formaldehyddehydrogenase,
Diaphorase und Nicotinamidadenindinucleotid (NAD) hinzufügt.
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ORIGINAL INSPECTED
Die Zusammensetzung kann weiterhin Stabilisierungsmittel enthalten,
wobei Carboxymethylcellulose und Polyoxyäthylenäther von Fettalkoholen (BRIJ hergestellt von ICI United States, Inc.,
Wilmington, Delaware 19897/USA) mit Vorteil ausgewählt werden.
Diese sind in einer Gesamtkonzentration von wenigstens etwa o,5 mg/dl in den wässrigen Lösungen enthalten. Weiterhin können
oberflächenaktive Mittel oder Dispergiermittel wie TRITON X-too (Rohm & Haas Inc. Philadelphia, PA/USA) verwendet werden. Ein
pH-Bereich zwischen etwa 7,5 und etwa 9 wird bevorzugt.
Die Aktivität der Enzymzubereitung wird durch die Anzahl der Aktivitätseinheiten pro mg Trockengewicht gemessen. Die Kommission
für Enzyme der internationalen Union der Biochemiker hat einen interantionale Einheit (I.U.) als die Enzymaktivität
bestimmt, bei welcher ein Mikromol ( ,uMol) des Substrates pro
Minute unter spezifizierten pH- und Temperaturbedingungen verbrauchtwird. Der Tetrazoliumindikator und NAD werden in
Millimol-(mMol) Konzentrationen angegeben.
Eine erfindungsgemässe Lösung kann unter Verwendung von physiologischen
Lösungen, organischen Lösungsmitteln under Mischungen davon, hergestellt werden. Der bevorzugte Konzentrationsbereich
der Mischungskomponenten ist:
Kreatini hydrolysierendes Enzym 32 - 38 I.ü./ml
Kreatinamidxnohydrolase 16 - 2o I.U./ml
Sarcosindehydrogenase 1-2 I.U./ml
Tetrazoliumindikator 1 - .2 mMol und,- sofern verwendet,-
Formaldehyddehydrogenase 1-4 I.U./ml
Diaphorase 1-5 I.U./ml
NAD 4-6 mMol
Die Lösung selbst, welche die Zusammensetzung gemäss der Erfindung
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enthält, kann zur Bestimmung von Bestandteilen in Körperflüssigkeiten
verwendet werden, indem man sie zu Proben der Körperflüssigkeit, wie Urin, Plasma oder Serum, gibt. Dabei
wird ein chromophorer Komplex mit einer entsprechenden Farbänderung bewirkt. Die erfindungsgemässe Verbindung wird jedoch
vorteilhaft in Form einer festen Zubereitung im Gegensatz zu der Lösung selbst angewendet.
Vorgesehen sind auch Testvorrichtungen, welche die erfindungsgemässen
Zusammensetzung enthalten und Verfahren zur Herstellung solcher Reagenstestvorrichtungen, bei denen man einen
Träger, wie eine Matrix oder eine Tablette mit der Zusammensetzung in Berührung bringt. Erfolgt dieses j^Berührungbringen
durch Imprägnieren mit der Lösung der Zusammensetzung gemäss der Erfindung, so kann der Träger anschliessend getrocknet
werden. Ausser Imprägnieren können die erfindungsgemässen Vorrichtungen
aber auch auf andere Weise hergestellt werden, z.B. durch Drucken oder Sprühen der Zusammensetzungen auf ein
Substrat oder eine Matrix. Als Lösungsmittel zur Herstellung der Lösungen für das jeweilige Verfahren können Wasser, physiologische
Lösungen, organische Lösungsmittel oder Mischungen davon verwendet werden.
Die Konzentration der zur Herstellung der Imprägnierlösungen verwendeten Reagenfcien liegen in folgenden Bereichen:
Kreatinin hydrolysierendes Enzym 32ö - 38o I.ü./ml
Kreatinamidinohydrolase 80 - 9o I.ü./ml
Sarcosin dehydrogenase 2 - 2o i.ü./ml
Tetrazoliumindikator 2 - 2o mMol '
und, sofern verwendet
Formaldehyddehydrogenase 1o - 4o I.U./ml .
