CN104101595A - 一种法呢基焦磷酸合酶等类酶的活性测定方法 - Google Patents

Abstract

目前对于在紫外-可见没有吸收的酶的底物，只能通过放射性同位素或者荧光基团标记方法等测定酶的活性。这些检测方法成本高，对环境不友好，且不易操作。本发明的法呢基焦磷酸合酶等类酶的活性测定方法特征是采用比色法检测其中产生的产物焦磷酸或者磷酸，再用特定试剂与其反应，还原后形成有颜色的化合物，该方法具有高效，敏感，经济等优点。该方法具有广谱性，除法呢基焦磷酸合成酶外，还可检测牻牛儿牻牛儿焦磷酸合酶(GGPPS)，角鲨烯合成酶(SS)，法尼基转移酶(FTase)，牻牛儿牻牛儿转移酶(GGTase)，甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶(MDD)等酶的活性，并且可高通量地用于这些酶抑制剂的筛选和药物的开发。

Description

一种法呢基焦磷酸合酶等类酶的活性测定方法

技术领域

本发明涉及法呢基焦磷酸合酶等类酶的活性测定方法，属于酶学检测技术领域。

背景技术

磷酸或焦磷酸在生物体代谢中有着重要地位，生物体中的很多酶在催化反应中利用或产生磷酸或焦磷酸。例如，法呢基焦磷酸合成酶，牻牛儿牻牛儿焦磷酸合酶(GGPPS)，角鲨烯合成酶(SS)，法尼基转移酶(FTase)，牻牛儿牻牛儿转移酶(GGTase)，甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶(MDD)等。这些酶是甲羟戊酸途径(Mevalonate pathway)中重要的酶。甲羟戊酸途径(Mevalonate pathway)是以乙酰辅酶A为原料合成异戊二烯焦磷酸和二甲烯丙基焦磷酸的一条代谢途径，存在于所有高等真核生物和很多病毒中。该途径的产物可以看作是活化的异戊二烯单位，是类固醇、类萜等生物分子的合成前体。

目前发现甲羟戊酸途径与很多疾病有关，如心血管疾病、老年痴呆症、骨质疏松症，癌症等都直接或间接的与甲羟戊酸有联系。所以调节甲羟戊酸途径对治疗这些疾病有重要作用。而抑制这个途径中的酶的活性是最直接有效的方法。对这些酶抑制的药物开发得到了广泛而深入的研究，但这些酶活力的检测方法目前主要有发射性同位素和荧光分光光度方法。前者需要价格昂贵的放射性底物才可检测，并且不可连续操作，步骤复杂，对环境危害也较大。后者荧光光度方法，需要对底物进行不要而精确的荧光集团的修饰而有可能进行检测，而且对检测体系要求较高，干扰因素较多，准确度不高，有些体系不适合水溶液操作。

发明内容

本发明要解决的技术问题是利用酶比色法技术检测这些酶其一产物磷酸或者焦磷酸的浓度，从而检测这些酶的活性。这种方法可方便的制备成试剂盒，利用96板多384板，可高通量的检测这些酶的活性，大批量的研究开发这些酶的抑制剂，检测速度快，精度和灵敏度可以和放射同位素方法比拟，比色法检测环境友好、操作简便、干扰因素少，适合切实的推广和应用。其原理为通过检测法呢基焦磷酸合酶等类酶在催化反应中产生的焦磷酸或磷酸的量，得到酶的催化反应活性。产生的焦磷酸或者磷酸与酸性化合物试剂反应，经还原剂还原后得到的有颜色的化合物，比色法检测其浓度，用于测算法呢基焦磷酸合酶等类酶的活性动力学及其用于酶的抑制剂药物筛选。

具体方法是在这些酶的反应体系中，先加入缓冲液，再加入酸性化合物试剂，然后加入酶或者抑制剂，再还原后得到的有颜色的化合物，用比色法检测其产生颜色化合物的浓度，从而用于测算法呢基焦磷酸合酶等类酶的活性动力学及其用于酶的抑制剂药物筛选。这个方法没有本底吸收，而反应后的吸收峰很强，说明这个方法精度和灵敏度高，外界因素干扰少。此方法具体操作过程见图1，反应后吸收的图谱见图2。

本发明的活性测定试剂盒包括缓冲液、稳定剂、酸性化合物试剂、还原剂。其中酸性化合物试剂指的是：钨酸钠盐或者铵盐，钼酸钠盐或者铵盐，砷酸钠盐或者铵盐等之一或其组合。还原所用的试剂指的是：孔雀绿，罗丹明，甲基紫，结晶紫，抗坏血酸，巯基乙醇，二硫苏糖醇，亚硫酸钠，焦亚硫酸钠，硫酸铁，二氯化锡，硫酸亚铁铵，果糖等之一或其组合。

试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解使用，或者配置液体试剂，直接使用，本发明的试剂盒低温长期存放稳定，重复性好，在酶的和底物的用量很少的条件下，可以快速准确地测定。

该方法适用的酶主要是法呢基焦磷酸合酶(FPPS)，牻牛儿牻牛儿焦磷酸合酶(GGPPS)，角鲨烯合成酶(SQS)，法尼基转移酶(FTase)，牻牛儿牻牛儿转移酶(GGTase)，甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶(MDD，以及其他涉及以磷酸或焦磷酸为产物或底物的酶或蛋白。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。

实施例一：

在法呢基焦磷酸合酶(FPPS)反应体系中，加入抑制剂条件下，混合10分钟后，加入酸性化合物试剂及还原剂，稳定2分钟后，将反应物置于生化分析仪下，检测吸光度的变化，从而测算出法呢基焦磷酸合酶的活性。

