CN105567788A - 牛奶中尿素氮检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种牛奶中尿素氮检测试剂盒，属于畜牧学、动物营养与饲料科学中的尿素氮检测技术领域。所述的试剂盒包括96孔反应板、浓缩沉淀剂Ⅰ、浓缩沉淀剂Ⅱ、缓冲溶液、酶液、显色剂Ⅰ、显色剂Ⅱ和对照液。应用所述试剂盒，根据样品液光密度值与空白光密度值之差代入尿素氮吸收曲线，计算牛奶样品中尿素氮的含量。本发明使用96孔反应板和酶标仪进行检测，节省试剂、检测通量大，同时还有牛奶处理液，进行样品处理。本产品使用方便，适合牛奶中尿素氮的大量检测。
Description
技术领域
本发明属于畜牧学、动物营养与饲料科学中的尿素氮检测技术领域，具体是指一种牛奶中尿素氮检测试剂盒。
背景技术
利用牛奶尿素氮(milkureanitrogen,MUN)来评价奶牛日粮能氮平衡、蛋白需要量、氮利用率、繁殖率以及诊断代谢疾病已成为世界范围内奶牛科学研究的热点，而且牛奶取样方便，不会对奶牛造成应激。
测定MUN的方法主要有二乙酰－肟法、脲酶－波氏比色法、酶联速率法、红外光谱法。红外光谱法操作简单，速度快，国外测定DHI就包括MUN指标，国内使用较少。
MUN检测试剂盒一般采用分光光度法检测，试剂使用量大。检测对象为血样或尿样。牛奶中乳蛋白和乳脂含量高，不能直接使用试剂盒进行检测，需要进行前处理。
发明内容
本发明为了解决现有技术中，牛奶中尿素氮检测过程中存在的操作繁琐、检测成本高、花费时间长、敏感性和特异性较低的问题，提供一种牛奶中尿素氮检测试剂盒，本发明使用96孔反应板和酶标仪进行检测，节省试剂、检测通量大，同时还有牛奶处理液，进行样品处理。本产品使用方便，适合牛奶中尿素氮的大量检测。
本发明提供的牛奶中尿素氮检测试剂盒，组成包括：96孔反应板、浓缩沉淀剂Ⅰ、浓缩沉淀剂Ⅱ、缓冲溶液、酶液、显色剂Ⅰ、显色剂Ⅱ、对照液，所述96孔反应板为96孔平底带盖酶标板；所述浓缩沉淀剂Ⅰ为亚铁氰化钾溶液，浓度范围为2.12～20.6g/dl；所述浓缩沉淀剂Ⅱ为乙酸锌溶液，浓度范围5.8～30g/dl；所述缓冲液为乙二胺四乙酸钠缓冲液，浓度范围为1％～10％，pH值为6.0～7.0；所述酶液为尿酶溶液，浓度范围为5～100U/ml；所述显色剂Ⅰ为酚或其衍生物与亚硝基铁氰化钾混合溶液，酚或其衍生物浓度范围为0.05％～5％；亚硝基铁氰化钾浓度范围0.01％～5％；所述显色剂Ⅱ为次氯酸钠溶液，浓度范围为1％～10％；所述对照液为已知浓度的尿素对照品溶液，浓度范围为0.1～10mg/dl。而且，所述浓缩沉淀剂Ⅰ为20X浓缩沉淀剂，使用前以纯化水按照体积比1:19的比例稀释，混匀后使用；所述浓缩沉淀剂Ⅱ为20X浓缩沉淀剂，使用前以纯化水按照体积比1:19v/v的比例稀释，混匀后使用。上述的百分数均为质量百分含量。
所述的牛奶中尿素氮检测试剂盒的使用方法，步骤如下：
(1)将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀；所述试剂包括浓缩沉淀剂Ⅰ、浓缩沉淀剂Ⅱ、缓冲溶液、酶液、显色剂Ⅰ、显色剂Ⅱ和对照液。所述的浓缩沉淀剂Ⅰ、浓缩沉淀剂Ⅱ使用前与纯化水按照体积比1:19的比例稀释。
(2)样品液；
精密量取牛奶样品0.1mL，加入0.95mL稀释后浓缩沉淀剂Ⅰ，涡旋混合，再加入0.95mL稀释后浓缩沉淀剂Ⅱ，涡旋混合，于5000转/分钟下离心10min，取上清液作为样品液。
(3)96孔反应板编号；
取出96孔反应板。预留2个空白孔，编号为微孔1和微孔2。
对照液做5个浓度，每个浓度做2孔平行，将对照液对应微孔按序编号为微孔3～微孔12，并记录对照液微孔所在位置。
剩余微孔按序编号为微孔13～微孔96，用于检测不同牛奶样品中尿素氮的含量，每个牛奶样品均需按照(2)处理得到相应的样品液。每个样品液最少做2孔平行，记录不同样品液对应微孔所在的位置。一个反应板最多可以检测42个不同牛奶样品。
(4)加对照液和样品液；
