CN107449744B - 一种检测纺织印染行业中过氧化氢酶活力的分析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种检测纺织印染行业中过氧化氢酶活力的分析方法，包括以下步骤：(1)将缓冲液稀释得到的待测酶稀释液和加入多支刻度试管或比色管中的过氧化氢底物溶液在30±10℃保温3～10min；(2)向其中一支管中先加入酸液，再加入待测酶稀释液，作为空白，向其余各管中分别先加入待测酶稀释液，反应3～10min后，立即加入酸液，使酶作用停止；(3)往管中加入钛溶液，定容、摇匀、静置后在400～450nm处测定各管中样品的吸光度；(4)根据测得的吸光度，结合校准曲线，计算过氧化氢酶的酶活力。与现有技术相比，本发明对测试时过氧化氢的浓度准确度要求不高，但是测试结果准确度高、测试效率高，操作简单。

Description

一种检测纺织印染行业中过氧化氢酶活力的分析方法
技术领域
本发明涉及一种氧化氢酶活力的分析方法，尤其是涉及一种检测纺织印染行业中过氧化氢酶活力的分析方法。
背景技术
过氧化氢酶，是催化过氧化氢分解成氧和水的一种生物酶，存在于细胞的过氧化物体内。过氧化氢酶在纺织印染行业中被用于去除氧漂工艺残留的过氧化氢，减少了传统工艺中用大量水清洗造成的水资源的浪费，也减轻了含有过氧化氢成分的废水进入污水处理系统对污水处理系统造成的压力。
测定过氧化氢酶酶活力常用的是碘量法，碘量法是通过过氧化氢与碘离子反应生成的碘，再用硫代硫酸钠滴定生成的碘，通过消耗的硫代硫酸钠的体积与浓度可以计算出过氧化氢酶的活力。该方法有以下三个缺点：第一、滴定实验对操作者的技术水平要求较高，需经过较长时间训练的操作人员进行操作，否则实验结果的准确度难以保证。第二、用淀粉溶液作指示剂，在滴定终点处，生成浅蓝色络合物的反应较慢，从而单次滴定耗时长。第三、单次滴定耗时长，使得一次只能进行一个样品的测试，所以待测样品越多的时候，用的测试时间会成倍的增加。第四、过氧化氢开稀后稳定变差，放置久后会自然分解，所以越到后面的测试，系统误差越大。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种检测纺织印染行业中过氧化氢酶活力的分析方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
一种检测纺织印染行业中过氧化氢酶活力的分析方法，包括以下步骤：
(1)向多支刻度试管或比色管中加入过氧化氢含量为5～40mg/L的过氧化氢底物溶液，用pH＝6～8的缓冲液稀释待测酶液，得到待测酶稀释液，将过氧化氢底物溶液和待测酶稀释液在30±10℃保温3～10min；
(2)向其中一支管中先加入酸液，再加入待测酶稀释液，作为空白，向其余各管中分别先加入待测酶稀释液，反应3～10min后，立即加入酸液，使酶作用停止；
(3)往各管的反应液中加入钛溶液，定容、摇匀、静置后在400～450nm处测定各管中样品的吸光度；
(4)根据测得的吸光度，结合绘制的校准曲线，计算过氧化氢酶的酶活力。
优选地，该分析方法包括以下步骤：
(1)向多支刻度试管或比色管中加入过氧化氢含量为20mg/L的过氧化氢底物溶液，用pH＝7.0的缓冲液稀释待测酶液，得到待测酶稀释液，将过氧化氢底物溶液和待测酶稀释液在30±1℃保温5min；
(2)向其中一支管中先加入酸液，再加入待测酶稀释液，作为空白，向其余各管中分别先加入待测酶稀释液，反应5min后，立即加入酸液，使酶作用停止；
(3)往各管的反应液中加入钛溶液，定容、摇匀、静置后在430nm处测定各管中样品的吸光度；
(4)根据测得的吸光度，结合绘制的校准曲线，计算过氧化氢酶的酶活力。
酶是一种催化能力非常高的生物催化剂，它的高效性要发挥出来，需要适宜的温度和pH。温度过高，酶会变性失活，而温度太低，酶的高效性发挥不出来；pH值过高或过低，都会使酶变性失活；过氧化氢酶在纺织印染行业中实际使用时的温度一般在10-50℃之间，因此实验温度选择30±10℃(优选30℃)，pH选择6～8(优选pH＝7)，能够在比较贴合实际使用条件的情况下，有利于发挥酶的高效性。
优选地，所述的校准曲线的绘制采用以下方法：