实施例二：

把法呢基焦磷酸合酶(FPPS)，反应底物，缓冲液，稳定剂，加入96板孔中，加入不同浓度的抑制剂，混合10分钟后，加入酸性化合物试剂及还原剂，稳定2分钟后，将反应物置于生化分析仪下，检测吸光度的变化，从而测算出系列的法呢基焦磷酸合酶的活性。

实施例三：

把牻牛儿牻牛儿焦磷酸合酶(GGPPS)，反应底物，缓冲液，稳定剂，加入96板孔中，加入不同浓度的抑制剂，混合10分钟后，加入酸性化合物试剂及还原剂，稳定2分钟后，将反应物置于生化分析仪下，检测吸光度的变化，从而测算出系列的牻牛儿牻牛儿焦磷酸合酶(GGPPS)的活性。

实施例四：

把角鲨烯合成酶(SQS)，反应底物，缓冲液，稳定剂，加入96板孔中，加入不同浓度的抑制剂，混合10分钟后，加入酸性化合物试剂及还原剂，稳定2分钟后，将反应物置于生化分析仪下，检测吸光度的变化，从而测算出系列的角鲨烯合成酶(SQS)的活性。

实施例五：

把法尼基转移酶(FTase)，反应底物，缓冲液，稳定剂，加入96板孔中，加入不同浓度的抑制剂，混合10分钟后，加入酸性化合物试剂及还原剂，稳定2分钟后，将反应物置于生化分析仪下，检测吸光度的变化，从而测算出系列的法尼基转移酶(FTase)的活性。

实施例六：

把牻牛儿牻牛儿转移酶(GGTase)，反应底物，缓冲液，稳定剂，加入96板孔中，加入不同浓度的抑制剂，混合10分钟后，加入酸性化合物试剂及还原剂，稳定2分钟后，将反应物置于生化分析仪下，检测吸光度的变化，从而测算出系列的牻牛儿牻牛儿转移酶(GGTase)的活性。

实施例七：

把甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶(MDD)，反应底物，缓冲液，稳定剂，加入96板孔中，加入不同浓度的抑制剂，混合10分钟后，加入酸性化合物试剂及还原剂，稳定2分钟后，将反应物置于生化分析仪下，检测吸光度的变化，从而测算出系列的甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶(MDD)的活性。

实施例八：

把法呢基焦磷酸合酶(FPPS)，反应底物，缓冲液，加入96板孔中，混合10分钟后，加入酸性化合物试剂及还原剂，稳定2分钟后，将反应物置于生化分析仪下，检测吸光度的变化，从而测算出法呢基焦磷酸合酶的活性。

实施例九：

把法呢基焦磷酸合酶(FPPS)，反应底物，缓冲液，加入96板孔中，加入不同浓度的抑制剂，混合10分钟后，加入试剂盒，稳定2分钟后，将反应物置于生化分析仪下，检测吸光度的变化，从而测算出系列的法呢基焦磷酸合酶的活性。

目前对于在紫外-可见没有吸收的酶的底物，只能通过放射性同位素或者荧光基团标记方法等测定酶的活性。这些检测方法成本高，对环境不友好，且不易操作。本发明的法呢基焦磷酸合酶等类酶的活性测定方法特征是采用比色法检测其中产生的产物焦磷酸或者磷酸，再用特定试剂与其反应，还原后形成有颜色的化合物，可定性或定量地分析。该方法具有高效，敏感，经济等优点。该方法具有广谱性，除法呢基焦磷酸合成酶外，还可检测牻牛儿牻牛儿焦磷酸合酶(GGPPS)，角鲨烯合成酶(SS)，法尼基转移酶(FTase)，牻牛儿牻牛儿转移酶(GGTase)，甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶(MDD)等酶的活性，并且可高通量地用于这些酶抑制剂的筛选和药物的开发。

Claims (5)

1.一种法呢基焦磷酸合酶等类酶的活性测定方法，其方法原理为通过检测法呢基焦磷酸合酶等类酶在反应中产生的焦磷酸或磷酸的量，得到酶的催化反应活性。产生的焦磷酸或者磷酸先与酸性化合物试剂反应，再经还原剂还原后得到的有颜色的化合物，比色法检测其浓度，从而测算法呢基焦磷酸合酶等类酶的活性动力学及其用于酶的抑制剂药物筛选。

2.根据权利要求1中所述的检测方法，主要特征在于用比色法检测法呢基焦磷酸合酶等类酶反应后的一种产物，焦磷酸或者磷酸的量。

3.根据权利要求1中所述的检测方法，主要特征为与焦磷酸或者磷酸反应的酸性化合物试剂是：钨酸钠盐或者铵盐，钼酸钠盐或者铵盐，砷酸钠盐或者铵盐等之一或其组合。

4.根据权利要求1中所述的检测方法，主要特征为还原所用的试剂指的是：孔雀绿，罗丹明，甲基紫，结晶紫，抗坏血酸，巯基乙醇，二硫苏糖醇，亚硫酸钠，焦亚硫酸钠，硫酸铁，二氯化锡，硫酸亚铁铵，果糖等之一或其组合。

5.根据权利要求1中所述的类酶，除法呢基焦磷酸合酶(FPPS)外，还指牻牛儿牻牛儿焦磷酸合酶(GGPPS)，角鲨烯合成酶(SQS)，法尼基转移酶(FTase)，牻牛儿牻牛儿转移酶(GGTase)，甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶(MDD)。