CN106092935B - 土壤微生物毒性试验中硝酸盐含量测定方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种土壤微生物毒性试验中硝酸盐含量测定方法，通过采用一种新的土壤预培养方法，结合对现有硝酸盐含量测定方法的改进，使该测定方法适用于土壤微生物毒性试验。本发明还公开了一种所述土壤微生物毒性试验中硝酸盐含量测定方法的应用。采用本发明，具有操作简便、重复性好、稳定性高、准确度和精密度高的特点，对正确评估化学品或农药对土壤微生物的毒性效应至关重要。

Description

土壤微生物毒性试验中硝酸盐含量测定方法及其应用
技术领域
本发明涉及一种应用于土壤微生物毒性试验-氮转化法中硝酸盐含量测定方法，尤其涉及一种可应用于我国标准化管理机构对化学品或农药登记管理的环境影响评价中土壤微生物的毒性测试。
背景技术
土壤微生物是维持土壤生态系统的重要组成部分，对物质的循环和土壤肥力的形成发挥着重要作用。土壤中存在多种对污染物敏感的微生物种群，其数量、功能、多样性等变化均能够指示土壤环境受污染的程度。土壤微生物作为指示土壤污染的敏感标志物，已经被国际标准化组织(International Organization for Standardization,ISO)，经济合作与发展组织(Organizationg for Economin Cooperation and Devekopment,OECD)和我国标准化管理机构作为化学品或农药登记管理的重要环境影响指标。这些标准化的测试方法包括化学品或农药对土壤微生物氮转化、碳转化、呼吸作用、硝化作用、脱氢酶活性、微生物量等方面。在土壤微生物氮转化试验中，OECD和我国标准化管理机构出台《化学农药环境安全评价试验准则》中概况的规定了试验方法、试验环境条件、试验操作、暴露浓度设计和评价方法等，未对实验前预培养的方式、硝酸盐测定方法及方法验证等进行详细描述。因此，选择一种操作简便、重复性好、稳定性高、准确度和精密度高的硝酸盐测定方法对正确评估化学品或农药对土壤微生物中的毒性效应至关重要。
酚二磺酸比色法是一种经典的硝酸盐测定方法，被广泛应用于土壤和水体样品的检测中。然而，现有的酚二磺酸比色法在土壤微生物毒性测试应用上却不适用，因此亟需提供一种新的适用于实验室的土壤微生物毒性试验中硝酸盐含量测定方法，以弥补当前在该领域的空白。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于，提供一种土壤微生物毒性试验中硝酸盐含量测定方法，具有操作简便、重复性好、稳定性高、准确度和精密度高的特点，对正确评估化学品或农药对土壤微生物的毒性效应至关重要。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种土壤微生物毒性试验中硝酸盐含量测定方法，包括以下步骤：
步骤1：称取10g土壤样品于三角瓶中，加入0.1g CaSO4·2H2O和50mL去离子水，混合均匀得到混合液；
步骤2：将所述混合液在150rpm转速，18-22℃温度范围的恒温摇床上振荡60min，结束后沉淀12-18min；
步骤3：取上清液在10000rpm高速冷冻离心机下离心5-10min，离心后用滤纸过滤1-2次；
步骤4：取上清液于100mL蒸发皿中，向其中加入0.05gCaCO3，随后水浴蒸干至干燥；
步骤5：冷却，迅速加入2mL酚二磺酸试剂，将皿旋转，使试剂接触到所有的蒸干物；
