CN104034721A - 一种发酵液中氨态氮的检测方法 - Google Patents

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曹阳春
姚军虎
王腊梅
李宗军
刘凯
李飞
孙菲菲
曹志昂
王卫涛
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Abstract

本发明公开了一种发酵液中氨态氮的快速检测方法，是将发酵液进行离心过滤回收上清液，然后对上清液进行稀释，稀释后的上清液中加入苯酚显色剂和次氯酸盐试剂混匀配置成待检测液，然后将待检测液水浴后应用全自动酶标仪在530～550nm下检测吸光值，根据氨标准溶液的标准曲线计算发酵液中氨态氮的浓度。上述方案中，通过靛酚蓝-全自动酶标仪相结合用于测定发酵液中氨态氮，该方法与传统方法相比，一个酶标板可测定96个样品且样品用量极低，其操作简便、测定速度快、重复性好和检测结果准确，适合氨态氮的批量快速检测工作。

Description

一种发酵液中氨态氮的检测方法
技术领域
本发明涉及氨态氮检测领域，具体涉及一种发酵液中氨态氮的检测方法。
背景技术
在微生物发酵过程中，氨态氮是一种重要的氮源物质，其浓度可影响发酵过程中菌体的生长和产物的合成。在微生物发酵过程中，常需要确定氮源的消耗曲线，而氮源消耗主要体现在发酵液中氨态氮的变化。氨态氮主要以游离氨或铵盐形式存在。微生物发酵过程中产物生成与发酵液中氨态氮消耗快慢有很大的关联，为此在发酵过程中，对于氨态氮的快速准确监测具有非常重要的实际意义。
目前，用于氨态氮检测的手段主要有滴定法(甲醛滴定、蒸馏法)、氨选择性电极法、纳氏试剂法、分光光度法和靛酚蓝法等。滴定法操作较为繁琐；氨选择性电极法相对较为方便，但是在含有表面活性剂悬浮颗粒以及其它的一些复杂体系中则难以应用；纳氏试剂法是测定水中氨的一种常用方法，但是该方法干扰因素多，灵敏度低；分光光度法则是一种操作方便、重现性和准确度都比较高的分析方法，在氨态氮的分析中用途广泛；靛酚蓝法则是一种非常适合的氨态氮分析方法，该方法是利用氨在高pH条件下和酚以及次氯酸盐发生反应而产生出一种靛酚蓝的蓝色化合物，颜色的深浅与氨的浓度具有显著的相关性，因此可以利用分光光度法来检测氨氮的含量。通常该方法是用于相对简单体系中氨的浓度检测，如水中氨态氮的检测，而对于生物发酵这样比较复杂的系统而言则鲜有报道。而且该方法利用分光光度计检测程序繁琐、样品需要量较大且费时费力。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速简便、可用于大量样品检测的发酵液中氨态氮的检测方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种发酵液中氨态氮的检测方法，操作具体如下：
将发酵液进行离心过滤回收上清液，然后对上清液进行稀释，稀释后加入苯酚显色剂和次氯酸盐试剂混匀配置成待检测液，然后将待检测液水浴后应用全自动酶标仪在530～550nm下检测吸光值，根据氨标准溶液的标准曲线计算氨态氮的浓度。
具体的方案为：
水浴温度为37～40℃、水浴显色时间15～30min。
待检测液的上样量为200～300μL。
苯酚显色剂中含有0.05g/L的亚硝基铁氰化钠和10g/L的干燥苯酚，配制好的苯酚显色剂需要低温避光保存。
次氯酸盐试剂中含有5g/L的氢氧化钠、37.85g/L的磷酸氢二钠和50mL/L的次氯酸钠。
优选按照如下参数进行操作，以取得最佳的检测的结果：
全自动酶标仪检测波长为540nm、水浴温度为37℃、水浴显色时间为30min，待检测液的上样量为200μL。
将发酵液进行离心过滤回收上清液的具体操作为：将发酵液在1000×g离心10min，用移液器将离心后的上清液准确移取1mL置于1.5mL离心管，再在室温下10000×g离心10min，取上清加入0.3mL25％的偏磷酸，混合均匀后在4℃环境下静置30min；然后在室温下1000×g离心10min，取上清液入新的离心管。吸取5～10μL发酵液，补加蒸馏水至50μL。
氨标准溶液的配制：先将1.0045g的NH4Cl溶于800ml蒸馏水中，然后用蒸馏水定容到1L，配制成氨含量为320mg/L的标准溶液。然后将标准溶液依次稀释成160mg/L、80mg/L、40mg/L、20mg/L和10mg/L，以蒸馏水作为对照(0mg/L)。