加入缓冲溶液60μl到96孔反应板中的空白孔；
微孔3～微孔12中分别加对照液10μl、20μl、30μl、40μl、60μl，然后再依次加入缓冲溶液50μl、40μl、30μl、20μl、0μl，使得每个对照液对应的微孔中液体体积均为60μl。
从微孔13开始，2孔平行，分别加样品液60μl，至所有样品液加样完成；随即加入缓冲溶液10μl/孔，轻轻振荡混匀，加入酶液40μl/孔轻轻振荡混匀，盖上盖后，置37℃避光环境中反应20min。
(5)显色；
加入显色剂Ⅰ100μl/孔，随即加入显色剂Ⅱ50μl/孔，轻轻振荡混匀，盖上盖后，置37℃避光环境中反应20min。
(6)测定；
设定酶标仪于630nm处，以微孔1和微孔2为空白，测定每孔光密度(OD)值。
(7)结果；
计算平行孔OD值的平均值，分别得到空白OD值，对照液OD值及样品液OD值。以对照液孔对照液加入体积10μl、20μl、30μl、40μl、60μl为横坐标，对应的对照液OD值与空白OD值的差值为纵坐标，计算尿素氮吸收曲线。把样品液OD值与空白OD值之差代入尿素氮吸收曲线，计算相应的体积v。按下式计算牛奶样品中尿素氮的含量：
尿素氮含量＝v/3×1mg/dl。
本发明的优点和有益效果是：
(1)本发明制备的试剂盒可用于牛奶中尿素氮的快速定量检测，具有使用方便、检测准确的优点。
(2)本发明制备的试剂盒的精密度批内变异系数(CV％)，CV％<10％。准确度以回收率表示，回收率应在70％～110％之间。线性相关系数R2:不小于0.9900。
附图说明
图1为本发明实施例中96孔反应板编号示意图；
图2为本发明实施例中96孔反应板上显色示意图；
图3为本发明实施例中得到的尿素氮吸收曲线示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进行详细说明。
本发明提供一种牛奶中尿素氮检测试剂盒，所述的检测试剂盒中试剂包括浓缩沉淀剂Ⅰ、浓缩沉淀剂Ⅱ、缓冲溶液、酶液、显色剂Ⅰ、显色剂Ⅱ和对照液，还包括一个带盖96孔板,具体为：
1.处理液制备：
浓缩沉淀剂I：称取4.24g亚铁氰化钾，用超纯水溶解并定容至100mL。
浓缩沉淀剂Ⅱ：称取8.76g乙酸锌，用超纯水溶解并定容至100mL。
2.缓冲溶液：
称取1g乙二胺四乙酸钠溶于100mL超纯水中，用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至6.5。
3.酶液：称取尿酶1g，用上述缓冲溶液溶解并定容至50mL。
4.显色剂
显色剂I：称取苯酚2.0g，亚硝基铁氰化钠0.1g，用超纯水溶解并定容至100mL。
显色剂II：5％次氯酸钠溶液；
5.对照液：称取尿素标准品0.1071g，用超纯水溶解并定容至50mL；精密量取1mL，用超纯水定容至100mL。
应用上述得到的试剂盒进行变异系数及回收率测定，具体步骤如下：
第一步，将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀；
用超纯水按照体积比1:19的比例分别稀释适量浓缩沉淀剂I和浓缩沉淀剂Ⅱ。
第二步，样品液；
精密量取牛奶0.1mL加0.95mL稀释后浓缩沉淀剂Ⅰ，涡旋混合，加0.95mL稀释后浓缩沉淀剂Ⅱ，涡旋混合，于5000转/分钟下离心10min，取上清液作为样品液。共重复做5次，分别为样品液1、样品液2、样品液3、样品液4、样品液5。
精密量取1mg/mL尿素对照溶液2mL，置50mL量瓶中，用同一牛奶定容至50mL刻度，此为对照品添加牛奶。精密量取对照品添加牛奶0.1mL加0.95mL稀释后浓缩沉淀剂Ⅰ，涡旋混合，再加0.95mL稀释浓后浓缩沉淀剂Ⅱ，涡旋混合，于5000转/分钟下离心10min，取上清液作为样品液6。
第三步，编码；
取出96孔反应板，具有96个微孔。预留两个空白孔，编号为微孔1和微孔2；对照液做5个浓度，每个浓度做2个微孔平行，将对照液对应微孔按序编号为微孔3～微孔12，并记录对照液微孔所在位置；对第二步中得到的样品液1～样品液6，每个样品液做2个微孔平行，并记录样品液微孔所在的位置，按序编号为微孔13～微孔24，具体编号如图1所示。