步骤6：静置反应10min后，加入20mL去离子水，用玻璃棒搅拌直到蒸干物完全溶解。冷却后缓缓加入1：1氨水并不断搅拌均匀，至溶液呈黄色再多加2mL，以保证氨水过量；
步骤7：将溶液转移至100mL容量瓶中，用去离子水定容至体积，得到显色液；
步骤8：将显色液通过分光光度计在波长420nm处进行比色，测得显色液的吸光度，以去离子水做参比，调节仪器零点；
步骤9：通过测得的吸光度从NO3-－N标准曲线中找出显色液的硝态氮浓度，并计算得出土壤中硝酸盐含量。
作为上述方案的改进，所述步骤1中的土壤样品需经过土壤采集、处理、理化指标测定以及预培养的过程后制得。
作为上述方案的改进，采集的土壤应未施用过农药或有机肥，采集深度为0cm-20cm。
作为上述方案的改进，土壤处理包括以下步骤：
除去土壤中石块、植物根系等杂物；
然后测定土壤的含水率，如含水率在10％-13％之间，无需进行风干处理，如含水率高于13％则需要风干处理；
处理后的样品置于4℃±2℃黑暗处保存。
作为上述方案的改进，土壤的理化指标测定包括以下检测项目：pH值、阳离子交换量、机械组成、有机碳、土壤含水量、土壤微生物量碳。
作为上述方案的改进，所述土壤预培养包括以下步骤：称取试验所需的土壤重量，按照每千克土壤用苜蓿粉5g的比例加入有机底物紫花苜蓿，进行碳调节，混合均匀后，加去离子水调节土壤含水量为最大持水量的40％-60％，置于温度为20℃±2℃、黑暗的环境中培养2d-28d。
作为上述方案的改进，所述紫花苜蓿的C/N比在12/1-16/1之间。
作为上述方案的改进，所述步骤4中量取上清液的体积范围为0.5mL-50mL。
相应地，本发明还提供一种所述土壤微生物毒性试验中硝酸盐含量测定方法的应用，采用所述测定方法评估甲嘧磺隆对土壤微生物氮转化的影响。
实施本发明实施例，具有如下有益效果：
本发明提出了一种新的土壤预培养方法，并调整和修改现有的硝酸盐含量测定步骤，使其适用于土壤微生物毒性试验-氮转化法中硝酸盐含量测定方法。通过对本发明所述硝酸盐含量测定方法的方法学验证可知，本发明所述测定方法准确度和精密度高，应用于土壤微生物毒性试验中其测试结果重复性好，稳定性高，可作为现行标准在土壤微生物毒性试验-氮转化法中硝酸盐含量测定方面的补充。此外，还可利用本发明所述硝酸盐含量测定方法测定在土壤中添加化学农药如甲嘧磺隆对土壤微生物氮转化的影响，也弥补甲嘧磺隆对土壤微生物毒性数据的空白，为该类物质环境影响评价提供数据支持。
附图说明
图1是采用本发明所述土壤微生物毒性试验中硝酸盐含量测定方法测定并绘制的硝酸根离子标准曲线。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。
现行在实验室常用的土壤硝酸盐含量测试方法不适用于土壤微生物毒性试验中硝酸盐含量测定方法，为此，本发明人经过反复多次的实验，分析，验证一系列过程，发现采用本发明所述土壤微生物毒性试验中硝酸盐含量测定方法，包括以下步骤：
步骤1：称取10g土壤样品于三角瓶中，加入0.1g CaSO4·2H2O和50mL去离子水，混合均匀得到混合液；
步骤2：将所述混合液在150rpm转速，18-22℃温度范围的恒温摇床上振荡60min，结束后沉淀12-18min；
步骤3：取上清液在10000rpm高速冷冻离心机下离心5-10min，离心后用滤纸过滤1-2次；
步骤4：取上清液于100mL蒸发皿中，向其中加入0.05gCaCO3，随后水浴蒸干至干燥；
步骤5：冷却，迅速加入2mL酚二磺酸试剂，将皿旋转，使试剂接触到所有的蒸干物；
