CN101571488A - 尿素氮测定方法及其测定试剂盒 - Google Patents
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Abstract
尿素氮测定方法及其测定试剂盒属于体外诊断试剂技术领域。本发明提供的尿素氮测定方法及其测定试剂盒用于酶标仪检测，特别适用于城镇、社区医院和农村医疗单位。
Description
技术领域
本发明涉及尿素氮测定方法及其测定试剂盒，用于测定血清或血浆中尿素氮含量，属于体外诊断试剂技术领域。
背景技术
血液尿素氮浓度受多种因素的影响，分生理因素和病理因素两个方面。生理因素：高蛋白饮食引起血清尿素氮浓度和尿液中排除量显著升高。血清尿素氮浓度男性比女性平均高0.3～0.5mmol/L。随着年龄的增加有增高的倾向。成人的日间生理变动平均为0.63mmol/L。妊娠妇女由于血容量增加，尿素氮浓度比非孕妇低。病理因素：有肾脏因素和非肾脏因素。血液尿素氮增加的原因可分为肾前、肾性及肾后三个方面。1.肾前性：最重要的原因是失水，引起血液浓缩，使肾血流量减少，肾小球滤过减低而使血液中尿素潴留。常见于剧烈呕吐、幽门梗阻、肠梗阻和长期腹泻等。2.肾性：急性肾小球肾炎、肾病晚期、肾衰竭、慢性肾盂肾炎及中毒性肾炎都可出现血液中尿素氮含量增高。3.肾后性疾病：前列腺肿大、尿路结石、尿道狭窄、膀胱肿瘤致使尿道受压等都可能使尿路阻塞，引起血液中尿素氮含量增加。血液中尿素氮减少较为少见，常表示严重的肝病，如肝炎合并广泛性肝坏死。
目前市场上测定尿素氮的方法大致可分为3种。第1种为酶偶联速率法：尿素在尿素酶催化下，水解生成氨和二氧化碳。氨在a-酮戊二酸和还原型辅酶I存在下，经谷氨酸脱氢酶催化，生成谷氨酸。同时，NADH被氧化成NAD，可在340nm波长处监测吸光度下降的速率，计算样品中尿素的含量。其测定过程中，各种器材和蒸馏水应无氨离子污染，否则结果偏高。血氨升高时，可使尿素测定结果偏高，溶血样本对测定有干扰。第2种二乙酰一肟显色法：在酸性反应环境中加热，尿素与二乙酰缩合，生成色原二嗪，称为Fearon反应。因为二乙酰不稳定，通常由反应系统中二乙酰一肟与强酸作用，产生二乙酰。二乙酰和尿素反应，缩合生成红色的二嗪。本法线性范围达14mmol/L尿素，如遇高于此浓度的标本，必须用生理盐水作适当的稀释后重测，结果乘以稀释倍数。第3种脲酶-波氏比色法：采用尿素氮氧化酶法测定人体中尿素氮含量，尿素氮经脲酶催化水解成氨，氨参与波氏反应生成靛蓝色色素，该色素的生成量与样品中所含尿素氮成正比，通过标准品同时比对计算结果。这三种方法中脲酶-波氏比色法成本低廉，使用范围较广、更易被临床接受，因此采用脲酶-波氏比色法进行尿素氮试剂盒的研制。
目前市场上测定尿素氮含量的试剂盒均适用于生化仪，大多城镇、社区的医疗单位不具备生化仪而具备酶标仪，但同时尿素氮含量是人体重要的生理指标，尿素氮含量的测定具有重要的临床意义。
发明内容
本发明测定尿素氮的方法和测定试剂盒，适用于酶标仪，由于酶标仪成本低廉，设备要求简单，无需购买昂贵的全自动生化仪，同时弥补了半自动生化仪对同一指标大规模检测能力的不足，比手工操作肉眼比色大大减少了工作量和人为误差；实验操作简便，一次可以检测近百份样本，几十分钟即可得到检测结果。测定结果计算方便，数据可保留或打印，利于实验室标准化管理及网络化建设。因此本发明的目的是开发适用于酶标仪的尿素氮含量测定试剂盒，以适用于农村、城镇和社区医疗。
采用尿素氮氧化酶法测定人体中尿素氮含量，尿素氮经脲酶催化水解成氨，氨参与波氏反应生成靛蓝色色素，该色素的生成量与样品中所含尿素氮成正比，通过标准品同时比对计算结果。
2NH3+2NaOCl——2NH2Cl+2NaOH
