CN113324931A - 一种小体系连续快速测定淡水中氨氮浓度的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种小体系连续快速测定淡水中氨氮浓度的方法，包括：配制不同氨氮浓度的氨氮工作液各1mL；在每个氨氮工作液中加入10～25μL酒石酸钾钠溶液后混匀；在每个氨氮工作液中加入与酒石酸钾钠溶液等体积的纳氏试剂后混匀放置10～30min；颜色稳定后，以空白为参照，测量并记录每个氨氮工作液的吸光度；绘制标准工作曲线，求其回归方程；取1mL水样，按与氨氮工作液相同步骤测定并记录水样的吸光度；用水代替水样，按与水样测定相同步骤测定空白试验的吸光度；结果计算。与氨氮国家标准测定方法进行比较，小体系连续快速测定氨氮浓度的方法具有工作效率高、测定成本低、二次污染减少且氨氮浓度测定范围大的优点。

Description

一种小体系连续快速测定淡水中氨氮浓度的方法

技术领域

本发明具体涉及一种小体系连续快速测定淡水中氨氮浓度的方法。

背景技术

水中氨氮的存在形式是游离氨(NH₃)或铵离子(NH₄ ⁺)，是地表水与污水监测的重要指标之一，同时也是国家实施节能减排及污染控制的主要监测指标之一。水体中氨氮的来源有两方面：一方面是含有各种蛋白质有机物的生活污水在微生物的作用下，发生复杂的生物化学反应，分解产生NH₃；另一方面是工业生产及农业生产过程中产生含氮废水，如合成氨化肥厂生产和农业施肥等。氨氮浓度过量会造成淡水水体富营养化，对水中生物的危害极为严重，如造成水中生物急、慢性中毒。其中毒表现为水生生物的摄食频率降低，生长发育迟缓，或者生物产生精神亢奋、严重缺氧等，甚至会导致水体生物死亡。生物中毒的机理是氧在生物细胞间的输送速率降低，造成组织损伤。若水中碱性越强，游离氨的数量越多，则毒性越强。

目前氨氮测定的方法包括：①分光光度法：纳氏试剂分光光度法、水杨酸-次氯酸盐分光光度法、靛酚蓝分光光度法(酚盐分光光度法)、次溴酸盐氧化法等；②电化学法：氨气敏电极法、离子选择性电极法、蒸馏-电位滴定法等；③蒸馏-中和滴定法；④仪器分析法：离子色谱法、连续流动分析/流动注射分析、气相分子吸收光谱法、荧光法、固相显色-反射光谱法等；⑤酶法等。

对比于其它的氨氮测定方法，国家标准《水质氨氮的测定纳氏试剂分光光度法》(HJ535-2009)(以下简称国标)适用于大批量处理水样且样品消耗量少，操作简单，较精密准确，成本相对其它测定方法较低，而广泛应用。然而国标方法需要清洗大量的玻璃仪器，工作量大、耗时较长，且废液量大，所使用的纳氏试剂具有毒性，易对环境造成污染。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种提高工作效率、降低测定成本、减少二次污染且提高氨氮浓度测定范围的小体系连续快速测定淡水中氨氮浓度的方法。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

一种小体系连续快速测定淡水中氨氮浓度的方法，包括以下步骤：

S1：标准工作曲线制定：

S1.1：采用浓度为3.8190g·L^-1的氨氮标准工作液配制氨氮浓度分别为0.0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0μg·mL^-1的氨氮工作液各1mL；

