CN101294192A - 一种检测土壤中过氧化氢酶活性的分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种检测土壤中过氧化氢酶活性的分析方法：1)称取鲜土n份置于100ml三角瓶中。向对照土壤中加入硫酸和三氯醋酸以钝化过氧化氢酶；将所有土样放在0℃冰浴内，15min后向三角瓶中加入过氧化氢溶液，混合，放在同一温度下培养1h；2)向试验瓶中加入硫酸和三氯醋酸以钝化过氧化氢；3)摇匀所有三角瓶，过滤；4)为每一个样品准备一个含有硫酸钛溶液的试管，吸取一定量的滤液和蒸馏水加入，混合，液体呈黄色；5)在分光光度计上比色测定吸光度；6)计算水解的过氧化氢的量。本发明优点为：1)简化了操作步骤，减少了实验中的不确定性；2)方法准确度高，易操作；3)结果稳定可靠，重现性好。
Description
技术领域
本发明涉及土壤中过氧化氢酶活性的测定，具体地说是一种检测土壤中过氧化氢酶活性的分析方法。
背景技术
土壤中的过氧化氢酶能酶促过氧化氢分解为水和分子氧，具体反应如下：
过氧化氢是在生物呼吸的过程中和由于有机物质的各种生物化学反应的结果而形成的。在生物体中，可能也在土壤中，过氧化氢酶的作用是破坏对生物体有毒的过氧化氢。因此，土壤中的过氧化氢酶间接影响着土壤肥力的高低，其活性受土壤条件如水分、温度、土壤质地的强烈影响，同时也受到农田耕作制度、管理措施以及不同作物的影响。因此，对土壤中过氧化氢酶活性的检验有很重要的意义。到目前为止，有关过氧化氢酶活性的测定基于过氧化氢与土壤相互作用，根据析出氧的体积或未分解的过氧化氢的量，测出过氧化氢的分解速率。不过有些方法步骤比较繁琐，需用专用的分析设备，试剂瓶和抽气装置，使其难以适应土壤中过氧化氢酶活性的定性比较和定量研究，降低了实验的效率，增加了实验结果的不准确性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检验土壤中过氧化氢酶活性的分析方法。该方法是在借鉴前人测定方法的原理基础上，对过氧化氢酶活性的测定步骤进行了改进，从而减少样品处理和试验步骤的复杂性，使分析结果更加精确可靠，分析重现性更好。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种检测土壤中过氧化氢酶活性的分析方法，
1)称取4-6g新鲜土壤或预培养后的土壤n份置于100ml三角瓶中，n≥2；以其中1份新鲜土壤或预培养后的土壤为对照土壤，向对照土壤中加入5-10ml重量浓度5-10％硫酸和5-10ml重量浓度5-10％三氯醋酸以钝化过氧化氢酶；将盛有钝化和未钝化土壤的三角瓶分别放入的0±4℃冰浴内；15±5min后，向每一个三角瓶中加5-10ml重量浓度1-2％过氧化氢溶液，小心混合反应物，并在0±4℃下培养1±0.2h；
2)培养结束后，向试验瓶中分别加入5-10ml重量浓度5％-10％硫酸和5-10ml重量浓度5％-10％三氯醋酸以钝化过氧化氢酶；
3)摇匀所有三角瓶，过滤；
4)为每一个样品准备一个含有1-3ml重量浓度2％-5％硫酸钛溶液的试管，分别向每一个试管中加入1-2ml滤液和8-9ml蒸馏水，混合，呈黄色；
5)在分光广度计上蓝色滤光片比色测定吸光度A；
6)制作工作标准曲线：配制一系列浓度的H2O2标准溶液，然后分别加入1-3ml重量浓度2％-5％硫酸钛溶液，混合后比色测定吸光度A’。以过氧化氢标准溶液的系列浓度和测定的吸光值A’制作工作标准曲线，得到斜率b；
7)根据吸光值A和斜率b，计算所测滤液中过氧化氢的浓度S，S＝A*b；
8)计算样品中被分解的过氧化氢的量；
9)计算过氧化氢酶活性：
计算公式为：(S1-S2)V/1000*W.T＝mg水解的过氧化氢/1g干土.1h
式中：S1为钝化处理中过氧化氢的含量(μg/ml)；S2为未钝化处理中过氧化氢的含量(μg/ml)；V为滤液体积(ml)；W为干土质量(g)；T为培养的时间(h)；1000为微克转化成毫克的转化系数。
所述制作工作标准曲线过程为，吸取1ml 10mg/ml H2O2溶液定容至100ml，浓度为100μg/ml；分别吸取H2O2稀释液0ml，7.5ml，10ml，12.5ml，15ml，17.5ml，20ml定容至50ml，得到一系列浓度的H2O2标准溶液，浓度为0，15，20，25，30，35，40μg/ml；分别吸取10ml系列浓度的H2O2标准溶液于试管中，然后分别加入1-3ml重量浓度2％-5％硫酸钛溶液，混合后比色测定吸光度A’；以过氧化氢标准溶液的系列浓度和测定的吸光值A’制作工作标准曲线，得到斜率b。