Diaphorase 1o - 5o I.U./ml
NAD 4o - 60 mMol
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Feste Zubereitungen, wie sie nachfolgend beschrieben werden,
werden vorzugsweise mit einer Trägermatrix in Streifenform vereint. Der Ausdruck Trägermatrix umfasst Feuchtigkeit aufnehmende
und nicht Feuchtigkeit aufnehmende Matrices, die unlöslich sind und ihre strukturelle Integrität in Wasser oder
physiologischen Flüssigkeiten beibehalten. Geeignete Feuchtig^-
keit aufnehmende Matrices sind z.B. Papier, Cellulose, Holz, synthetische Faservliese, gewebte und nicht gewebte Stoffe und
dergleichen. Nicht Feuchtigkeit aufnehmende Matrices schliessen organoplastische Stoffe, wie Polystyrol, Polypropylen und
dergleichen ein. Wird eine Feuchtigkeit aufnehmende Matrix verwendet, so wird die Matrix vorteilhaft auf einer geeigneten
Vorrichtung befestigt, z.B. mittels doppelseitigem Klebepapier auf einen unlöslichen Träger, wie einen organoplastischen
Streifen, um die Handhabung zu erleichtern.
Alternativ können die erfindungsgemässen Zusammensetzungen
mit einem Träger in Form einer verpressten oder verformten Tablette, welcher die üblichen Trägermaterialien enthält, eingebettet
werden.
Die Testvorrichtung wird vorteilhaft verwendet, indem man sie kurz in die zu prüfende Probe eintaucht oder auf andere Weise
die Testprobe in die Trägermatrix einbringt, und dadurch ergibt sich eine merkliche Farbänderung, sofern Kreatinin vorhanden ist.
Da die typische Farbreaktion in Abhängigkeit von den Kreatininkonzentrationen
erfolgt, ist eine quantitative Bestimmung möglich. Die Testvorrichtung kann in gleicher Weise auch verwendet
werden, wenn Plasma-, Serum- oder andere Körperflüssigkeitsproben
geprüft werden.
Die Beispiele sind nur beschreibend und beschränken die Erfindung nicht. Für jeden Fachmann ist ersichtlich, dass er Veränderungen,
Ergänzungen und dergleichen in den Bestandteilen und Parametern vornehmen kann, sofern dies wünschenswert ist.
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Eine Zusammensetzung zur Bestimmung von Kreatinin in einer Probe wird im nachfolgenden Beispiel beschrieben.
Dei Zusammensetzung wird in einer Lösung .gemäss der in Tabelle
angegebenen Formulierung hergestellt.
Kreatin hydrolysierendes Enzym, 35o Einheiten/ml o,1 ml
Kreatinamidinohydrolase, 9o Einheiten /ml o,2 ml
Sarcosindehydrogenase, 2 Einheiten/ml o,5 ml
MTT, 10 mMol in 1 % TRITON X-1oo o,1 ml
Kaliumphosphat, pH 7,5, 0,1 m o,1ml
Die oben erwähnten Reagentien werden miteinander vermischt und auf 37°C vorerhitzt. Dann gibt man eine 1o bis 1oo Nanomol
Kreatinin enthaltende Probe hinzu und inkubiert 6o Minuten bei 37 C. Danach wird die Absorption der Lösung bei 57o Nanometer
gemessen. Die Absorption einer Blindlösung, enthaltend alle Reagentien der Tabelle 1, aber ohne die zu untersuchende Probe,
wird von der Absorption der Probe abgezogen, um den wahren Absorptionswert zu erzielen. Der Gehalt der Probe wird bestimmt,
indem man das Ergebnis mit dem einer Serie von Kreatininstandards einer Konzentration von 25, 5o und 1oo Nanomols, die
mit der gleichen Verfahrensweise durchgeführt wurden, vergleicht.
Fig. 1 zeigt die Ergebnisse, die nach diesem Verfahren erhalten wurden. Diese Ergebnisse bestätigen den quantitativen Nachweis
von Kreatinin.