S1.2：在每个氨氮工作液中加入10～25μL浓度为500g·L^-1的酒石酸钾钠溶液后混匀；

S1.3：在每个氨氮工作液中加入与酒石酸钾钠溶液等体积的纳氏试剂后混匀放置10～30min；

S1.4：颜色稳定后，以空白为参照，用酶标仪在波长420nm下测量并记录每个氨氮工作液的吸光度；

S1.5：以氨氮浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准工作曲线，求出其回归方程；

S2：水样测定：

S2.1：取1mL盐度小于5psu、pH为3～11的水样，按与氨氮工作液相同的步骤测定并记录所述水样的吸光度A_s；

S3：空白试验：

用水代替水样，按与水样测定相同的步骤进行空白试验的吸光度A_b的测定；

S4：结果计算：

水样中氨氮的质量浓度按式(1)计算：

ρ_N——水样中氨氮的质量浓度(以N计)，mg/L；

A_s——水样的吸光度；

A_b——空白试验的吸光度；

a——标准工作曲线的截距；

b——标准工作曲线的斜率；

V——试料体积，ml。

优选地，所述步骤S1-S3中，所述纳氏试剂的制备过程如下：

配配制NaOH浓度为1.6g/L、KI浓度为0.7g/L，HgI₂浓度为1g/L的HgI₂-KI-NaOH溶液，再在转速为5000～7000rpm的条件下离心处理4～6min，取上清液，得到所述纳氏试剂。

优选地，八个氨氮工作液的制备过程如下：

在8个圆底2mL离心管中分别加入氨氮标准工作液0、10、20、40、80、120、160、200μL，用超纯水稀释至1mL。

优选地，所述氨氮标准工作液的制备过程如下：

称取3.8190g氯化铵(NH₄Cl，预先在100～105℃烘2h)于烧杯中，加入少量超纯水搅拌溶解，移入1000mL容量瓶后加入超纯水稀释至标线，混匀后在在2～5℃下冷藏保存，形成氨氮标准储备液；

临用前，吸取1.00mL氨氮标准贮备液于100mL容量瓶，加入超纯水稀释至标线，混匀后使用。

优选地，所述酒石酸钾钠溶液的制备过程如下：

称取50.0g酒石酸钾钠溶于烧杯中，加入100mL超纯水后搅拌溶解，将烧杯放置在加热炉上加热煮沸去除氨，静置冷却至室温，用超纯水稀释至100mL后保存。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

本发明采用小体系测定氨氮代替氨氮国家标准大体系方法，优化了小体系测定氨氮浓度的显色剂用量、显色时间、盐度、pH等因素，并且通过对纳氏试剂进行离心处理提高纳氏试剂的可使用率，减少纳氏试剂的浪费。利用酶标仪代替紫外分光光度计测定氨氮浓度实现了样品测定的高通量，达到连续、快速地测定多个样品。与氨氮国家标准测定方法进行比较，小体系连续快速测定氨氮浓度的方法可以达到节省玻璃仪器清洗的时间，提高工作效率；减少纳氏试剂与酒石酸钾钠使用量，降低测定成本；极大降低废液量，减少二次污染的风险及节约废弃液处理成本。且1mL小体系在测定氨氮浓度保持较高的准确度下，氨氮浓度检测范围从国标大体系的0～2.0μg·mL^-1提升到0～4.8μg·mL^-1。综上所述，本研究探究小体系连续快速测定氨氮浓度方法，极大地使氨氮含量的测定工作简便、连续、快速、批量化，节省了测定成本与测定时间，提高了工作效率，为实地实时测定淡水氨氮浓度提供了可行性。

附图说明

图1为纳氏试剂与氨氮反应的原理图。

图2为显色剂用量对小体系氨氮浓度测定的影响图。

图3为显色时间对小体系氨氮浓度测定的影响图。

图4为水体盐度对小体系氨氮浓度测定的影响图。

图5为pH对小体系氨氮浓度测定的影响图。

图6为两种不同处理条件下测定的氨氮的标准曲线图。

图7为两种不同处理条件体系的正交验证曲线图。

图8为两体系测定氨氮的标准曲线图。

图9为两体系正交验证曲线图。

图10为小体系测定氨氮的检测范围。

具体实施方式

以下结合具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。

仪器与材料

酶标仪、2mL圆底离心管、移液器一套、96孔板。

溶液配制参照国标中的方法，所需试剂的具体配制如下表1：

表1所需试剂的具体配制方法

实施例1：

本实施例提供一种小体系连续快速测定淡水中氨氮浓度的方法，包括以下步骤：

S1：标准工作曲线制定：

S1.1：在8个圆底2mL离心管中分别加入氨氮标准工作液0、10、20、40、80、120、160、200μL，用超纯水稀释至1mL，得到氨氮浓度分别为0.0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0μg·mL^-1的氨氮工作液各1mL。