由于H2O2标准溶液的浓度会发生变化，故在制备时应在酸性介质中，用0.01mol/L KMnO4滴定溶液中的H2O2，以测得后者的准确含量；1ml 0.01mol/L KMnO4相当于170μg H2O2。
本发明方法改进的依据
土壤过氧化氢酶是酶促过氧化氢分解为水和氧分子的一类酶的总称，它们都是参与土壤中对生物体有害的过氧化氢的分解的氧化还原酶。过氧化氢酶很多方法的测定都是基于过氧化氢与土壤相互作用，根据析出氧的体积或未分解的过氧化氢的量，测出过氧化氢的分解速率。与此相同，本方法中土壤过氧化氢酶活性的测定是以双氧水(H2O2)为底物，经过一定时间的培养，通过计算单位时间内单位土壤的过氧化氢的分解量来表征过氧化氢酶的活性。
本发明所使用的测定原理为：
本试验是基于在酸性情况下，过氧化氢能与硫酸钛反应，形成黄色和黄橙色的过二硫代钛酸，其颜色的深浅，取决于过氧化氢的量。通过比色测定滤液中过氧化氢的量，进而计算过氧化氢酶的活性。
与过去的分析方法相比较，本发明的优点主要有：
1)所需设备简单、降低了试验成本。本发明中的培养试验是在100ml的三角瓶中进行，不需用一些方法中提及的用来测量氧气的专用装置。
2)操作简单，分析结果稳定可靠，重现性好。本发明简化了操作步骤，减了实验中的不确定性；方法准确度高，易操作；原来方法需要设置灭菌土壤作为对照，本发明只需要一个不加底物的溶液作为对照，与传统方法比较，所需设备简单，成本低；同时提高了实验结果的准确度。
具体实施方式
试剂配制：
1.1％H2O2溶液(即10mg/ml)：按1∶30比例将商用30％(W/V)的H2O2溶液用水稀释(双氧水有强氧化性，配制时注意安全)。
2.2％硫酸钛溶液(用2.5N H2SO4配制)：称取2g硫酸钛，用2.5N H2SO4定容至100ml(有混浊时过滤)。
3.10％硫酸溶液：按1∶9.5比例将浓度95％的浓H2SO4用水稀释(浓硫酸有强氧化性、腐蚀性，配制时注意安全)。
4.10％三氯醋酸溶液：称取10g三氯醋酸，用蒸馏水定容至100ml(三氯醋酸有强腐蚀性，配制时注意安全)。
5.0.01mol/L KMnO4溶液：称取1.5803g KMnO4溶解并用蒸馏水定容至1000ml。
6.制作工作标准曲线：吸取1ml 10mg/ml H2O2溶液定容至100ml(浓度为100μg/ml)。分别吸取H2O2稀释液0ml，7.5ml，10ml，12.5ml，15ml，17.5ml，20ml定容至50ml，得到一系列浓度的H2O2标准溶液(浓度为0，15，20，25，30，35，40μg/ml)。分别吸取10ml一系列浓度的H2O2标准溶液于试管中，然后分别加入2ml硫酸钛溶液，混合后比色测定吸光度A’。以过氧化氢溶液的系列浓度和测定的吸光值A’制作工作标准曲线，得到斜率b。以过氧化氢标准溶液的系列浓度和测定的吸光值A’制作工作标准曲线，得到斜率b；由于H2O2标准溶液的浓度会发生变化，故在制备时应在酸性介质中，用0.01mol/L KMnO4滴定溶液中的H2O2，以测得后者的准确含量。1ml0.01mol/L KMnO4相当于170μg H2O2；
操作步骤：
1)称取5g鲜土4份置于100ml三角瓶中(n≥2)，向对照土壤中加入5ml 10％硫酸和5ml 10％三氯醋酸以钝化过氧化氢酶；将盛有钝化和未钝化土壤的三角瓶放入的0℃冰浴内。15min后，向每一个三角瓶中加10ml 1％过氧化氢溶液，小心混合反应物，并在同一温度下培养1h；
2)培养结束后，向试验瓶中分别加入5ml 10％硫酸和5ml 10％三氯醋酸以钝化过氧化氢酶；
3)摇匀所有三角瓶，过滤；
4)为每一个样品准备一个含有2ml 2％硫酸钛溶液的试管。向每一个试管中加入1ml滤液和9ml蒸馏水，混合，呈黄色；
5)在分光广度计上蓝色滤光片比色测定吸光度A；
6)制作工作标准曲线，以过氧化氢标准溶液的系列浓度和测定的吸光值A’制作工作标准曲线，得到斜率b；
7)根据吸光值A和斜率b，计算所测滤液中过氧化氢的浓度S，S＝A*b；
8)计算样品中被分解的过氧化氢的量；
9)计算过氧化氢酶活性：
计算公式为：(S1-S2)V/1000*W.T＝mg水解的过氧化氢/1g干土.1h
式中：S1为钝化处理中过氧化氢的含量(μg/ml)；S2为未钝化处理中过氧化氢的含量(μg/ml)；V为滤液体积(ml)；W为干土质量(g)；T为培养的时间(h)；1000为微克转化成毫克的转化系数。
实施例1
本实施例所使用的黑土采自于中国科学院海伦生态试验站，白浆土采自于三江平原。两种土壤都在25℃培养24h以上，土壤含水量均为20％(风干土重)，用上述方法检测两种土壤的过氧化氢酶活性。