步骤6：静置反应10min后，加入20mL去离子水，用玻璃棒搅拌直到蒸干物完全溶解。冷却后缓缓加入1：1氨水并不断搅拌均匀，至溶液呈黄色再多加2mL，以保证氨水过量；
步骤7：将溶液转移至100mL容量瓶中，用去离子水定容至体积，得到显色液；
步骤8：将显色液通过分光光度计在波长420nm处进行比色，测得显色液的吸光度，以去离子水做参比，调节仪器零点；
步骤9：通过测得的吸光度从NO3-－N标准曲线中找出显色液的硝态氮浓度，并计算得出土壤中硝酸盐含量。
土壤微生物氮转化试验的预培养过程中添加了苜蓿粉，在土壤硝酸盐浸提过程中，如果沿用原有硝酸盐浸提过程，会造成苜蓿粉杂质悬浮在浸提液中，影响吸光度的测定，造成结果偏差。采用本发明步骤2和步骤3进行对土壤硝酸盐浸提，可有效去除悬浮在上清液中的苜蓿粉，提高测定准确度。
NO3-－N标准曲线的配制：从1000μg/mL硝酸根标准溶液中量取1mL于100mL容量瓶中，配制成10μg/mL硝酸根标准液。分别取10μg/mL硝酸根标准液0mL(0μg/mL)、1mL(0.1μg/mL)、2mL(0.2μg/mL)、5mL(0.5μg/mL)、10mL(1.0μg/mL)、15mL(1.5μg/mL)和20mL(2.0μg/mL)于蒸发皿中，在水浴上蒸干，与试验待测液相同操作(同步骤5-8)，进行显色和比色，绘制成标准曲线。
方法学验证：
A.硝酸根离子标准曲线
标准曲线的制作参照上述NO3-－N标准曲线的配制方法。以硝酸盐浓度0，0.1，0.2，0.5，1.0，1.5，2.0mg/L为横坐标，以吸光度值为纵坐标制作标准曲线(图1)。由图1可见，本方法标准曲线线性方程为y＝0.1014x+0.0057，相关系数r＝0.9996，该相关系数高，说明吸光度与硝酸盐含量之间的线性相关程度高，通过测定土壤样品经过步骤1-7制得显色液中的吸光度则可计算出其硝酸盐含量，可靠性高。
B.准确度测定：
通过加标回收实验，验证本发明所述测定方法测定硝酸盐含量的准确度。具体试验步骤如下：取两份相同的样品，一份加入已知量的标准物，直接加到样品或浸提液中，即称取10g土样后加入5.00mL硝酸根标准溶液(1000μg/mL)，一份10g土壤样品本底，每个处理组8个平行，在同一条件下测定含量，采用上述硝酸盐测定方法(步骤1-步骤8)，计算加入已知量的回收率，可作为准确度指标。试验结果如表1加标回收测定结果所示。
表1加标回收测定结果
由表1可知，样品回收率为92.32％～97.05％，高样品回收率表明本发明所述测定方法具有较高的准确度；而测试结果的相对标准偏差RSD为1.69％，显示所述测定方法的精密度高，由于RSD不大于5％，可判断该分析方法适合有关样品分析。从测试结果来看，说明本发明所述测定方法有较高的准确度和精密度。
C.检出限测定：
对于吸光光度法则规定当扣除空白值后吸光度为0.01者对应的浓度作为检出限。本发明所述测试方法中，检出限为0.1μg/mL。
本发明还提供了一种应用于土壤微生物毒性试验-氮转化法中土壤预培养的方式。称取试验所需的土壤重量，按照每千克土壤(干重)用苜蓿粉5g的比例加入有机底物紫花苜蓿(Medicago sativa)(C/N比在12/1～16/1之间)，进行碳调节，混合均匀后，加去离子水调节土壤含水量为最大持水量的40％～60％，置于温度为20℃±2℃、黑暗的环境中培养2d～28d。预培养结果如表2所示，硝酸盐含量随培养时间的延长呈稳步上升趋势。
表2不同培养时间硝酸盐含量的变化
此外，还可以应用本发明硝酸盐含量测定方法来评估甲嘧磺隆对土壤微生物氮转化的影响，具体如下：