S1.2：在每个氨氮工作液中加入10～25μL浓度为500g·L^-1的酒石酸钾钠溶液后混匀；

S1.3：在每个氨氮工作液中加入与酒石酸钾钠溶液纳氏试剂后混匀放置10～30min；

S1.4：颜色稳定后，以空白为参照，用酶标仪在波长420nm下测量并记录每个氨氮工作液的吸光度；

S1.5：以氨氮浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准工作曲线，求出其回归方程；

S2：水样测定：

S2.1：取1mL盐度小于5psu、pH为3～11的水样，按与氨氮工作液相同的步骤测定并记录所述水样的吸光度A_s；

S3：空白试验：

用水代替水样，按与水样测定相同的步骤进行空白试验的吸光度A_b的测定；

S4：结果计算：

水样中氨氮的质量浓度按式(1)计算：

ρ_N——水样中氨氮的质量浓度(以N计)，mg/L；

A_s——水样的吸光度；

A_b——空白试验的吸光度；

a——标准工作曲线的截距；

b——标准工作曲线的斜率；

V——试料体积，ml。

其中，纳氏试剂配制后，再在转速为5000～7000rpm的条件下离心处理4～6min，取上清液用于试验。

实施例2：

1、实验设计

1.1、小体系测定氨氮影响因素的优化实验

为了准确建立小体系测定氨氮方法，优化改进方法的最佳反应条件，探究了显色剂用量、显色时间、盐度、pH等对氨氮测定反应过程的影响：

①显色剂用量影响因素。在室温下，配制浓度为0.0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0μg·mL^-1的氨氮工作液，各氨氮浓度设置四组，每组两个平行，对各浓度氨氮工作液分别加入酒石酸钾钠10μL、15μL、20μL、25μL与纳氏试剂10μL、15μL、20μL、25μL进行显色反应，以此确定纳氏试剂的最佳使用量。

②显色时间影响因素。保证纳氏试剂投入量一致下，在室温条件下对氨氮工作液分别以5、10、20、30、60、90、120min进行显色反应，以确定氨氮显色反应的最佳时间。

③盐度影响因素。为了研究分析水体盐度对氨氮测定结果的影响，对氨氮工作液加入氯化钠(NaCl)改变水体盐度为0、2.5、5.0、7.5、15、35，保证纳氏试剂投入量与显色时间一致下，进行氨氮显色反应实验。

④pH影响因素。为了研究分析水体pH对氨氮测定结果的影响，对氨氮工作液加入盐酸试剂(HCl)或氢氧化钠试剂(NaOH)调节水体pH为1、3、5、7、9、11、13，保证纳氏试剂投入量与显色时间一致下，进行氨氮显色反应实验。

以上实验均设置两个平行。

1.2、标准工作曲线绘制

参照国标中的方法，具体步骤为：

(1)在8个圆底2mL离心管中分别加入氨氮标准工作液0、10、20、40、80、120、160、200μL，用超纯水稀释至1mL；

(2)加入20μL酒石酸钾钠溶液后混匀；

(3)加入20μL纳氏试剂后混匀放置10min；

(4)颜色稳定后，以空白为参照，用酶标仪在波长420nm下测量并记录吸光度；

(5)以氨氮浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准工作曲线，求出其回归方程。

1.3、样品测定来源

本实验样品采集于广东省茂名市茂南区田头屋附近池塘养殖塘3个，编号分别为YZ-1、YZ-2、YZ-3，小东江河流，采集表层水体(水深约0.1m)的2个样品，编号分别为DJ-1、DJ-2。样品采集送回实验室后即刻分别采用小体系与国标两种方法测定其氨氮浓度。