每种土壤得具体分析步骤如下：
1)称取5g鲜土4份置于100ml三角瓶中(n≥2)，向对照土壤中加入5ml 10％硫酸和5ml 10％三氯醋酸以钝化过氧化氢酶；将盛有钝化和未钝化土壤的三角瓶放入的0℃冰浴内。15min后，向每一个三角瓶中加10ml 1％过氧化氢溶液，小心混合反应物，并在同一温度下培养1h；
2)培养结束后，向试验瓶中分别加入5ml 10％硫酸和5ml 10％三氯醋酸以钝化过氧化氢酶；
3)摇匀所有三角瓶，过滤；
4)为每一个样品准备一个含有2ml 2％硫酸钛溶液的试管。向每一个试管中加入1ml滤液和9ml蒸馏水，混合，呈黄色；
5)在分光广度计上蓝色滤光片比色测定吸光度A；
6)制作工作标准曲线，以过氧化氢标准溶液的系列浓度和测定的吸光值A’制作工作标准曲线，得到斜率b；
7)根据吸光值A和斜率b，计算所测滤液中过氧化氢的浓度S，S＝A*b；
8)计算样品中被分解的过氧化氢的量；
9)计算过氧化氢酶活性：
试验结果如下：
由表中数据可以看出，各处理之间结果差异达到显著水平，较小的标准差值表明该分析方法结果之间的偏差较小，精确度较高，重现性好。
实施例2
本实施例所使用的棕壤采于中国科学院沈阳生态实验站，褐土采自于朝阳。两种土壤含水量均为20％(风干土重)，在25℃条件下培养24h以上，测定其过氧化氢酶活性，具体步骤如下：底物H2O2浓度为2％，加入5mL，其余步骤同实例1。
实验结果如下：
表中数据同样显示了分析结果的稳定性及较高的精密度。
Claims (3)
1.一种检测土壤中过氧化氢酶活性的分析方法，其特征在于：
1)称取4-6g新鲜土壤或预培养后的土壤n份置于100ml三角瓶中，n≥2；以其中1份新鲜土壤或预培养后的土壤为对照土壤，向对照土壤中加入5-10ml重量浓度5-10％硫酸和5-10ml重量浓度5-10％三氯醋酸以钝化过氧化氢酶；将盛有钝化和未钝化土壤的三角瓶分别放入的-4～4℃冰浴内；15±5min后，向每一个三角瓶中加5-10ml重量浓度1-2％过氧化氢溶液，小心混合反应物，并在-4～4℃下培养0.8-1.2h；
2)培养结束后，向试验瓶中分别加入5-10ml重量浓度5％-10％硫酸和5-10ml重量浓度5％-10％三氯醋酸以钝化过氧化氢酶；
3)摇匀所有三角瓶，过滤；
4)为每一个样品准备一个含有1-3ml重量浓度2％-5％硫酸钛溶液的试管，分别向每一个试管中加入1-2ml滤液和8-9ml蒸馏水，混合，呈黄色；
5)在分光广度计上蓝色滤光片比色测定吸光度A；
6)制作工作标准曲线：配制一系列浓度的H2O2标准溶液，然后分别加入1-3ml重量浓度2％-5％硫酸钛溶液，混合后比色测定吸光度A’。以过氧化氢标准溶液的系列浓度和测定的吸光值A’制作工作标准曲线，得到斜率b；
7)根据吸光值A和斜率b，计算所测滤液中过氧化氢的浓度S，S＝A*b；
8)计算样品中被分解的过氧化氢的量；
9)计算过氧化氢酶活性：
计算公式为：(S1-S2)V/1000*W.T＝mg水解的过氧化氢/1g干土.1h
式中：S1为钝化处理中过氧化氢的含量(μg/ml)；S2为未钝化处理中过氧化氢的含量(μg/ml)；V为滤液体积(ml)；W为干土质量(g)；T为培养的时间(h)；1000为微克转化成毫克的转化系数。
2.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于：所述制作工作标准曲线过程为，吸取1ml 10mg/ml H2O2溶液定容至100ml，浓度为100μg/ml；分别吸取H2O2稀释液0ml，7.5ml，10ml，12.5ml，15ml，17.5ml，20ml定容至50ml，得到一系列浓度的H2O2标准溶液，浓度为0，15，20，25，30，35，40μg/ml；分别吸取10ml系列浓度的H2O2标准溶液于试管中，然后分别加入1-3ml重量浓度2％-5％硫酸钛溶液，混合后比色测定吸光度A’；以过氧化氢标准溶液的系列浓度和测定的吸光值A’制作工作标准曲线，得到斜率b。
3.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于：由于H2O2标准溶液的浓度会发生变化，故在制备时应在酸性介质中，用0.01mol/L KMnO4滴定溶液中的H2O2，以测得后者的准确含量；1ml0.01mol/L KMnO4相当于170μg H2O2。
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