甲嘧磺隆对土壤微生物氮转化的影响，主要测定程序如下：
(1)土壤采集
土壤样品为河北潮土，由河北省科学院提供，采集地点未施用过农药或有机肥，采集深度为0cm-20cm。
(2)土壤处理
采集新鲜土壤后，a.首先捡去石块、植物根系等物质，特别是植物根系会使硝化作用受到抑制。因此，在进行土壤前处理时，必须将植物根系尽可能量的剔除。b.然后测定含水量。如果含水量为10％-13％之间，无需进行风干处理；如果含水量较高，需要进行风干，风干时要监测土壤含水量变化，避免过干造成微生物数量和活性的减少。c.处理后的样品置于4℃±2℃黑暗处保存，最长可保存3个月。
(3)土壤理化指标测定
参照表3方法对供试土壤的理化指标进行测定。
表3供试土壤理化指标测定方法
测试结果如表4所示：
表4土壤微生物毒性试验(氮转化法)-土壤理化性质
(4)土壤预培养
从过筛后的土壤中称取4654.3g(含土壤干重为4100g)，加入20.5g苜蓿粉进行混合。然后向潮土中加去离子水410mL，调节土壤含水量为最大持水量的40％，搅拌均匀后，平均每个烧杯847g土壤，分装于8个2000mL烧杯中，土壤的体积最好占容器体积的四份之一左右，保证有足够的空间进行气体交换。烧杯上覆盖一层穿孔的塑料薄膜。然后对土壤样品和烧杯整体称重，预培养结束时再次称重，与预培养开始时重量比较，补齐相差的重量。最后将烧杯放置于温度为20℃±2℃、黑暗的环境中培养2天。
(5)试验体系的制备
(a)分组及剂量设计：试验设置2个样品浓度，低浓度样品试验组浓度设置为最大推荐施用浓度(甲嘧磺隆的田间最大推荐剂量为750g a.i./ha)，高浓度样品试验组浓度设置为最大推荐浓度的5倍。假设样品与5cm的土壤混合均匀，且土壤容重为1.5g/cm3，即1公顷农田5cm厚土壤重量为7.5×105kg。因此，试验以5倍组距，设计1个空白对照组、1个溶剂对照组和2个样品试验组。
试验体系制备之前，首先将预培养后的土壤样品称重，与预培养开始前的重量相比，如果变化范围超过5％，需要补齐损失的水量，即此时土壤样品中土壤含水量为最大持水量的40％。搅拌均匀。
采用整体培养的方式，即每一个样品组及对照组的土壤各作为一个整体样品，每组设置1个平行，从预培养的土壤中每组称取含600g干土土壤。浓度设计及每组体系总重量见表5。
表5土壤微生物毒性试验(氮转化法)—分组及浓度设计表
备注：每组土壤总重量指试验开始时每组土壤样品的重量，即土壤含水量调节至最大持水量40％时含水量和土壤干土重量、石英砂以及苜蓿粉重量之和。
(b)样品试验溶液的配制：
准确称取0.2042g(甲嘧磺隆的有效成分为98％)样品于小烧杯中，加入适量丙酮溶解后，转移至20mL容量瓶中，用丙酮定容至标线，混合均匀，得到浓度1.00×104mg a.i./L的样品贮备液1。
从样品贮备液1中量取4.00mL于20mL容量瓶中，用丙酮定容至标线，混合均匀，得到浓度为2.00×103mg a.i./L的样品贮备液2，即样品试验组2。
从样品贮备液2中量取2.00mL于10mL容量瓶中，用丙酮定容至标线，混合均匀，得到浓度为400mg a.i./L的样品试验组1。
(c)样品添加至土壤：
空白对照组：称取6.00g石英砂于含600g干土重量的2000mL烧杯中，搅拌均匀，将烧杯和土壤样品进行整体称重。
溶剂对照组：称取6.00g石英砂于100mL烧杯中，然后加入1.5mL丙酮，搅拌混匀，等丙酮完全挥发后，将其转移至装有600g干土重量的2000mL烧杯中，搅拌混匀，最后将烧杯和土壤样品进行整体称重。
