CN104422690B - 一种检测土壤谷氨酰胺酶活性的分析方法 - Google Patents

一种检测土壤谷氨酰胺酶活性的分析方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种检测土壤中谷氨酰胺酶活性的分析方法：称取过土壤风干样品使用氯仿进行熏蒸；每份1克于n（n≥6）个硼硅酸盐试管中，其中向n/2支加入0.3‑0.5ml反应液，另外n/2支加入0.3‑0.5ml对照液；向所有试管中加谷氨酰氨溶液。试管在室温条件下使用往复振荡器振荡，加入4.0‑4.8ml终止液；静止待固体颗粒沉淀后，取上清液离心；离心后得到的上清液使用分光光度计比色；得到吸光度值，根据吸光度值和斜率，计算所测定溶液中的5‑N‑羟基谷氨酰氨的浓度1）本发明首次探明土壤中谷氨酰氨酶的测定方法；2）减少对设备要求的依赖性；3）方法准确度高，易操作；4）结果稳定可靠，重现性好。

Description

一种检测土壤谷氨酰胺酶活性的分析方法
技术领域
本发明涉及土壤中谷氨酰胺酶活性的测定，具体地说是一种检测土壤中谷氨酰胺酶活性的分析方法。
背景技术
土壤中的谷氨酰胺酶催化氨与谷氨酸氨生成谷氨酸盐的反应：
氮是土壤中微生物生长繁殖的最重要的营养元素，细菌和真菌可利用很多种有机和无机氮化合物。微生物对有机氮和无机氮的利用比例强烈影响氮在土壤中的循环以及微生物和植物对氮的竞争。NH4 +是土壤中能够被直接利用的无机氮形态，微生物对无机氮的利用有两种机制，结果都是通过胺化作用将α-酮戊二酸合成谷氨酸盐。其中一种途径由谷氨酰胺合成酶(E.C.6.3.1.2)进行催化.谷氨酰胺合成酶对NH4 +的俘获能力较强，亲合力较大(较小的Km值)，因此在NH4 +浓度较低时此种酶有效性较强。对这种酶活性的测定有助于理解微生物对无机氮不同利用途径的强弱，对探究土壤氮的形为具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检验土壤中谷氨酰胺酶活性的分析方法。该方法是首次对土壤谷氨酰胺酶活性的测定，通过对不同土壤样品的测定表明，分析结果精确可靠，分析重现性较好。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种检测土壤中谷氨酰胺酶活性的分析方法，
1)称取过2-4mm筛的土壤风干样品使用氯仿进行熏蒸；
2)称取熏蒸后的土壤每份1克于n(n≥6)个硼硅酸盐试管中，其中向n/2支加入0.3-0.5ml反应液，另外n/2支加入0.3-0.5ml对照液；
3)向所有试管中加1.5-1.8ml谷氨酰胺溶液(0.2M)。
4)试管在室温条件下使用往复振荡器振荡50-70分钟；
5)振荡后加入4.0-4.8ml终止液；
6)静止3分钟；待固体颗粒沉淀后，取1.3ml上清液进行离心；
7)取1ml离心后得到的上清液；
8)使用分光光度计在540nm条件下比色；
9)得到吸光度值A；
10)根据吸光度值A和斜率b，计算所测定溶液中的5-N-羟基谷氨酰胺的浓度S，S＝A*b,其中样品中的浓度定义为S1,对照中的浓度定义为S2；
11)计算土壤谷氨酰胺合成酶活性,单位为mmol羟基谷氨酰胺kg干土h-1
计算公式为：【(S1–S2)*V/1000】*V/W.T＝mmol羟基谷氨酰胺kg干土h-1式中：S1为样品中的羟基谷氨酰胺浓度(mmol/L)，S2为对照中的羟基谷氨酰胺浓度(mmol/L)，V为浸提液总体积(mL)，W为土样重(g)，1000为单位转换系数，T土样培养时间(h)。
制作工作标准曲线过程，1)配制标准溶液：称取1.621g 5-N-羟基谷胺酰胺溶于1000ml吡唑溶液中，得到浓度为10mmol/L的标准储备液，2)吸取0，1，2，3，4，5ml标准储备液加入到比色皿中，再加入4.0ml-4.8ml终止液，而后将所有的样品补齐到10ml，得到浓度为0，1，2，3，4，5mmol/L的系列浓度溶液，在540nm条件下进行比色，得到的吸光度和样品浓度绘制标准曲线，得到斜率b。
所述反应液为10.5ml吡唑缓冲液(pH 7.15)；0.9ml盐酸羟胺(800Mm)；0.1mlMnCL2l﹒4H2O(100mM)；1.4ml KH2AsO4(280mM)；0.14ml二磷酸腺苷5’谷氨酸钠盐(40mM)；对照液为11.95ml吡唑缓冲液(pH 7.15)；0.9ml盐酸羟胺；0.1ml MnCL2﹒4H2O；0.14ml二磷酸腺苷5’谷氨酸钠盐；终止液为21ml盐酸，20g三氯甲酸,55g FeCl3﹒6H2O溶于1L去离子水中。
本发明方法的测定原理
在土壤中，谷氨酸氨合成酶在发挥上述作用的同时也催化一个转化反应，它在Mn2 +存在时对腺苷酰化作用不敏感，酶活性稳定，易于测定，反应的产物羟基谷氨酰胺与氯化铁反应生成红色化学物质，可以在540nm条件下比色测定，基于此转化反应，测定谷氨酰胺合成酶活性。
具体实施方式
1.试剂配制：