第四步，加对照液和样品液；
在空白孔即微孔1和微孔2中各自加入缓冲溶液60μl。
在微孔3～微孔12中，分别加对照液10μl、20μl、30μl、40μl、60μl，然后再依次加入缓冲溶液50μl、40μl、30μl、20μl、0μl，使得每个对照液对应的微孔内液体体积均为60μl。
在微孔13～微孔24中，依次加样品液1～样品液6各60μl，随即加入缓冲溶液10μl/孔，轻轻振荡混匀，加入酶液40μl/孔轻轻振荡混匀，盖上盖后，置37℃避光环境中反应20min。
第五步，显色；
加入显色剂Ⅰ100μl/孔，随即加入显色剂Ⅱ50μl/孔，轻轻振荡混匀，盖上盖后，置37℃避光环境中反应20min。显色结果如图2所示，空白孔近无色；对照孔显蓝色且随对照液加入体积的增大而加深；样品液孔显蓝色且蓝色的深浅与牛奶中尿素氮含量相关。
第六步，测定；
设定酶标仪于630nm处，以空白孔为空白，测定每孔OD值。OD值见下表1：
表196孔反应板上微孔内测定的OD值
| 0.213 | 0.194 | 0.49 | 0.657 | ||||||||
| 0.42 | 0.354 | 0.599 | 0.499 | ||||||||
| 0.668 | 0.597 | 0.583 | 0.566 | ||||||||
| 0.834 | 0.819 | 0.729 | 0.756 | ||||||||
| 0.991 | 1.038 | ||||||||||
| 1.418 | 1.438 | ||||||||||
| 0.488 | 0.485 | ||||||||||
| 0.595 | 0.592 |
第七步，结果；
计算平行孔OD值的平均值。得到空白OD值为(0.213+0.194)/2＝0.2035；得到对照液OD值分别为(0.42+0.354)/2＝0.387、(0.668+0.597)/2＝0.6325、(0.834+0.819)/2＝0.8265、(0.991+1.038)/2＝1.0145和(1.418+1.438)/2＝1.428。样品液1～样品液6OD值分别为(0.488+0.485)/2＝0.4865、(0.595+0.0.592)/2＝0.5935、(0.49+0.657)/2＝0.5735、(0.599+0.499)/2＝0.549、(0.583+0.566)/2＝0.5745和(0.729+0.756)/2＝0.7425；以对照液孔对照液加入体积10μl、20μl、30μl、40μl、60μl为横坐标，对应的对照液OD值与空白OD值的差值为纵坐标，计算尿素氮吸收曲线结果如图3。把样品液OD值与空白OD值之差带入尿素氮吸收曲线，计算相应的体积v。按下式计算牛奶中尿素氮的含量：
尿素氮含量＝v/3×1mg/dl
样品液1至样品液5计算得到的尿素氮含量，为同一牛奶样品重复测定5次得到的尿素氮含量，其值分别为7.94mg/dl、9.68mg/dl、9.36mg/dl、8.96mg/dl和8.966mg/dl。平均值：9.06mg/dl；标准差：0.6769；变异系数:7.4％。样品液6计算得到的尿素氮含量，为对照品添加牛奶的尿素氮含量，其值为12.10mg/dl。回收率为85％。
Claims (2)
1.牛奶中尿素氮检测试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒包括96孔反应板、浓缩沉淀剂Ⅰ、浓缩沉淀剂Ⅱ、缓冲溶液、酶液、显色剂Ⅰ、显色剂Ⅱ和对照液，所述96孔反应板为96孔平底带盖酶标板；所述浓缩沉淀剂Ⅰ为亚铁氰化钾溶液，浓度范围为2.12～20.6g/dl；所述浓缩沉淀剂Ⅱ为乙酸锌溶液，浓度范围5.8～30g/dl；所述缓冲液为乙二胺四乙酸钠缓冲液，浓度范围为1％～10％，pH值为6.0～7.0；所述酶液为尿酶溶液，浓度范围为5～100U/ml；所述显色剂Ⅰ为酚或其衍生物与亚硝基铁氰化钾混合溶液，酚或其衍生物浓度范围为0.05％～5％；亚硝基铁氰化钾浓度范围0.01％～5％；所述显色剂Ⅱ为次氯酸钠溶液，浓度范围为1％～10％；所述对照液为已知浓度的尿素对照品溶液，浓度范围为0.1～10mg/dl；所述浓缩沉淀剂Ⅰ和浓缩沉淀剂Ⅱ使用前分别以纯化水按照体积比1:19的比例稀释，混匀后使用；上述的百分数均为质量百分含量。