样品试验组：称取6.00g石英砂于100mL烧杯中，然后加入1.5mL样品试验溶液，搅拌混匀，等溶剂完全挥发后，将其转移至装有600g干土重量的2000mL烧杯中，搅拌混匀，最后将烧杯和土壤样品进行整体称重。
以上土壤样品，混合时，应确保样品试验组中的样品在土壤样品中均匀分布，同时要避免土壤压紧和结块。另外，石英砂加入量按照每千克干重土壤中加入砂的比例为10g/kg。
(d)最后将烧杯放入温度为20℃±2℃、全黑暗的试验环境中，开始试验。
(e)测定时间及取样分析样品量：于0d、7d、14d、28d、42d、56d和70d分别取样分析硝酸盐含量，每次取样前混合均匀，每组各取6个样品进行硝酸盐测定。
(f)检测指标：
指标1：温度：每天测定并记录试验环境的温度。
指标2：湿度：试验开始时，记录每组烧杯和土壤样品的总重量。试验期间，每隔1d—4d对烧杯和土壤样品进行称重，如果变化范围超过5％，立即补充水分，并记录补水重量。补水量为上一次取样后烧杯和土壤的总重量和每个观察时间点土壤和烧杯总重量的差值。
指标3：土壤含水量测定：每次取样分析时对土壤进行含水量测定。
水分换算系数：每次取样分析时对土壤进行水分换算系数k2的计算。需做3个平行，每个平行首先将空的培养皿称重，记为m，然后从制备的土壤样品中称取5g于培养皿中，记为m1，将培养皿和土壤样品放入烘箱中100℃烘干至恒重，记为m2。水分换算系数最终值取三次平均数。水分换算系数的公式如下：
指标4：硝酸盐含量及其形成速率测定：记录每组土壤样品形成的硝酸盐含量，求出各组别平均值。硝酸盐形成速率表示为每天每千克土壤产生硝酸盐的毫克数，单位为mg/(kg·d)。比较每个处理组和对照组中土壤样品的硝酸盐形成速率，并计算出处理组偏离对照组的百分率。
(6)硝酸盐含量测定
步骤1：称取10g土壤样品于250mL三角瓶中，加入0.1g CaSO4·2H2O和50mL去离子水，混合均匀。
步骤2：将上述混合液在150rpm恒温摇床(温度：20℃±2℃)上振荡60min，结束后沉淀15min。
步骤3：取上清液在10000rpm高速冷冻离心机下离心5min，离心后用滤纸过滤1-2次。
步骤4：量取0.5mL-50mL的上清液于100mL蒸发皿中，向其中加入0.05gCaCO3，随后水浴蒸干至干燥。
步骤5：冷却，迅速加入2mL酚二磺酸试剂，将皿旋转，使试剂接触到所有的蒸干物；
步骤6：静置反应10min后，加入20mL去离子水，用玻璃棒搅拌直到蒸干物完全溶解。冷却后缓缓加入1：1氨水并不断搅拌均匀，至溶液呈黄色再多加2mL，以保证氨水过量；
步骤7：将溶液转移至100mL容量瓶中，用去离子水定容至体积，得到显色液；
步骤8：将显色液通过分光光度计在波长420nm处进行比色，测得显色液的吸光度，以去离子水做参比，调节仪器零点；
步骤9：通过测得的吸光度从NO3-－N标准曲线中找出显色液的硝态氮浓度，并计算得出土壤中硝酸盐含量。
NO3-－N标准曲线的配制：从1000μg/mL硝酸根标准溶液中量取1mL于100mL容量瓶中，配制成10μg/mL硝酸根标准液。分别取10μg/mL硝酸根标准液0mL(0μg/mL)、1mL(0.1μg/mL)、2mL(0.2μg/mL)、5mL(0.5μg/mL)、10mL(1μg/mL)、15mL(1.5μg/mL)和20mL(2.0μg/mL)于蒸发皿中，在水浴上蒸干，与试验待测液相同操作(同步骤5—8)，进行显色和比色，绘制成标准曲线。
(7)数据处理
1)土壤中硝酸盐含量计算(酚二磺酸比色法)：