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Die Empfindlichkeit des in Beispiel 1 beschriebenen Systems wird erhöht und die Nachweisgrenze erniedrigt, wenn man die
Zusammensetzung so verändert, dass sie auch noch einschliesst:
Formaldehyddehydrogenase, 3o I.U./ml o,1 ml Diaphorase, 3o I.U./ml o,1 ml
NAD (3o mM) o,1 ml
Diese Reagentien werden zu Beginn der Lösung gemäss Beispiel 1
augegeben.
Die Gesamtreaktion enthält dann noch die Reaktionen (4) und (&)
Formaldehyddehydrogenase (reduziertes Formaldehyd + H2O + NAD ^NADH2 ^reduziertes
NAD) + Ameisensäure (4)
Diaphorase '
NADH2+ MTT
Die Oxidation von Formaldehyd zu Ameisensäure in der Reaktion
(4) wird durch die Formaldehyddehydrogenase unter gleichzeitiger Bildung von reduziertem NAD katalysiert. Dies letztere
Produkt wird durch das in Reaktion (5) gebildete oxidierte NAD quantitativ bestimmt. Für jedes Mol an Kreatinin,das in
Reaktion (1) hydrolisiert wurde, entstehen 2 Mol MTTH2 aus
der Summe der Reaktionen (2) bis (5).
Das in den Reaktionen (2) bis (5) beschriebene System kann auch verwendet werden zur Bestimmung von Kreatin oder Sarcosin, indem
man das erste oder das erste und das zweite Enzym weglässt.
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Die Erfindung wurde zwar verhältnismässig genau beschrieben, aber für jeden Fachmann ist es klar, dass hier nur Beispiele
gegeben wurden und dass zahlreiche Veränderungen vorgenommen werden können, ohne dass man vom Geist und Umfang der Erfindung
abweicht.
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Claims (30)
1.j Zusammensetzung zur Bestimmung von in einer zu untersuchenden Probe enthaltenen Kreatinin, dadurch gekennzeichnet , dass sie ein Kreatinin hydrolysierendes
Enzym, Kreatinamidinohydrolase, Sarcosindehydrogenase und einen Tetrazoliumindikator enthält.
2. Zusammensetzung gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass das Kreatinin hydrolysierende
Enzym Kreatininamidohydrolase ist.
ORIGINAL INSPECTED
3. Zusammensetzung gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass der Tetrazoliumindikator
Thiazolylblau, Nitroblau-tetrazolium, 2-p-Iodophenyl-3-nitrophenyl-5-phenyl-2H-tetrazoliumchlorid
oder Tetranitroblau-tetrazolium ist.
4. Zusammensetzung gemäss Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet , dass der Tetrazoliumindikator
Thiazolylblau ist.
5. Lösung, enthaltend eine Zusammensetzung gemäss Anspruch 1 und einen Puffer mit einem pH-Bereich zwischen etv/a 7,5 und
etwa 9.
6. Zusammensetzung gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass sie zusätzlich Formaldehyddehydrogenase,
Diaphorase und Nikotinamidadenindinucleotid . enthält.
7. Zusammensetzung gemäss Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet , dass sie zusätzlich Formaldehyddehydrogenase,
Diaphorase und Nikotinamidadenindinucleotid enthält.
8. Zusammensetzung gemäss Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet , dass sie zusätzlich Formaldehyddehydrogenase,
Diaphorase und Nikotinamidadenindinucleotid enthält.
9. Zusammensetzung gemäss Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet , dass sie zusätzlich Formaldehyddehydrogenase,
Diaphorase und Nikotinamidadenindinucleotid enthält.
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" 3" 29270S4
10. Zusammensetzung gemäss Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet , dass der Tetrazolium-Farbstoff
Tetrazolylblau, Nitroblautetrazolium, 2-p-Iodophenyl--3-nitrophenyl-5-phenyl-2H-tetrazoliumchlorid
oder Tetranitroblautetrazolium ist.
11. Testeinrichtung zur Bestimmung von Kreatinin in einer
Probe, gekennzeichnet durch einen Träger und eingebettet in diesen eine Zusammensetzung gemäss Ansprüchen
1 bis 5.
12. Testeinrichtung zur Bestimmung von Kreatinin in einer Probe, gekennzeichnet durch einen inerten
Träger und eingebettet darin eine Zusammensetzung gemäss Anspruch 6.