对比大体系国标方法，对样品氨氮浓度的测定结果进行置信度为95％的F检验和t检验，以验证1mL体系测定方法测定样品氨氮浓度的可行性。

2、结果与讨论

2.1、显色剂用量对小体系氨氮浓度测定的影响

由于在碱性条件下，水体中以氨或铵离子存在的氨氮能与纳氏试剂反应生成黄棕色络合物，其显色反应原理如图1所示。该络合物的颜色深度与氨氮浓度成正比关系，所以显色剂用量是影响实验结果的一个重要因素。显色剂用量对小体系测定氨氮浓度的影响如图2所示：显色剂用量为10～25μL范围内，其测定吸光值随显色剂用量的增加而提高，显色剂用量为10μL时，测定吸光值较低。其原因为纳氏试剂用量不足，不能与水体中的氨氮完全反应，造成测定吸光值偏低。在显色剂用量为25μL时，测定吸光值偏高，其原因为过量的纳氏试剂会与氨氮反应生成颜色更深的沉淀物使液体色度加深，造成测定吸光值偏高。显色剂用量为15μL和20μL时的测定吸光值在同一氨氮浓度下没有明显差异，但相对于显色剂用量为15μL时，显色剂用量为20μL的数据重复性要更好，因此小体系测定氨氮浓度过程中纳氏试剂用量20μL较合适。

2.2、显色时间对小体系氨氮浓度测定的影响

显色时间长短是影响水体中氨氮与纳氏试剂反应程度的一个重要因素。显色时间对小体系氨氮与纳氏试剂反应程度的影响如图3所示：在不同的氨氮浓度条件下，5min反应时间条件下的测定吸光值偏低，其原因为水体中氨氮与纳氏试剂反应还在进行，水体中氨氮与纳氏试剂反应不充分，造成测定吸光值偏低。在10～30min中，测定吸光值较为稳定，说明水体中氨氮与纳氏试剂反应充分，此时吸光度较为稳定，测定吸光值的结果较为准确。在显色反应30min后，其测定吸光值在低氨氮浓度下呈下降趋势，在高氨氮浓度下呈上升趋势，即吸光值表现为不稳定的状态。因此，显色反应到氨氮浓度测定应在10～30min内完成较好。

2.3、盐度对小体系氨氮浓度测定的影响

申请人的研究表明，水体盐度同样是影响氨氮与纳氏试剂反应的一个重要因素，影响小体系测定方法对海水和淡水水样测定氨氮浓度的适用性。本实验研究了不同盐度对小体系氨氮与纳氏试剂反应的影响，实验结果如图4所示：在不同氨氮浓度条件下，在水体盐度低于5psu时测定吸光值较稳定，没有明显差异。在水体盐度大于5psu时，其测定吸光度随盐度的提高而提高，而氨氮浓度越高，盐度对显色反应的影响越明显。因此该方法仅适用于水体盐度在5psu以下淡水水样的氨氮浓度测定。

2.4、pH对小体系氨氮浓度测定的影响

由于氨氮与纳氏试剂反应需要在碱性条件下，所以pH是影响氨氮与纳氏试剂反应结果的一个重要因素。本实验研究了不同pH对氨氮与纳氏试剂反应结果的影响如图5所示：在不同氨氮浓度条件下，当水体pH为3～11时其测定吸光值没有明显变化。在水体pH为1时其测定吸光值均趋于0。在水体pH为13时，其测定吸光值偏高，且水体氨氮浓度越高，其影响越明显。综上所述，小体系测定氨氮方法适用于水体pH范围为3～11。