1)反应液：10.5ml吡唑缓冲液(pH 7.15)；0.9ml盐酸羟胺；0.1ml MnCL2﹒4H2O；1.4ml KH2AsO4；0.14ml二磷酸腺苷5’谷氨酸钠盐(此试剂足够测25个样品)；
2)对照液：11.95ml吡唑缓冲液(pH 7.15)；0.9ml盐酸羟胺；0.1mlMnCL2﹒4H2O；0.14ml二磷酸腺苷5’谷氨酸钠盐(此试剂足够测25个样品)；
3)终止液：21ml盐酸，20g三氯甲酸,55g FeCl3﹒6H2O溶于1L去离子水中；
4)吡唑缓冲液(100mM)：称取6.82g吡唑溶于1L水中；
5)盐酸羟胺(800Mm)：称取55.6g盐酸羟胺溶于1L吡唑溶液中；
6)MnCl(100mM):称取MnCl﹒4H2O 19.8g溶于1L吡唑溶液中；
7)砷酸氢钾溶液(280mM)：称取KH2AsO4 50g溶于1L吡唑溶液中；
8)二磷酸腺苷5’谷氨酸钠盐溶液(40mM)：称取17.01g二磷酸腺苷5’谷氨酸钠盐溶于1L吡唑溶液中；
9)L-谷氨酰胺溶液(0.2M)：29.3g L-谷氨酰胺溶于1L吡唑溶液中。
2.制做标准曲线：标准溶液：称取1.621g 5-N-羟基谷氨酰胺溶于1000ml吡唑溶液中,得到浓度为10mmol/L的标准储备液。吸取0，1，2，3，4，5ml上述溶液加入到比色皿中，再加入4.0-4.8ml终止液，而后将所有的样品补齐到10ml，得到浓度为0，1，2，3，4，5mmol/L的系列浓度溶液，在540nm条件下进行比色，得到的吸光度和样品浓度绘制标准曲线，得到斜率b.
操作步骤：
1)将土壤样品过2-4mm筛，称取n克土壤样品使用氯仿熏蒸4小时；
2)称取熏蒸后的土壤n份于n支硼硅酸盐试管中(16*100mm)，每支1g，其中3支加入0.5ml反应液，另外3支加入0.5ml对照液；
3)向所有试管中加1.7ml谷氨酰胺溶液；
4)试管在室温条件下使用往复振荡器振荡一个小时；
5)振荡后加入4.4ml终止液；
6)静止几分钟待固体颗粒沉淀后，取1.3ml上清液进行离心(15000rev min-1,1分钟)；
7)取1ml离心后得到的上清液；
8)使用分光光度计在540nm条件下比色；
9)得到吸光度值A；
10)根据吸光度值A和斜率b，计算所测定溶液中的5-N-羟基谷胺酰胺的浓度S，S＝A*b,其中样品中的浓度定义为S1,对照中的浓度定义为S2；
11)计算土壤谷氨酰胺合成酶活性,单位为mmol羟基谷胺酰胺kg干土h-1
计算公式为：【(S1–S2)*V/1000】/W.T＝mmol羟基谷胺酰胺kg干土h-1式中：S1为样品中的羟基谷氨酰胺浓度(mmol/L)，S2为对照中的羟基谷氨酰胺浓度(mmol/L)，V为浸提液总体积(mL)，W为土样重(g)，1000为单位转换系数，T土样培养时间(h)。
实施例1
本实施例所使用的黑土采自于中国科学院海伦生态试验站，设三个不同的处理：1号为对照，既不经过任何处理和添加任何土壤添加剂在25℃培养24h以上的普通土壤；2号为添加硝化抑制剂DCD且在25℃培养24h以上的土壤；3号为添加硝化抑制剂DMPP且在25℃培养24h以上的土壤。土壤含水量均为20％(风干土重)。2号和3号添加硝化抑制剂的土壤，其中两种抑制剂的添加量都是50ppm，用上述方法检测三种土壤的谷氨酰胺合成酶活性。
每种土壤得具体分析步骤如下：
1)将土壤样品过2-4mm筛，称取6g土壤样品使用氯仿熏蒸4小时；
2)称取熏蒸后的土壤6份于6支硼硅酸盐试管中(16*100mm)，每份1g，其中3支加入0.5ml反应液，另外3支加入0.5ml对照液)；
3)向所有试管中加1.7ml谷氨酰胺溶液；
4)试管在室温条件下使用往复振荡器振荡一个小时；
5)振荡后加入4.4ml终止液；
6)静止几分钟待固体颗粒沉淀后，取1.3ml上清液进行离心(15000rev min-1,1分钟)；
7)取1ml离心后得到的上清液；
8)使用分光光度计在540nm条件下比色；
9)得到吸光度值A；
10)根据吸光度值A和斜率b，计算所测定溶液中的5-N-羟基谷胺酰胺的浓度S，S＝A*b,其中样品中的浓度定义为S1,对照中的浓度定义为S2；
11)计算土壤谷氨酰胺合成酶活性,单位为mmol羟基谷氨酰胺kg干土h-1.
试验结果如下：
由表中数据可以看出，添加硝化抑制剂使土壤谷氨酰胺合成酶活性显著升高，第2种和第3种土壤之前无显著差异，说明不同的硝化抑制剂类别对土壤谷氨酰胺合成酶的活性影响不大，较小的标准差值表明该分析方法结果之间的偏差较小，精确度较高，重现性好。
实施例2
本实施例所使用的三种不同种植作物的棕壤均采于中国科学院沈阳生态实验站：其中4号土壤前茬作物为水稻，5号土壤前茬作物为玉米，6号土壤前茬作物为大豆。三种不同耕作制度的土壤均在含水量为20％(风干土重)，温度在25℃条件下培养24h以上，测定其谷氨酰胺合成酶活性，具体步骤同实例1。
试验结果如下：
表中数据同样显示了分析结果的稳定性及较高的精密度。也表明不同的耕作制度对谷氨酰胺合成酶的活性影响较大。