将一系列浓度的过氧化氢标准溶液与钛溶液混合，静置后在与步骤(3)相同的波长处测定吸光度，根据吸光度及相应的过氧化氢浓度，绘制得到校准曲线。
优选地，校准曲线的绘制过程中所用的钛溶液与步骤(3)中的钛溶液相同。
优选地，将一系列浓度的过氧化氢标准溶液与钛溶液混合采用以下方法：
吸取20mg/L的过氧化氢标准使用液0.00mL、0.25mL、0.50mL、0.70mL、1.00mL、2.5mL、5.00mL、7.00mL及10.00mL于25mL刻度试管或比色管中，加入钛溶液5mL，定容至25mL。
优选地，步骤(1)中，通过调节待测酶液的稀释倍数，使测定的非空白反应液对应的样品的吸光度为0.15～0.35。
通过调节待测酶液的稀释倍数，使测定的非空白反应液对应的样品的吸光度为0.15～0.35，能更好的保证实验结果的准确度。这是因为：
(1)过氧化氢有强氧化性，它能使一部分的过氧化氢酶失活，过氧化氢酶浓度越低，损失的过氧化氢酶比例越高，实验结果误差越大；
(2)如果测得的吸光度太低，代表剩余的过氧化氢含量低以及初始的过氧化氢酶含量高，这种情况下，可能会造成过氧化氢的效果没得到完全的发挥，使得最终酶活力结果偏小；
(3)反之，如果测得的吸光度太高，代表剩余的过氧化氢含量高以及初始的过氧化氢酶含量低，可能因过氧化氢氧化性损失的酶比例高，而产生较大的实验误差。
优选地，步骤(2)中的待测酶稀释液、步骤(2)中的酸液和步骤(1)中的过氧化氢底物溶液的体积比为1:2～7:5，步骤(2)中的酸液的H+浓度不小于0.5mol/L。
优选地，所述的酸液为能水解出H+的无机酸或有机酸，包括硫酸、盐酸、冰醋酸或磷酸。
优选地，步骤(3)中钛溶液的体积、反应液的体积及定容容积之比为5:8～13:25。
优选地，所述的钛溶液选用二氧化钛-硫酸溶液，钛溶液的浓度为1～5g/L。
本分析方法的原理为：
过氧化氢酶是一种具有活性的生物大分子，它有蛋白质的性质，诸如强酸、强碱、高温等能让蛋白质变性的因素，都能让过氧化氢酶变性而失活，这是一个不可逆的过程。在过氧化氢浓度足够高时，过氧化氢酶能匀速的催化过氧化氢的分解，当溶液酸性很强时，过氧化氢酶将会失活，酶反应会终止，未被催化的过氧化氢残留在酸性溶液中。钛溶液中的钛离子与这部分残留在酸性溶液中的过氧化氢反应生成橙色的络合物，这种络合物用分光光度计在400～450nm(优选430nm)能测出相应的吸光度。过氧化氢含量越高，络合物的浓度成正比例的变高。通过预先做好的校准曲线可以求出残余过氧化氢的量，进而求出过氧化氢酶的酶活力。总之，本发明是在过氧化氢酶分解过氧化氢后，用钛离子与剩余的过氧化氢反应生成橙色络合物，根据显色法原理，用分光光度计测试生成物的吸光度。根据过氧化氢与钛离子生成的络合物的吸光度的差异，计算过氧化氢酶的酶活力。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明的分析方法操作简单，对操作者的实验水平要求不高，可以通过使用移液器、分光光度计等工具和仪器操作也能有很高的准确度和重复性。
(2)本发明的分析方法可多个样品同时进行测试，不但降低了测试强度，也节省了测试时长。(例如碘量法测5个样品需要5个小时左右，使用本方法约2小时即可以完成)
(3)本发明的分析方法单次可进行多个样品的测试，降低了因过氧化氢溶液不稳定而自然分解产生的系统误差，提高了实验的准确度。
(4)本发明的分析方法对测试时过氧化氢的浓度准确度要求不高，所以即使过氧化氢溶液自然分解，可通过调整底物溶液的稀释倍数进行试验且无需测试稀释后的过氧化氢的准确浓度，对实验结果的影响也较小。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
一种检测纺织印染行业中过氧化氢酶活力的分析方法，包括以下步骤：
(1)校准曲线的绘制
准确吸取20mg/L的过氧化氢标准使用液0.00mL、0.25mL、0.50mL、0.70mL、1.00mL、2.5mL、5.00mL、7.00mL及10.00mL于25mL具塞比色管中，加入5mL浓度为5g/L的二氧化钛-硫酸溶液，定容至25mL，摇匀，放置10min后，用1cm比色皿在430nm处测定吸光度；