2.5、纳氏试剂离心处理对小体系氨氮浓度测定的影响

申请人的研究表明，纳氏试剂在配置时会出现部分沉淀，在对水体氨氮浓度测定实验中，带沉淀的纳氏试剂会使测定吸光值偏高。本实验通过对纳氏试剂进行离心处理(6000rpm，5min)，取上清保存，保证其它反应条件不变，将原反应条件中的纳氏试剂更改为离心处理后取上清保存下的纳氏试剂进行实验。实验结果如图6所示：吸光度与氨氮浓度具有很好的线性回归关系，原条件不进行离心处理的纳氏试剂体系下吸光度与氨氮浓度的线性回归方程为Y＝0.1819X-0.002,线性相关系数R²＝0.9997；经离心处理的纳氏试剂体系吸光度与氨氮浓度的线性回归方程为Y＝0.1824X-0.004，线性相关系数R²＝0.9990。为了进一步说明离心处理对纳氏试剂的可靠性，采用正交验证法对两种不同处理方法体系进行验证，横坐标为未离心处理的纳氏试剂体系测定的吸光值，纵坐标为离心处理的纳氏试剂体系测定的吸光值，进行线性拟合(图7)。两种方法的线性方程为A_a体系＝1.0034A_b-0.002(a表示离心处理的纳氏试剂，b表示未经离心处理的纳氏试剂)，线性相关系数R²＝0.9996，结果表明对纳氏试剂不进行离心处理与进行离心处理下测定的结果拟合度较高，经置信度为95％的t检验，对纳氏试剂不进行离心处理与进行离心处理两种处理方法的sig.＝0.168＞0.05，说明对纳氏试剂不进行离心处理与进行离心处理的测定结果不存在显著性差异。因此，在纳氏试剂配制后，可经过离心处理后再使用，可避免在使用过程中吸入纳氏试剂沉淀而造成假阳性的实验误差，以便于操作，提高试剂的使用率。

2.6、在优化条件下的标准工作曲线的绘制

使用氨氮标准工作液浓度范围为0～2.0μg·mL^-1，按确定的实验条件：纳氏试剂使用量为20μL，反应时间为10min，盐度在5psu以下，pH在3～11之间，进行1mL小体系氨氮测定标准曲线的绘制，同时根据国标方法绘制50mL体系的标准曲线，结果如图8所示：1mL体系吸光度与氨氮浓度的线性回归方程为Y＝0.1819X-0.002，线性相关系数R²＝0.9997；50mL体系线性回归方程为Y＝0.1819X-0.002,线性相关系数R²＝0.9999。可以得出，小体系测定氨氮与国标方法大体系测定氨氮的吸光度和氨氮浓度具有很好的线性回归关系。

为了进一步说明小体系测定的准确性及可靠性，本文采用正交验证法进行验证，横坐标为50mL体系测定的吸光值，纵坐标为1mL体系测定的吸光值，进行线性关系拟合(图9)。两种方法的线性方程为A_a＝0.9854A_b-0.00006，线性相关系数R²＝0.9997，结果表明两种方法拟合度较高(a:1mL体系,b:50mL体系)。经置信度为95％的t检验，小体系与国标大体系两种测定方法的sig.＝0.390＞0.05，即1mL小体系与50mL大体系国标测定方法的测定结果不存在显著性差异，这说明1mL小体系快速测定淡水氨氮浓度的方法具有可行性，可信度较高。

2.7、小体系测定氨氮浓度的线性检测范围

采用优化后的实验条件进行1mL体系的线性检测范围实验，结果如图10所示。当氨氮浓度在0～4.8μg·mL^-1范围内，水体中氨氮浓度与吸光度有较好的线性关系，线性回归方程为Y＝0.1855X-0.0028，线性相关系数R²＝0.9999。当氨氮浓度大于4.8μg·mL^-1时，吸光度增加幅度随氨氮浓度增加而开始下降。由实验结果可得，相对于国标氨氮测定方法中适用氨氮浓度测定范围0～2.0μg·mL^-1，本实验确定小体系测定淡水中氨氮浓度的检测范围为0～4.8μg·mL^-1，氨氮检测范围扩大了2.4倍。小体系测定提高了氨氮浓度的测定范围，可对较高氨氮浓度的样品进行准确有效的测定。