Claims (2)

1.一种检测土壤中谷氨酰胺酶活性的分析方法，其特征在于：
1)称取过2-4mm筛的土壤风干样品使用氯仿进行熏蒸；
2)称取熏蒸后的土壤每份1克于n个硼硅酸盐试管中，n≥6，其中向n/2支加入0.3-0.5ml反应液，另外n/2支加入0.3-0.5ml对照液；
3)向所有试管中加1.5-1.8ml 0.2M的谷氨酰胺溶液。
4)试管在室温条件下使用往复振荡器振荡50-70分钟；
5)振荡后加入4.0-4.8ml终止液；
6)静止3分钟；待固体颗粒沉淀后，取1.3ml上清液进行离心；
7)取1ml离心后得到的上清液；
8)使用分光光度计在540nm条件下比色；
9)得到吸光度值A；
10)根据吸光度值A和斜率b，计算所测定溶液中的5-N-羟基谷氨酰胺的浓度S，S＝A*b,其中样品中的浓度定义为S1,对照中的浓度定义为S2；
11)计算土壤谷氨酰胺酶活性,单位为mmol·kg-1·h-1计算公式为：【(S1–S2)*V/1000】/W·T单位为mmol·kg-1·h-1
式中：S1为样品中的羟基谷氨酰胺浓度，其单位为mmol/L；S2为对照中的羟基谷氨酰胺浓度，其单位为mmol/L；V为浸提液总体积，其单位为mL；W为土样重，其单位为kg；1000为单位转换系数；T土样培养时间，其单位为h；
所述反应液为10.5ml吡唑缓冲液，吡唑缓冲液pH为7.15；0.9ml盐酸羟胺，其中盐酸羟胺800Mm；0.1ml浓度为100mM MnCL2l·4H2O；1.4ml浓度280mM KH2AsO4；0.14ml浓度为40mM二磷酸腺苷5’谷氨酸钠盐；对照液为11.95ml吡唑缓冲液，吡唑缓冲液pH为7.15；0.9ml盐酸羟胺；0.1ml MnCL2·4H2O；0.14ml二磷酸腺苷5’谷氨酸钠盐；终止液为21ml盐酸，20g三氯甲酸,55g FeCl3·6H2O溶于1L去离子水中。
2.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于：制作工作标准曲线过程，1)配制标准溶液：称取1.621g 5-N-羟基谷胺酰胺溶于1000ml吡唑溶液中，得到浓度为10mmol/L的标准储备液，2)吸取0，1，2，3，4，5ml标准储备液加入到比色皿中，再加入4.0ml-4.8ml终止液，而后将所有的样品补齐到10ml，得到浓度为0，1，2，3，4，5mmol/L的系列浓度溶液，在540nm条件下进行比色，得到的吸光度和样品浓度绘制标准曲线，得到斜率b。
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