2phenol+2NH2Cl+2OH-——24-aminophenol+2Cl-+2H2O
24-aminophenol+2phenol+O2——2indophenol+2H2O
根据此反应原理，尿素氮含量测定试剂盒包括酶标板、试剂R1、R2、R3和标准液。
采用的测定方法为，于酶标板上，设一孔试剂空白孔，两孔标准孔，其余为测定孔。加R1：20μl，空白孔内加蒸馏水5μl，标准孔内加校准液5μl，测定孔分别加入待测血清(血浆)5μl，混匀置37℃温育10分钟，加R2：100μl，R3：100μl，混匀置37℃温育20分钟，于酶标仪比色。在主波长620nm，副波长492nm下，试剂空白孔调零，进行检测。测定结果按以下公式计算尿素氮含量：血清(血浆)尿素氮浓度＝测定孔吸光度/标准孔吸光度×20(mg/dL)。
具体实施方式
下面用实施例进一步说明本发明。本发明的实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域的常规条件进行。
实施例一：
试剂盒的组成为：R1、R2、R3和标准液。
其中R1的组成主要为脲酶1.6KU/L
R2为NaOH 2.6g/L、NaOCl 0.42g/L。
R3为苯酚 5g/L。
尿素氮标准液20mg/dL
实施例二：
测定方法如下：
1.于96孔酶标板上，设一孔试剂空白孔，两孔标准孔，其余为测定孔。加R1：20μl，空白孔内加蒸馏水5μl，标准孔内加校准液5μl，测定孔分别加入待测血清(血浆)5μl，混匀置37℃温育10分钟，加R2：100μl，R3：100μl，混匀置37℃温育20分钟。
2.于酶标仪比色。在主波长620nm，副波长492nm下，试剂空白孔调零，进行检测。
3.测定结果按以下公式计算尿素氮含量：
血清(血浆)尿素氮浓度＝测定孔吸光度/标准孔吸光度×20(mg/dL)。
实施例三：
本发明测定试剂盒按照实施例一配置，按照实施例二进行操作。准确度：测定值在质控血清(Randox的质控血清)正常及异常质控血清靶值±2SD范围内。试剂空白吸光度：A＜0.30(主波长620nm、副波长492nm；37℃)。
经过临床考核试验，本发明的试剂盒与现有技术相比相关性均大于0.9无显著性差异，可应用于临床，并且具有适用于社区、农村、城镇医疗系统，具有更广的适用范围。
Claims (3)
1、一种用于酶标仪的尿素氮测定试剂盒，该试剂盒包括酶标板、R1、R2、R3和标准液，R1主要由脲酶；R2由NaOH、NaOCl；R3由苯酚等化学成份组成。标准液为尿素氮标准液。
2、一种用于酶标仪的尿素氮测定方法：于酶标板上，设一孔试剂空白孔，两孔标准孔，其余为测定孔。加R1：20μl，空白孔内加蒸馏水5μl，标准孔内加校准液5μl，测定孔分别加入待测血清(血浆)5μl，混匀置37℃温育10分钟，加R2：100μl，R3：100μl，混匀置37℃温育20分钟，于酶标仪比色。在主波长620nm，副波长492nm下，试剂空白孔调零，进行检测。测定结果按以下公式计算尿素氮含量：血清(血浆)尿素氮浓度＝测定孔吸光度/标准孔吸光度×20(mg/dL)。
3、根据权力要求2所述的用于酶标仪的尿素氮测定方法，其特征在于：于酶标板上，设一孔试剂空白孔，两孔标准孔，其余为测定孔。加R1：20μl，空白孔内加蒸馏水5μl，标准孔内分别加校准液5μl，测定孔分别加入待测血清(血浆)5μl，混匀置37℃温育10分钟，加R2：100μl，R3：100μl，混匀置37℃温育20分钟，于酶标仪比色。在主波长620nm，副波长492nm下，试剂空白孔调零，进行检测。
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