WN(mg a.i./kg)＝[c(μg/mL)×V(mL)×ts]/[m(soil)×k2]
WN：硝态氮含量，单位为mg a.i./kg；
c：从工作曲线上查得显色液的硝态氮浓度，单位为μg/mL；
V：显色液体积，100mL
ts：分取倍数；
ts＝浸提液总体积(mL)/吸取浸出液体积(mL)；
m(soil)：受试土壤样品的重量，单位为g；
k2：由风干土样换算成烘干土样的水分换算系数。按照6.3的要求操作，并得出最终数据。
2)硝酸盐形成速率计算：
CND[mg/(kg·d)]＝[CNC+1(mg a.i./kg)-CNC(mg a.i./kg)]÷d
CND：硝酸盐形成速率，单位为mg/(kg·d)，表示每天每千克干重土壤产生硝酸盐的毫克数；
CNC：在某一取样时间点的硝酸盐含量，单位为mg a.i./kg；
CNC+1：在某一取样时间点后的下次取样时间点的硝酸盐含量，单位为mg a.i./kg；
d：CNC和CNC+1取样时间的间隔时间。
3)对照组和处理组硝酸盐形成速率的差异计算：
Di(％)＝(CNT-CNC)/CNC×100％
Di(％)：对照组和处理组硝酸盐形成速率的差异，结果为正值，表示处理组硝酸盐形成速率高于对照组，结果为负值，表示处理组硝酸盐形成速率低于对照组。
CNC：对照组硝酸盐含量；
CNT：处理组硝酸盐含量。
4)平均数、标准偏差(SD)和变异系数CV％的计算：
平均数和标准差的计算由Excell中的函数“Average”和“STDEV”直接得出。变异系数CV％，即相对标准差，标准差占测定值的平均值的百分率。按照质量控制要求，对照组重复之间的差异应小于±15％，即CV％小于±15％。
(8)结果
(a)温度测定
试验期间，环境温度范围为19.0℃～21.0℃。
(b)土壤湿度测定
每次取样分析时对土壤湿度进行测定。土壤实际含水量如下表所示：
表6土壤微生物毒性试验(氮转化法)—土壤湿度
(c)硝酸盐含量测定结果
该样品对潮土土壤中微生物硝酸盐形成量的影响见表7。
表7土壤微生物毒性试验(氮转化法)—硝酸盐含量测定结果
(d)硝酸盐形成速率测定结果
根据硝酸盐含量，计算出该样品对潮土土壤中微生物硝酸盐形成速率，以及处理组偏离对照组硝酸盐形成速率的百分率见表8和表9。
表8硝酸盐形成速率测定结果
表9处理组硝酸盐形成速率偏离对照组的百分率
备注：7d-％D、14d-％D、28d-％D、42d-％D、56d-％D和70d-％D分别表示7d、14d、28d、42d、56d和70d样品试验组硝酸盐形成速率偏离对照组的百分率。结果为正值，表示处理组硝酸盐形成速率高于对照组，结果为负值，表示处理组硝酸盐形成速率低于对照组。
(9)结论
根据OECD和“中华人民共和国农业部GB/T 31270.16-2014化学农药环境安全评价试验准则第16部分：土壤微生物毒性试验规定的化学农药对土壤微生物毒性的评价标准，在本试验条件下，该样品对潮土土壤微生物氮转化的影响在70d所取的样品中，测定其低浓度样品试验组的硝酸盐形成速率和对照组的硝酸盐形成速率的差异为-23.2％，《化学农药环境安全评价试验准则》中化学农药对土壤微生物毒性的评价标准要求：在28d后的任何时间所取样品，若测定其低浓度处理组和对照组的硝酸盐形成速率的差异不大于25％，则可认为该农药对土壤中的氮转化没有长期影响。因此，判断甲嘧磺隆对土壤中的氮转化没有长期影响。