2.根据权利要求1所述的牛奶中尿素氮检测试剂盒的应用方法，其特征在于：
第一步，将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温平衡30min以上，每种液体试剂使用前均须摇匀；所述试剂包括浓缩沉淀剂Ⅰ、浓缩沉淀剂Ⅱ、缓冲溶液、酶液、显色剂Ⅰ、显色剂Ⅱ和对照液；所述的浓缩沉淀剂Ⅰ、浓缩沉淀剂Ⅱ使用前与纯化水按照体积比1:19的比例稀释；
第二步，样品液；
精密量取牛奶样品0.1mL，加入0.95mL稀释后浓缩沉淀剂Ⅰ，涡旋混合，再加入0.95mL稀释后浓缩沉淀剂Ⅱ，涡旋混合，于5000转/分钟下离心10min，取上清液作为样品液；
第三步，96孔反应板编号；
取出96孔反应板；预留2个空白孔，编号为微孔1和微孔2；
对照液做5个浓度，每个浓度做2孔平行，将对照液对应微孔按序编号为微孔3～微孔12，并记录对照液微孔所在位置；
剩余微孔按序编号为微孔13～微孔96，用于检测不同牛奶样品中尿素氮的含量，每个牛奶样品均需按照第二步处理得到相应的样品液；每个样品液最少做2孔平行，记录不同样品液对应微孔所在的位置；
第四步，加对照液和样品液；
加入缓冲溶液60μl到96孔反应板中的空白孔；
微孔3～微孔12中分别加对照液10μl、20μl、30μl、40μl、60μl，然后再依次加入缓冲溶液50μl、40μl、30μl、20μl、0μl，使得每个对照液对应的微孔中液体体积均为60μl；
从微孔13开始，2孔平行，分别加样品液60μl，至所有样品液加样完成；随即加入缓冲溶液10μl/孔，振荡混匀，加入酶液40μl/孔振荡混匀，盖上盖后，置37℃避光环境中反应20min；
第五步，显色；
加入显色剂Ⅰ100μl/孔，随即加入显色剂Ⅱ50μl/孔，振荡混匀，盖上盖后，置37℃避光环境中反应20min；
第六步，测定；
设定酶标仪于630nm处，以微孔1和微孔2为空白，测定每孔光密度值；
第七步，结果；
计算平行孔光密度值的平均值，分别得到空白光密度值，对照液光密度值及样品液光密度值；以对照液孔对照液加入体积10μl、20μl、30μl、40μl、60μl为横坐标，对应的对照液光密度值与空白光密度值的差值为纵坐标，计算尿素氮吸收曲线；把样品液光密度值与空白光密度值之差代入尿素氮吸收曲线，计算相应的体积v；按下式计算牛奶样品中尿素氮的含量：
尿素氮含量＝v/3×1mg/dl。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106404999A (zh) * | 2016-08-30 | 2017-02-15 | 内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司 | 用于检测磷含量的试剂盒及测定磷含量的方法 |
| CN106872455A (zh) * | 2017-01-22 | 2017-06-20 | 北京农业职业学院 | 一种乳蛋白和乳尿素含量的检测方法 |
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| CN101571488A (zh) * | 2008-04-28 | 2009-11-04 | 北京华大吉比爱生物技术有限公司 | 尿素氮测定方法及其测定试剂盒 |
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2016
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