根据吸光度及相应的过氧化氢含量，绘制校准曲线。
(2)样品的测定
(2-1)在三支25mL的比色管中加5mL、20mg/L的过氧化氢底物溶液，用pH＝7.0缓冲液将待测酶液稀释，得到待测酶稀释液，将过氧化氢底物溶液和待测酶稀释液一起放于30℃恒温水槽中水浴5min。
(2-2)在前两支比色管中加入待测酶稀释液1mL，准确反应5min后，立即加入4mL0.5mol/L H2SO4，使酶作用终止。
(2-3)在第三支比色管中先加4mL 0.5mol/L H2SO4，再补加1mL待测酶稀释液，作为空白。
(2-4)往三支比色管的反应液中各加入5mL浓度为5g/L的二氧化钛-硫酸溶液，定容至25mL，摇匀，放置10min。
(2-5)用1cm比色皿在430nm处测定各比色管中样品的吸光度。
通过调节待测酶液的稀释倍数，使测定的非空白反应液对应的样品的吸光度范围为0.15～0.35。
(3)根据测试所得的吸光度，结合校准曲线，计算过氧化氢酶的酶活力。
Figure GDA0002690326780000051
式中：V：参与反应试液的体积，ml；
X1：根据标准曲线计算出的第三支比色管中H2O2的含量，μg；
X2：根据标准曲线计算出的第一、二支比色管中H2O2的含量，μg；
34：H2O2的摩尔质量，单位g/mol；
N：稀释倍数。
采用上述方法对过氧化氢酶A和过氧化氢酶B两种过氧化氢酶的酶活力进行测试，其测试结果如表1所示：
表1
Figure GDA0002690326780000061
本实施例中的酶活定义为在30℃、pH值为7.0的条件下，1mL酶液、1分钟分解1μmol过氧化氢所需的酶量为1个酶活力单位IU。
从上表可以看出，本方法的准确度高，重复性好。
实施例2
本实施例的检测纺织印染行业中过氧化氢酶活力的分析方法与实施例1基本相同，不同之处在于，本实施例步骤(2-2)和步骤(2-3)中加入的H2SO4的体积为2mL。
实施例3
本实施例的检测纺织印染行业中过氧化氢酶活力的分析方法与实施例1基本相同，不同之处在于，本实施例步骤(2-2)和步骤(2-3)中加入的H2SO4的体积为7mL。
实施例4
本实施例的检测纺织印染行业中过氧化氢酶活力的分析方法与实施例1基本相同，不同之处在于，本实施例中的酸液为与实施例1中的H2SO4同等氢离子浓度的盐酸、冰醋酸或磷酸等无机酸或有机酸。
实施例5
(1)校准曲线的绘制
准确吸取20mg/L的过氧化氢标准使用液0.00mL、0.25mL、0.50mL、0.70mL、1.00mL、2.5mL、5.00mL、7.00mL及10.00mL于25mL具塞比色管中，加入5mL浓度为5g/L的二氧化钛-硫酸溶液，定容至25mL，摇匀，放置10min后，用1cm比色皿在400nm处测定吸光度；
根据吸光度及相应的过氧化氢含量，绘制校准曲线。
(2)样品的测定
(2-1)在三支25mL的刻度试管中加5mL 10mg/L的过氧化氢底物溶液，用pH＝8缓冲液将待测酶液稀释，得到待测酶稀释液，将过氧化氢底物溶液和待测酶稀释液一起放于20℃恒温水槽中水浴3min。
(2-2)在前两支刻度试管中加入待测酶稀释液1mL，准确反应3min后，立即加入4mL1mol/L H2SO4，使酶作用终止。
(2-3)在第三支刻度试管中先加4mL 1mol/L H2SO4，再补加1mL待测酶稀释液，作为空白。
(2-4)往三支刻度试管的反应液中各加入5mL浓度为5g/L的二氧化钛-硫酸溶液，定容至25mL，摇匀，放置10min。
(2-5)用1cm比色皿在400nm处测定各比色管中样品的吸光度。
(3)根据测试所得的吸光度，结合校准曲线，计算过氧化氢酶的酶活力。
实施例6
(1)校准曲线的绘制
准确吸取20mg/L的过氧化氢标准使用液0.00mL、0.25mL、0.50mL、0.70mL、1.00mL、2.5mL、5.00mL、7.00mL及10.00mL于25mL具塞比色管中，加入5mL浓度为4g/L的二氧化钛-硫酸溶液，定容至25mL，摇匀，放置10min后，用1cm比色皿在450nm处测定吸光度；
根据吸光度及相应的过氧化氢含量，绘制校准曲线。
(2)样品的测定