上述方案中，通过靛酚蓝-全自动酶标仪法相结合用于测定发酵液中氨态氮，该方法与传统的分光光度计法相比，一个酶标板可测定96个样品且样品用量极低，其操作简便、测定速度快、重复性好和检测分析结果准确，适合氨态氮的批量快速检测工作。
附图说明
图1为实施例1中绘制的标准曲线。
具体实施方式
为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
其中实施例1中所用的苯酚显色剂为：准确称取0.05g亚硝基铁氰化钠溶解于500mL蒸馏水中，然后加入10g干燥苯酚，定容至1L容量瓶中，于棕色瓶中低温避光保存待用。
次氯酸盐试剂为：5g氢氧化钠溶于650mL蒸馏水中冷却，37.85g磷酸氢二钠溶于150mL蒸馏水中冷却，将冷却的上述两种溶液混合，加入50mL次氯酸钠，然后定容至1L，低温避光保存待用。
实施例1
将发酵液在1000×g离心10min，用移液器将离心后的上清液准确移取1mL入1.5mL离心管，在室温下10000×g离心10min，取上清加入0.3mL25％的偏磷酸，混合均匀后在4℃冷藏冰箱静置30min。然后再室温下1000×g离心10min，取上清液入新的离心管。吸取5～10μL发酵液，补加蒸馏水至50μL，每个样品三个重复。吸取苯酚显色剂1mL加入每个试管，漩祸振荡均匀。吸取次氯酸盐试剂0.8mL加入每个试管，漩涡振荡均匀。37℃水浴30min。取200μL样品应用全自动酶标仪在540nm下检测吸光值，根据氨标准溶液的标准曲线计算氨态氮浓度。
应用上述优化的发酵液中氨态氮的测定方法，制作氨态氮标准曲线，如附图1所示，由图可知，标准曲线R2达到了0.9971，线性效果非常好。因此，可用该法测定发酵液中氨态氮浓度。
选择小麦秸秆、玉米秸秆、水稻秸秆、羊草和苜蓿五种粗饲料作为底物。称取80mg底物和量取9.0mL培养基入亨盖特培养管中，121℃湿热灭菌20min。厌氧条件下接种真菌，接种后的培养基在39℃下连续培养5天，每种底物4个重复。同时，在培养过程中每种底物都有底物空白和对照，培养5天。
应用上述优化的发酵液中氨态氮的测定方法和反应体系检测各发酵液中氨态氮浓度，具体结果如表1所示。
表1厌氧真菌以不同饲料为底物5天培养后对发酵液中氨态氮浓度的影响
其中：a，b，c，d-同行数据后字母标注不同者差异显著(P＜0.05)，S.E.M＝平均数标准差。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种发酵液中氨态氮的检测方法，操作具体如下：
将发酵液进行离心过滤回收上清液，然后对上清液进行稀释，稀释后的上清液加入苯酚显色剂和次氯酸盐试剂混匀配置成待检测液，然后将待检测液水浴后应用全自动酶标仪在530～550nm下检测吸光值，根据氨标准溶液的标准曲线计算氨态氮的浓度。
2.如权利要求1所述的发酵液中氨态氮的检测方法，其特征在于：水浴温度为37～40℃、水浴显色时间15～30min。
3.如权利要求1所述的发酵液中氨态氮的检测方法，其特征在于：待检测液的上样量为200～300μL。
4.如权利要求1所述的发酵液中氨态氮的检测方法，其特征在于：苯酚显色剂中含有0.05g/L的亚硝基铁氰化钠和10g/L的干燥苯酚。
5.如权利要求4所述的发酵液中氨态氮的检测方法，其特征在于：苯酚显色剂需要低温避光保存。
6.如权利要求1所述的发酵液中氨态氮的检测方法，其特征在于：次氯酸盐试剂中含有5g/L的氢氧化钠、37.85g/L的磷酸氢二钠和50mL/L的次氯酸钠。
7.如权利要求1所述的发酵液中氨态氮的检测方法，其特征在于：全自动酶标仪检测波长为540nm、水浴温度为37℃、水浴显色时间为30min，待检测液的上样量为200μL。
8.如权利要求1所述的发酵液中氨态氮的检测方法，其特征在于：氨标准溶液的配制是先将1.0045g的NH4Cl用蒸馏水定容到1L，配制成氨含量为320mg/L的标准溶液，然后将标准溶液依次稀释成160mg/L、80mg/L、40mg/L、20mg/L和10mg/L，以蒸馏水作为对照(0mg/L)。
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