2.8、小体系与国标方法测定实际样品的交叉验证

为验证小体系测定样品的可行性，用小体系与国标两种方法同时分别测定淡水水产养殖及河流样品氨氮浓度，对两种氨氮浓度测定体系测定氨氮浓度结果进行F检验与t检验：经置信度为95％的F检验，1mL小体系与国标50mL体系方法对测定实际样品氨氮浓度结果的F值为1.124＜F值表4.96(df₁为1，df₂为10)，说明小体系与国标方法测定氨氮浓度的精密度无显著性差异。经置信度为95％的t检验，1mL小体系与国标50mL体系方法对测定实际样品氨氮浓度结果的sig.＝0.394＞0.05，说明小体系与国标方法测定氨氮浓度结果无显著性差异。因此，说明本研究建立的小体系连续快速测定淡水氨氮浓度具有可行性。

以上所述，仅是本申请的较佳实施例，并非对本申请做任何形式的限制，虽然本申请以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本申请，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本申请技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于技术方案范围内。

Claims (5)

1.一种小体系连续快速测定淡水中氨氮浓度的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：标准工作曲线制定：

S1.1：采用浓度为3.8190 g·L^-1的氨氮标准工作液配制氨氮浓度分别为0.0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 μg·mL^-1的氨氮工作液各1 mL；

S1.2：在每个氨氮工作液中加入10～25 μL浓度为500 g·L^-1的酒石酸钾钠溶液后混匀；

S1.3：在每个氨氮工作液中加入与酒石酸钾钠溶液等体积的纳氏试剂后混匀放置10～30 min；

S1.4：颜色稳定后，以空白为参照，用酶标仪在波长420 nm下测量并记录每个氨氮工作液的吸光度；

S1.5：以氨氮浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准工作曲线，求出其回归方程；

S2：水样测定：

S2.1：取1 mL盐度小于5 psu、pH为3～11的水样，按与氨氮工作液相同的步骤测定并记录所述水样的吸光度

；

S3：空白试验：

用水代替水样，按与水样测定相同的步骤进行空白试验的吸光度

的测定；

S4：结果计算：

水样中氨氮的质量浓度按式（1）计算：

（1）

——水样中氨氮的质量浓度（以N计），mg/L；

——水样的吸光度；

——空白试验的吸光度；

——标准工作曲线的截距；

——标准工作曲线的斜率；

——试料体积，ml。

2.根据权利要求1所述的小体系连续快速测定淡水中氨氮浓度的方法，其特征在于，所述步骤S1-S3中，所述纳氏试剂的制备过程如下：

配制NaOH浓度为1.6 g/L、KI浓度为0.7 g/L，HgI₂浓度为1 g/L的HgI₂-KI-NaOH溶液，再在转速为5000～7000rpm的条件下离心处理4～6min，取上清液，得到所述纳氏试剂。

3.根据权利要求1所述的小体系连续快速测定淡水中氨氮浓度的方法，其特征在于，八个氨氮工作液的制备过程如下：

在8个圆底2 mL离心管中分别加入氨氮标准工作液0、10、20、40、80、120、160、200 μL，用超纯水稀释至1 mL。

4.根据权利要求1或3所述的小体系连续快速测定淡水中氨氮浓度的方法，其特征在于，所述氨氮标准工作液的制备过程如下：

称取3.8190 g氯化铵（NH₄Cl，预先在100~105℃烘2 h）于烧杯中，加入少量超纯水搅拌溶解，移入1000 mL容量瓶后加入超纯水稀释至标线，混匀后在在2~5℃下冷藏保存，形成氨氮标准储备液；

临用前，吸取1.00 mL氨氮标准贮备液于100 mL容量瓶，加入超纯水稀释至标线，混匀后使用。

5.根据权利要求1所述的小体系连续快速测定淡水中氨氮浓度的方法，其特征在于，所述酒石酸钾钠溶液的制备过程如下：

称取50.0 g酒石酸钾钠溶于烧杯中，加入100 mL超纯水后搅拌溶解，将烧杯放置在加热炉上加热煮沸去除氨，静置冷却至室温，用超纯水稀释至100 mL后保存。

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