(2-1)在三支25mL的比色管中加5mL 15mg/L的过氧化氢底物溶液，用pH＝6缓冲液将待测酶液稀释，得到待测酶稀释液，将过氧化氢底物溶液和待测酶稀释液一起放于40℃恒温水槽中水浴10min。
(2-2)在前两支比色管中加入待测酶稀释液1mL，准确反应10min后，立即加入4mL2mol/L H2SO4，使酶作用终止。
(2-3)在第三支比色管中先加4mL 2mol/L H2SO4，再补加1mL待测酶稀释液，作为空白。
(2-4)往三支比色管的反应液中各加入5mL浓度为4g/L的二氧化钛-硫酸溶液，定容至25mL，摇匀，放置10min。
(2-5)用1cm比色皿在450nm处测定各比色管中样品的吸光度。
(3)根据测试所得的吸光度，结合校准曲线，计算过氧化氢酶的酶活力。
采用上述方法对过氧化氢酶A和过氧化氢酶B两种过氧化氢酶的酶活力进行测试，其测试结果如表2所示：
表2
Figure GDA0002690326780000081
从上表可以看出，本方法的准确度高，重复性好。
实施例7
本实施例与实施例1基本相同，不同之处在于，本实施例中校准曲线的绘制过程中以及步骤(2-4)中所用的二氧化钛-硫酸溶液的浓度均为1g/L。
实施例8
本实施例与实施例1基本相同，不同之处在于，本实施例中步骤(2-1)的过氧化氢底物溶液的浓度为5mg/L。
实施例9
本实施例与实施例1基本相同，不同之处在于，本实施例中步骤(2-1)的过氧化氢底物溶液的浓度为40mg/L。

Claims (8)

1.一种检测纺织印染行业中过氧化氢酶活力的分析方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)向多支刻度试管或比色管中加入过氧化氢含量为20mg/L的过氧化氢底物溶液，用pH＝7.0的缓冲液稀释待测酶液，得到待测酶稀释液，将过氧化氢底物溶液和待测酶稀释液在30±1℃保温5min；
(2)向其中一支管中先加入酸液，再加入待测酶稀释液，作为空白，向其余各管中分别先加入待测酶稀释液，反应5min后，立即加入酸液，使酶作用停止；
(3)往各管的反应液中加入钛溶液，定容、摇匀、静置后在430nm处测定各管中样品的吸光度；
(4)根据测得的吸光度，结合绘制的校准曲线，计算过氧化氢酶的酶活力；
步骤(1)中，通过调节待测酶液的稀释倍数，使测定的非空白反应液对应的样品的吸光度为0.15～0.35。
2.根据权利要求1所述的一种检测纺织印染行业中过氧化氢酶活力的分析方法，其特征在于，所述的校准曲线的绘制采用以下方法：
将一系列浓度的过氧化氢标准溶液与钛溶液混合，静置后在与步骤(3)相同的波长处测定吸光度，根据吸光度及相应的过氧化氢浓度，绘制得到校准曲线。
3.根据权利要求2所述的一种检测纺织印染行业中过氧化氢酶活力的分析方法，其特征在于，将一系列浓度的过氧化氢标准溶液与钛溶液混合采用以下方法：
吸取20mg/L的过氧化氢标准使用液0.00mL、0.25mL、0.50mL、0.70mL、1.00mL、2.5mL、5.00mL、7.00mL及10.00mL于25mL刻度试管或比色管中，加入钛溶液5mL，定容至25mL。
4.根据权利要求1所述的一种检测纺织印染行业中过氧化氢酶活力的分析方法，其特征在于，步骤(2)中的待测酶稀释液、步骤(2)中的酸液和步骤(1)中的过氧化氢底物溶液的体积比为1:2～7:5，步骤(2)中的酸液的H+浓度不小于0.5mol/L。
5.根据权利要求4所述的一种检测纺织印染行业中过氧化氢酶活力的分析方法，其特征在于，所述的酸液为能水解出H+的无机酸或有机酸，包括硫酸、盐酸、冰醋酸或磷酸。
6.根据权利要求1所述的一种检测纺织印染行业中过氧化氢酶活力的分析方法，其特征在于，步骤(3)中钛溶液的体积、反应液的体积及定容容积之比为5:8～13:25。
7.根据权利要求1所述的一种检测纺织印染行业中过氧化氢酶活力的分析方法，其特征在于，所述的钛溶液选用二氧化钛-硫酸溶液，钛溶液的浓度为1～5g/L。
8.根据权利要求1所述的一种检测纺织印染行业中过氧化氢酶活力的分析方法，其特征在于，每支刻度试管或比色管中加入的过氧化氢底物溶液、待测酶稀释液、酸液和钛溶液的量分别相同。
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