综上所述，本发明提出了一种新的土壤预培养方法，并调整和修改现有的硝酸盐含量测定步骤，使其适用于土壤微生物毒性试验-氮转化法中硝酸盐含量测定方法。通过对本发明所述硝酸盐含量测定方法的方法学验证可知，本发明所述测定方法准确度和精密度高，应用于土壤微生物毒性试验中其测试结果重复性好，稳定性高，可作为现行标准在土壤微生物毒性试验-氮转化法中硝酸盐含量测定方面的补充。此外，还可利用本发明所述硝酸盐含量测定方法测定在土壤中添加化学农药如甲嘧磺隆对土壤微生物氮转化的影响，也弥补甲嘧磺隆对土壤微生物毒性数据的空白，为该类物质环境影响评价提供数据支持。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (7)

1.土壤微生物毒性试验中硝酸盐含量测定方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：称取10g土壤样品于三角瓶中，加入0.1g CaSO4·2H2O和50mL去离子水，混合均匀得到混合液；
步骤2：将所述混合液在150rpm转速，18-22℃温度范围的恒温摇床上振荡60min，结束后沉淀12-18min；
步骤3：取上清液在10000rpm高速冷冻离心机下离心5-10min，离心后用滤纸过滤1-2次；
步骤4：取上清液于100mL蒸发皿中，向其中加入0.05gCaCO3，随后水浴蒸干至干燥；
步骤5：冷却，迅速加入2mL酚二磺酸试剂，将皿旋转，使试剂接触到所有的蒸干物；
步骤6：静置反应10min后，加入20mL去离子水，用玻璃棒搅拌直到蒸干物完全溶解；冷却后缓缓加入1：1氨水并不断搅拌均匀，至溶液呈黄色再多加2mL，以保证氨水过量；
步骤7：将溶液转移至100mL容量瓶中，用去离子水定容至体积，得到显色液；
步骤8：将显色液通过分光光度计在波长420nm处进行比色，测得显色液的吸光度，以去离子水做参比，调节仪器零点；
步骤9：通过测得的吸光度从NO3-－N标准曲线中找出显色液的硝态氮浓度，并计算得出土壤中硝酸盐含量；
所述步骤1中的土壤样品需经过土壤采集、处理、理化指标测定以及预培养的过程后制得；
所述土壤预培养包括以下步骤：称取试验所需的土壤重量，按照每千克土壤用苜蓿粉5g的比例加入有机底物紫花苜蓿，进行碳调节，混合均匀后，加去离子水调节土壤含水量为最大持水量的40％-60％，置于温度为20℃±2℃、黑暗的环境中培养2d-28d。
2.如权利要求1所述土壤微生物毒性试验中硝酸盐含量测定方法，其特征在于，采集的土壤应未施用过农药或有机肥，采集深度为0cm-20cm。
3.如权利要求1所述土壤微生物毒性试验中硝酸盐含量测定方法，其特征在于，土壤处理包括以下步骤：
除去土壤中杂物；
然后测定土壤的含水率，如含水率在10％-13％之间，无需进行风干处理，如含水率高于13％则需要风干处理；
处理后的样品置于4℃±2℃黑暗处保存。
4.如权利要求1所述土壤微生物毒性试验中硝酸盐含量测定方法，其特征在于，土壤的理化指标测定包括以下检测项目：pH值、阳离子交换量、机械组成、有机碳、土壤含水量、土壤微生物量碳。
5.如权利要求1所述土壤微生物毒性试验中硝酸盐含量测定方法，其特征在于，所述紫花苜蓿的C/N比在12/1-16/1之间。
6.如权利要求1所述土壤微生物毒性试验中硝酸盐含量测定方法，其特征在于，所述步骤4中量取上清液的体积范围为0.5mL-50mL。
7.一种如权利要求1所述土壤微生物毒性试验中硝酸盐含量测定方法的应用，其特征在于，采用所述测定方法评估甲嘧磺隆对土壤微生物氮转化的影响。
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