13. Verfahren zur Herstellung einer für den Kreatininnachweis
geeigneten Vorrichtung, dadurch gekennzeichnet , dass man einen Träger mit einer Lösung,
enthaltend eine Zusammensetzung gemäss Anspruch 1, in Berührung bringt und den Träger dann trocknet.
14. Verfahren zur Herstellung einer für den Kreatininnachweis
geeigneten Vorrichtung, dadurch gekennzeichnet , dass man einen Träger mit einer Lösung,
enthaltend eine Zusammensetzung gemäss Anspruch 6, in Berührung bringt und den Träger dann trocknet.
15. Verfahren zur Bestimmung von Kreatinin in einer Probe, dadurch gekennzeichnet , dass man die Probe
mit einer Vorrichtung gemäss Anspruch 11 in Berührung bringt
und die entstehende Farbänderung beobachtet.
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16. Verfahren zur Herstellung von Kreatin in einer Probe, dadurch gekennzeichnet , dass man
die Probe mit einer Vorrichtung gemäss Anspruch 11 in Berührung
bringt und die entstehende Farbänderung beobachtet.
17. Verfahren gemäss Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Beobachtung spektrofotometrisch
erfolgt.
18. Verfahren gemäss Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet , dass die Beobachtung spektrofotometrisch
erfolgt.
19. Zusammensetzung zum Nachweis von Kreatin in einer
zu untersuchenden Probe, dadurch gekennzeichnet , dass die Zusammensetzung Kreatinamidinohydrolase, Sarcosindehydrogenase
und einen Tetrazoliumindikator enthält.
20. Zusammensetzung gemäss Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet , dass der Indikator Thiazolylblau,
Nitroblautetrazolium, 2-p-Iodophenyl-3-p-nitrophenyl-5-phenyl-2H-tetrazoliumchlorid
oder Tetranitroblautetrazolium ist.
21. Zusammensetzung gemäss Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet , dass sie einen Puffer mit einem
pH zwischen etwa 7,5 und etwa 9 enthält.
22. Zusammensetzung gemäss Anspruch 19. dadurch gekennzeichnet , dass sie weiterhin Formaldehyddehydrogenase,
Diaphorase und Nikotinamidadenindinucleotid enthält.
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23. Vorrichtung zum Nachweisen von Kreatin, enthaltend eine Trägermatrix, in welcher die Zusammensetzung gemäss
Anspruch 19 eingebettet ist und zwar in einer Menge, die ausreicht,
um mit dem Kreatin in der zu prüfenden Probe nachweisbar zu reagieren.
24. Vorrichtung zum Nachweisen von Kreatin, enthaltend eine Trägermatrix, in welcher die Zusammensetzung gemäss
Anspruch 22 eingebettet ist und zwar in einer Menge, die ausreicht, um mit dem Kreatin in der zu prüfenden Probe nachweisbar
zu reagieren.
25. Vorrichtung gemäss Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet , dass die Trägermatrix ein Feuchtigkeit
aufnehmender oder Feuchtigkeit nicht aufnehmender Streifen ist.
26. Vorrichtung gemäss Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet , dass die Trägermatrix ein Feuchtigkeit
aufnehmender oder Feuchtigkeit nicht aufnehmender Streifen ist.
27. Verfahren zur Herstellung einer Kreatin-Hachweis-.
vorrichtung, dadurch gekennzeichnet , dass man eine Trägermatrix mit einer Lösung, enthaltend die Zusammensetzung
gemäss Anspruch 19, in Berührung bringt und die Matrix dann trocknet.
28. Verfahren zur Herstellung einer Kreatin-Nachweisvorrichtung, dadurch gekennzeichnet , dass
man eine Trägermatrix mit einer Lösung, enthaltend die Zusammensetzung gemäss Anspruch 22, in Berührung bringt und die
Matrix dann trocknet.
030007/0696
29. Verfahren zur quantitativen und qualitativen Bestimmung
von Kreatin in einer zu untersuchenden Probe, dadurch gekennzeichnet , dass man eine Probe mit der
Vorrichtung gemäss Anspruch 25 in Berührung bringt und die Menge der gebildeten Farbe misst.
30. Verfahren gemäss Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet , dass man die Messung spektrofotometrisch
vornimmt.
030007/0696
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